COBAS TaqMan MTB Test

COBAS TaqMan MTB Test TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. COBAS TaqMan MTB Test CTM MTB 48 Tests P/N: 04803531 190 AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit RSP PREP 100 Tests P/N: 20756903 122 ART: 07 5690 3 US: 83267 TILSIGTET BRUG COBAS TaqMan MTB-testen er en in vitro-nukleinsyreamplifikationstest til kvalitativ bestemmelse af Mycobacteria tuberculosis (MTB)-komplex DNA i opløste, dekontaminerede og koncentrerede humane luftvejsprøver, herunder sputum og BAL (bronkoalveolær lavage). Testen anvender AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit til manuel prøveforberedelse og COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet til automatisk amplifikation og detektion. OVERSIGT OVER OG FORKLARING AF TESTEN Medlemmer af slægten Mykobakterier er syrefaste, ikke-motile, stavformede, aerobe bakterier, der ikke danner sporer. De indeholder flere arter, der er sygdomsfremkaldende for mennesker. Mange mykobakterielle arter er jord- og vandsaprofytter. De primære humane patogener er arter af M. tuberculosis-komplekset (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum og M. microti) og M. leprae. M. tuberculosis er det vigtigste mykobakterielle patogen og findes kun hos mennesker. Tuberkulose (TB) er en smitsom sygdom. Den spredes igennem luften som en almindelig forkølelse. Det er kun mennesker, der er syge med TB i lungerne, som er smitsomme. Når smittede personer hoster, nyser, taler eller spytter, udsendes TB-bakterier i luften. En person behøver kun at inhalere et lille antal af disse for at blive smittet. På verdensplan er en tredjedel af jordens befolkning aktuelt smittet med TB-bakerien. Af de personer, der smittes med TB-bacillen, bliver 5-10% syge eller smitsomme i løbet af deres liv. Det anslås, at TB resulterede i 1,7 millioner dødsfald i 2004. Som i andre sygdomstilfælde er der flest anslåede døde i det sydøstlige Asien, men den højeste dødelighed pr. person er i Afrika, hvor HIV har medført en hurtig spredning af TB og forøget risikoen for at dø af TB. WHO s mål, som blev stadfæstet ved World Health Assembly i 1991, er at detektere 70% af nye smitsomme tilfælde med TB samt at kurere 85% af disse i 2005. 18 lande havde allerede opnået disse mål i 2002 1-5. På grund af risikoen for spredning af sygdommen, den potentielle mulighed for forekomsten af stammer, der er resistente over for medicin og alvorligheden af sygdommen hos patienter, der er smittet med HIV-1, er en hurtig diagnose af M. tuberculosis-komplekset særdeles vigtig. Isolationen af en organisme fra M. tuberculosis-komplekset er nødvendig for med sikkerhed at kunne diagnosticere tuberkulose. Rutinedyrkninger er tidskrævende og kan tage op til otte uger. Mikroskopisk undersøgelse af syrefaste udstrygninger er den hurtigste metode til påvisning af mykobakterier, men den er ikke-følsom og non-specifik. De immunologiske og serologiske metoder er begrænsede, hovedsageligt på grund af ringe sensitivitet og/eller specificitet 6,7. Det er påvist, at udviklingen af PCR-baserede tests, der er specifikke for mykobakterier, har gjort det endnu hurtigere at diagnosticere tuberkulose ved at give mulighed for direkte påvisning af mykobakterier i kliniske prøver 8-14. PRINCIPPER FOR PROCEDUREN COBAS TaqMan MTB-testen er baseret på to hovedprocesser: (1) Manuel prøveforberedelse for at opnå MTB DNA. (2) Samtidig PCR-amplifikation af target-dna ved hjælp af komplementære primere og detektion af target-dna via spaltning af dobbeltfluorescerende, farvemærkede oligonukleotide prober 15,16. Sammen muliggør disse processer detektion af amplificeret MTB-target (amplikon) og Mycobacterium-intern kontrol-dna, som amplificeres og detekteres samtidigt med prøven. Master Mix-reagenset indeholder et primerpar, der bruges til at amplificere en genspecifik region på kromosomet, og specificiteten for M. tuberculosis-komplekset (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum og M. microti) opnås ved hjælp af en dobbeltmærket target-detektionsprobe. Det samme primerpar bruges til at amplificere det interne kontrol-dna. Detektionen af amplificeret DNA udføres ved hjælp af targetspecifikke og intern kontrol-specifikke dobbeltmærkede oligonukleotide prober, der tillader en uafhængig identifikation af MTB-amplikonet og Mycobacterium-intern kontrol-amplikonet. 1

Forberedelse af prøver NALC/NaOH 17 opløste, dekontaminerede sputum- og BAL-prøver vaskes med en vaskeopløsning til luftvejsprøver. Organismerne lyseres ved inkubation i Respiratory Specimen Lysis Reagent (lysisreagens til luftvejsprøven), og prøven forberedes til amplifikation ved tilsætning af luftvejsprøveneutraliseringsreagens. PCR-amplifikation Valg af target Mycobacterium-genomet indeholder et område på ca. 1.500 nukleotider, der koder for genet 16S rrna. COBAS TaqMan MTB-testen benytter Mycobacterium-genspecifikke primere til at definere en sekvens i dette område 18. Targetamplifikation PCR-amplifikationen foregår i K-tubes eller K-trays, hvor behandlede prøver tilsættes til amplifikationsblandingen. Reaktionsblandingen tempereres for at denaturere det dobbeltstrengede DNA og blotlægge primerens targetsekvenser. Når blandingen afkøler, binder primerne sig til targetsekvenserne. Ved tilstedeværelsen af Mg 2+ og overskydende dntp er forlænges Z05 DNA-polymerase i de bundne primeres 5'-3'-retning langs targetskabelonerne og producerer et dobbeltstrenget DNA-molekyle, kaldet et amplikon. COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet gentager automatisk denne proces et bestemt antal gange, hvor mængden af amplikon-dna fordobles for hver cyklus. Det påkrævede antal cyklusser er forprogrammeret i COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet. Amplifikationen foregår kun i området mellem primerne på MTBgenomet. Hele MTB-genomet amplificeres ikke. Intern kontrol-amplifikation I enzymbaserede amplifikationsprocesser, f.eks. PCR, kan effektiviteten reduceres af de hæmmere, der kan være til stede i den kliniske prøve. Den interne kontrol gør det muligt at identificere behandlede prøver, der indeholder stoffer, som kan give interferens med PCR-amplifikationen. Den interne kontrol for Mycobacterium er et ikke-smitsomt, rekombinant DNA-plasmid med primerbindingsområder, der er identiske med dem i M. tuberculosis-targetsekvensen, en randomiseret intern sekvens, der har samme længde og basesammensætning som M. tuberculosis-targetsekvensen, samt et unikt probebindingsområde, der adskiller Mycobacterium-intern kontrol-amplikonet fra targetamplikonet. Disse funktioner er valgt for at sikre en ensartet amplifikation af Mycobacterium-intern kontrol- og M. tuberculosis-target-dna et. Reagenset til den interne kontrol for Mycobacterium medfølger i COBAS TaqMan MTB-testen og tilsættes til hver enkelt amplifikationsreaktion, som co-amplificeres med MTB DNA fra den kliniske prøve. Den interne kontrol for Mycobacterium er udviklet med henblik på at sikre identifikation af prøver, der indeholder inhibitorer, som pårvirker amplifikationen og detektionen af MTB-targetsekvensen. Selektiv amplifikation Selektiv amplifikation af target-nukleinsyren fra prøven opnås i COBAS TaqMan MTB-testen ved hjælp af AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzymet 19 og deoxyuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet genkender og katalyserer nedbrydningen af DNA-strenge, der indeholder deoxyuridin, men ikke DNA, der indeholder deoxythymidin. Deoxyuridin findes ikke i naturligt forekommende DNA, men findes altid i amplikon som følge af brugen af deoxyuridintrifosfat som et af dntp erne i Master Mix-reagenset. Det er derfor kun amplikonet, der indeholder deoxyuridin. Deoxyuridin gør kontaminerende amplikon modtagelig for nedbrydning med AmpErase-enzym før amplifikationen af target-dna et. Ethvert ikke-specifikt produkt, der dannes efter den første aktivering af Master Mix ved hjælp af magnesium, ødelægges af AmpErase-enzymet. AmpEraseenzymet, der findes i Master Mix-reagenset, katalyserer spaltningen af deoxyuridinholdigt DNA ved deoxyuridin-residues ved at åbne deoxyribosekæden ved positionen C1. Ved opvarmning i den første termiske cyklus ved den alkaliske ph i Master Mix brækker amplikonets DNA-kæde ved positionen for deoxyuridin, og dermed kan DNA et ikke amplificeres. AmpErase-enzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 C, dvs. i de termiske cyklusser, og derfor ødelægges det target-amplikon, der dannes under amplifikationen, ikke. Detektion af PCR-produkter i en COBAS TaqMan -test COBAS TaqMan MTB-testen benytter real-time PCR-teknologi. Anvendelsen af dobbeltfluorescerende prober gør det muligt af foretage real-time detektion af PCR-produktopbygningen ved at monitorere emissionsintensiteten i de fluorescerende rapportfarvestoffer, der frigives under amplifikationen. Proberne består af MTB- og Mycobacterium-intern kontrol-specifikke oligonukleotider, der er mærket med et rapportfarvestof og et quencher-farvestof. I COBAS TaqMan MTB-testen mærkes MTB- og Mycobacterium-intern kontrol-proberne med forskellige fluorescerende rapportfarvestoffer. Når de dobbeltfluorescerende, farvemærkede prober er intakte, reduceres rapportfluorescensen af den tætte afstand til quencherfarvestoffet på grund af Förster-energioverførselseffekten. Under PCR-reaktionen hybridiseres proben til en targetsekvens og spaltes af 5'-3'-exonukleaseaktiviteten i den termostabile Z05 DNA-polymerase. Når rapport- og quencherfarvestofferne frigives og separeres, stopper quenchingeffekten, og rapportfarvestoffets fluorescensaktivitet øges. Amplifikationen af MTB DNA og Mycobacteriumintern kontrol-dna måles uafhængigt ved forskellige bølgelængder. Denne proces gentages et bestemt antal gange, og hver cyklus øger effektivt emissionsintensiteten i det individuelle rapportfarvestof, hvilket giver mulighed for en uafhængig identifikation af MTB DNA et og intern kontrol-dna et. 2

REAGENSER AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit RSP PREP AMPLICOR luftvejsprøveforberedelseskit (P/N: 20756903 122. ART: 07 5690 3. US: 83267) RW (vaskeopløsning til luftvejsprøve) Tris-HCl buffer < 1% emulgator EDTA 0,05% natriumazid RL (lysisreagens til luftvejsprøve) 0,2% natriumhydroxid < 1% emulgator EDTA 0,05% natriumazid RN (luftvejsprøveneutraliseringsreagens) Tris-HCl buffer Magnesiumklorid 0,05% natriumazid COBAS TaqMan MTB Test CTM MTB (P/N: 04803531 190) Kontrolreagenser MYCO IC (Mycobacterium-intern kontrol) Tris-HCl-buffer < 0,001% ikke-smitsomt plasmid-dna (mikrobielt) indeholdende Mycobacterium-primerbindingssekvenser og et unikt probebindingsområde < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA Amaranth-farve 0,05% natriumazid MTB (+) C [M. tuberculosis-positiv kontrol] Tris-HCl-buffer < 0,001% ikke-smitsomt plasmid-dna (mikrobielt) indeholdende MTB-sekvenser < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid MYCO ( ) C [Mycobacterium-negativ kontrol] Tris-HCl-buffer < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid 100 test 2 x 25 ml 3 x 6 ml 2 x 5 ml 48 test 4 x 0,1 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 3

Amplifikations- og detektionsreagenser MTB MMX (COBAS TaqMan MTB Master Mix) 4 x 12 test Tricinbuffer 4 x 0,46 ml Kaliumacetat Kaliumhydroxid Dimethylsulfoxid Glycerol < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001% MTB-primere < 0,001% fluorescensmærkede oligonukleotide prober, der er specifikke for MTB og Mycobacterium-intern kontrol < 0,001% oligonukleotid aptamer < 0,05% Z05 DNA-polymerase (mikrobiel) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym (mikrobielt) 0,09% natriumazid MYCO Mg 2+ (Mycobacterium-magnesiumreagens) 4 x 12 test < 1,0% magnesiumacetat 4 x 0,2 ml 0,09% natriumazid ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. B. Denne test er kun til brug med sputum eller BAL, der er opløst, dekontamineret og koncentreret ved hjælp af NALC-NaOH 17 -metoder. C. Brug ikke mundpipette. D. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. Anvend engangsbeskyttelseshandsker, særligt arbejdstøj og beskyttelsesbriller ved håndtering af prøver og reagenser. Vask hænderne grundigt efter at have håndteret prøver og testreagenser. E. Undgå bakteriekontaminering af reagenser, når der fjernes afmålte mængder fra reagensflaskerne. F. Det anbefales at bruge sterile engangspipetter og pipettespidser. G. Reagenser fra forskellige lotnumre eller fra forskellige flasker fra det samme lotnummer må ikke blandes. H. Reagenser fra forskellige kit må ikke blandes. I. Reagenser, affald og prøver skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. J. Brug ikke et kit efter udløbsdatoen. K. Der kan rekvireres leverandørbrugsanvisninger (MSDS) hos Roche. L. Prøver og kontroller skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 og CLSI-dokument M29-A3 21. Rengør og desinficer alle arbejdsflader grundigt med en nyfremstillet 0,5% opløsning af natriumhypoklorit i deioniseret eller destilleret vand. Bemærk! Almindeligt tilgængeligt flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natriumhypoklorit med en koncentration på 5,25%. En 1:10 fortynding af blegemidlet giver en 0,5% opløsning af natriumhypoklorit. M. RW, RL, RN, MTB MMX, MYCO Mg 2+, MYCO IC, MTB (+) C og MYCO ( ) C indeholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Når natriumazidholdige opløsninger hældes ud i laboratorievasken, skal afløbet skylles med store mængder vand for at undgå ophobning af azider. N. Der skal bruges rør med skruelåg til forberedelse af prøver og kontroller for at undgå stænk og potentiel krydskontaminering af prøver. Brug ikke rør med snaplukning. O. Anvend beskyttelsesbriller, særligt arbejdstøj og engangsbeskyttelseshandsker ved håndtering af alle reagenser. Undgå kontakt med huden, øjnene og slimhinderne. Ved kontakt skylles straks med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis området ikke behandles. Hvis disse reagenser spildes, skal de fortyndes med vand, før de tørres op. P. Hvis det skulle ske, at en K-tube eller K-tray åbnes efter amplifikationen, skal K-carrieren, brøndene og den udløbne væske behandles med blegemiddel (den effektive koncentration er 5000 ppm, 0,5%) natten over for at ødelægge det udslupne amplikon. 4

KRAV TIL OPBEVARING OG HÅNDTERING Reagenser og kontroller må ikke nedfryses. A. RW, RL og RN opbevares ved 2-25 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig indtil den angivne udløbsdato. B. MTB MMX, MYCO Mg 2+, MYCO IC, MTB (+) C og MYCO ( ) C opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig indtil den angivne udløbsdato. C. MTB (+) C og MYCO ( ) C, der ikke er helt opbrugt, opbevares ved 2-8 C mellem kørsler. Kontroller udløbsdatoen på åbnede kontroller før brug. MTB (+) C og MYCO ( ) C kan bruges op til fire gange. Efter åbning kan MTB (+) C og MYCO ( ) C holde sig i 4 uger eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. D. MTB MMX, MYCO Mg 2+ og MYCO IC leveres som engangsflasker til sæt af 12 reaktioner. Eventuelt ubrugt materiale skal bortskaffes. E. Arbejds-Master Mix (forberedt ved at tilsætte MYCO Mg 2+ og MYCO IC til MTB MMX) kan opbevares ved 2-8 C på et mørkt sted i op til 2 timer. F. Forberedte prøver og kontroller skal tilsættes til arbejds-master Mix inden 2 timer efter forberedelsen, hvis det opbevares ved stuetemperatur, eller inden 8 timer, hvis det opbevares ved 2-8 C. G. Amplifikationen skal startes senest 90 minutter, efter at de behandlede prøver og kontroller er tilsat til arbejds-master Mix. MEDFØLGENDE MATERIALER Prøveforberedelsesreagenser A. AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit AMPLICOR luftvejsprøveforberedelseskit (P/N: 20756903 122. ART: 07 5690 3. US: 83267) RW (vaskeopløsning til luftvejsprøve) RL (lysisreagens til luftvejsprøve) RN (luftvejsprøveneutraliseringsreagens) RSP PREP Amplifikations- og detektionsreagenser B. COBAS TaqMan MTB Test (P/N: 04803531 190) MYCO IC (Mycobacterium-intern kontrol) MTB (+) C [M. tuberculosis-positiv kontrol] MYCO ( ) C [Mycobacterium-negativ kontrol] MTB MMX (COBAS TaqMan MTB Master Mix) MYCO Mg 2+ (Mycobacterium-magnesiumreagens) CTM MTB 5

NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Instrumenter og software COBAS TaqMan 48-analyseinstrument AMPLILINK-software Datastation til AMPLILINK-softwaren Instrumentmanual til COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet til brug med applikationsmanualen til AMPLILINK Software, Version 3.2 Series Applikationsmanual til AMPLILINK Software Version 3.2 Series til brug med COBAS AmpliPrepinstrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet og COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet Capper til K-tubes (P/N: 03516539001) Capping tool til K-tray (P/N: 03339904001) K-carrier til COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet (P/N: 28150397001) K-tray-carrier til COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet (P/N: 03341488001) Engangsmaterialer K-tubes (P/N: 03137082001) K-trays til COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet (P/N: 03343146001) ANDRE NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Vortex-mixer Pipette-værktøj: Drummond (P/N: 4-000-100) eller tilsvarende 1,5 ml polypropylenrør med skruelåg, sterile, ikke-silikoniseret, koniske (Sarstedt 72.692.105 eller tilsvarende)** Racks til rør (Sarstedt 93.1428 eller tilsvarende) Pipetter (kapacitet 50 µl, 100 µl, 200 µl, 250 µl, 500 µl og 1000 µl)* med aerosolbarriere- eller positive displaceringsspidser Sterile transferpipetter med lille spids Mikrocentrifuge (maks. RCF 16.000 x g, min. RCF 12.500 x g), Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M eller tilsvarende 60 C ± 2 C varmeblok Termometer Trækpapir Beskyttelseshandsker, uden talkum Biosafety-kabinet med vakuum * Pipetter må højst afvige 3% fra den angivne volumen. Der skal anvendes aerosolbarriere- eller positive displaceringsspidser (eller nukleasefri), hvor det er angivet, for at undgå krydskontaminering af prøver og amplikon. ** Der skal bruges rør med skruelåg til klargøring af prøver og kontroller for at undgå stænk og potentiel krydskontaminering af prøver og kontroller. Brug ikke rør med snaplukning. INDSAMLING, TRANSPORT OG OPBEVARING AF PRØVER Bemærk! Alle prøver og kontroller skal håndteres som potentielt smittefarlige. A. Indsamling af prøver Der må kun anvendes ekspektorerede og inducerede sputum- eller BAL-luftvejsprøver. Prøverne skal være opløst, dekontamineret og koncentreret ved hjælp af NALC-NaOH 17 -metoder. B. Transport af prøver Dekontaminerede prøver skal transporteres til laboratoriet ved 2-25 C inden for 24 timer efter indsamlingen. Hvis prøverne ikke transporteres inden for 24 timer, skal de opbevares og afsendes ved -70 C. Afsendelsen af prøverne skal foregå i overensstemmelse med gældende nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer 22. C. Opbevaring af prøver Dekontaminerede prøver kan opbevares ved -20 C i op til 2 uger. Behandlede prøver kan opbevares ved -70 C i op til 6 måneder eller ved 2 C til 8 C i op til 4 dage. 6

BRUGSVEJLEDNING Bemærk! Se instrumentmanualen COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet til brug med AMPLILINK-software, Version 3.2 Series og applikationsmanualen til AMPLILINK-software, Version 3.2 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan - analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet og COBAS AMPLICOR - analyseinstrumentet for at få en detaljeret brugsvejledning, vejledning i udskrivning af resultater og fortolkning af markeringer, kommentarer og fejlmeddelelser. Bemærk! Hvis der udføres prøvebehandling, amplifikation og detektion i løbet af en enkelt arbejdsdag, skal den testprocedure, der er nævnt nedenfor, følges. Hvis prøveforberedelsen udføres på en anden dag end amplifikationen og detektionen, skal reagensforberedelsen udføres samme dag som amplifikationen og detektionen. Bemærk! Alle amplifikations- og detektionsreagenser skal have opnået den omgivende temperatur før brug. Hvis de opbevares ved 2-8 C, skal de tages ud mindst 30 minutter før brug. Bemærk! Prøver skal optøs (hvis de er frosne), tempereres i 15-30 minutter ved den omgivende temperatur og mikses før brug. Bemærk! Brug pipetter med aerosolbarriere- eller positive displaceringsspidser, hvor det er angivet. Vær yderst omhyggelig for at undgå kontaminering. Kørselsstørrelse: Hvert COBAS TaqMan MTB-testkit indeholder reagenser til fire kørsler af 12 test, der kan udføres separat eller samtidig. Hver testkørsel skal inkludere mindst én bestemmelse af hver af kontrollerne MYCO ( ) C og MTB (+) C med op til 48 prøver og kontroller (se afsnittet Kvalitetskontrol ). Amplifikations- og detektionsreagenserne er pakket i engangsflasker med 12 test. Den mest effektive anvendelse af reagenser, prøver og kontroller opnås ved at behandle dem i batches, der kan multipliceres med 12. A. Prøve- og kontrolforberedelse Udført i: Præamplifikation Prøve- og kontrolforberedelsesområdet 1. Fastlæg det antal prøver, der skal testes, og placer tilstrækkeligt med 1,5 ml polypropylenrør med skruelåg i arbejdsområdet, så der er ét rør for hver prøve og ét rør for hver kontrol. Brug ikke rør med snaplukning. Se Advarsler og forholdsregler. Sæt en etiket med prøve-id på hvert prøveforberedelsesrør. 2. Tilsæt 500 µl RW til hvert prøverør. 3. Brug en pipette med aerosolfilterspids til at tilsætte 100 µl opløst, dekontamineret og koncentreret luftvejsprøve til det relevant mærkede rør med RW. Brug en ny aerosolfilterpipettespids til hver prøve. Sæt låget på rørene igen, og bland i 5 sekunder på vortex-mixer. 4. Centrifuger ved 12.500 x g i 10 minutter. 5. Afsug supernatanten med en transferpipette med lille spids, og tilsæt 100 µl RL til cellepelleten med en pipette med en ny aerosolfilterspids for hver prøve. Bland i 5 sekunder på vortex-mixer for at resuspendere pelleten. 6. Forbered arbejdskontrollerne på følgende måde: Bemærk! Der skal forberedes nye arbejdskontroller til hver dag, testen udføres, og de skal bortskaffes ved hver dags afslutning. Bemærk! MTB (+) C og MYCO ( ) C, der følger med COBAS TaqMan MTB-testkittet, er udviklet til at blive brugt op til fire gange til forberedelse af MTB (+)- og MYCO ( )- arbejdskontrollerne. Efter åbning kan MTB (+) C og MYCO ( ) C holde sig i 4 uger eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. a. Bland MYCO ( ) C-røret i 5 sekunder på vortex-mixer. Pipetter 50 µl MYCO ( ) C til et 1,5 ml polypropylenrør med en pipette med aerosolfilterspids. Tilsæt 200 µl RL. Bland i 5 sekunder på vortex-mixer. Dette er Mycobacterium ( )-arbejdskontrollen. b. Bland indholdet af MTB (+) C-røret i 5 sekunder på vortex-mixer. Pipetter 50 µl MTB (+) C til et 1,5 ml polypropylenrør med en pipette med aerosolfilterspids. Tilsæt 200 µl RL. Bland i 5 sekunder på vortex-mixer. Dette er M. tuberculosis (+)-arbejdskontrollen. c. Pipetter 100 µl af hver arbejdskontrol til et 1,5 ml polypropylenrør med skruelåg til behandling parallelt med de kliniske prøver. 7. Inkuber prøver og kontroller i en 60 C ± 2 C varmeblok i 45 minutter. 8. Fjern rørene fra varmeblokken, og pulscentrifuger rørene i 5 sekunder for at fjerne kondensat fra låget. 7

9. Brug en pipette med aerosolfilterspids til at tilsætte 100 µl RN til hvert prøve- og kontrolrør. Bland i 5 sekunder i en vortex-mixer ved halv hastighed. Brug en ny aerosolfilterpipettespids til hver prøve og kontrol. 10. Flyt de forberedte prøver (patientprøver og kontroller) til amplifikations-/detektionsområdet. B. Reagensforberedelse og indsættelse af K-carrier Udført i: Præamplifikation - Reagensforberedelsesområdet Bemærk! COBAS TaqMan MTB Master Mix (MTB MMX), "arbejds-master Mix" (arbejds-mmx) og arbejds-master Mix plus behandlede prøver og kontroller er lysfølsomme. Disse reagenser skal beskyttes mod lys. Bemærk! COBAS TaqMan MTB Master Mix (MTB MMX), COBAS TaqMan Mycobacteriumintern kontrol (MYCO IC) og COBAS TaqMan Mycobacterium-magnesiumreagens (MYCO Mg 2+ ) skal tempereres ved den omgivende lufttemperatur i mindst 30 minutter før forberedelsen af arbejds-master Mix. Bemærk! Arbejds-MMX skal forberedes, når den manuelle prøve- og kontrolforberedelse er fuldført. Bemærk! Forberedte prøver kan holde sig i op til 2 timer ved stuetemperatur eller op til 8 timer ved 2-8 C før tilsættelse til arbejds-master Mix. Bemærk! Arbejds-MMX skal opbevares ved 2-8 C og skal bruges inden 2 timer efter forberedelsen. Bemærk! Når de behandlede prøver og kontroller er tilsat arbejds-mmx, skal amplifikationen påbegyndes inden 90 minutter. 1. Temperer én flaske med MTB MMX, én flaske med MYCO Mg 2+ og én flaske med MYCO IC ved den omgivende lufttemperatur i mindst 30 minutter. 2. Anbring en K-carrier i en K-carrier-holder. 3. Anbring nye K-tubes eller en ny K-tray i K-carrieren uden at berøre siderne på K-tubes eller K-traybrøndene. Bemærk! Hvis der skal køres mindre end 24 analyser, skal K-tube-brøndpositionerne 1, 2, 5, 20, 23 og 24 udfyldes for at afbalancere K-carrieren i thermo cycleren. 4. Fjern lågene på K-tubes ved hjælp af capperen til K-tubes, hvis det er relevant. Placer lågene i parkeringspositionsholderen til K-tubes. 5. Forbered arbejds-mmx på følgende måde: Tilsæt 200 µl MYCO Mg 2+ og 50 µl MYCO IC i ét rør med MTB MMX. Sæt låg på røret, og bland ved at vende røret 10 gange. Bland ikke arbejds-mmx på vortex-mixer. Beskyt arbejds-master Mix mod lys, og brug det inden 2 timer. 6. Tilsæt 50 µl arbejds-mmx til hver K-tube eller den relevante K-tray-brønd. Bemærk! Arbejds-MMX er meget lysfølsomt. Sørg for, at K-tubes eller K-tray med arbejds-mmx udsættes for så lidt lys som muligt. 7. Tilsæt 50 µl af hver af de behandlede prøver eller kontroller til den relevante K-tube eller K-traybrønd med arbejds-mmx ved hjælp af en mikropipette med aerosolbarriere- eller positiv displaceringsspids. Bland forsigtigt hver prøve eller kontrol ved at afsuge og afpipettere tre gange uden at danne bobler. 8. Gentag trin 7 for hver behandlet prøve eller behandlet kontrol, indtil de alle er blevet overført til K-tubes eller K-trays. Brug en ny spids til hver prøve og kontrol. Inspicer manuelt for at kontrollere, om der er bobler, og fjern dem om nødvendigt. Sæt låg på K-tubes/K-trays ved hjælp af et Capper tool til K-tubes/K-trays. Kontroller manuelt, at der er tilsat de korrekt mængder. 9. K-carrieren, der er klar til PCR, opbevares på et mørkt sted ved 15-30 ºC, hvis amplifikationen ikke skal foregå straks. Amplifikationen skal startes senest 90 minutter, efter de behandlede prøver og kontroller er tilsat K-tubes eller K-tray med arbejds-mmx. 8

C. Amplifikation og detektion Udført i: Post-amplifikation - Amplifikations-/detektionsområdet Indsættelse af reagenser i og betjening af COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet 1. Tænd for computerarbejdsstationen, og log på Windows XP ved hjælp af korrekt bruger-id og adgangskode. 2. Tænd for COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet mindst 30 minutter, før kørslen startes. Kontroller, at instrumentet initialiseres og er klar til brug. Hvis der fra tidligere kørsler stadig er placeret K-carriers i en af thermo cyclerne, skal de fjernes ved hjælp af K-carrier-transportøren. 3. Åbn AMPLILINK-softwaren på computeren. Log på ved hjælp af korrekt bruger-id og adgangskode. 4. Klik på ikonet Orders for at oprette K-carrier-ordrer for de prøver, der skal analyseres. Vælg fanen Sample, klik derefter på knappen New, og indtast ordrenummeret for hver prøve ved hjælp af tastaturet, eller indlæs det ved hjælp af barkodescanneren. Vælg testdefinition for COBAS TaqMan MTB-testen. Gentag processen for hver prøve. Klik på knappen Save. Bemærk! Hvis der skal køres mindre end 24 analyser, skal K-tube-brøndpositionerne 1, 2, 5, 20, 23 og 24 udfyldes for at afbalancere K-carrieren i thermo cycleren. 5. Indtast kvalitetskontroloplysninger ved at vælge fanen Quality Control i vinduet Orders. Klik på knappen New, og indtast oplysningerne fra COBAS TaqMan MTB Test Value-kortet, der følger med kittet, ved hjælp af tastaturet, eller indlæs dem ved hjælp af barkodescanneren. Indtast lotnummer, udløbsdato, intervaller for Low (+)-kontrollen samt kalibreringskoefficienter for COBAS TaqMan MTB-testen i de angivne felter. Klik på OK. 6. Tildel et K-carrier-nummer til kørslen ved at klikke på fanen K-Carrier i vinduet Orders. Klik på New i vinduet K-Carrier. Indtast K-carrier-nummeret fra barkoden på K-carrieren eller K-trayen i cellen til højre for K-Carrier ID ved hjælp af tastaturet, eller indlæs det ved hjælp af barkodescanneren. Vælg testdefinition til COBAS TaqMan MTB-testen på testpanelet i nederste del af vinduet. 7. Marker den første række i kolonnen Type (T) i arbejdslisten (Worklist). Fremhæv dette felt for at få adgang til rullemenuen, og vælg derefter den ønskede kontroltype. Dobbeltklik derefter i prøve-idfeltet for den samme række. Vinduet LookUp Control åbnes med de tilgængelige kontroller. Når kontrollen er valgt, vises de tilsvarende kalibrerings- og kontrolværdier i oplysningsruden nederst til højre. Gentag processen for de ønskede kontroller. 8. Dobbeltklik på den første position (række) for at indtaste prøverne i arbejdslisten (Worklist). Derved åbnes vinduet Lookup Sample med de tildelte prøveordrer. Brug tasterne Skift + Pil, hvis du vil markere mere end ét ordrenummer. Kontroller, at alle ordrer er tildelt til testdefinitionen for COBAS TaqMan MTB-testen. 9. Klik på Save for at gemme K-carrier-ordretildelingen. 10. Vælg ikonet Systems under fanen System. Klik på Open for at åbne thermo cycleren. Når låget til thermo cycleren er helt åbent, og meddelelsen Ready to Load vises i vinduet Systems, skal låget til thermo cycleren løftes op og holdes åbent. Overfør K-carrieren med de tillukkede K-tubes med arbejds-master Mix samt prøver og kontroller til thermo cycleren ved hjælp af K-carriertransportøren. Luk låget til thermo cycleren. 11. Klik på Start i vinduet Systems under ikonet TC for at lukke låget på thermo cycleren og starte kørslen. 12. COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet udfører automatisk amplifikation og detektion. RESULTATER Beregning af resultater COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet bestemmer automatisk, om MTB DNA er påvist for prøven eller kontrollen. COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet: Bestemmer cyklusgrænseværdien (Ct) for MTB DNA et og Mycobacterium IC DNA et. Bestemmer, om MTB DNA et er påvist baseret på Ct-værdierne for MTB DNA et og MYCO IC-DNA et. Bestemmer, om MTB (+) C og MYCO ( ) C er gyldige. 9

Validering af kørsel Kontroller resultatvinduet i AMPLILINK-softwaren eller kørselsudskriften for markeringer og kommentarer for at sikre, at kørslen er gyldig. Kørslen er gyldig, hvis der ikke vises markeringer for COBAS TaqMan MTB-kontrollerne. Følgende resultater opnås, hvis kørslen er gyldig: Kontrol Resultat Fortolkning Negativ kontrol Target Not Detected Kontrollen er inden for intervallet Positiv kontrol 1 Positive Kontrollen er inden for intervallet Kørslen er ikke gyldig, hvis der vises en af følgende markeringer for COBAS TaqMan MTB-kontrollerne: MYCO-negativ kontrol: Markering ( Flag ) Resultat Fortolkning _N_NC_INVALID Invalid Kontamineret prøve eller intet IC-signal MTB-positiv kontrol: Markering ( Flag ) Resultat Fortolkning _L_LPC_INVALID Invalid Kontrollen er ikke inden for intervallet, intet targetsignal eller intet IC-signal Bemærk! MTB PC kaldes lav positiv kontrol (LPC) Hvis kørslen er ugyldig, skal hele kørslen gentages, herunder prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion. Fortolkning af resultater: For at finde ud af, om kørslen er gyldig, skal det for hver enkelt prøve kontrolleres, om der er markeringer eller kommentarer på udskriften. Resultaterne skal fortolkes på følgende måde: En gyldig kørsel kan inkludere både gyldige og ugyldige prøveresultater afhængigt af, om der er genereret markeringer og/eller kommentarer for de individuelle prøver. Prøveresultaterne fortolkes på følgende måde: Markering ( Flag ) Resultat Fortolkning M. tuberculosis DNA blev ikke detekteret. Prøven er Ingen markering Target Not formodet negativ for M. tuberculosis. Et negativt resultat Detected udelukker ikke tilstedeværelsen af en M. tuberculosisinfektion, da resultater er afhængig af korrekt prøvetagning, fravær af inhibitorer og tilstrækkeligt med DNA, for at der kan foretages en detektion. Ingen markering 1 Positive M. tuberculosis DNA blev detekteret. Prøven er positiv for M. tuberculosis. _Q_RFITOOLOW > 1 Positive M. tuberculosis DNA blev detekteret. Prøven er positiv for eller M. tuberculosis. Ingen markering Inhiberet prøve. M. tuberculosis-dna vil, hvis det er til stede, ikke kunne påvises. Behandl en ny afmålt mængde af den _Q_QS_INVALID Invalid oprindelige prøve, og gentag testen. Inhibitorer er ofte labile, og prøver, der i første omgang er hæmmede, er muligvis ikke hæmmede, når de behandles igen. Hvis den oprindelige prøve ikke er tilgængelig, skal der tages en ny prøve. Bemærk! AMPLILINK-softwaren markerer IC-fejl (intern kontrol) som en ugyldig QS (_Q_QS_INVALID). 10

KVALITETSKONTROL Hver testkørsel skal indkludere mindst én bestemmelse af hver af kontrollerne MYCO ( ) og MTB (+). Som ved alle nye laboratorieprocedurer bør nye brugere overveje at bruge ekstra kontroller, hver gang testen udføres, indtil de har opnået en høj grad af fortrolighed med hensyn til at udføre testen korrekt. Der er ikke noget krav til kontrollernes position i K-carrieren. Kontroller kørselsudskriften for markeringer og kommentarer for at sikre, at kørslen er gyldig. Negativ kontrol MYCO ( ) C skal give resultatet Target Not Detected (target er ikke påvist), dvs. Ct-værdien for MTB DNA et er over grænsen for analysen, eller der blev ikke opnået en Ct-værdi for MTB DNA, men en gyldig Ct-værdi for Mycobacterium-intern kontrol-dna et. Hvis MYCO ( ) C ikke opfylder dette kriterium, er hele kørslen ugyldig. Gentag hele testproceduren (prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion). Hvis MYCO ( ) C konstant er ugyldig, skal Roche kontaktes for at få teknisk hjælp. Positiv kontrol Det tildelte interval for MTB (+) C er angivet på COBAS TaqMan MTB Test Value-kortet. Resultatet for MTB (+) C skal ligge inden for det interval, der er angivet på COBAS TaqMan MTB Test Value-kortet, for at en kørsel er gyldig. Det korrekte resultat vises som 1 Positive. Hvis den positive kontrol ikke opfylder dette kriterium, er hele kørslen ugyldig. Gentag hele testproceduren (prøve- og kontrolforberedelse, amplifikation og detektion). Hvis resultatet for den positive kontrol konstant er uden for det tildelte interval, skal Roche kontaktes for at få teknisk hjælp. MTB (+)-kontrollen indeholder ca. 20 kopier af en M. tuberculosis-plasmid-dna-sekvens pr. test. Dette er ca. fire gange analysens minimumsdetektionsgrænse, som er bestemt ved Poisson-analyse. Amplifikation og påvisning af MTB (+)-kontrollen sikrer, at der er fundet en amplifikation sted. MTB (+)-kontrollen overvåger ikke testens amplifikationseffektivitet eller detektionsniveau. Intern kontrol Den interne kontrol er udviklet til at identificere prøver, der indeholder polymerasehæmmere. Brugen af den interne kontrol kan ikke eliminere alle falsk-negative testresultater. FORHOLDSREGLER VED PROCEDURERNE Som ved alle testprocedurer er det vigtigt med god laboratorieteknik for en korrekt performance af analysen. På grund af testens høje analytiske sensitivitet skal der udvises stor omhu for at bevare renheden i reagenser og amplifikationsblandinger i kittet. Renheden af alle reagenser skal overvåges nøje. Kasser alle suspekte reagenser. BEGRÆNSNINGER VED PROCEDURERNE 1. Denne test er kun godkendt med ekspektorerede og inducerede sputum- og BAL-prøver, der er opløst, dekontamineret og koncentreret ved hjælp af NALC-NaOH. Test af andre prøvetyper kan resultere i falsk-negative eller falsk-positive resultater. 2. Detektionen af M. tuberculosis er afhængig af det antal organismer, der findes i prøven, og kan påvirkes af prøvetagningsmetoder, patientfaktorer (f.eks. alder, tilstedeværelse af symptomer) og/eller infektionsstadiet for M. tuberculosis. 3. Der kan forekomme falsk-negative resultater pga. polymerasehæmning. Der er tilsat Mycobacteriumintern kontrol i COBAS TaqMan MTB-testen for at tillade identifikation af behandlede prøver, der indeholder stoffer, som kan påvirke PCR-amplifikationer, med mere end 20 kopier pr. test. 4. Der kan forekomme falsk-negative resultater ved tilstedeværelse af Mycobacterium-arter med høj titer, som ikke findes i M. tuberculosis (MTB)-komplekset, hvis MTB forefindes ved en lavere titer end de interfererende Mycobacterium-arter. 5. Pålidelige resultater er afhængige af korrekte procedurer for prøveindsamling, transport, opbevaring og behandling. Variationer, som skyldes opbevaring, er ikke fuldstændigt defineret. 6. Tilsætningen af AmpErase-enzyme til Master Mix aktiverer den selektive amplifikation af target-dna. Kontaminering fra reagenser kan dog kun undgås med god laboratoriepraksis og nøje overholdelse af de procedurer, der er angivet i dette pakningsindlæg. 7. Testen kan ikke afgøre behandlingsmæssig succes eller fiasko. 8. Som ved alle diagnostiske tests skal resultaterne af COBAS TaqMan MTB-testen fortolkes på baggrund af alle kliniske og laboratoriemæssige undersøgelser. 9. Dette produkt må kun anvendes af medarbejdere, der er oplært i brugen af PCR-teknikker. 10. COBAS TaqMan MTB-testen giver kvalitative resultater. Der kan ikke udledes korrelation mellem størrelsen af en Ct-værdi i COBAS TaqMan MTB-testen og antallet af M. tuberculosis-celler i en inficeret prøve. 11

11. Dette produkt må kun anvendes med COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet. 12. Forekomst af PCR-inhibitorer kan medføre falsk-negative eller ugyldige resultater. 13. Selvom de er sjældne, kan mutationer i den bedst konserverede region i bakteriegenomet, som er dækket af testens primere og/eller probe, bevirke, at bakterierne ikke detekteres. 14. På grund af naturlige forskelle mellem teknologier anbefales det, at brugeren udfører metodekorrelationsundersøgelser i laboratoriet for at fastslå teknologiske forskelle, før der skiftes fra en teknologi til en anden. EVALUERING AF IKKE-KLINISK PERFORMANCE Analytisk specificitet Den analytiske specificitet for COBAS TaqMan MTB-testen er evalueret ved test af følgende bakterier, vira og svampe, hvoraf mange er normale flora eller patogener, der er almindelige i luftvejene. Ingen af følgende organismer udviste reaktivitet i COBAS TaqMan MTB-testen: Mykobakterielle arter Mycobacterium abscessus Mycobacterium neoaurum Mycobacterium asiaticum Mycobacterium nonchromogenicum Mycobacterium avium Mycobacterium phlei Mycobacterium chelonae Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium chitae Mycobacterium senegalens Mycobacterium fallax Mycobacterium shimoidei Mycobacterium flavescens Mycobacterium simiae Mycobacterium fortuitum Mycobacterium smegmatis Mycobacterium gastri Mycobacterium sphagni Mycobacterium gordonae Mycobacterium szulgai Mycobacterium intracellulare Mycobacterium terriae Mycobacterium kansasii Mycobacterium thermoresistibile Mycobacterium komassense Mycobacterium triviale Mycobacterium malmoense Mycobacterium vaccae Mycobacterium marinum Mycobacterium xenopi Ikke-mykobakterielle arter Acinetobacter calcoaceticus Corynebacterium xerosis Actinomadura madurae Cryptococcus neoformans Actinomyces pyogenes Cytomegalovirus, human Actinoplanes italicus Deinococcus radiodurans Adenovirus, human Dermatophilus congolensis Aeromonas hydrophila Derxia gummosa Arthrobacter oxydans Eikenella corrodens Bacillus subtilis Enterobacter aerogenes Bacteriodes fragilis Enterobacter cloacae Blastomyces dermatitidis Enterococcus faecalis Bordetella parapertussis Enterococcus faecium Bordetella pertussis Enterovirus, human Branhamella (Moraxella) catarrhalis Escherichia coli Brevibacterium linens Fusobacterium nucleatum Campylobacter jejuni Gordona sputi Candida albicans Haemophilus influenzae Chlamydia trachomatis Herpes simplexvirus, type 1 Chromobacterium violaceum Histoplasma capsulatum Citrobacter freundii Influenzavirus B Clostridium perfringens Klebsiella pneumoniae Coccidioides immitis Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae Corynebacterium aquaticum Lactobacillus casei Corynebacterium diphtheriae Legionella micdadei Corynebacterium flavescens Legionella pneumophila Corynebacterium glutamicum Mycoplasma hominis Corynebacterium jeikeium Mycoplasma pneumoniae Corynebacterium minutissimum Neisseria gonorrhoeae Corynebacterium pseudodiphtheriticum Neisseria lactamica Corynebacterium pseudotuberculosis Neisseria meningitidis Corynebacterium renale Nocardia asteroides Corynebacterium striatum Nocardia brasiliensis 12

Nocardia farcinica (W5218) Nocardia nova (W5194) Nocardia otitidiscaviarum Nocardia transvalensi Oerskovia turbata Parainfluenza 2-virus Peptococcus niger Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus magnus Porphyromonas asaccharolytica Porphyromonas gingivalis Prevotella melaninogenica Propionibacterium acnes Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Respiratorisk syncytialvirus Rhinovirus 14, human Rhodococcus aichiensis Rhodococcus chubuensis Rhodococcus equi Salmonellacholeraesus subsp Choleraesuis Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus agalactiae Streptococcus gordonii Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptomyces griseinus Veillonella atypica Veillonella parvula Vibrio parahaemolyticus Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica Analytisk sensitivitet: M. tuberculosis-celler Detektionsgrænsen for COBAS TaqMan MTB-testen blev fastlagt ved at bestemme det mindste antal M. tuberculosis-kolonidannelsesenheder (CFU), der ved reproduktion kan detekteres ( 95% positive resultater) med COBAS TaqMan MTB-testen. En dekontamineret kultur af MTB blev fortyndet i NALC/NaOH-opløst negativt sputum til et panel bestående af 7 koncentrationer med 10, 5, 1, 0,5, 0,25, 0,1 og 0 MTB CFU/PCR. Dette panel blev forberedt uafhængigt hver dag i tre dage. 54 bestemmelser af hver panelkoncentration blev testet ved hjælp af tre COBAS TaqMan MTB-testreagenslot. Resultaterne fra Probit-analysen (tabel 1) viser, at detektionsgrænsen for COBAS TaqMan MTB-testen er 0,46 CFU/PCR eller ca. 18 CFU/ml i sputum-prøver. Tabel 1 Detektionsgrænse for COBAS TaqMan MTB-testen med M. tuberculosis-celler Medlem Nominelt input CFU/PCR Antal ugyldige Antal gyldige Antal pos. Antal forsøg % hit 95% Cl 1 10 0 54 54 54 100,0% 94,6-100% 2 5 0 54 54 54 100,0% 94,6-100% 3 1 0 54 54 54 100,0% 94,6-100% 4 0,5 0 54 51 54 94,4% 84,6-98,8% 5 0,25 0 54 46 54 85,2% 72,9-93,4% 6 0,1 0 54 33 54 61,1% 46,9-74,0% 7 0 0 54 0 54 0,0% 0,0-5,4% 95% LOD ved PROBIT = 0,46 CFU/PCR 95%-konfidensinterval = 0,33-0,83 CFU/PCR Inklusivitet COBAS TaqMan MTB-testen blev evalueret med alle Mycobacteria-arter, der findes i MTB-komplekset (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, og M. africanum). Kvantificerede genomiske DNA-forberedelser (10 kopier/pcr) og bakteriekulturer blev undersøgt. Ved startkoncentrationen på 10 genomiske kopier/pcr blev alle 4 medlemmer af MTB-komplekset identificeret som positive. Desuden blev 169 kulturer af arter i MTB-komplekset (M. tuberculosis = 159, M. bovis = 6, M. microti = 3 og M. africanum = 1) analyseret med COBAS TaqMan MTB-testen. Én kultur af M. microti og én kultur af M. tuberculosis blev testet negativ og resulterede i en samlet inklusivitetsprocent på 99%. 13

Reproducerbarhed COBAS TaqMan MTB-testen blev evalueret for reproducerbarhed via analyse af resultater fra dag til dag, lot til lot og bruger til bruger. Undersøgelsen af dag til dag (tabel 2) blev foretaget af én bruger med ét COBAS TaqMan MTB-testreagenslot i løbet af 15 dage ved hjælp af MYCO-negativ kontrol (NC), MTBpositiv kontrol (PC) og MTB-positiv kontrol fortyndet med negativ kontrol (1/2 PC). Undersøgelsen af lot til lot (tabel 3) blev foretaget af én bruger i løbet af én dag med tre COBAS TaqMan MTB-testreagenslot ved hjælp af MYCO-negativ kontrol (NC), MTB-positiv kontrol (PC) og MTB-positiv kontrol fortyndet med negativ kontrol (1/4 PC og 1/2 PC). Undersøgelsen af bruger til bruger (tabel 4) blev foretaget af tre brugere i løbet af tre dage med ét COBAS TaqMan MTB-testreagenslot ved hjælp af MYCO-negativ kontrol (NC), MTBpositiv kontrol (PC) og MTB-positiv kontrol fortyndet med negativ kontrol (1/2 PC). De 720 resultater fra de tre undersøgelser vises i tabel 2-4. Der blev opnået negative resultater med 100% af de testede 132 NC-bestemmelser. Alle 588 positive bestemmelser, fra 20 til 5 kopier af MTB-target/PCR, blev testet positive. I alle tre undersøgelser var %CV 2,4 eller mindre og viste dermed god reproducerbarhed for kvalitative resultater med denne test. Tabel 2 Reproducerbarhedsresultater for dag til dag med COBAS TaqMan MTB-testen MTB-target NC (0 c/pcr) PC (~20 c/pcr) 1/2 PC (~10 c/pcr) Antal gyldige bestemmelser i alt 60 60 60 % positive resultater 0% 100% 100% Gennemsnitlig MTB-bøjning Ikke tilgængelig 39,4 41,1 Minimumsværdi Ikke tilgængelig 38,3 39,9 Maksimumsværdi Ikke tilgængelig 40,8 42,8 Standardafvigelse Ikke tilgængelig 0,5 0,7 Variationskoefficient Ikke tilgængelig 1,3% 1,7% Tabel 3 Reproducerbarhedsresultater for lot til lot med COBAS TaqMan MTB-testen MTB-target Antal gyldige bestemmelser i alt NC (0 c/pcr) PC (~20 c/pcr) 1/2 PC (~10 c/pcr) 1/4 PC (~5 c/pcr) 36 36 36 324 % positive resultater 0% 100% 100% 100% Gennemsnitlig MTB-bøjning Ikke tilgængelig 39,6 40,7 41,6 Minimumsværdi Ikke tilgængelig 38,5 39,1 39,5 Maksimumsværdi Ikke tilgængelig 41,3 42,3 48,0 Standardafvigelse Ikke tilgængelig 0,8 0,7 1,0 Variationskoefficient Ikke tilgængelig 1,9% 1,7% 2,4% 14

Tabel 4 Reproducerbarhedsresultater for bruger til bruger med COBAS TaqMan MTB-testen MTB-target NC (0 c/pcr) PC (~20 c/pcr) 1/2 PC (~10 c/pcr) Antal gyldige bestemmelser i alt 36 36 36 % positive resultater 0% 100% 100% Gennemsnitlig MTB-bøjning Ikke tilgængelig 39,6 40,8 Minimumsværdi Ikke tilgængelig 38,4 39,2 Maksimumsværdi Ikke tilgængelig 41,5 42,6 Standardafvigelse Ikke tilgængelig 0,8 0,8 Variationskoefficient Ikke tilgængelig 1,9% 2,0% Korrelation Der blev foretaget en undersøgelse af korrelationen for at sammenligne performance for COBAS TaqMan MTB-testen med COBAS AMPLICOR MTB-testen. Der blev i alt analyseret 769 sputum-prøver og 186 BAL-prøver i undersøgelsen. Prøverne blev anskaffet fra frosne arkiver eller fra nyligt indsamlede frosne prøver. Der blev anvendt tre forskellige COBAS TaqMan MTB-testreagenslot i undersøgelsen. Den positive korrelationsprocent for sputum-prøver (tabel 5) var 96,2%, mens den negative korrelationsprocent var 99,1%, hvilket gav en samlet overensstemmelse på 98,3% for sputum-prøver mellem COBAS TaqMan MTB-testen og COBAS AMPLICOR MTB-testen. Den positive korrelationsprocent for BALprøver (tabel 6) var 97,1%, mens den negative korrelationsprocent var 99,3%, hvilket gav en samlet overensstemmelse på 98,9% for BAL-prøver mellem COBAS TaqMan MTB-testen og COBAS AMPLICOR MTB-testen. Tabel 5 Korrelation mellem COBAS TaqMan MTB-testen og COBAS AMPLICOR MTB-testen Samlede sputum-resultater Sputum-resultater N = 769 COBAS TaqMan MTB Test COBAS AMPLICOR MTB Test + I alt + 207 5 212 8 549 557 I alt 215 554 769 Positiv procentoverensstemmelse Negativ procentoverensstemmelse Samlet overensstemmelse Forhold % overensstemmelse 95%- konfidensinterval 207/215 96,2% 92,8-98,4 549/554 99,1% 97,9-99,7 756/769 98,3% 97,1-99,1 15

Tabel 6 Korrelation mellem COBAS TaqMan MTB-testen og COBAS AMPLICOR MTB-testen Samlede BAL-resultater BAL-resultater N = 186 COBAS TaqMan MTB Test Positiv procentoverensstemmelse Negativ procentoverensstemmelse Samlet overensstemmelse Forhold COBAS AMPLICOR MTB Test + I alt + 34 1 35 1 150 151 I alt 35 151 186 % overensstemmelse 95%- konfidensinterval 34/35 97,1% 85,1-99,9 150/151 99,3% 96,4-99,9 184/186 98,9% 98,9-99,9 Systemfejl generelt Systemfejlfrekvensen blev bestemt for COBAS TaqMan MTB-testen ved at undersøge den procentvise andel af de positive resultater med 100 bestemmelser af negativ sputum beriget med MTB-kultur til en slutkoncentration på 60 CFU/ml eller ~ 3 gange detektionsgrænsen for testen (se afsnittet Detektionsgrænse ovenfor). Der blev opnået positive resultater for 99 af de 100 bestemmelser, hvilket gav en samlet systemfejlfrekvens på 1,0% og en succesfrekvens på 99% for COBAS TaqMan MTB-testen. Interferens COBAS TaqMan MTB-testen blev evalueret for endogen hæmoglobininterferens ved at teste negativt sputum beriget med MTB-positiv kontrol (25 kopier/pcr) og hæmoglobin fra 0,52 til 5,2 mg/ml. Ingen af koncentrationerne med beriget hæmoglobin udviste interferens med COBAS TaqMan MTB-testen. COBAS TaqMan MTB-testen blev evalueret for interferens med seks anti-tuberkulosemedikamenter, der normalt anvendes i behandlingen. De seks medikamenter (tabel 7) blev testet ved 1 x C max og 3 x C max ved at tilsætte medikamenter til negativ sputum med MTB-positiv kontrol-plasmid (~17 kopier/pcr). Der var ingen effekt på COBAS TaqMan MTB-testens performance med nogen af de seks medikamenter, der blev tilsat ved koncentrationer på 1 x C max og 3 x C max. Tabel 7 Anti-tuberkulosemedikamenter og C max -koncentrationer Medikament Kemisk navn Forkortelse C max (µg/ml) Isoniazid Isoniazid INH 5-7 Ethambutol Ethambutol-dihydroklorid ETH 1,7 Rifampicin Rifadin Rimactan RIF 7,99 Pyrazinamid Pyrazincarboxamid PZA 30-35 Kanamycin Kanamycin-monofulfat KM 2,0 Streptomycin Streptomycinsulfatsalt SM 25-30 Hæmning Hæmningsfrekvensen (ugyldig intern kontrol) for COBAS TaqMan MTB-testen blev bestemt via analyse af flere undersøgelser ved hjælp af sputum- og BAL-prøver samt MTB-dyrkningspanelmaterialer, i alt 1094 datapunkter. Den generelle hæmningsfrekvens for COBAS TaqMan MTB-testen for alle analyserede undersøgelser (prøver og MTB-dyrkningspanelmaterialer) var 0,0% (0/1094). 16

REFERENCER 1. World Health Organization Fact Sheet Nº 104 Revised April 2005. 2. Tuberculosis Elimination Revisited: Obstacles, Opportunities, and a Renewed Commitment Advisory Council for the Elimination of Tuberculosis (ACET). Morbidity and Mortality Weekly Reports 1999. (RR09): 1-13. 3. Metchock, B.G., Nolte, F.S. and Wallace, R.J. 1999. Mycobacterium, pp. 339-437: In: Manual of Clinical Microbiology, 7th ed., eds. Murray, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A. et al. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 4. Bloom, B.R. og Murray, C.J.L. 1992. Tuberculosis: commentary on a re-emergent killer. Science 257:1055-1063. 5. Böttger, E.C. 1991. Detection, differentiation, and systematics of bacterial pathogens - the family Mycobacteriaceae. Immunitat und Infection 19:143-152. 6. Daniel, T.M. 1990. The rapid diagnosis of tuberculosis: a selective review. Journal of Laboratory Clinical Medicine 116:277-282. 7. Hermans, P.W.M., Schuitema, A.R.J., Soolingen, D.V. et al. 1990. Specific detection of Mycobacterium tuberculosis complex strains by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology 28:1204-1213. 8. CDC. Nucleic Acid Amplification tests for Tuberculosis. MMWR 2000:49. 9. Pfyffer, G.E., Kissling, P., Jahn, E.M.I. et al. 1996. Diagnostic performance of amplified Mycobacterium tuberculosis direct test with cerebrospinal fluid, other nonrespiratory, and respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology 34:834-841. 10. Miller, N., Hernandez, S.G. and Cleary, T.J. 1994. Evaluation of Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and PCR for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology 32:393-397. 11. Bergmann, J.S., Keating W.E., Woods G.L. 2000. Clinical evaluation of the BDProbeTec ET system for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 38:863-865. 12. Yuen, K., Yam, W., Wong, L. et al. 1997. Comparison of two automated DNA amplification systems with a manual one-tube nested PCR assay for diagnosis of pulmonary tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 35:1385-1389. 13. J. C. Palomino. 2005. Nonconventional and new methods in the diagnosis of tuberculosis: feasibility and applicability in the field. European Respiratory Journal 26:339-350. 14. Ichiyama, S., Iinuma, Y., Tawada, Y. et al. 1996. Evaluation of Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and Roche PCR-microwell plate hybridization method (AMPLICOR Mycobacterium) for direct detection of mycobacteria. Journal of Clinical Microbiology 34:130-133. 15. Saiki, R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich, and N. Arnheim. 1985. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230:1350-1354. 16. Mullis, K. B. and F. A. Faloona. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology, 155:335-350. 17. Kent, P.T. and Kubica, G.P. 1985. US DHHS. Public Health Mycobacteriology. A guide for the level III laboratory. Centers for Disease Control, Atlanta, GA. 18. Böddinghaus, B., Rogall, T., Flohr, T. et al. 1990. Detection and identification of mycobacteria by amplification of rrna. Journal of Clinical Microbiology 28:1751-1759. 19. Longo, M. C., M. S. Berninger, and J. L. Hartley. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene, 93:125-128. 20. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 1999. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 21. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005. 22. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp. 17