SERUM FOLATPRØVERS HOLDBARHED OG

Transkript

1 Bioanalytikeruddannelsen Aarhus SERUM FOLATPRØVERS HOLDBARHED OG HÆMOLYSEINTERFERENS AF SERUM FOLATKONCENTR ATION PROFESSIONSBACHELORPROJEKT 2012/2013 Christine Schubert Waldstrøm Christiansen Studienummer: I-vejleder: Karen Koed, K-vejleder: Ole Bernth Jensen, Antal tegn (inklusive mellemrum):

2 Forord Nærværende professionsbachelorprojekt rapport Serum folatprøvers holdbarhed og er resultatet af projektarbejde gennemført i perioden fra den 8. oktober til den 19. december 2012, inklusive forsøgsarbejde på Klinisk Biokemisk Afdeling på Sygehus Thy-Mors i perioden fra den 9. oktober til den 22. oktober Først og fremmest tak til uddannelseskoordinatoren Chalotte Johansen for, at vi kunne udføre vores bachelorforsøg på Klinisk Biokemisk Afdeling på Sygehus Thy-Mors, eftersom Klinisk Biokemisk Afdeling på Sygehus Thy- Mors ikke oprindelig var udpeget til bachelorophold. Dernæst skal I- og K-vejlederne, Karen Koed og Ole Bernth Jensen have tak for deres hjælpsomhed og engagement. Der skal også rettes en stor tak til de ansatte på Klinisk Biokemisk Afdeling på Sygehus Thy- Mors som frivilligt afgav blodprøver til projektet. Til sidst tak til Ruth Bjørnskov Christensen for god støtte, da prøverne skulle analyseres. Tilknyttet denne professionsbachelorprojekt rapport er bilagene på USB: Bilag 1_Hæmoglobinværdier til hæmolyseforsøget Bilag 2_S-folatværdier til hæmolyseforsøget Bilag 3_Fra fryseren til Modular E170 Bilag 4_Rådata til forhold 1 (lys) Bilag 5_Rådata til forhold 2 (mørke) Bilag 6_Rådata til forhold 3 (køl) Bilag 7_Hæmolyseforsøget Bilag 8_Holdbarhedsforsøget (lys) Bilag 9_ Holdbarhedsforsøget (mørke) Bilag 10_ Holdbarhedsforsøget (køl) Bilag 11_ P-Folat; stofk. forskriften fra KBA Thy-Mors Bilag 12_ Folat III, Indlægssedlen fra cobas (Roche Diagnostics) Side 1 af 47

3 Resume Bagrund Folat er vandopløselig B vitamin, som er essentiel i biosynteserne af blandt andet nukleotider og er dermed aktiv i DNA-syntesen. Folatmangel fører til makrocytær anæmi (1,2). I litteraturen er der uenighed om holdheden og opbevaring af folatprøver (3-5). Derfor undersøges serum folatprøver (S-folatprøver) under tre forskellige opbevaringsforhold. Derudover er der ingen oplysninger om, hvor stor en kvantitativ mængde hæmolyse, der interfererer folatprøver. Derfor undersøges hæmolyseinterferens af S-folatprøver. Metode Til hæmolyseforsøget (hæmolyseinterferens af serum folatprøver) anvendes vejledning fra bogen Interferographs: users guide to interferenscens in clinical chemistry instuments (6) hvor en hæmolyse fortyndingsrækkefølge bestående af syv glas for to niveauer af S-folat, først bliver analyseret på Konelab Prime 30i for frit hæmoglobin og dernæst bliver analyseret på Roche Modular Analytics E 170 for S-folat. Til holdbarhedsforsøget indsamles otte prøver fra hver af de 15 frivillige. Serum fra de otte prøver fra hver af de 15 frivillige, bliver fordelt på 21 prøver. Disse 21 prøver bliver fordelt og opbevares derefter under følgende opbevaringsforhold: Forhold 1: lys og stuetemperatur (20-25⁰C), Forhold 2: mørke og stuetemperatur (20-25⁰C) Forhold 3: mørke og køl (2-8⁰C) til tiderne. Alle S-folatprøver (S-folatprøver) bliver analyseret på følgende tidspunkter: 0,2,4,8,24,48 og 72 timer. Resultater Hæmolysegraden for S-folatprøver må have en hæmoglobinkoncentration på 20 µmol/l ved S-folatprøver med en folatkoncentration på 7.07 nmol/l. Holdbarheden for S- folatprøver: 2 døgn ved stuetemperatur ubeskyttet mod lys, mere end 3 døgn ved stuetemperatur beskyttet mod lys (i mørke) og på køl beskyttet mod lys. Side 2 af 47

4 Konklusion Ud fra resultaterne i hæmolyse- og holdbarhedsforsøget ses det, at hæmolyse har størst indvirkning på S-folatkoncentrationen. Side 3 af 47

5 Indholdsfortegnelse Forord... 1 Resume... 2 Bagrund... 2 Metode... 2 Resultater... 2 Konklusion Introduktion Baggrund Formål Problemformulering Målformulering Hypotese Teori Vitaminer Folat P-folat-analysens anvendelse Analyseprincip bag kompetitiv ECL-assay Kvalitetssikring Interferens af folat-analysen Ny holdbarhedsmetode fra Norden Databehandling Materialer og metoder Materialer Hæmolyseforsøget Holdbarhedsforsøget Side 4 af 47

6 3.2 Metodedesign Hæmolyseforsøg Holdbarhedsforsøg Resultater Hæmolyseforsøget Holdbarhedsforsøget Forhold Forhold Forhold Diskussion Hæmolyseforsøget Resultatvurdering af hæmolyseforsøget Vurdering af metodedesign for hæmolyseforsøget Holdbarhedsforsøget Resultatvurdering af holdbarhedsforsøget Vurdering af metodedesign for holdbarhedsforsøget Sammenligning af hæmolyse-og holdbarhedsforsøgets resultater Konklusion Perspektivering Referenceliste Side 5 af 47

7 1 Introduktion 1.1 Baggrund Folat er vandopløselig B vitamin, som består af en cyklisk konjugering af pteridin, paraaminobenzoesyre (PABA) og glutaminsyrerester (1). Folat er en vigtig co-faktor i biosyntesen af methionin, aminosyrerne serin, glycin og histidin, cholin og purin- og thyminnukleotider og er dermed aktiv i DNA-syntesen (1,7). Folat er et essentielt B- vitamin og skal optages gennem føden og findes primært i gær, bladgrønsager og dyrelever, men findes også i sædvanlig kost såsom frugt, appelsinjuice, brød og mælkeprodukter. Mennesket er således afhængig af indtaget af folat. Dårlige kostvaner kan dermed føre til folatmangel (8). Ved folatmangel forringes DNA-syntesen. Den manglende evne til at syntetisere DNA fører til nedbrydelse af erytroblaster i knoglemarven og de erytroblaster, der overlever får en forlænget delingsperiode, som medfører, at de kan syntetisere mere hæmoglobin, så cellevolumen bliver større end normalt. Dette fænomen betegnes som makrocytær/magaloblastære anæmi(2). Indtagelsen af folat eller folinsyre bliver ofte associeret med svangerskab. Det er bevist, at folattilskud i det første trimester af graviditeten reducerer risikoen for neuralrørsdefekt og derfor er analysering af folat en vigtig kontrol under svangerskab (1,9). På Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA) på Sygehus Thy-Mors anvendes serum folat (Sfolat) til koncentrationsbestemmelse af folat. Analysen udføres med et kompetitivt ECLassay (electrochemiluminescens) på apparaturet Roche Modular Analytics E 170 (Modular E170). Ved ønske om analytkoncentration skal to forudsætninger være tilstede for at prøveresultatet kan give et korrekt billede af patientens tilstand: Analysemetoden må have en god specificitet og sensitivitet, så der måles en korrekt koncentration af prøven Analytkoncentrationen i prøvematerialet må ikke ændre sig signifikant i tidrummet mellem blodprøvetagning og analyseringen af prøvematerialet (10) Dermed er det væsentligt at kende holdbarheden for folatprøver, og netop dette er der uenigheder om i litteraturen. Holdbarhed (Stabilitet) er blevet defineret af Den Internationale Standardiseringsorganisation (ISO) som prøvematerialets evne til at Side 6 af 47

8 opretholde den oprindelige måleværdi inden for definerede grænser, når måleværdien ligger under et givet forhold i et givet tidsrum (11). I e-doks laboratoriehåndbog for Hospitalsenheden Vest står der for folat: Holdbarhed efter afpipettering: Stuetemperatur: 2 d, køleskab (2-8 C): 7 d. (5). I reagensindlægssedlen for folat fra cobas (4) er oplyst, at serum og Li-heparinplasma prøver har en holdbarhed på 2 timer ved ⁰C, to døgn ved 2-8 ⁰C og prøverne skal opbevares beskyttet mod lys. På KBA på Sygehus Thy-Mors står der i forskriften for folat, at holdbarheden for folatprøver er på et døgn, både ved stuetemperatur (20-25 ⁰C) og på køl (2-8 C), samt at prøverne ikke bør henstå i stærkt lys (3). KBA er i tvivl om, hvad der er mest hensigtsmæssig med hensyn til holdbarhed og opbevaring af folatprøver. Hvis det viser sig, at prøvematerialet kan holde i kortere tid end et døgn eller hvis prøvematerialet ikke kan tåle lys, vil det give problemer. Hvorimod det vil lette arbejdsbyrden, hvis prøvematerialet kan holde længere tid end de to timer, som anført af cobas (4). Derudover står der i indlægssedlen fra cobas Hæmolyse kan øge folatværdierne signifikant på grund af de høje koncentrationer af folat i røde blodceller. Hæmolyserede prøver er derfor ikke egnede til brug med denne analyse (4). Til tider oplever KBA på Sygehus Thy-Mors uenighed ved vurdering af, hvorvidt en prøve er hæmolyseret eller ikke, da der tages en visuel vurdering. Det kunne derfor være en stor hjælp, hvis man vidste, hvor lidt hæmolyse en prøve kan have for at påvirke folatkoncentrationen. 1.2 Formål Formålet med forsøget er at undersøge, hvordan man optimalt håndterer og opbevarer prøver til analysering for S-folat, og ligeledes afdække hvilke konsekvenser det evt. medføre for Klinisk Biokemisk Afdeling, Sygehus Thy-Mors. Derudover ønskes det undersøgt, hvor meget hæmolyse i µmol/l, der må være i S-folatprøver før det bliver af klinisk betydning. Side 7 af 47

9 1.3 Problemformulering Hvilken indvirkning har hæmolyse, lys, mørke, temperatur og opbevaringstid på S- folatkoncentrationen? 1.4 Målformulering Hæmolyseforsøget Vi vil undersøge hæmolyseinterferens af S-folatkoncentrationen ved at fremstille en pool med en kendt S-folatkoncentration, som bliver fordelt på seks glas med forskellige grad af hæmolysat. Hertil er der endvidere en 0-prøve kun bestående af pool og destilleret vand. Dette forsøg udføres i to niveauer af S-folat. Alle prøverne bliver analyseret på Konelab Prime 30i for hæmoglobin, som er et kvantitativt mål for hæmolyse. Dernæst foretages en S-folat-analyse på Modular E170. Til vurdering af hæmolyseinterferens af S-folatkoncentrationen fremstilles en graf, som viser måleværdierne i procent fra udgangsværdien (0 prøven) som er sat til 100 % for hvert af de to niveauer. S-folat analysens tilladte Bias % og tilladte total error (TE %) vil angives som horisontale linjer. Holdbarhedesforsøget Vi vil undersøge, hvordan opbevaring af S-folatprøver påvirker S- folatkoncentrationen ved at indsamle serumprøver fra 15 frivillige. Serum fra prøverne bliver fordelt og opbevares derefter under disse forhold, som vist i tabel 1: Tabel 1. De 3 opbevaringsforhold Forhold Lys/mørke Temperatur Tiderne (timer) nr. 1 Lys (ubeskyttet Stuetemperatur (20-25 ⁰C) 0, 2, 4, 8, 24, 48 og 72 mod lys) 2 Mørke (beskyttet Stuetemperatur (20-25 ⁰C) 0, 2, 4, 8, 24, 48 og 72 Side 8 af 47

10 mod lys) 3 Mørke (beskyttet mod lys) Køl (2-8⁰C) 0, 2, 4, 8, 24, 48 og 72 Efterfølgende bliver prøverne frosset ned (-80 ⁰C), tøet op igen og analyseres for S- folat på Modular E170. Til vurdering af holdbarheden for S-folat under de forskellige opbevaringsforhold, fremstilles en graf til hvert af forholdene, som viser måleværdierne i procent fra udgangsværdien (0 timer) som er sat til 100 %. Gennemsnitsværdien af måleværdierne til hver tid med et 90 % konfidensinterval vil ses på grafen og S- folat analysens tilladte Bias % og TE % vil blive angivet som horisontale linjer. 1.5 Hypotese Hæmolyseforsøget Der kan godt udføres en S-folat analyse på S-folatprøver med lav grad af hæmolyse Holdbarhedsforsøget Det forventes, at S-folatprøvers holdbarhed er større end de oplyste 2 timer ved stuetemperatur (20-25⁰C) og beskyttet mod lys Side 9 af 47

11 2 Teori I dette teoriafsnit vil der blandt andet være en videre forklaring af folat, en beskrivelse af analysepricippet bag kompetitiv Electrochemiluminescens-assay (ECL-assay) som anvendes til analysering af S-folat på KBA på Sygehus Thy-Mors, en beskrivelse af interfererende stoffer for folat-analysen og en beskrivelse af den nye holdbarhedsmetode fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger, som anvendes i holdbarhedsforsøget i dette professionsbachelorprojekt. 2.1 Vitaminer Som beskrevet i overstående afsnit er folat et vitamin. Vitaminer er organiske molekyler, som har mange forskellige funktioner i kroppen. Eksempelvis fungerer vitaminer som cofaktorer (co-enzymer) for enzymatiske reaktioner i metabolismen af kulhydrater, fedt, proteiner, og knogler (7,12). Vitaminer kan generelt ikke syntetiseres af pattedyrceller, og dermed skal vitaminer optages gennem føden. Der findes to forskellige typer vitaminer, de vandopløselige og de fedtopløselige (7). Under betegnelsen de fedtopløselige vitaminer hører A-, D-, E- og K- vitaminer, og under de vandopløselige vitaminer hører B- og C- vitaminer til. B-vitaminer er en samlet betegnelse for en række vitaminer, hvor blandt andet folat indgår (se tabel 2) (7): Tabel 2. B- vitaminer Vitamin Navne B1 thiamin B2 riboflavin B3 niacin eller niacinamid B5 pantotensyre B6 pyridoxin, pyridoxal eller pyridoxamin B7 Biotin B9 folat eller folinsyre B12 cobalamin Side 10 af 47

12 2.2 Folat Efter indtagelsen af folat-rig kost, nedbrydes det fra polyglutaminer til monoglutaminer i tarm, hvorefter det absorbers af tarmepitel-cellerne i Jejunum og bliver ført ud i blodbanen (1,2). Hovedparten af folaterne bliver om dannet til 5-methyl- tetrahydrofolat (5-methyl- THF) under methylering og reducering i hovedsageligt leverceller, hvor folat også deponeres. 5-methyl-THF er den form for folat som cirkulerer i plasma, hvor størstedelen er løst bundet til transportproteinet albumin og en mindre del er bundet fast til specifikke proteiner, som dannes i leukocytterne. Før at 5-methyl-THF kan være medvirkende DNAsyntesen, skal det optages i cellerne. Denne optagelse af 5-methyl-THF sker ved hjælp af folattransportere, hvor cobalamin (B 12 vitamin) fungerer som er en co-faktor og katalyserer omdannelsen af homocystein til methionin ved, at hydroxycobalamin overbringer methylgruppen fra 5-methyl-THF til homocystein. Nu befinder folat sig i cellen i form af THF (tetrahydrofolat). Det er denne form for folat, som syntetiserer dannelsen af methionin, aminosyrerne serin, glycin og histidin, cholin og purin- og thyminnukleotider. Se figur 1 (1,7). Folat deponeres også i cellerne i form af THF og anvendes først ved behov. Folat findes fastbundet til hæmoglobin i erytrocytterne, selv om folat hverken optages eller afgives i de modne erytrocytter. Det er under erytropoiesen, at folat akkumuleres i de umodne erytrocytter (erytroblaster). (1). Figur 1. Reaktioner hvor THF fungerer som en co-faktor. Fra (13) Side 11 af 47

13 Folatkoncentration kan bestemmes på bagrund af plasma/serum eller erytrocytter (ERC). Det er blevet vist ud fra ernæringsundersøgelser, at S-folat/plasma-folat (P-folat) er den bedste indikator for folatbalancen ved nylig folat indtag. ERC-folat er en mere definitiv test for at undersøge folatdepoterne, eftersom erytrocytterne kun akkumulerer folat under erytropoiese. ERC-folatkoncentrationen ændres dermed langsommere med ændring af indtagelse af folat, eftersom erytrocytternes levetid er på 120 dag (14). Folatkoncentrationen bør analyseres på baggrund af serum eller plasma, eftersom ERCfolat-analysen er mere kompleks at udføre, da den kræver en særlig håndtering af prøver og har således en lavere impræcision (8,15). I Region Nordjylland er referenceintervallet for P-folat > 6 nmol/l (3), som er baseret på baggrund af folat-analysens metode, kompetitiv ECL-assay (14). Der er ikke krav om, at patienterne skal være fastende ved foretagelse at folat-analyse. Befinder folatstofkoncentration 6 nmol/l, kan dette betragtes som en folatmangel P-folat-analysens anvendelse Folatmangel ligner meget B12-vitaminmangel (cobalaminmangel), da de begge medfører makrocytær anæmi (7). Derved kan man anvende P-folat-analysen til udredning af makrocytær anæmi og kan ligeledes anvendes ved cobalaminmangel. Cobalaminmangel medfører øget folatkoncentration i blodet, eftersom folat ikke kan optages i cellerne, da cobalamin er fraværende (1). Folat optages i tarmen, og ved malabsorption nedsættes optagelsen af folat og dermed falder folatkoncentration i blodet (1). Ved fejlernæring kan der være nedsat folatkoncentration i blodet. Det samme gælder ved indtagelsen af antiepileptika og folatantagonister. Nedsat folatkoncentration i blodet ses også ved øget forbrug af folat i kroppen, som er tilfældet ved svangerskab, leukæmi og hæmolytisk anæmi (1). 2.3 Analyseprincip bag kompetitiv ECL-assay Som nævnt tidligere anvendes et kompetitivt ECL-assay (electrochemiluminescens assay) på apparaturet Modular E 170 til koncentrationsbestemmelse af folat på Sygehus Thy- Mors (4). Inkubation 1: Efter prøven bliver sat på Modular Analytics E 170, bliver 25 µl serum/plasma inkuberet ved 37 ⁰C med folatforbehandlingsreagenserne 1 og 2, som Side 12 af 47

14 indeholder Natrium 2-mercaptoethansulfonat og Natriumhydroxid. Folatforbehandlingsreagenser frigiver de bundne folater fra de endogene folatbindende proteiner som albumin. Inkubation 2: Dernæst bliver den forbehandlede prøve inkuberet med en overskydende mængde rutheniummærkede (ruthenium (II) tris-bipyridal (Ru (bpy) )) folatbindende protein (FBP), som er specifik for folat og der dannes et patient-folatkompleks, hvis mængde afhænger af analytkoncentrationen (folat) i prøven. Biotinyleret folat og streptavidin-coatede mikropartikler bliver dernæst tilsæt blandingen. Inkubaton 3: Det biotinylerede folat optager de ubundne bindingspladser på de rutheniummærkede folatbindende proteiner, hvorved der dannes et rutheniummærket folatbindende proteinfolatbiotinkompleks. Disse rutheniummærket folatbindende proteinfolatbiotinkompleks bindes til streptavidin-coatede mikropartikler via den stærke interaktion mellem biotin og streptavidin. Reaktionsblandingen opsuges i målecellen, hvor proteinfolatbiotinkompleks bliver indfanget magnetisk på elektrodens overflade via mikropartiklerne. Dernæst vaskes med ProCell/ProCell M for at fjerne ubundne stoffer såsom patient-folatkomplekser, eftersom disse ikke bliver opfanget på elektrodeoverfladen (4). ProCell/ProCell M indeholder tripropylamin (TPA) som er læse-buffer til den endelige ECL-reaktion (16). Ved at sætte spænding til elektroden induceres kemiluminiscensemission, hvor reportermolekylet, det bundne ruthenium og TPA, bliver oxideret. TPA mister en proton og TPA anvendes som en reduktant, der fører ruthenium til en exciteret tilstand, hvilket medfører lys som udsendes ved en bølgelængde på 620 nm (se figur 1) (16,17). Lyset bliver opfanget af fotomultiplikatoren og Ruthenium kommer tilbage til grundformen. Ruthenium bliver ikke brugt op i reaktionen, så denne cyklus kan fortsætte, så længe TPA er til stede. Flere excitation/emission cykler forstærker det udsendte lys og øger følsomheden (17). Mængden af produceret lys er omvendt proportionalt med mængden af folat i patientprøven. Det vil sige, at jo mere folat desto mindre lys bliver der udsendt, eftersom folat optager størstedelen af pladserne på FBP, som bliver vasket ud af målecellen af ProCell/Proll M (18). Kemiluminiscensemission bliver målt af fotomultiplikatoren over en bestemt periode, som anvendes til bestemmelse af folatkoncentrationen ved anvendes af en kalibreringskurve. Kalibreringskurven er fremstillet ud fra kendt folatkoncentration (2- punktskalibrering), og en masterkurve (16,17). Side 13 af 47

15 Figur 2. Den sidste reaktion i ECL-assay. Fra (17) ECL detektionsteknologi er en meget anvendelig teknologi, eftersom den giver tydelige fordele i forhold til andre detektionsmetoder. ECL har (18): Ikke-isotopisk markør Høj specificitet og sensitivitet Korte inkubationstider, høj kvalitet Giver hurtige resultater Stort måleområde Anvender små mængder af prøvemateriale Kontrolleret reaktion 2.4 Kvalitetssikring Man skal sikre sig, at et analyseresultat er sandfærdigt, dermed er der stor fokus på kvalitetssikring. Kvalitetssikring er alt det, der bidrager til at opretholde kvaliteten af resultatet af prøvematerialet (19). Derfor foretages kalibrering, som er baseret på kendt koncentration af en givet analyt. Kalibrering udføres: Når lotnumre på reagens til analysering ændres Når systemkomponenter udskiftes Når resultaterne af kvalitetskontrollen gentagne gange befinder sig uden for et givet område Side 14 af 47

16 Kvalitetskontroller udføres før analysering af patientprøver. Der opstilles krav til, hvor meget kvalitetskontroller må afvige fra deres vedtagne sande værdier (se afsnittet databehandling) og ud fra dette, kan vurderes om analysen fungerer tilfredsstillende. Til folat-analysen på Modular E170 anvendes disse tre kontroller (3,4): Tabel 3 Kontrol Navn Middelværdi Intern Lyphochek immunoassay Plus Control, Level 1, Cat No BIO-RAD Lyphochek immunoassay Plus Control, Level 2, Cat No BIO-RAD Ekstern Hormone- og immunkemi (Labquality) HK12 (DEKS) (nmol/l) SD CV % 7,67(n = 166) 0,70 (n= 166) 9,1(n = 166) 15(n = 164) 0,83(n = 164) 5,5(n = 164) 12,71(n= 119) 0,92(n = 119) 7,2(n = 119) CV %, som er folat-analysens usikkerhed sammenlignes med den tilladte CV %, som findes på Westgards hjemmeside. CV % for folat-analysen på Modular E170 skal være under den tilladte CV % på 12 % for, at man kan anvende denne analyse til kvantitativ bestemmelse af folatkoncentration. Det ses ud fra CV % erne fra tabel 3 og indlægssedlen fra cobas (Roche Diagnostics)(4), at folat-analysen på Modular E170 er tilfredsstillede. De interne kvalitetskontroller anvendes daglig for at undersøge om S-folat-analysen er tilfredsstillende, de såkaldte kort tidskontroller. Den eksterne kvalitetskontrol fra DEKS (Dansk Institut for Ekstern Kvalitetssikring for Laboratorier i Sundhedssektoren) HK12, er en langtidskontrol og anvendes til at sammenligne S-folat-analysen med andre laboratorier i landet, som anvender samme og forskellige apparatur for at se, hvordan analysen ligger i forhold til hinanden. Under kvalitetssikring er der også krav om holdbarhed til reagenset som anvendes til analysering og prøvematerialet. Holdbarhed eller stabilitet er ikke en egenskab som kan måles direkte. Holdbarhed kan forstås som evnen til at bevare sin oprindelige tilstand af et givet produkt. Derfor undersøges folatprøvers holdbarhed under tre opbevaringsforhold Side 15 af 47

17 som beskrevet i tabel 1. For hvert forhold udskiftes en faktor, eksempelvis lys til mørke. Årsag til, at det er disse tre forhold vi vil undersøge i dette professionsbachelorprojekt er, at de kan sammenlignes med oplysningerne i indlægssedlen fra cobas (Roche Diagnostics) (4). Andre muligheder er ikke medtaget på grund af ressourcepres (tid og økonomi). 2.5 Interferens af folat-analysen Under kvalitetssikring skal man også være opmærksom på interfererende stoffer, som kan være en betydelig fejlkilde i kliniske analyser. Sådanne fejl kan i visse tilfælde udgøre en fare for patienten. Mens impræcision (analytisk variation: afvigelsen mellem gentagne målinger på den samme prøve) rutinemæssigt overvåges ved intern kvalitetskontrol, og korrekthed kan verificeres ved sammenligning med referencematerialer eller procedurer, kan laboratorier ikke let opdage fejl forårsaget af interfererende stoffer (20). Dermed er det vigtigt at vide, hvilke stoffer der interferer folat-analysen på Modular E170. Til folatanalysen er der eksogen interferens i form af lægemidlerne methotrexat og leucovorin, da der opstår krydsreaktioner (1,20). Endogene interfererende stoffer for folat-analysen er blandt andet icterus, lipæmi og biotin. I indlægssedlen fra cobas (Roche Diagnostics) er der kvantitative acceptkriterier for de interfererende stoffer (4): Icterus: (bilirubin) < 564 µmol/l Lipæmi: (Intralipid) < 1500 mg/dl ~ 6,2 mol/l biotin < 86.1 nmol/ L Mængden af bilirubin og intralipid i folatprøven må være større end biotin, eftersom bilirubin og intralipider bliver skyllet ud af målecellen af ProCell/ProCell M, som beskrevet ved ovenstående afsnit. Biotin derimod interfererer mere med folatprøverne, da ECL-assayet indeholder biotinyleret folat og biotin fra prøver kan således optage Biotinyleret folaternes plads på streptavidin-coatede mikropartikler og dermed medføre et falsk forhøjet værdi af folatkoncentration. Hæmolyse er også nævnt i indlægssedlen fra cobas (Roche Diagnostics) som et interfererende stof (4). Hæmolyse betegner den situation, hvor erytrocytter afgiver hæmoglobin (giver den røde farve) og andet indhold til det omgivende medium, eftersom cellemembranen ødelægges. Hæmolyse kan være in vivo (inde i kroppen) og in vitro (uden for kroppen). Hæmolyse forekommer in vivo ved patologiske tilstande såsom HELLPsyndrom eller hæmolytisk uræmisk syndrom og in vitro forekommer hæmolyse oftest ved Side 16 af 47

18 forkert blodprøvetagning (21). Det er ikke den røde farve af hæmoglobin, som interfererer folat-analysen, men den høje folatkoncentration i erytrocytter og dermed får hæmolyseret folatprøver et falsk forhøjet folatkoncentration (4). Men mængden af hæmolyse, som interfererer folatprøverne er ikke oplyst i indlægssedlen fra cobas (Roche Diagnostics), og derfor undersøges hæmolyseinterfererens af folatprøver i dette professionsbachelorprojekt. 2.6 Ny holdbarhedsmetode fra Norden I artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger fra Klinisk Biokemi i Norden (10) har Arne Åsberg, et al. fra afdeling for Medicinsk Biokemi, St. Olavs Hospital i Trondheim udviklet en ny metode til at vurdere holdbarhedsforsøg. De mener, at gennemsnitsværdien af analytkoncentrationen i prøver opbevaret med en bestemt kombination af opbevaringsbetingelser og opbevaringstidsrum må være inden for den gennemsnitlige udgangsværdi ± den tilladte Bias (ønskede). Det er den tilladte Bias af en givet analyt som avendes, da der findes pålidelige data vedrørende normal biologisk variation (10). Se definition og beregningen af den ønskede tilladte Bias i afsnittet Databehandling. Den målte gennemsnitsværdi har en tilknyttet usikkerhed, derfor anvendes et 90 % konfidensinterval for gennemsnitsværdien, så der er 95 % sandsynlighed for, at gennemsnitsværdien for hver tid ligger inden for konfidensintervallet. Det kræves, at 90 % konfidensintervallet skal ligge inden for acceptgrænserne for tilladte Bias % for at acceptere, at prøvematerialet er holdbart. De vurderer også den enkelte måleværdi, hvor acceptgrænsen er den enkelte prøves udgangsværdi ± den tilladte TE, som også defineres og beregnes i afsnittet Databehandling (22). Den tilladte TE anvendes som acceptgrænse for den enkelte måleværdi(10). Altså for en bestemt kombination af opbevaringsbetingelser og opbevaringstid skal begge krav, både kravet til gennemsnitsværdien og kravet til den enkelte måleværdi være opfyldt for, at prøvematerialet kan betragtes som holdbart (10). Side 17 af 47

19 2.7 Databehandling Bias- systematisk Bias afspejler den systematiske fejl og er defineret som forskellen mellem middelværdien af uendeligt mange målinger og prøvens referenceværdi (den sande værdi) (19). Bias er med et andet ord korrektheden og kan beregnes således: Bias= (19) Den sande værdi for et givet materiale er svær at definere, eftersom der skal uendelig mange målinger til at bestemme den sande værdi. Derfor anvendes den vedtaget sande værdi ofte som er middelværdien af mange målinger af et givet prøvemateriale. Den tilladte Bias er den største afvigelse som måleværdiernes gennemsnit må have før, at det bliver klinisk signifikant og patienter kan dermed få angivet en forkert diagnose. Den tilladte Bias kan være af optimum performance, desirable performance eller minimum performance. Den desirable performance Bias (den ønskede tilladte Bias) er den, som oftest anvendes og det er denne tilladte Bias i % for en givet analyt, som findes på Westgards hjemmeside (22) og den beregnes således (10,22): Den ønskede tilladte Bias % = (10,22) Hvor CVw er CV % for within-subject (intraindividuel variation) og CVg er CV% for between subject (interindividuel variation) Total allowable error range tilladte TE Den tilladte TE er den største afvigelse en enkelt måleværdi må have før, at det bliver klinisk signifikant (10) og denne tilladte TE i % findes på Westgards hjemmeside (22). Den tilladte TE % beregnes således(10): Den tilladte TE % = ± Hvor I % er den tilladte analytiske CV % for en givet analyt. Konfidensinterval Side 18 af 47

20 Et konfidensinterval er et tillidstro interval. Det er det interval, hvor man med en bestemt sikkerhed ved, at en givet parameter ligger indenfor. Ofte anvendes et 95 % konfidensinterval, som beregnes således (19): konfidensinterval = Hvor SEM (standard error of the mean) = CV - variationskoefficient CV er målingernes impræcision, altså graden af overensstemmelse mellem uafhængige målinger af en givet analyt. Ofte er variationskoefficient angivet i CV % og kan både beregnes som af analytisk eller biologisk variation. CV % beregnes således (19): CV % = Hvor SD er standardafvigelsen. CV % af den intra- og interindividuelle variation og den tilladte analytisk variation af en givet analyt, finds på Westgards hjemmeside (22). Side 19 af 47

21 3 Materialer og metoder 3.1 Materialer Hæmolyseforsøget - Destilleret vand - Koldt fysiologisk saltvand (natriumklorid 9 mg/ml) - Centrifuge (Hettich: 10 min. ved 2500 g) grader fryser - Engangspipetter - Automatpipetter + pipettespidser - Afpipetterings plastglas med prop - kopper (til Konelab Prime 30i og Modular E170) Apparatur - ABL 800 Flex - Konelab Prime 30i - Modular E170 Reagenser - Natruimcarbonatopløsning 0,94mmol/L (fremstillet på KBA, Sygehus Thy-Mors, anvendes til Konelab Prime 30i) - Folat III fra Roche: pretreatment reagens 1, pretreatment reagens 2 og Streptavidincoatede mikropartikler (produkt nr.: ) (anvendes til Modular E170) Prøvemateriale - Plasma fra 2x Geriner bio-one, Vacuette LH lithium heparin. Ref nr (Liheparinglas) (til fremstilling af hæmolysat til hver af de to niveau) - Serum fra 2x8 Geriner bio-one, Vacuette Clot Activator with Gel Separator. Ref nr (serum gelglas) (i forvejen analyserede prøver for folat dagen for inden) Holdbarhedsforsøget - Utensilier til ca. 15 venepunktur der tages 8 gelglas pr. venepunktur. - Centrifuge (Ebbendorf og Hettich: 10 min g) ⁰C fryser Side 20 af 47

22 - Køleskab (2-8 ⁰C) - Prøvestativer - Engangspipetter - Automatpipetter + pipettespidser Plast glas med prop kopper (til Modular E170) - Folie (til mørkebelægning af prøver) - Papkasser: (til mørkebelægning af prøver) - Lys (almindeligt loftpære + indfaldslys fra vinduerne til belysning af prøver) Apparatur - Modular E170 Reagenser - Folat III fra Roche: pretreatment reagens 1, pretreatment reagens 2 og Streptavidincoatede mikropartikler (produktnr.: ) (anvendes til Modular E170) Prøvemateriale - Serum fra 8 Geriner bio-one, Vacuette Clot Activator with Gel Separator. Ref nr (serum gelglas) fra hver 15 raske personer 3.2 Metodedesign Velvidende, at folat-analysen hedder P-folat; Stofk. (3) og serum ikke findes i kroppen, anvendes termen serum (S-folat) om folatprøverne, eftersom folatkoncentrationen bestemmes på serum både i hæmolyseforsøget og holdbarhedesforsøget i dette professionsbachelorprojekt Hæmolyseforsøg Til udførelsen af hæmolyseforsøget anvendes vejledning fra bogen Interferographs: users guide to interferenscens in clinical chemistry instuments (6). Hæmolyseforsøget blev udført i to niveauer: Niveau 1: lav S-folatkoncentration (ca. 8,15 nmol/l) Niveau 2: høj S-folatkoncentration (ca.26,9 nmol/l), Side 21 af 47

23 Man kan ikke vide sig sikker på om hæmolysesgradens interferens stemmer overens i alle niveauer af folatkoncentrationer, og derfor blev hæmolyseforsøget undersøgt på to niveauer Fremstillingen af stamopløsning for hæmolysat Til fremstillingen af hæmolysat-stamoplysning blev der anvendt erytrocytter fra Liheparinglas - et Li-heparinglas til hvert niveau. Der var her opmærksomhed på, at folatkoncentrationen i Li-heparinglassene var cirka den samme som i de to niveauer, eftersom folat frigives fra erytrocytterne ved hæmolyse. Hvis man anvendte et hæmolysatstamopløsning med høj folatkoncentration til det lave niveau, ville folatværdierne blive falsk forhøjede. Til hæmolysat-stamopløsningen for niveau 1 blev anvendt et Liheparinglas fra en patient, hvis serum indgår i poolen til niveau 1. Til det høje niveau (niveau 2) var der ingen Li-heparinglas fra en patient hvis serum indgik i poolen for niveau 2, som kunne anvende til hæmolyat for niveau 2. Dermed blev der analyser plasma folat (P-folat) på fem tilfældige Li-heparinglas. Det Li-heparinglas hvis P-folatkoncentration kom tættes på koncentration af folat i niveau 2 blev anvendt som niveau 2 s hæmolysat. Erytrocytterne i Li-heparinglassene blev vasket med koldt fysiologisk saltvand, centrifugeret og dernæst blev supernantanten aspireret, for at fjerne overskydende plasma og buffycoat. Denne vaskeprocedure blev i alt gentaget fem gange for at få den reneste pellet af erytrocytter. Erytrocytterne blev hæmolyseret ved tilsætningen af destilleret vand, dette skyldes det osmotiske tryk i erytrocytterne, som herved stiger og springes. Der blev tilsat så meget destilleret vand, så hæmoglobinkoncentrationen blev fortyndet til omkring de 3 mmol/l i stedet for de oprindelige 12 mmol/l, som oplyst i Interferographs: user s guide to interferencens in clinical chemistry instruments (6). Dette er grundet i, at indlægssedlen for folat fra cobas oplyser, at der ingen hæmolyse må være ved analysering af folatprøver (4). Derfor undersøgte vi folatkoncentration ved lave hæmolyse-koncentrationer. Med henblik på at opnå en hæmoglobinkoncentration på de omkring 3 mmol/l, blev ABL 8000 Flex anvendt, eftersom en analyse kun tager få minutter. For at sikre, at alle erytrocytterne blev hæmolyseret, blev de to hæmolysatglas placeret i -80 ⁰C fryser, optøet og sat på frys igen. Side 22 af 47

24 Efter anden optøning blev hæmoglobinkoncentrationen kontrolleret på ABL igen for, at vi var sikre på, at de to hæmolysater var omkring 3 mmol/l. Til sidst blev hæmolysatglassene centrifugeret så eventuelle cellerester blev bundfældet Fremstilling af hæmolyse-opløsningerne Der blev fremstillet en serum-pool til hvert af de to niveauer. Hver serum-pool bestod af serum fra otte forskellige serum-gelglas, som var analyseret for S-folat dagen forinden. Herved var folatkoncentrationerne kendte og ud fra dette blev de to niveauer fremstillet, henholdsvis: Niveau 1: lav S-folatkoncentration (ca. 8,15 nmol/l) Niveau 2: høj S-folatkoncentration (ca.26,9 nmol/l) En fortyndingsrækkefølg af hæmolyse beståede af 7 opløsninger for hvert af de to niveauer blev fremstillet (se tabel 4): Tabel 4. Fortyndingsrækkefølge af hæmolyse-opløsningerne Teoriske Fortynding Navn Hæmoglobinkoncentration (µmol/l) H H x H150 H37,5 37,5 4x H150 H20 18,75 8x H150 H10 9,375 16x H150 H5 4, x H150 H0 0 Først blev 0-prøven (hæmoglobinkoncentration (H) = 0 µmol/l) for hver af de to niveauer fremstillet ved at blande 0,5 ml destilleret vand med 9,5 ml serum fra poolen til de to niveauer. 0-prøven blev anvendt som serum-stamopløsning til opløsningerne H75, H37,5, H20, H10, H5 og der blev afpipperet 1,0 ml fra serum-stamopløsningen (0-prøven) til hver af de 5 opløsninger. Side 23 af 47

25 Til fremstillingen af H150 i fortyndingsrækkefølgen til hvert af de to niveauer blev 0,1 ml fra hæmlysat-stamopløsningen afpippeteret og blandet godt med 1,9 ml fra serumpoolen. Dernæst blev 1,0 ml fra H150 afpippeteret til H75. 1,0 ml fra H75 blev afpippeteret til H37,5, og dette fortsætter således at 1,0 ml fra den forgående fortynding bliver afpippeteret over i det næste trin i fortyndingsrækken, ind til der blev afpippeteret 1,0 ml fra H10 til H5 (se figur 2). Figur 2. Hvordan hæmolysat overføres i fortyndingsrækkefølge. (Selvfremstillet i Paint) Side 24 af 47

26 De færdige hæmolyse-opløsninger af de 2 niveauer, så således ud: Billede 1. Niveau 1 (eget billede) Billede 2. Niveau 2 (eget billede) Hæmoglobinkoncentration i de syv opløsninger blev målt på Konelab Prime 30i med fotometrisk metode (23) for at få de aktuelle hæmoglobinkoncentrationer (se bilag 1). Dernæst blev S-folat målt på de syv opløsninger på Modular E170 for at undersøge de forskellige hæmolysegraders interferens på de to niveauer (se bilag 2). Efterfølgende blev hæmolyseresultaterne plottet ind i en lignende graf som figur 2 fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10) Holdbarhedsforsøg Til dette holdbarhedsforsøg af S-folat tages der udgangspunkt i artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10). Vi tog blodprøver fra 15 raske frivillige bioanalytikere, da vi ønskede flere forsøgspersoner i holdbarhedsforsøget end de 10 personer som var tilfældet i artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10). Grunden til, at vi valgt 15 forsøgspersoner var, at der var 21 folatprøver tilkoblet hver person, da vi undersøgte hver person for tre forhold, herunder tilknyttet syv tider, i alt 315 prøver (15x21). Såfremt vi inddrog flere end de 15 forsøgspersoner ville antallet af analyser tilsvarende overstige 315 prøver, hvilket ville gøre analyseringen væsentlig dyrere at udføre og samtidig vanskeligere at håndtere, da tiden er en væsentlig faktor i relation til dette holdbarhedsforsøg, da det oplyses i folat indlægssedlen for cobas (Roche Diagnostics), at folatprøver har en max. holdbarhed på to timer (4). På grund af det korte disponible tidsrum på to timer, hvor folatprøverne først skal henstå i 30 minutter, dernæst centrifugeres i 10 minutter før analysering, udføres holdbarhedsforsøget på raske personer. Hvis man anvendte patienter i stedet for raske personer, ville tiden til 0-prøven Side 25 af 47

27 blive længere end 0-prøven på de raske personer, da blodprøvetagning skulle foregå på Sygehus Thy-Mors sengeafdelinger. De 15 personers folatværdier blev ikke kontrolleret inden holdbarhedsforsøget blev sat i gang på baggrund af følgende: Når folat referenceintervallet ligger på > 6 nmol/l, ville der være variation af folatkoncentrationen ved de 15 forsøgspersoner, eftersom man skal ligge over de 6 nmol/l og også da den interindividuelle variation er med en CV % på 73 (22). Dermed er der sandsynlighed for at opnå et interval med stor værdivariation inden for folat-normalområdet. Folatkoncentrationen i blodet er afhængig af indtagelsen af føde og S-folat har dermed en intraindividuel variation CV % på 24 (22). Blodprøvetagning af 15 forsøgspersoner blev udført over to dage for at få tiden på 0- prøverne så lille så mulig. Der blev taget otte serum gel-prøveglas fra hver forsøgsperson, da der cirka er 1,5 serum pr. serum gel- prøveglas og der skulle anvendes 500 µl serum (200 µl til analyse på modular E170 plus spild) til hver af de 21 prøver. Serum og ikke Lithium-heparinplasma blev anvendt til dette holdbarhedsforsøg for folat, da det også er serum som KBA på Sygehus Thy-Mors anvender til koncentrationsbestemmelse af folat og Lithium-heparinplasma må ikke fryses ned (4). Efter blodprøvetagning blev tre af de otte serum-gelprøveglas fra hver forsøgsperson mørkelagt med folie. Prøverne henstod i 30 minutter (så blodet blev ordenligt koaguleret), hvorefter de blev centrifugeret i 10 minutter på 2500 g. Serum fra serum gel-prøveglassene blev afpippeteret til plastglas med prop, markeret med forhold og tid. Serum fra de tre mørkebelagte serum gel-prøveglas blev anvendt til forhold 2 (mørke, stuetemperatur (20-25 ⁰C), til tiderne: 0, 2, 4, 8, 24, 48 og 72 timer). 0-prøverne blev placeret i -80 ⁰C fryser efter, at prøvernes middelværdien var en time gammel. Her antog vi, at ingen ændring af S- folatkoncentration finder sted ved -80⁰C. De andre serumprøver stod under de tre forhold (se tabel 4), hvor de efterfølgende også blev placeres i -80 ⁰C fryser. Side 26 af 47

28 Tabel 4 Forhold 1 (lys, ⁰C til 0, 2, 4, 8, 24, 48 og 72 timer) 2( mørke, ⁰C til 0, 2, 4, 8, 24, 48 og 72 timer) 3(mørke, 2-8⁰C til 0, 2, 4, 8, 24, 48 og 72 timer) Definition Prøverne stod i et rum ved stuetemperatur, med store vinduer og med alm. rumlys tændt under hele forsøget. Prøverne stod i samme rum som forhold 1 og var placeret i en tætlukket kasse. Prøverne stod i en kasse i køleskabe på 2-8 ⁰C Vi ønskede at udføre holdbarhedsforsøget så virkelighedstro så muligt, så prøverne i forhold 1 og 2 blev anbragt i en rum, der ligner rummet med Modular E 170. Vi anbragte alle prøverne i -80 ⁰C fryser, så alle prøverne blev analyseret på samme dag, under samme kalibrering og godkendte kontroller for at undgå dag til dag variation (interindividuel variation). Prøverne blev taget ud af fryseren og blev tøet op i batches - 15 i hver. Prøverne blev udtaget efter de tre forhold, men med tilfældige tider og prøvenumre. Efter prøverne fra forhold 2 blev taget ud, stod prøverne til optøning under en tæt lukket kasse. Inden prøverne blev sat på Modular E 170 blev prøverne blandet godt og overført til kopper til Modular E 170 og kontrolleret for at prøverne ikke indeholdte bobler. Tiden der gik fra prøverne blev udtaget af den -80 ⁰C fryser til prøverne var på Modular E 170, var middelværdien 28 minutter (Bilag 3). Prøverne havde prop/låg på under hele holdbarhedsundersøgelsen, bortset fra når prøverne blev afpippeteret og når prøverne var sat på Modual E170. Resultaterne for de 3 forhold (bilag 4-6) blev indsamlet og blev plottet ind i en lignende graf som figur 2 fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10). Ud af x-aksen blev den sammenlagte tid anvendt, eksempelvis tiden 2 timer bliver til 2,47 timer, eftersom prøverne stod i de tre forhold i 2 timer og det tog 28 minutter fra prøverne Side 27 af 47

29 blev udtaget fra den -80 ⁰C fryser til prøverne var på Modular E 170 (se graferne 1-4 i resultatafsnittet) Etiske overvejelser Ved anvendelsen af blod fra raske, frivillige bioanalytikere på KBA, Sygehus Thy-Mors, blev en forespørgsel af patienter til brug af deres blod undgået. De frivillige bioanalytikere havde givet samtykke til brug af deres blod, ved selv at skrive sig på en seddel, som var hængt op på afdeling. På sedlen var der information om projektetet, hvor mange blodtagningsglas vi skulle anvende fra hver person og hvornår blodprøvetagningen vil blive foretaget. Der blev taget otte serum gel-prøveglas (8 3 ml = 24 ml) fra hver person. Dette kunne vi tillade os, da der ved en almindelig bloddonortapning tappes ca. en halv liter blod uden, at dette ville påvirker personen. På informationssedlen var angivet, at forsøget krævede syv prøveglas fra hver person, så de frivillige blev informeret om, at vi tog et ekstra glas (otte i alt) for at være sikker på at have tilstrækkelig prøvemateriale inden de blev stukket. De frivillige personer forblev anonyme, da deres navn ikke blev tilknyttet prøverne, men blot markeret med tal. Side 28 af 47

30 4 Resultater 4.1 Hæmolyseforsøget På graf 1 ses resultaterne af hæmolyseforsøget, præsenteret i lignende graf fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10) (se bilag 1-2 og 7). Graf 1 Folatkoncentrationsændring ved stigende grad af hæmolyse 250,00 200,00 % 150,00 100,00 Niveau 1: lav Niveau 2: høj 50,00 0, Aktuel hæmoglobinkoncentration (µmol /L) De blå cirkler markerer enkeltværdier i procent af udgangsværdien (0-prøven =100 %) for hvert af de to niveauer. De blå, horisontale linjer viser den tilladte TE % for S-folat (fra Westgards hjemmeside (22)). De røde, horisontale linjer viser den tilladte Bias % for S- folat (fra Westgards hjemmeside(22)). Side 29 af 47

31 4.2 Holdbarhedsforsøget Forhold 1 På graf 4 er resultatet for holdbarhedsforsøget for S-folat koncentration ved forhold 1. præsenteret i lignende graf fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10) (se bilag 4 og 8). Graf S-folat koncentrationsændring af forhold 1 lys, stuetemperatur (20-25⁰C) % Timer De blå cirkler markerer enkeltværdier i procent af udgangsværdien, som er sat til 100 %. De blå horisontale linjer viser den tilladte TE % for S-folat (fra Westgards hjemmeside(22)). Det midterste, lodrette, røde og korte linje er symbolet for middelværdien (i procent af udgangsværdien) hvor hvert tidspunkt, mens de to andre lodrette, røde og korte linjer, som omgiver middelværdien, afspejler den øvre og nedre grænse af 90 % konfidensintervallet. De røde, horisontale linjer viser den tilladte Bias % for S-folat (fra Westgards hjemmeside(22)). Side 30 af 47

32 4.2.2 Forhold 2 På graf 5 er resultatet for holdbarhedsforsøget for S-folat koncentration ved forhold 2, præsenteret i lignende graf fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10) (se bilag 5 og 9). Graf S-folat koncentrationsændring af forhold 2 mørke, stuetemperatur (20-25⁰C) % Timer De blå cirkler markerer enkeltværdier i procent af udgangsværdien, som er sat til 100 %. De blå horisontale linjer viser den tilladte TE % for S-folat (fra Westgards hjemmeside(22)). Det midterste, lodrette, røde og korte linje er symbolet for middelværdien (i procent af udgangsværdien) hvor hvert tidspunkt, mens de to andre lodrette, røde og korte linjer, som omgiver middelværdien, afspejler den øvre og nedre grænse af 90 % konfidensintervallet. De røde, horisontale linjer viser den tilladte Bias % for S-folat (fra Westgards hjemmeside(22)). Side 31 af 47

33 4.2.3 Forhold 3 På graf 4 er resultatet for holdbarhedsforsøget for S-folat koncentration ved forhold 3, præsenteret i lignende graf fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10). (se bilag 6 og 10). Graf 4 S-folat koncentrationsændring af forhold mørke, køl (2-8⁰C) % Timer De blå cirkler markerer enkeltværdier i procent af udgangsværdien, som er sat til 100 %. De blå horisontale linjer viser den tilladte TE % for S-folat (fra Westgards hjemmeside(22)). Det midterste, lodrette, røde og korte linje er symbolet for middelværdien (i procent af udgangsværdien) hvor hvert tidspunkt, mens de to andre lodrette, røde og korte linjer, som omgiver middelværdien, afspejler den øvre og nedre grænse af 90 % konfidensintervallet. De røde, horisontale linjer viser den tilladte Bias % for S-folat (fra Westgards hjemmeside(22)). Side 32 af 47

34 5 Diskussion 5.1 Hæmolyseforsøget De aktuelle S-folatværdier på H0 (0-prøve) er: Niveau 1: 7,07 nmol/l Niveau 2: 26,11 nmol/l Resultatvurdering af hæmolyseforsøget Ud fra graf 1 ses det, at folat-analysen på Modular E 170 med et ECL-assay er følsom over for hæmolyse, da folatkoncentrationen stiger i takt med mængden af hæmolyse ved begge niveauer. Det ses også, at ved en hæmolysegrad (hæmoglobinkoncentration) på 10 µmol/l er der ingen forskel på de to niveauers værdier og deres 0-prøve. Dermed er min opstillede hypotese til hæmolyseforsøget bekræftet. Ved en hæmoglobinkoncentration på 39 µmol/l overskrider niveau 1 den tilladte TE % s (39 %) øvre grænse, mens niveau 2 ligger inden for den tilladte Bias %, som er 19,2 %. Niveau 2 overskrider den øvre tilladte Bias %-grænse ved en hæmoglobinkoncentration på 74 µmol/l og den øvre tilladte TE % s-grænse ved 148 µmol/l. Det vil sige, at hæmolyseinterferensen er størst ved de lavere værdier af S-folatkoncentration. Det ses ud fra grafen, at niveau 2 fra en hæmoglobinkoncentration på 17 µmol/l til hæmoglobinkoncentration på 36 µmol/l ikke stiger som det ellers var forventet, men der imod falder lidt. Dette kan skyldes analysens usikkerhed (CV %). Spørgsmålet er, hvilket acceptkriterium (acceptgrænse) skal hæmolyseinterferens af S-folat have, før det bliver af klinisk betydning? I litteraturen findes der intet standardiseret acceptkriterium/grænse for hæmolyseinterferens generelt. Der findes mange måder at gribe dette an på ifølge Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (20). I interferogaphs: User s guide to interferences in clinical chemistry instruments (6) anvender de 10 % som acceptgrænse. At anvende 10 % som grænse til en vilkårlig analyse er ikke det bedste udgangspunkt, eftersom alle analyser har forskellige intra og interindividuelle variationer og dermed også forskellig tilladt Bias %. Hvis acceptgrænsen af interferens for S- thyroxin bindende globulin (TBG) er 10 %, er denne acceptgrænse større end den tilladte Bias % for TBG, som er på 0,0 % (22). Den tilladte Bias % for S-folat er på 19,2 %, som dermed Side 33 af 47

35 næsten er 20 gange så stor som TBG s tilladte Bias %. Derfor anvendes de 10 % ikke som acceptgrænse for hæmolyseinterferens for S-folat. Acceptgrænsen til hæmolyseinterferens skal være større end folat-analysens intermediær impræcision (analytiske variation, CV %) på Modular E170, eftersom det er analyseusikkerheden og har dermed intet at gøre med hæmolyseinterferencen. Hertil anvendes folat-analysens største CV %, som ligger på 9,1 % ved den laveste interne kontrolværdi. Dermed skal acceptgrænsen til hæmolyseinterferens ligge over 9,1 %, eftersom de 9,1 % ikke er et udryk for hæmolyseinterfererens i S-folatprøverne. Både den tilladte Bias % og den tilladte TE % for S-folat, som er angivet på graf 1, kan anvendes som acceptgrænse for hæmolyseinterferens af S-folat prøverne ifølge CLSI (20). Den tilladte TE % på 39 % kan anvendes som acceptgrænsen for S-folatprøver på baggrund af termens definition (se afsnittet databehandling), da vi kun har målt de to niveauers fortyndingsrækker en gang. Her er den analytiske variation medtaget i og med den tilladte CV% for S-folat indgår i den tilladte TE % s beregning for S-folat. Man kan også anvende den tilladte Bias % til acceptgrænse for hæmolyseinterferens af S- folat prøverne, eftersom det er oplyst i indlægssedlen for cobas (Roche Diagnostics), at der ingen hæmolyse må være i folatprøverne, og dermed kræver det en mere snæver acceptgrænse såsom den tilladte Bias %. Den tilladte TE % på 39 % er meget stor i forhold til, at der ingen hæmolyse må være. Jo mindre grænse jo større sikkerhed har man for, at måleværdierne er rigtige. Ud fra graf 1 ses det, at det er lige meget hvilken acceptgrænse man anvender (den tilladte Bias % eller tilladte TE %) for hæmoglobinkoncentrationen vil være på 20 µmol/l for begge niveauer, eftersom niveau 1 overskrider den tilladte Bias %-grænse og den tilladte TE %-grænse ved hæmoglobinkoncentrationen på 39 µmol/l. For niveau 2 er det anderledes, eftersom det overskrider den tilladte Bias %-grænse ved en hæmoglobinkoncentrationen på 74 mmol/l og den tilladte TE %-grænse ved en hæmoglobinkoncentrationen på 148 µmol/l. Den tilladte TE % bliver anvendt ved dette hæmolyseforsøg på bagrund af den tilladte TE% definition. Så man kan acceptere hæmolyseinterferens i S-folatprøver ved: Side 34 af 47

36 En hæmoglobinkoncentration på 20 µmol/l ved S-folatkoncentration omkring 7,07 nmol/l En hæmoglobinkoncentration på 148 µmol/l ved S-folatkoncentration omkring 26,11 nmol/l Siden man ikke kender folatkoncentrationen på de prøver, der skal folatanalyseres ved man heller ikke, hvilken hæmolysegrad (hæmoglobinkoncentration) man skal acceptere til hver prøve. Dermed anvendes den laveste hæmolysegrad. Hvis man ser på billederne af de færdige hæmolyse-opløsninger af de to niveauer i metodeafsnittet (billede 1 og 2), kan man visuelt se, at hæmolyse forekommer i opløsningerne H37,5 til H150 på begge niveauer. KBA på Sygehus Thy-Mors benyttede visuel vurdering til at afgøre, om der er hæmolyse i S-folatprøven (visuelle hæmolysevurdering) har dermed vist sig at være en god metode. Dette fordi man kan skelne mellem H20, som vi anvender til analyse af S-folat og H37,5, som vi ikke vil anvende til analyse af S-folat. Hvis KBA på Syghus Thy-Mors skulle foretage en koncentrationbestemmelse af hæmoglobin på hver folat-analyse for at undersøge om folatprøverne overskrider den tilladte hæmolysegrad, eftersom man ikke visuelt kan se den maksimale hæmolysegrad, ville selve folat-analysen blive væsentlig dyrere og mere omfattede. Dog er begge niveauers S-folatkoncentration i normalområdet, hvilket er > 6 nmol/l. Hvordan vil sammenhængen mellem hæmolyseinterferens være patologiske folatværdier? Tidligere i dette afsnit er nævnt, at hæmolyseinterferens er størst ved det lavere niveau. Dermed ville hæmolyse interfererer patologiske S-folatværdier mere end ved niveau 1 og disse værdier kunne muligvis overskride acceptgrænsen, den tilladte TE %, før niveau 1. Hvis man anvender niveau 1 s tilladte hæmolysegrad (hæmoglobinkoncentration µmol/l) for de patologiske S-folatværdier, vil de patologiske S-folatværdier få tildelt forhøjet værdier, som kan have klinisk betydning, hvor man fejldiagnosticere patienter og har antaget, at patienterne er raske, når patienterne i virkeligheden har folatmangel. Folatværdier der befinder sig > 6nmol/L, som bliver målt til en højre værdi (falsk forhøjet) på grund af hæmolyse, har ikke klinisk betydning, eftersom man ikke kan have forhøjede værdier ifølge referenceintervallet. Derfor bliver der ikke sat en præcis hæmolysegrad, herunder hæmoglobinkoncentration i µmol/l, til hvor meget hæmolyse der kan accepteres i S-folatprøver. Dermed vides det Side 35 af 47

37 ikke, om den visuelle hæmolysevurdering er en sikker metode, da man ikke kan se hæmolyse i H0 til H20 på begge niveauer på billederne af de færdige hæmolyseopløsninger (billede 1 og 2), hvis det er under disse hæmoglobinkoncentrationer, at den tilladte hæmolysegrad for S-folatprøver befinder sig. Dog kan det siges, ud fra de to niveauer som hæmolyseforsøget består af, at hæmolysegraden for S-folatprøver må være på en hæmoglobinkoncentration på 20 µmol/l og her kan den visuelle hæmolysevurdering anvendes Vurdering af metodedesign for hæmolyseforsøget Resultaterne for hæmolyseforsøget blev præsenteret i en lignende graf fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10), eftersom resultaterne for holdbarhedsforsøget for S-folatprøverne også blev præsenteret på denne måde. Graf 1 viser på en god, visuel og enkel måde effekten af hæmolyseinterferens af de to niveauer for S-folat ved at præsentere den procentvise stigning fra den oprindelige værdi (sat til 100 %), og giver mulighed for en god sammenligning af de to niveauer. Siden det kan blive af klinisk betydning ved de lave folatkoncentrationer, hvori der befinder sig hæmolyse, ville metodedesignet for hæmolyseforsøget være mere optimalt, hvis vi også havde et patologisk niveau, som var < 6 nmol/l. Dette var dog ikke muligt på forsøgstidspunkt, da der blev anvendt S-folatprøver til hæmolyseforsøget, som blev målt S- folat på dagen forinden, og alle prøver på nær en blev anvendt til fremstilling af de to niveauer (niveau 1 og 2). Dermed var der ikke prøver til yderligere at gennemføre et niveau mere. Desuden havde ingen af prøverne patologiske S-folatværdier, som var analyseret dagen før. Samtidig ville økonomien også havde spillet en rolle, da vi blandt andet yderligere skulle foretage flere folat-analyser hertil. Til hæmolyseforsøget blev der kun foretaget en S-folatanalyse af hver af de forskellige hæmolyse-opløsninger i de to niveauer. Hvis vi havde foretaget gentagende målinger (normalt 3 gentagende målinger) på de forskellige hæmolyse-opløsninger under repeterbarhedsbetingelser, der er beskrevet i CLSI s Document EP7-A2(20) og anvendt middelværdien for hver hæmolyse-opløsninger, ville vi have større tillid til resultatværdierne. Vi ville komme tættere på S-folatkoncetrationernes sande hæmolyseinterferens. Dermed ville vi måske have set den forventede stigning af niveau 2 fra en hæmoglobinkoncentration på 17 µmol/l til hæmoglobinkoncentration på 36 µmol/l. Side 36 af 47

38 Den tilladte Bias % ville dermed blive anvendt som acceptgrænsen til hæmolysesinterferens. Et forsøgsdesign med gentagende målinger af 3 niveauer ville dermed også være mere omfattede i og med, at det ville være dyrere at udføre, da der skal anvendes mere prøvemateriale, og der skal foretages flere analyser samt at det ville have taget længere tid at udføre. Hæmolyse-opløsninger i hæmolyseforsøget blev anbragt og analyseret på Modular E170 efter niveau og stigende hæmoglobinkoncentration (se bilag 2). Det ville have været mere optimalt, hvis hæmolyse-opløsningerne var anbragt på Modular E170 i tilfældig rækkefølge, eftersom vi ville undgå mulig afsmitning fra den en prøve til den næste prøve, der bliver analyseret, specielt ved skift fra det ene niveau til det andet, da man går fra den højeste hæmoglobinkoncentration i niveau 1 til den laveste hæmoglobinkoncentration i niveau 2(0-prøven). Denne mulige afsmitning kan forvirre fortolkningen af resultaterne. Dog ses det ud fra graf 1, at der ikke har været afsmitning eller at det ikke har været af betydning i dette hæmolyseforsøg, da de første tre resultatværdier for niveau 2 er tæt på at være identiske. 5.2 Holdbarhedsforsøget Under selve holdbarhedsforsøget mistede vi to S-folatprøver til forhold 1 (lys og stuetemperatur) til tiden 2,47 timer og 4,47 timer Resultatvurdering af holdbarhedsforsøget Resultaterne fra graf 2 tolkes således: S- folatprøverne er holdbare under forhold 1 (lys og stuetemperatur) indtil 48,47 timer, eftersom i dette tidsrum er både bias-kriteriet (90 % konfidensinterval med middelværdien overskrider ikke den tilladte Bias %-grænse) og TE-kriteriet (en enkelt målresultat over ikke den tilladte TE%-grænse) opfyldt, og ved 72,47 timer er hverken bias-kriteriet eller TE-kriteriet oplyst. Min opstillede hypotese for holdbarhedsforsøget blev dermed bekræftet. Ved tiden 48,47 timer ligger en enkelt måling meget tæt på den nedre tilladte TE%-grænse og ligger med en stor afstand fra alle andre 14 målinger, som ligger tæt omkring det 90 % konfidensinterval. Ved de andre tider ligger alle enkeltmålinger tæt på hinanden omkring det 90 % konfidensinterval. Dette skyldes næppe analyseusikkerheden alene. Det kan skyldes, at der har været bobler i prøven, så Side 37 af 47

39 modular E170 har afpippeteret en for lille mængde prøvemateriale, som medfører en lavere S-folatkoncentration (falsk nedsat). Ud fra graf 3 ses det, at S-folatprøverne er holdbare over de 72,47 timer under forhold 2 (mørke og stuetemperatur), eftersom både bias-kriteriet og TE-kriteriet er opfyldt ved alle tider i dette holdbarhedsforsøg. Der befinder sig en enkeltmåling, som ligger længere væk fra de andre enkeltmålinger ved tiden 8,47 timer, 48,47 timer og 72,47 timer. Disse enkeltmålinger stammer fra den sammen prøve. Prøven har den laveste S- folatkoncentration af prøverne medvirkende i holdbarhedsforsøget. Disse enkeltmålinger ligger således, fordi en procentvis ændring vil være relativt større, da der er tale om lave værdier. Derfor ligger enkeltmålingerne længere væk end de resterende enkeltmålinger. Forhold 1 og 2 er identiske bortset fra en faktor, som er lys. Ved sammenligning af graf 2 og 3 kan det konkluderes, at lys får S-folatkoncentrationen til at falde over tid. Ud fra graf 4 ses det, at S-folatprøverne er holdbare over de 72,47 timer under forhold 3, eftersom både bias-kriteriet og TE-kriteriet også er opfyldt ved alle tider i dette holdbarhedsforsøg. S-folatprøverne har en større holdbarhed ved forhold 3 end S- folatprøverne ved forhold 2, eftersom S-folatprøverne ved forhold 3 ligger tæt på 90 % konfidensinterval og ikke overskrider den tilladte bias-grænse. Efter forsøgets udførelse blev Roche kontaktet vedrørende deres oplysning om folatprøvers holdbarhed. De oplyste, at S-folat og P-folatprøver er holdbare i 2 timer på grund af mulig fordampning fra prøver/kontroller/kalibratorer på instrumenter. S-folat og P-folatprøver er holdbare i 4 timer ved stuetemperatur, når proppen ikke er taget af (24). Side 38 af 47

40 Tabel 5. Samlede resultat af holdbarholdsforsøg og opbevaringsforhold, som er oplyst i Indlægssedlen fra cobas (Roche Diagnostics) samt oplysninger i KBA Sygehus Thy-Mors P-folat; stofk. foreskrift. Temperatur forhold Vores fund Indlægssedlen fra C 48,47 timer ubeskyttet mod lys (~2 døgn) >72,47 timer beskyttet mod lys (~ >3 døgn) 2-8 C >72,47 timer beskyttet mod lys (~ >3 døgn) cobas Diagnostics) 2 timer (4 timer) (opbevares mod lys) 48 timer (opbevares mod lys) (Roche beskyttet beskyttet KBA Sygehus Thy-Mors P-folat; stofk. 1 døgn (bør opbevares beskyttet mod lys) 1 døgn (bør opbevares beskyttet mod lys) Ud fra tabel 5 ses, at S-folat prøver har større holdbarhed under de forskellige betingelser end Roche har oplyst. Dette gælder også information om, at S-folatprøverne er holdbare i 4 timer ved stuetemperatur, når proppen ikke er taget af. Dette var overraskende resultater for mig, siden Roche oplyser de 2 timers holdbarhed, hvilket ikke er lang tid, og på baggrund af, at Greiner Vacuette oplyser, at visse analyser på serumgelglas har en holdbarhed på op til 2 døgn (25). Selv om der er anført, at prøven bør opbevares beskyttet mod lys i forskriften for P-folat; Stofk. for KBA Sygehus Thy-Mors, beskytter de ikke S-folatprøver mod lys. Hvilket reelt heller ikke har nogen betydning, set ud fra vores gennemførte holdbarhedsforsøg, hvor prøver må befinde sig i lys og i stuetemperatur i 2 døgn. Generelt ses det ud fra vores resultater fra holdbarhedsforsøget, at råderummet er væsentlig større end antaget ved alle de tre opbevaringsforhold, som blev undersøgt. Derfor kan man reelt godt ajourføre forskriften P-folat; stofk. Omvendt er der ikke så mange S-folatprøver, der skal analyseres på KBA Sygehus Thy-Mors, så alle bliver analyseret inden for et døgn. Side 39 af 47

41 5.2.2 Vurdering af metodedesign for holdbarhedsforsøget Der befinder sig mange måder at udføre et holdbarhedsforsøg på, eftersom der ikke findes en korrekt måde at udføre det på. Nogle hævder, at før et prøvemateriale kan betragtes som holdbart, skal gennemsnitsværdien af analytkoncentrationen i et givet antal patientprøver, hvor der opstilles det krav om at gennemsnitsværdien, befinde sig inden for en givet afvigelse fra middelværdiens udgangsværdi, som også er kaldt clinically acceptable limit (10). Andre anvender den tilladte TE %, eller ± 1 analytisk standardafvigelse (SD) som acceptkriterium og siger, at middelværdien skal ligge inden for dette acceptkriterium før prøvematerialet kan kaldes for holdbart. På bioanalytikeruddannelse anvendes blandt andet variansanalysen. Til dette holdbarhedsforsøg kunne vi have foretaget en to-faktors variansanalyse uden gentagelser (1 faktor: tid og 2 faktor: 15 forskellige prøver) ud fra vores resultater. Ved en variansanalyse sammenlignes variationen mellem middelværdier med variationen inden for hver tid. Er der forskel mellem tidernes middelværdier, vil variationen mellem middelværdierne være for stor i forhold til variationen inden for tiderne (19). Ved udførelse af variansanalyses opstilles først de to hypoteser(19): H 0 : Der er ingen signifikant forskel H 1 : Der er signifikant forskel Teststørrelsen som er F beregnes og hvis F er > end F tabel (værdi som er oplyst i F-tabellen) forkastes H 0 og der er signifikant forskel på tider (19). Ligesom i hæmolyseforsøget ville det være mere optimalt at udføre gentagende målinger for at opnå det mere præcise resultat. Der anvendes således en to-faktors variansanalyse med gentagelser. Selv om en to-faktors variansanalyse med gentagelser er bedre at anvende i forhold til en to-faktors variansanalyse uden gentagelser, ville det være et praktisk problem af udføre. Der skal meget mere prøvemateriale til, det bliver vanskeligere at håndtere og tiden for udførelsen af forsøget bliver længere og rent økonomisk vil det blive meget dyrere. Ulempen ved variansanalyser er, at de ikke fortæller til hvilken tid den signifikante forskel befinder sig og selv om der er signifikant forskel for tiderne for S-folat, er det ikke ensbetydende med, at det er af klinisk betydning. Selve variansanalysen opgiver kun tal, Side 40 af 47

42 som det kan være svært at danne sig et overblik over. Her er en grafisk afbildning af resultater at foretrække. Den nye holdbarhedsmetode som er præsenteret i artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10) og som vi har anvendt til vores hæmolyse- og holdbarhedsforsøg, er en overskuelig graf, selv om man får mange informationer om enkeltmålinger, middelværdier med tilknyttet 90 % konfidensinterval osv. Med denne form for graf skal man ikke til at lave beregninger, som det er tilfældet i variansanalyse og man er ikke i tvivl om til hvilken tid S-folatprøver under de forskellige opbevaringsforhold er holdbar til, da det tydeligt ses, når det 90 % konfidensinterval overskrider den tilladte Bias %-grænse eller/og når en enkeltmåling overskrider den tilladte TE %-grænse. Vi formåede at få vores tiden 0 (den mindste tid en prøve kan have fra den er taget, til den er på analyseudstyret) til at blive 1,47 timer, som er mindre end Arne Åsberg, et al. Formåede i Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10) eftersom deres tiden 0 var 2 timer. Arne Åsberg, et al har opstillet to grænser til holdbarheden af et givet prøvemateriale som skal accepteres, før man kan tage stilling til om prøvematerialet er holdbart, hvor andre kun har opstillet en grænse. Og dermed stiller Arne Åsberg, et al. større krav til prøvemateriales holdbarhed. Arne Åsberg, et al. har en tilknyttet usikkerhed på middelværdien i form af de 90 % konfidensinterval og dermed behøves der ikke gentagende målinger, eftersom der er 95 % sandsynlighed for, at middelværdier befinder sig inden for dette konfidensinterval. Der er tale om 95 % sandsynlighed for, at middelværdier befindes sig inden for det 90 % konfidensinterval, når den øvre eller nedre grænse af det 90 % konfidensinterval ligger på selve den tilladte Bias % s øvre eller nedre grænse. Dermed er der 95 % sandsynlighed for, at middelværdien ligger inden for den tilladte Bias % grænse og 5 % sandsynlighed for, at den ligger uden for den tilladte Bias % grænse. Med grafen fra artiklen Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger (10) tager Arne Åsberg, et al. hensyn til, hvad der er af klinisk betydning på baggrund af deres opstillede krav og ikke om der er statistisk signifikant forskel. Dermed anser jeg denne grafiske visning for et godt standpunkt vedrørende holdbarhedsforsøg. Ulempen ved denne graf er, at man ikke kan, hvilken enkeltpunkter der hører til hvilken prøve. En mulighed Side 41 af 47

43 kunne være at tilknytte en farve til hver prøve omvendt kunne dette forvirre enkeltbilledet af grafen. Der skal tages hensyn til, at holdbarhedsforsøget blev foretaget midt i oktober måned. Hvis holdbarhedsforsøget derimod blev foretaget om sommeren, hvor der er høj sol, ville folatprøverne blive udsat for solstråler fra vinduerne og dermed ville S-folatværdier under forhold 1 måske se anderledes ud. I indlægsseddel fra cobas (Roche Diagnostics) er der oplyst Kontroller for de forskellige koncentrationsniveauer bør køres individuelt mindst én gang i døgnet, når testen er i brug, én gang pr. reagenskit og efter hver kalibrering (4). Det kunne have været en godt ide at køre kontroller efter analysering af de 213 (315- de to prøver vi mistede) S-folatprøver, også efter, at der ikke blev skiftet reagenskit og alle analyser var inden for den samme kalibrering. Normalt gennemføres der ikke så mange analyser på et døgn, som den dag, vi gennemførte vores holdbarhedsforsøg. Hvis vi målte kontrollerne, og de ikke var tilfredsstillende og analysen dermed var skredet, ville dette være en væsentlig fejlkilde til vores resultater. 5.3 Sammenligning af hæmolyse-og holdbarhedsforsøgets resultater Når man sammenligner resultaterne fra hæmolyse-og holdbarhedsforsøget ses det, at hæmolyse påvirker S-folatkoncentration mere end lys. Det er hæmolyse man skal være mest opmærksom på ved analysering af S-folatprøver. Ved hæmolyse stiger S-folat værdierne og når S-folatprøver bliver udsat for lys over tid falder S-folatkoncentration. Dermed har hæmolyse størst klinisk betydning, eftersom det er værre at fejldiagnostikere en patient med falsk forhøjet folatværdier end falsk nedsatte folatværdier. Hvis en patient får falsk nedsat folatværdier og bliver diagnosticeret til at have folatmangel, ville patienten ikke tage skade af at tage folattilskud eller får at vide, at vedkommende skal spise sundere og burde indtage mere flerbladede grønsager i sin diæt, eftersom man ikke kan have en forhøjet folatværdi i følge referenceområder. Hvis en patient derimod får diagnosticeret en normal folatværdi på grund af falsk forhøjet værdi, som hæmolyse kan forårsage og dermed i virkeligheden har folatmangel, vil patienten ikke komme i behandling med folattilskud og vil udvikle makrocytær anæmi. Side 42 af 47

44 Som tidligere nævnt er der ingen krav om, at folat-analysen skal foretages på fastende patienter, hvilket kan virke mærkelig, eftersom P-folat-analysen er et udtryk for folatstatus ved nylig folatindtag (14). Rent statistisk er det bedst, at folat-analysen foretages på fastende patienter, når man skal til at sammenligne resultater, og man risikerer dermed ikke at fejldiagnosticere. I MedlemsNyt fra Dansk Selskab for Klinisk Biokemi (DSKB) skriver Anne-Mette Hvas og Ebba Nexø fra KBA Aarhus Sygehus, at de undlader at anvende fastende prøver til P-folat-analysen, eftersom der ikke var signifikant forskel på fastende prøver og ikke-fastende prøver. De så, at ulempen er størst, hvis S-folat-analysen skulle foretages på fastende patienter (26). Side 43 af 47

45 6 Konklusion Ud fra resultaterne i hæmolyse- og holdbarhedsforsøget ses det, at hæmolyse har størst indvirkning på S-folatkoncentrationen. Der kan ikke sættes en præcis hæmolysegrad på, hvor meget hæmolyse, der må være i S-folatprøver, eftersom der ikke indgik et patologisk niveau af folat i hæmolyseforsøget. Dertil vides det ikke om den visuelle hæmolysevurdering af S-folatprøverne, som udføres på KBA Sygehus Thy-Mors er tilstrækkelig. Holdbarheden af S-folatprøver er væsentlig større end antaget ved alle tre undersøgte opbevaringsforhold. 7 Perspektivering Som tidligere sagt påvirker hæmolyse S-folatkoncentration, da S-folatkoncentrationen stiger med mængden af hæmolyse, da erytrocytterne lyseres, og folatindholdet frigives fra erytrocytterne. Det vides, at efter centrifugering af et serumglas uden seperationsgel, vil der over tid sive folat fra erytrocytterne op i serum, som ikke er synligt. Det ville derfor være interessant at undersøge, hvor stor indflydelse gel-separatoren har i serumgelglassene. Der iværksættes snart en ny transportordning i Region Nordjylland, hvor prøver fra praktiserende læger bliver hentet uden, at prøverne er centrifugeret forinden. Centrifugeringen af prøver vil dermed først ske ved ankomst til laboratoriet. Dette tiltag er udtænkt for at nedbringe omkostningerne. Det kunne være interessant at undersøge, hvilket glas (Li-haparin glas eller serumglas med og uden separationsgel), der kan være mest optimalt at anvende ved denne transportordning til afhentning af folatprøver. Den kompetitive ECL-assay har mange steder erstattet anvendelsen af mikrobiologiske assays til koncentrationsbestemmelse af folat, som er blevet anvendt i over 50 år. Grunden til dette er primært, fordi den kompetitive ECL-assays er let at udføre på grund af dens kommercielle kit form og analysevarigheden er kortere. ECL-assayet måler på plasma eller serum folat monoglutaminer, hvor hovedparten findes i folatformen 5-methyl-THF (1). I de seneste år har viden om de forskellige individuelle folatformer i individet steget. Den seneste udvikling om massespektrometri kan imødekomme denne interesse om de individuelle folatformer. Ved hjælp af HPLC-separation kan massespektrometri metoden separerer de individuelle folatformer uden at manipulere nogle af folatformerne. Massespektrometri metoden er dog ikke valideret endnu til anvendelse af Side 44 af 47

46 koncentrationsbestemmelse af folat (14). Det vil være interessant at se, om massespektrometri vil erstatte den kompetitive ECL-assay til koncentrationsbestemmelse af folat. Side 45 af 47

47 8 Referenceliste (1) Lyngbye J, et al. Lyngbye Laboratoriemedicin. 2nd ed. København: Nyt nordisk forslag Arnold busck; (2) B. Schaffalizky De Muckadell, Ove, et al. Medicinsk kompendium bind 2. 17th ed.: NYT NORDISK FORLAG ARNOLD BUSCK A/S; (3) B. Jensen O. P-Folat; stofk. Klinsik Biokemisk Afdeling, Sygehus Thy-Mors (version folat-003). Findes som bilag (bilag 11) (4) cobas (Roche Diagnostics). Folat III. Indlægssedlen for Folat (version 9,dansk). Findes som bilag (bilag 12) (5) Hospitalsenheden Vests laboratoriehåndbog P-folat. Available at: Accessed 10/29/2012, (6) R. Glick M, W. Ryder K, J. Glick S. Interferographs: user s guide to interferencens in clinical chemistry instruments. 2nd ed.: Science Enterprises, Inc; (7) Vitamins, Minerals and Supplements. The medical biochemistry page - oplysninger om vitaminer. Available at: Accessed 10/29/2012, (8) Zemlin AE, Essack Y, Rensburg M, Keller T, Brinkmann T. Stability of red blood cell folate in whole blood and haemolysate. Clin Lab 2010;56(9-10): (9) Blencowe H, Cousens S, Modell B, Lawn J. Folic acid to reduce neonatal mortality from neural tube disorders. Int J Epidemiol 2010 Apr;39 Suppl 1:i (10) Åsberg A, et al. Prøvematerialets holdbarhet kriterier og vurderinger. Klinisk Biokemi i Norden 2011;23( ): (11) ISO Guide 30. Terms and definitions used in connection with reference materials. Geneva: International Organization for Standardization 1992(2). (12) Wynn T, Hoffrogge Z. Vitamins: therapy or hype. Int J Pharm Compd 2012 Jan- Feb;16(1): (13) Folic Acid Metabolism: A Role in Cancer's Cause and Cure BioFiles Volume 5 Number 6 - Cancer Sigma-Aldrich. Anvendt figur til figur 1. Available at: Accessed 12/14/2012, (14) Shane B. Folate status assessment history: implications for measurement of biomarkers in NHANES. Am J Clin Nutr 2011 Jul;94(1):337S-342S. Side 46 af 47

48 (15) Phekoo K, Williams Y, Schey SA, Andrews VE, Dudley JM, Hoffbrand AV. Folate assays: serum or red cell?. J R Coll Physicians Lond 1997 May-Jun;31(3): (16) Thompson I, McGiven J, Sawyer J, Thirlwall R, Commander N, Stack J. Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains. Clin Vaccine Immunol 2009 May;16(5): (17) Wellstat Diagnostics, LLC Company Information. Anvendt figur til figur 2. Available at: Accessed 11/14/2012, (18) Mathew BC, Biju RS, Thapalia N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu Univ Med J (KUMJ) 2005 Jan- Mar;3(1): (19) Noter i statistik for bioanalytikere. Available at: Accessed 11/28/2012, (20) J. McEnroe R, et al. Document EP7-A2 Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guideline-Second Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) november 2005;25(27). (21) Nybo M, R. Nielsen H, B. Hansen A. Kliniske konsekvenser ved hæmolyserede blodprøver?. Uge skrift for læger 14 august 2006(168/33). (22) Desirable Biological Variation Database specifications - Westgard QC. Anvendt oplysninger og S-folats biologiske variationer, ønskede tilladte Bias % og TE %. Available at: Accessed 11/6/2012, (23) B.Jensen O, Nielsen M. P-Hæmoglobin(fe); stofk. "Frit hæmoglobin". Klinisk Biokemisk Afdeling, Syghus Thy-Mors 8/ (24) Produktspecialist Henriette Kronow fra Roche Diagnostics A/S Centralized Diagnostics. (25) Greiner Vacuette & Monoject Blood Collection Tubes. Oplysninger om prøvetagningsglassene, som KBA Sygehus Thy-Mors anvender. Available at: Accessed 11/28/2012, (26) Hvas A, Nexø E. I Århus Amt analyserer vi P-Folater i stedet for Ery-Folater. MedlemsNyt, DSKB 2004(5). Side 47 af 47