KvægInfo nr.: 1471 Dato: 27-04-2005 Forfatter: Søren Borchersen,Preben Christensen Kønssorteret sæd det fungerer under danske forhold Af Udviklingsleder Søren Borchersen, Kvægavlsforeningen Dansire, E-mail: SOB@dansire.dk og Lektor Preben Christensen, Den Kgl. Veterinær og Landbohøjskole, E-mail: Preben.Christensen@klin.kvl.dk Anvendelse af kønssorteret sæd i kvægbruget er en drøm, som er ved at gå i opfyldelse. Perspektiverne ved kønssortering er store og åbenlyse i kvægavlen. Firmaet XY Inc. i Colorado har verdenspatent på sortering af sæd ved hjælp af flowcytometri. Metoden er i dag den eneste anvendte til kommerciel produktion af kønssorteret sæd. Nye danske tal på to engelske tyre fra avlsfirmaet Cogent i Chester, England, viser en drægtighedsprocent på 35-40 og på 15-25 for henholdsvis kvier og køer. Dette er lidt lavere end for konventionel sæd, men absolut interessant ved rigtig brug i praksis. Resultaterne viser samtidig en høj sikkerhed på kønnet på de to tyre varierende fra 85,4 procent til 90,3 procent fødte kviekalve. Undersøgelsen viser samtidig, at de fødte kalves overlevelse er normal. Resultaterne er i god overensstemmelse med mange mindre udenlandske insemineringsforsøg med kønssorteret sæd. Den danske opgørelse er den første større undersøgelse, hvor insemineringerne er foretaget af inseminører i almindelige kvægbesætninger. Kønssortering af sæd kan give mange fordele Perspektiverne ved kønssortering af tyresæd er store og åbenlyse for kvægbruget: Øget avlsfremgang også for de funktionelle egenskaber; Yversundhed, Resistens mod øvrige sygdomme, Kælvningsevne og Frugtbarhed i den enkelte besætning Mulighed for lettere kælvninger og flere levende kalve ved anvendelse af kviesæd (Xkromosombærende sæd) til kvier, fordi kviekalvene lettere fødes af kvier og har større overlevelsesevne end fødte tyrekalve Produktion af kødkvægs krydsningskalve i malkekvægsbesætninger (ved anvendelse af kødkvægtyre på de resterende køer og kvier) kan øge produktionen af kvalitetskød. Besætningen kan få de ønskede kviekalve og undgå aflivning af uønskede tyrekalve. Ulemperne er den højere pris pr. sæddosis; at metoden ikke giver 100 procent sikkerhed på kønnet samt de flere løbninger pr. drægtighed, der kan resultere i længere tomperiode. Dette opvejes dog rigeligt af de økonomiske og produktionsmæssige fordele ved kønssortering i form af bedre slagtedyr og større avlsfremgang i besætningen. Ved en besætningsudvidelse er det også muligt at drage nytte af kønssorteret sæd. Besætningen kan få flere kvier af eget opdræt og derved undgå indkøb med tilhørende smitterisiko. Det vil også være muligt at udsætte flere af besætningens dårligste køer ved overskud af kvier. En gennemsnitlig SDM-besætning kan tjene 13.000 kr. pr. år og en tilsvarende Jersey-besætning kan opnå en ekstra indtjening på 63.000 kr. pr. år i form af ekstra avlsfremgang og større kødproduktion ved brug af kønssorteret sæd (1). Den teknologiske udvikling Siden slutningen af 80èrne har det været muligt at foretage sortering af sædceller ved hjælp af flowcytometri, således at man ved efterfølgende inseminering har stor mulighed for at opnå det ønskede køn (2). Selvom der igennem mange år er forsket i forskellige metoder til adskillelse af sædceller med henholdsvis X- og Y- kromosom, er der pt. ikke andre metoder end flowcytometri som muliggør en høj sikkerhed i sorteringen (3). Sorteringshastigheden var indtil omkring 1998 på ca. 100 sædceller pr. sekund. Med udviklingen af highspeed flowcytometre til sortering blev det pludseligt muligt at sortere ca. 1500 sædceller pr. sekund (4,5). Hermed opstod der fornyet interesse omkring muligheden for kommerciel udnyttelse af kønssortering, og
sorteringshastigheden er siden blevet øget til ca. 5000 sædceller pr. sekund, da det har været muligt at opnå en bedre separation af sædcellerne (3). Firmaet XY Inc., Colorado, USA, blev stiftet i 1998. XY Inc. har opkøbt de relevante patenter på området samt etableret et samarbejde med DakoCytomation, som i dag producerer en speciel type high-speed flowcytometre til sortering af sædceller. Firmaet har siden 1998 etableret samarbejdsprojekter med avlsorganisationer og forskningsinstitutioner i bl.a. USA, Argentina, Tyskland, Japan, Schweiz, England, Australien og senest i Kina. Mere end 10.000 kalve er rapporteret født med metoden. Frugtbarheden ved anvendelse af kønssorteret sæd er stadig ikke på højde med almindelig inseminering (3). Den lavere frugtbarhed kan bl.a. skyldes, at der i forbindelse med kønssorteret sæd anvendes en lav insemineringsdosis (6). Andre potentielle muligheder for lavere frugtbarhed ved anvendelse af kønssorteret sæd er beskadigelse af sædcellerne ved sorteringen eller i forbindelse med indfarvning (7). Problemet omkring den lavere frugtbarhed er fortsat mangelfuldt belyst og udviklingsarbejdet hæmmes af, at det er tidskrævende og bekosteligt at foretage insemineringsforsøg. Fra dansk side er der siden 1995 satset på udviklingen af nye og mere præcise metoder til beskrivelse af sædens befrugtningsevne (8,9,10). Anvendelse af disse metoder i forbindelse med kønssorterering af sæd vil i højere grad muliggøre, at sæd, som ikke så godt tåler kønssortering og efterfølgende frysning, kan identificeres tidligt i processen. Samtidig kan metoderne anvendes til forbedring af den nuværende protokol for sorteringen samt efterfølgende sædbehandling og nedfrysning. De første danske resultater fra et større dansk fortyndingsforsøg viser forskelle i tyrenes egnethed til befrugtning (11). Flowcytometri-metoden Sædcellernes DNA-indhold farves med det fluorescerende farvestof Hoechst, 33342 (12). De levende sædceller indfarves i ca. en time med farvestoffet således, at farven afspejler DNA-indholdet i sædcellen. Den farvede X-sædcelle udsender proportionalt mere fluorescens end en Y-sædcelle, fordi sædceller, der bærer X-kromosomet indeholder 3-4 procent mere DNA end Y-sædcellen. Når flowcytometeret har registreret fluorescensen, behandles data i en computer, hvorefter væskestrømmen deles i dråber ved hjælp af en meget nøjagtig vibration i strålespidsen af røret. Herefter påføres dråben en ladning. X-cellerne får en negativ ladning og Y-cellerne en positiv ladning (3). Ved bunden af røret bevæger sædcellerne sig afhængig af køn mod en af apparatets to ladede poler afhængig af ladning og deles herved i henholdsvis en X- og en Y-population. I princippet vejes sædcellerne i tre bunker - en bunke med hunlige sædceller og en bunke med hanlige sædceller, samt en bunke med ikke bestemte sædceller. Sortering af sædceller har været fokuseret på kvæg og heste primært på grund af den kommercielle interesse. Interessen skyldes dog også den store anvendelse af kunstig inseminering for hest og kvæg, samt den anvendte insemineringsteknik. For svins vedkommende anvendes en insemineringsdosis, som er ca. 200 gange kvægets. Det tager derfor meget lang tid at kønssortere en dosis til svin og stiller større krav til insemineringsteknikken. Nye undersøgelser viser, at forskellen i DNA-indhold mellem X- og Y-sædceller er forskellig for de europæiske kvægracer og Brahman i Asien (13). Undersøgelsen viser også, at spermier fra Jersey-tyre har større forskel i DNA-indholdet for X- og Y-kromosombærende sædceller end eksempelvis tyre fra Holstein Frisian, Hereford og Angus (13). Stor forskel i DNA-indhold mellem X- og Y-sædceller gør sorteringen lettere. Effektiviteten ved sortering er afhængig af de enkelte trin i sorteringsprocessen. Ved sortering er effektiviteten typisk 22 procent svarende til, at der opsamles 11 procent X-sædceller og 11 procent Y- sædceller, mens resten går tabt (3). I en normal dosis tyresæd er ca. 10 procent af sædcellerne døde (14). En del af sædcellerne går tabt som følge af indfarvning, sortering og frysning. Efter sortering på flowcytometeret opsamles de X-sædceller og Y-sædceller i en Tris-æggefortynder (15). De sorterede sædceller opkoncentreres og fortyndes herefter i Tris-æggefortynderen til 2 mio. X-sædceller pr. insemineringsdosis. Det er vigtigt, at sæden er pakket præcist for at sikre indholdet i insemineringsdosis (13). Kønssorteret tyresæd er frosset med succes (13, 19). På grund af en sorteringshastighed på 5000 celler pr. sekund indeholder en dosis kønssorteret tyresæd kun ca. 2 mio. sædceller sammenlignet med, at en almindelig dosis tyresæd indeholder 10.-15. mio. sædceller.
Billedet viser et flowcytometer til sortering af tyresæd. Resultater af insemineringer med kønssorteret sæd i danske kvægbesætninger Kvægavlsforeningen Dansire indledte i 2003 et samarbejde med det engelske avlsfirma Cogent, Chester, England. Cogent er det første udenlandske avlsfirma med kommerciel produktion af kønssorteret sæd. Firmaet har siden opstarten med et apparat til sortering i 1999 øget kapaciteten til at omfatte 10 maskiner til sortering af tyresæd i døgndrift. Formålet var at få afprøvet de to Holstein Frisian-tyre O. Dreamer og C. Courier under almindelige praktiske forhold i danske kvægbesætninger samt at få undersøgt, om de fødte kalve er normale. Delmålene var at undersøge drægtighedsprocenten og sikkerhed på kønnet. 1500 doser af hver tyr er udleveret til inseminering i besætningerne. Dette svarer til det antal doser, der i dag anvendes ved afprøvning af en dansk ungtyr. Sæden blev solgt til den samme pris som en dosis dansk brugstyresæd (75 kr. pr. dosis). Resultaterne er derfor et godt billede på mulighederne for anvendelse af kønssorteret sæd i Danmark. Drægtighedsprocenter Resultaterne med de to engelske tyre er opgjort ved dataudtræk fra kvægdatabasen for perioden 1.1.2003-5.1.2005 (16). Tabel 1 viser insemineringsresultatet opgjort på drægtighedsprocent. Drægtige dyr er optalt som konstateret drægtighed ved drægtighedsundersøgelse af inseminør (ca. 90 procent) eller ved født kalv (ca. 10 procent). Ikke-drægtig er opgjort som negative drægtighedsundersøgelser og omløbere. Tabel 1. Insemineringsresultat opgjort på drægtighedsprocent* O Dreamer C Courier Insemineringsresultat KVIER KØER I alt KVIER KØER I alt Omløbere 540 92 632 685 107 792 Drægtige 337 27 364 305 19 324 I alt 877 119 996 990 126 1116 Drægtighedsprocent 38,4 22,7 36,5* 30,8 15,1 29,0* Insemineringer pr. drægtighed 2,6 4,4 2,7 3,2 6,6 3,4 * Gennemsnitlig drægtighedsprocent for konventionel tyresæd (10-15 mio. spermier pr. dosis) for alle køer og kvier er 38 procent i Danmark (17). Dette svarer til 2,5 dosis pr. drægtighed. Den gennemsnitlige drægtighedsprocent for O. Dreamer er 36,5 procent, svarende til en drægtighedsprocent for henholdsvis kvier og køer på 38,4 procent og 22,7 procent. Omregner vi dette til insemineringsdoser er der i gennemsnit til kvieinsemineringer anvendt 2,7 dosis kønssorteret sæd pr. drægtighed eller ca. en ekstra dosis pr. drægtighed sammenlignet med konventionel sæd. For køer ses et forbrug på 4,4 dosis pr. drægtighed eller ca. 1,5 dosis ekstra pr. drægtighed sammenlignet med konventionel sæd. Dette er i overensstemmelse med udenlandske resultater (13). De tilsvarende drægtighedsprocenter for C. Courier er lavere for både kvier og køer. Drægtighedsprocenten for konventionel sæd er i en israelsk undersøgelse opgjort til 64,6 procent for kvier (1,6 dosis pr. drægtighed), for 1. kalvs køer 43,0 procent (2,3
dosis pr. drægtighed), for øvrige køer 36,4 procent (2,7 dosis pr. drægtighed) (18). Dette illustrerer de biologiske forskelle afhængig af hundyrenes alder og viser den faldende drægtighedsprocent med stigende antal laktationer. Undersøgelsen viser samtidig at den gennemsnitlige drægtighedsprocent for alle insemineringer for 1. kalvs køer og øvrige køer er henholdsvis 36,9 procent og 32,8 procent. Ikke-omløberprocenter Tabel 2 viser de tilsvarende ikke-omløberprocenter for de to tyre. C. Courier er anvendt til inseminering med både konventionel og kønssorteret sæd. Der ses 12-15 procent point lavere ikke-omløberprocent for kønssorteret sæd sammenlignet med konventionel sæd. Sammenligning af tabel 1 og tabel 2 viser også forskellen i opgørelse på drægtighedsprocent og ikkeomløberprocenter, 0-56 dage. I tabel 1 er positiv drægtighed opgjort på basis af positive drægtighedserklæringer eller fødte kalv og negative drægtigheder er opgjort på basis af negativ drægtighedserklæring eller omløber med anden tyr. Ikke-omløberprocenten er opgjort på 0-56 dage i forhold til 1. inseminering og indeholder derfor ikke information om drægtighedsresultatet efter 56 dage. Der er en stor sammenhæng mellem drægtighedsprocenten og ikke-omløberprocenten. Generelt giver drægtighedsprocenten en lille undervurdering af frugtbarheden, fordi den ikke indeholder afgåede drægtige dyr. Ikke-omløberprocenten indebærer en overvurdering af frugtbarheden, da den ikke fortæller noget om tab af drægtighed efter dag 56. Kvægavlsforeningen benytter ikke-omløberprocenten, fordi den indeholder den første information om tyrens frugtbarhedsresultat. SDM-racen har en gennemsnitlig ikke-omløberprocent på 69 procent fordelt med ca. 63 procent og 73 procent for henholdsvis køer og kvier (11). Udvælgelse af tyrene er foretaget ud fra både avlsværdi og fertilitet. I begyndelsen af 2004 var C. Courier og O. Dreamers omregnede S-indeks henholdsvis 110 og 104. I dag er det omregnede S-indeks for begge tyre på 103. C. Courier blev således udvalgt på baggrund af avlsværditallet og knap så meget på grund af høj fertilitet, da tyrens ikke-omløberprocent er ca. 5 procent point under racens gennemsnit målt på kvier. Tabel 2. Ikke-omløberprocent Kønssorteret sæd (2 mio. sædceller pr. dosis) Konventionel sæd (15 mio. sædceller pr. dosis) Insemineringsresultat O Dreamer C Courier C Courier Kvier Antal - 1. ins. 778 770 318 Ikke-omløberprocent 62,6% 55,1% 67,9% Køer Antal - 1. ins. 145 139 291 Ikke-omløberprocent 51,0% 48,9% 63,4% Tabel 3 viser kalvenes tilstand ved fødsel. Procent levende kalve afviger ikke væsentlig fra gennemsnittet for SDM-racen, idet der er 90,4% levende for 1. kælvning og 94,7% levende efter 1 døgn for senere kælvninger. Sikkerheden på kønnet er på henholdsvis 85,4 procent og 90,3 procent for O. Dreamer og C. Courier. Dette er i god overensstemmelse med udenlandske undersøgelser (3). Tabel 3. Kalvens tilstand O Dreamer Kalvens tilstand Kælvning nr. Levende Død indenfor 1 døgn Aborter Tvillinger I alt 1 89,2% 10,8% 65 TYREKALVE 2 og senere 75,0% 25,0% 4 I alt 88,4% 10,1% 1,5% 69 1 90,5% 8,7% 0,8% 346 KVIEKALVE 2 og senere 87,8% 9,3% 3,5% 3,5% 57 I alt 90,1% 8,2% 1,2% 0,5% 403 I alt 89,8% 8,5% 1,1% 0,6% 472
Sikkerhed 403 : 472 = 85,4% C Courier Kalvens tilstand Kælvning nr. Levende Død indenfor 1 døgn Aborter Tvillinger I alt 1 80,0% 20,0% 30 TYREKALVE 2 og senere 100,0% 4 I alt 82,4% 17,6% 34 1 95,2% 4,8% 290 KVIEKALVE 2 og senere 88,0% 4,0% 8,0% 25 I alt 94,6% 4,8% 0,6% 315 I alt 93,4% 6,0% 0,6% 349 Sikkerhed 315 : 349 = 90,3% Tabel 4. Kalvens tilstand, gennemsnit SDM 2003 (20) (Procent levende og dødfødte) Død indenfor 1. Levende døgn 1. kælvning 90,2 9,8 2. og senere kælvning 94,7 5,3 Afslutning Danske kvægbrugere har en stor interesse i, at sortering af sæd også bliver muligt på sæden af danske brugstyre, da disse i forhold til udenlandske tyre har en fuld varedeklaration. Kendskab til både S-indeks og køn er både en økonomisk og etisk fordel for kvægbrugeren. Derfor afprøver Dansire i samarbejde med Cogent to danske Jersey-tyre Q Zik og Q Impuls. De første resultater er meget lovende med en ikkeomløberprocent på 66,3 procent for kvier og 66,7 procent for lakterende køer. Resultaterne viser at det er muligt at opnå brugbare resultater med kønssorteret sæd i praksis under danske forhold. Kønssortering er et eksempel på, at bioteknologien sætter nye rammer for gennemførelsen af det praktiske avlsarbejde. Metoden kan få stor betydning for avlsarbejdet i den enkelte besætning. Litteraturliste 1. Borchersen S. Kønssorteret sæd avls- og produktionsmæssige muligheder i din besætning. Dansk Kvægs Kongres, 2004. 2. Johnson LA, Flook JP, Hawk HW. Sex preselection in rabbits: live births from X and Y sperm separated by DNA and cell sorting. Biol Reprod 1989; 41:199-203 3. Seidel GE Jr, Garner DL. Current status of sexing mammalian spermatozoa. Reprod 2002;124:733-743. 4. Johnson LA, Welch GR. Sex preselection: high-speed flow cytometric sorting of X and Y sperm for maximum efficiency. Theriogenology 1999; 52:1267-1284. 5. Seidel GE Jr. Cran DG, Herickhoff LA, Schenk JL, Doyle SP, Green RD. Inseminations heifers with sexed frozen or liquid semen. Theriogenology 1999; 51:400 6. Seidel GE Jr. Fertility of bulls on the edge of the dose-response curve for numbers of sperm per inseminate. Proceedings of 17 th Technical Conference, NAAB 1998:18-24. 7. Guthrie HD, Johnson LA, Garrett WM, Welch GR, Dobrinsky JR. Flow cytometric sperm sorting: effects of varying laser power on embryo development in swine. Mol Reprod Devel 2002; 37:330-334. 8. Christensen P. Danish Semen Analysis: Fertility vs. Quality Tests. Proceedings of the 19 th Technical Conference on Artificial Insemination and Reproduction, NAAB 2002; 96-101. 9. Hansen C, Christensen P, Stryhn H, Hedeboe AM, Rode M, Boe-Hansen G: Validation of the FACSCount AF System for determination of boar sperm concentration. Reprod Domest. Anim. 2002; 61:87-92.
10. Boe-Hansen GB, Avery B, Christensen P, Lehn-Jensen H, Greve T. Sperm Chromatin Structure and IVF in Bulls with Low Fertility in Vivo. Proceedings 28 th Annual Conference of the International Embryo Transfer Society. Theriogenology 2003; 59:439. 11. Labouriau R, Christensen P, Pedersen J, Borchersen S. Analysis of a pilot experiment on semen dilution for artificial insemination in Cattle. Personlig kommunikation, 2005. 12. Johnson LA, Flook JP, Look MV. Flow cytometry of X and Y chromosome-bearing sperm for DNA using an improved preparation method and staining with Hoechst 33342. Gamete Res. 1987: 17:203-212. 13. Garner DL. Flow cytometric sexing of mammalian sperm. Theriogenology 2005, In press. 14. Christensen P. Personlig kommunikation, 2005 15. Schenk JL, Suh TK, Cran DG, Seidel GE, Jr. Cryopreservation of flow-sorted bovine sperm. Theriogenology 1999: 52: 1375-1391. 16. Flagstad P. Dansk Kvæg, Dataudtræk Kvægdatabasen. 2005 17. Andersen O. Dansk Kvæg. Reproduktionsopgørelse. Personlig Kommunikation, 2003. 18. Israelsk årsberetning: Daniel Hojman: The Dairy Industry In Israel. ISRAEL DAIRY BOARD and ISRAEL CATTLE BREEDERS ASSOCIATION, 2003. 19. Thomas CA, Garner DL, DeJarnette JM, Marshall CE. Effect of cryopreservation on bovine sperm organelle function and viability as determined by flow cytometry. Biol Reprod 1998; 58:786-793. 20. Dansk Kvæg. Årsstatistik Avl 2003-2004, Rapport 109, 2004. KvægInfo nr.: 1471 Dansk Kvæg