AdnaTest ProstateCancerSelect Berigelse af tumorceller fra blod fra prostatacancerpatienter til genekspressionsanalyse Til in vitro-diagnostisk brug Vejledning T-1-520
Indhold Bestillingsinformation... 3 Tiltænkt formål... 3 Forkortelser og symboler... 4 Patenter og registrerede varemærker... 4 Produktbeskrivelse... 5 Kittets komponenter... 6 Yderligere påkrævede materialer... 7 Opbevaringsforhold... 8 Oplysninger om anvendelse... 8 Advarsler og forholdsregler for in vitro-diagnostisk brug... 10 Protokol... 11 A. Forberedelse af ProstateSelect-kugler... 11 B. Valg af tumorceller... 12 Ydelseskarakteristika... 14 Kort vejledning... 14 2
Bestillingsinformation Bestillingsinformation findes på www.qiagen.com og www.adnagen.com. Derudover kan QIAGENs supportteam i Hannover besvare spørgsmål vedrørende AdnaTests (support@adnagen.com). Tiltænkt formål blev udviklet til berigelse af cirkulerende tumorceller fra perifert blod fra prostatacancerpatienter og er beregnet til in vitro-diagnostisk brug. AdnaTest ProstateCancerDetect anbefales til den efterfølgende analyse af genekspression i forbindelse med prostatacancer. 3
Forkortelser og symboler AdnaMag-L AdnaMag-S bp cdna DNA mrna PCR RNase o/min. RT Magnetisk partikelkoncentrator (-stor) Magnetisk partikelkoncentrator (-lille) Basepar Komplementær deoxyribonukleinsyre Deoxyribonukleinsyre Messenger-RNA Polymerasekædereaktion Ribonuklease Omdrejninger pr. minut Revers transkriptase Anvendes inden Temperaturgrænse Katalognummer Se de informationer, der er angivet i håndbogen Producent Medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik Patenter og registrerede varemærker Dynabeads er et registreret varemærke tilhørende Invitrogen og Life Technologies Corporation. 4
Produktbeskrivelse muliggør immunomagnetiske berigelse af tumorceller via epiteliale og tumorforbundne antigener. Antistoffer mod epiteliale og tumorforbundne antigener er konjugeret til magnetiske kugler (Dynabeads ) til mærkning af tumorceller i perifert blod. Mærkede celler ekstraheres via en magnetisk partikelkoncentrator (AdnaMag-L og AdnaMag-S) og lyseres efterfølgende (figur 1). Cellelysatet anvendes til yderligere analyse (det anbefales at fortsætte med AdnaTest ProstateCancerDetect). ProstateSelectkugler Inkubering Adskillelse Cellelysering RNA Oprensning af mrna med magnetiske kugler dækket med Oligo(dT) 25 Revers transkriptase Blodceller Tumorceller RNA RNA cdna Magnetiske kugler dækket med antistof eller Oligo(dT) 25 AdnaTest ProstateCancerDetect Figur 1. Skematisk oversigt over prøveforberedelsen 5
Kittets komponenter indeholder følgende komponenter: Tabel 1. Kittets komponenter Komponent ProstateSelect Beads (ProstateSelect-kugler) Lysis/Binding Buffer (Lyse-/bindingsbuffer) Symbol T-1-520 (12 prøver) 1 1 2 1 6
Yderligere påkrævede materialer Udstyr: Rørrotator til 15 ml og 1,5 ml rør Magnetiske partikelkoncentratorer AdnaMag-L (QIAGEN Hannover GmbH, katalognr. T-1-700) AdnaMag-S (QIAGEN Hannover GmbH, katalognr. T-1-800) Materialer: Sterilt, RNase-frit 10 ml glas eller plastikpipetter og pipetteringsenhed Sterile, RNase-frie 1,5 ml reaktionsrør (f.eks. Sarstedt, katalognr. 72.690) 15 ml rør (brug sterile, RNase-frie polypropylenrør f.eks. Sarstedt, katalognr. 65.554.502) Pipetter og RNase-frie pipettespidser med aerosolbarrierer, som passer til pipetteringsvolumener fra 100 µl til 1.000 µl Beskyttelseshandsker, sikkerhedsbriller Reagenser: Fosfatbufferet saltvandsopløsning (PBS), ph 7,0-7,3 (f.eks. Fisher, katalognr. VX14190169, D-PBS) 7
Opbevaringsforhold skal opbevares ved 4-8 C. Ingen komponenter må bruges efter udløbsdatoen. Oplysninger om anvendelse I tilfælde af eksterne skader på kittets æske eller enkeltkomponenter skal man kontakte QIAGENs tekniske service (se kontaktoplysningerne på www.qiagen.com). Testen skal udføres af personale med kvalifikationer inden for molekylærbiologiske teknikker. Prøveforberedelse: Blodprøver skal tages før anvendelsen af terapeutiske stoffer. Brug ikke AdnaTest før 7 dage efter den sidste terapeutiske intervention! Blodprøvetagning: Brug kun AdnaCollect-blodprøvetagningsrør (katalognr. T-1-600, QIAGEN Hannover GmbH) eller rør, der indeholder EDTA som antikoagulans til blodprøvetagning (f.eks. "S Monovette Kalium EDTA", Sarstedt; "BD Vacutainer K3EDTA", Becton Dickinson), til at udtage mindst 5 ml fuldblod. Der må ikke anvendes heparin og citrat. Blodet skal straks opbevares ved 4-8 C. 8
Prøver skal behandles så hurtigt som muligt og ikke senere end 4 timer efter blodprøvetagningen, når der anvendes standard-edta-rør, eller inden for 24 timer, når der anvendes AdnaCollect. Blodprøven må ikke hæmolyseres. Håndtering: ProstateSelect-kugler 1 indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. Natriumazid er cytotoksisk og skal derfor fjernes, før kuglerne bruges. Alle komponenter og ekstra reagenser fra andre leverandører skal opbevares i henhold til deres instruktioner. Sikkerhedsrådene fra de pågældende producenter er gældende. Bær beskyttelseshandsker for at undgå kontaminering med DNA, RNA og RNase. Alikvotér ProstateSelect-kuglerne for at undgå kontaminering. Testen skal udføres i denoteret sekvens og skal overholde alle de specifikationer, der er angivet med hensyn til inkuberingstider og inkuberingstemperaturer. Kassér prøver, hvis udvælgelseskuglerne agglutinerer under celleberigelsen. Udfør om muligt prøvebehandling inkl. revers transkriptase og efterfølgende analyse af forstærkede PCR-produkter i forskellige rum for at undgå krydskontaminering. Brugen af produkter fra andre leverandører end de foreslåede kan medføre ringere resultater. 9
Advarsler og forholdsregler for in vitro-diagnostisk brug Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Der findes flere oplysninger i de tilhørende sikkerhedsdatablade (safety data sheets, SDS'er). Disse er tilgængelige online i et praktisk og kompakt PDF-format på adressen www.qiagen.com/safety, hvor det er muligt at finde, få vist og udskrive SDS'et for hvert QIAGEN-kit og hver kitkomponenter. Prøve- og analyseaffald skal bortskaffes i henhold til lokale sikkerhedsregler. 10
Protokol A. Forberedelse af ProstateSelect-kugler Det er nødvendigt at fjerne natriumazid ved at vaske Prostate- Select-kuglerne før brug: 1. Genopslæm ProstateSelect-kuglerne 1 grundigt ved hjælp af pipettering. De må ikke vortexes! 2. Beregn det antal ProstateSelect-kugler 1, som kræves for at behandle alle prøver (100 µl pr. prøve), og overfør det beregnede antal til et 1,5 ml reaktionsrør. Hvis der behandles mere end 10 prøver, skal der anvendes ekstra 1,5 ml reaktionsrør. 3. Placer røret i AdnaMag-S. 4. Efter 1 min. skal supernatanten fjernes med en pipette. Vigtigt for hver procedure: Kuglerne må ikke berøres, når man fjerner supernatanterne! 5. Vask a. Fjern magnetskyderen fra AdnaMag-S. b. Tilsæt 1 ml PBS, og genopslæm kuglerne ved hjælp af gentagen pipettering. c. Sæt magnetskyderen ind i AdnaMag-S. d. Efter 1 min. skal supernatanten fjernes helt med en pipette. Gentag proceduren to gange (tre vaske i alt). 6. Fjern røret fra AdnaMag-S, og genopslæm kuglerne i PBS til den oprindelige volumen (100 µl pr. prøve). 11
B. Valg af tumorceller 1. Pipettér 5 ml af en blodprøve i et 15 ml rør. (Brug kun godkendte blodprøvetagningsrør, se side 8) 2. Genopslæm ProstateSelect-kuglerne grundigt (forberedt i trin A6) ved at pipettere og tilsætte 100 µl af disse kugler i hver blodprøve. 3. Vend rørene langsomt (ca. 5 o/min.) i 30 min. ved stuetemperatur på en enhed, som både kan vippe og rotere. 4. Placer rørene i AdnaMag-L uden magnetskyder. Sving AdnaMag-L nedad for at frigøre bloddråber, som sidder fast i hætten. 5. Indsæt magnetskyderen, og inkuber rørene i AdnaMag-L i 3 min. ved stuetemperatur. 6. I mellemtiden skal lyse-/bindingsbuffer 2 temperaturudlignes til stuetemperatur. Bemærk: Kontrollér, at lyse-/bindingsbufferen ikke indeholder bundfald. Hvis der er bundfald, skal bufferen temperaturudlignes til stuetemperatur og blandes, indtil den er helt opløst. 7. Fjern blodsupernatanten helt med en 10 ml pipette uden at røre kuglerne. 8. Vask a. Fjern magnetskyderen fra AdnaMag-L. b. Tilsæt 5 ml PBS, luk rørene, og ryst AdnaMag-L forsigtigt frem og tilbage 5 gange for at genopslæmme de magnetiske kugle-/cellekomplekser. c. Sving AdnaMag-L med rørene nedad to gange for at frigøre dråber, som sidder fast i hætten. 12
d. Placer magnetskyderen i AdnaMag-L, og inkuber i 1 min. ved stuetemperatur. e. Fjern supernatanten helt med en pipette. Gentag proceduren to gange (tre vaske i alt). 9. Fjern magnetskyderen fra AdnaMag-L. 10. Genopslæm de magnetiske kugle-/cellekomplekser i 1 ml PBS, og overfør hver prøve til et 1,5 ml reaktionsrør. 11. Placer reaktionsrørene i AdnaMag-S med en indsat magnetskyder. Bemærk: Magnetskyderen til AdnaMag-S kan indsættes to steder. Indsæt altid skyderen med hvide plastikfilm fremadvendt for at sikre, at magneterne er tæt på reaktionsrørene. 12. Efter 1 minut skal supernatanterne fjernes helt med en pipette for at optimere følgende cellelysering! 13. Fjern magnetskyderen fra AdnaMag-S. 14. Tilsæt 200 µl lyse-/bindingsbuffer 2 (temperaturudlignet til stuetemperatur) til hvert reaktionsrør. Genopslæm ved at pipettere mindst fem gange. 15. Indsæt magnetskyderen i AdnaMag-S, og inkuber i 1 min. 16. Overfør supernatanter (cellelysater) til nye 1,5 ml reaktionsrør. 17. Kassér rørene med kuglerne. 18. Fortsæt straks med mrna-isolation (AdnaTest ProstateCancer- Detect), eller opbevar cellelysaterne ved maks. -20 C i højst 2 uger. 13
Ydelseskarakteristika Se www.qiagen.com/hb-2100-d01 for ydelseskarakteristika for. Kort vejledning Komponenter ProstateSelect Beads (ProstateSelect-kugler) Lysis/Binding Buffer (Lyse-/bindingsbuffer) 1 2 Til hver prøve skal du bruge 5 ml fuldblod (se side 8 for at få flere oplysninger) 1 15 ml rør 2 1,5 ml reaktionsrør 10 ml glas- eller plastikpipetter (RNase-frie) og pipetteringsenhed 100-1.000 µl pipetter og pipettespidser (RNase-frie) Protokol Genopslæm ProstateSelect-kuglerne 1 grundigt, og overfør 100 µl for hver blodprøve til et 1,5 ml reaktionsrør. Vask ProstateSelect-kuglerne med 3 1 ml PBS. Genopslæm ProstateSelect-kuglerne i 100 µl PBS pr. blodprøve. Overfør 5 ml fuldblod til et 15 ml rør. Tilsæt 100 µl vaskede ProstateSelect-kugler i hver blodprøve. 14
Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur under vipning og rotation ved ca. 5 o/min. Sæt røret 3 min. i AdnaMag-L for at adskille kuglerne. Frigør eventuelle bloddråber, som sidder fast i hætten, ved at svinge AdnaMag-L nedad. Fjern blodsupernatanten. Vask kuglerne med 3 5 ml PBS. Genopslæm kuglerne i 1 ml PBS, og overfør dem til et nyt 1,5 ml reaktionsrør. Adskil kuglerne i AdnaMag-S, og fjern supernatanten. Genopslæm kuglerne i 200 µl lyse-/bindingsbuffer 2 ved at pipettere mindst fem gange. Placer reaktionsrørene i AdnaMag-S, og overfør supernatanten til et nyt reaktionsrør. Fortsæt straks med AdnaTest ProstateCancerDetect, eller opbevar dem ved maks. -20 C i højst 2 uger. 15
HB-2099-DA-001# QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse 1 D-40724 Hilden TYSKLAND For support skal du kontakte Tlf.: +49 (0) 511 72 59 50-50 Fax: +49 (0) 511 72 59 50-40 E-mail: support@adnagen.com Internet: www.adnagen.com og www.qiagen.com