PATENT 110208 Int. Cl. A 61 k 3/62 Kl. 30h 6 Ansøgning nr. 2011/65 Indleveret den 21. apr. 1965 Fremlagt den 19. dec. 1966 DANMARK DIREKTORATET FOR PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET KØBENHAVN Patentbeskrivelsen offentliggjort den 21. dec. 1970 Fortrinsret påberåbt fra den 22. apr. 1 964 nr. B 76450, Forbundsrepublikken Tyskland. - BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg an der Lahn, Forbundsrepublikken Tyskland. Fuldmægtigundersagensbehandling: Ingeniørfirmaet Budde, Schou 8c Co. Fremgangsmåde til fremstilling af influenza-vacciner. Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af influenza-vacciner. Det er allerede kendt, at influenzavira kan. dyrkes i hønseæg. Denne metode har imidlertid den ulempe, at influenzavirusets beskyttende virkning aftager i løbet af passagebehandlingen i æg, og at der ved æggepassagerne fås en influenzavirus, af hvilken der kun kan fremstilles en i utilfredsstillende grad-beskyttende vaccine. Det er også allerede blevet forsøgt at dyrke influenzavira mus og fremstille en vaccine af lungevævet. Ganske vist forbliver influenzaviruset stabilt i sin beskyttende virkning ved musepassagerne, men det er teknisk vanskeligt at udvinde større mængder influenzavirus fra mus.
110208 Der er nu blevet fundet en velegnet fremgangsmåde til fremstilling af influenza-vacciner, som ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man dyrker influenzavira, der er patogene for patte-. dyrs respiratoriske systems epitel, i lungevæv af pattedyr, indtil patogeniteten for det respiratoriske systems epitel har nået et maksimum og ikke mere aftager ved derpå følgende rugeægspassager, og derefter overfører dem til under rugning værende fertile hønseæg, bringer dem til formering deri og på i og for sig kendt måde fremstiller en vaccine ud fra den virusholdige allantoisvæske. De anvendte influenzavira kan være influenzavirustyperne A, B og C og deres stammer, f.eks. A/PR8, A l /FM 1, A l /Ann Arbor, A2/Asia, A 2 /Japan, B/Stockholm, B/Johannesburg, B/Maryland, B/Lee eller C/Taylor. Som lungevæv af pattedyr, hvori influenzaviraene dyrkes, indtil de ved rugeægspassager ikke mere ændrer deres patogenitet for det respiratoriske systems epitel, kommer især lungevæv af f.eks. mus, væseler, marsvin, rotter, heste eller svin i betragtning. Influenzaviraene kan f.eks. dyrkes i mus efter C.E. van Rooyen og A.J. Rhodes, Virus Diseases of Man (Nelson, New York 1948), side 602 og 603. Også vævskulturer af lungevæv kan med godt resultat anvendes til formering af influenzaviraene. Til udvinding af virusmateriale til vaccinefremstillingen overføres vira fra f.eks. en muselungevævspassage, hvilke vira ved rugeægspassager bibeholder deres patogenitet over for det ovennævnte epitel, til det under rugning værende fertile hønseæg. Dyrkningen i hønseæg kan f.eks. udføres efter C.E. van Rooyen og A.J. Rhodes, Virus Diseases of Man (Nelson, New York 1948), side 616-621. En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen består at man mellem den 6. og 12., fortrinsvis på den 8. eller 9. rugedag inficerer det fertile, i forvejen rugede hønseæg med 0,01-0,5, fortrinsvis 0,1 ml af en influenzavirus-suspension i en fortynding på op til 10-9, fortrinsvis en fortynding på 10-4, i allantois-hulen. Som fortyndingsvæske kan anvendes enhver isotonisk opløsning, f.eks. en Tyrode-kogsalt-opløsning, fysiologisk kogsaltopløsning, phosphatpufret kogsaltopløsning med en ph-værdi på 7, Hanks' opløsning eller Earle's opløsning. Derpå bringes viruset til formering, idet de
3 110208 inficerede hønseæg ruges ved temperaturer mellem 28 og 38 C, fortrinvis mellem 32 og 36,5 C. Hensigtsmæssigt udvindes det flydende æggeindhold (allantoisvæsken) efter 2 dages f'orløb. Denne allantoisvæske kan på i og for sig kendt måde anvendes til fremstilling af en vaccine. Den kan også benyttes til yderligere passager i hønseæg. Til fremstilling af en vaccine anvendes allantoisvæsken uforandret eller - efter en forudgående rensning, f.eks. filtrering gennem et klarelag, eller koncentrering, f.eks. ved ultracentrifugering eller chromatografi, eller både filtrering og koncentrering. Således kan sedimentet ved udførelse af f.eks. en ultracentrifugering optages i en isotonisk opløsning, f.eks. en Tyrode-kogsalt-opløsning. Derefter er det muligt at tilsætte f.eks. et inaktiveringsmiddel eller konserveringsmiddel eller begge dele samt eventuelt et adjuvans. Som adjuvans benyttes f.eks. aluminiumphosphat, alun og ukomplet Freundsk adjuvans, men fortrinsvis aluminiumhydroxid. Adjuvansmængderne kan hensigtsmæssigt ligge fra ca. 0,1 til ca. 2%, fortrinsvis - især ved tilsætning af aluminiumhydroxid - fra 0,3 til 1%. - Som inaktiveringsmiddel anvendes fortrinsvis formaldehyd. Efter inaktiveringen afbindes det ikke forbrugte formaldehyd hensigtsmæssigt med natriumbisulfit i en mængde på 1 1/2 gang den støkiometriske mængde. Til inaktivering egner sig også f.eks. hydroxylamin, ultraviolet stråling og P-propiolacton. Som konserveringsmiddel kan f.eks. anvendes følgende: "Merthiolate" (natriumsalt af ethylmercuri-thiosalicylsyre), "Phemerol" (2-j'-(p-diisobutylphenoxy)-ethox7-ethyldimethylbenzylammoniumchlorid), "Thiocid" (natriumsalt af p-ethylkviksølvmercaptophenyl-- sulfonsyre) og phenol. Hæmagglutinationstiteren af de enkelte influenzavirusstammer i de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede vacciner kan f.eks. ligge mellem ca. 100 og ca. 5000 HAE/ml, fortrinsvis mellem 1000 og 3000 HAE/ml. Alt efter vaccinernes tilsigtede anvendelsesformål kan titerområderne også efter ønske over- eller underskrides. Virkningen af de vacciner, som er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, bestemmes ved det "direkte musebeskyttelsesforsøg". Bedømmelsen af den af vaccinen fremkaldte immunitet foretages her på grundlag af omfanget af lungeforandringerne og antallet af
4 110208 overlevende mus. Det har vist sig, at ikke hæmagglutinationshæmningsprøven, men det direkte musebeskyttelsesforsøg er afgørende for bedømmelsen af den beskyttende virkning. Ved hæmagglutination'sprøven kan nemlig forskellige influenza-vacciner vise sig lige gode, selv om de ved musebeskyttelsesforsøget viser signifikante forskelle. Til gennemførelse af musebeskyttelsesforsøget går man hensigtsmæssigt frem på følgende måde: Mus med en vægt på 25 g immuniseres hver intraperitoriealt med 0,25 ml af den virussuspension, der skal bestemmes. Efter 40 eller flere dages forløb inficeres de immuniserede mus nasalt med virusholdigt lungepulverisat. Hertil pulveriseres med sand to lunger af 48 timer tidligere nasalt inficerede mus, pi;oduktet fortyndes til en koncentration på 1:10 med Tyrode-kogsalt-opløsning, overlaget centrifugeres efter afsætning i 10 minutter ved 3000 omdrejninger pr. minut, og den herved fremkomne overfraktion fortyndes til 1:100. Denne fortyndings titer er 10.000 letale doser/ml. Til infektionen narkotiseres musene med ether, og deres næse neddyppes i løbet af 4 sekunder flere gange i muselungepassage-virusfortyndingen. Til kontrol inficeres 20 normalmus. Døde mus dissekeres, og lungediagnosen registreres. De overlevende dræbes efter 12 dages forløb med ether og dissekeres. Lungediagnoserne aflæses senest 1 time efter dissekeringen, idet der anvendes bedømmelsesværdierne 0 til 4. Som værdi angives det aritmetiske gennemsnit af alle lungediagnoserne. I nedenstående bedømmelsesskala er forholdet mellem lungeforandringerne, talværdierne og immunitetsgraden opført: Talværdi hele lungen pneumonisk 4 3/4 af lungen pneumonisk 3 Immunitetsgrad ingen immunitet ingen immunitet svag, partiel immunitet den halve lunge pneumonisk,2 1/4 af lungen pneumonisk 1 tydelig partiel immunitet 1/8 af lungen pneumonisk 0,5 stærk partiel immunitet yderst små pletter til negativ 0,25-0 stærk partiel til fuld immunitet
5 110208 Viruskoncentrationen kan også bestemmes med hæmagglutinationen. Herved forstås det fænomen, at hønseerythrocyterne klumper sig sammen ved kontakt med virusholdige opløsninger. De ved denne prøve fundne enheder betegnes HAE og henføres til 1 ml. 'Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dyrkede influenzavirus A 2/Asia har f.eks. en hæmagglutinationstiter på 2560 og derover pr. ml. De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede vacciner udviser en betydelig bedre virkning i forhold til kendte influenzavacciner. Således udviste f.eks. 20 børn, som blev vaccineret med ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillet vaccine, i mængder på 2000 HAE-enheder antigen pr. dosis, allerede efter vaccinering alle sammen antistofdannelse, dvs. antistofdannelsen andrager 100%. Ved en vaccinering af voksne med den samme mængde af en kendt influenza-vaccine (L. Heller, B. KUrtoft, J. MUrner og B. Zetenberg, Nord. Med. 60, 1706 (1958) og L. Heller, Bull WHO 20,.377 (1959)) optrådte der efter 6n vaccinering kun antistofdannelse hos 68% af de vaccinerede, efter to vaccineringer kun hos 78%. Denne virkningsmæssige overlegenhed er så meget mere bemærkelsesværdig, som børn er vanskeligere at immunisere mod influenza end voksne. De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede vacciner' har den fordel, at de til en storproduktion nødvendige virusmængder kan udvindes på simpel måde i laboratoriet under ringe arbejdsopbud og ved lave produktionsomkostninger. Efter at det var kendt, at influenzavirusets antigenitet forringes ved æggepassager, skulle det forventes, at det ved passager i mus dyrkede influenzavirus ligeledes ville blive beskadiget ved æggepassager, men på overraskende måde bibeholdes antigeniteten fuldstændig. Eksempel 1 a) 40 ml af en blandingsallantoisvæske af influenzavira A 2/Asia stamme Singapore, som er dyrket gennem 81 rugeægspassager, blandes med 20 ml phosphatpuffer med ph-værdi 7,0 og rystes i 30 minutter i et rysteapparat. b) 40 ml af en blandingsallantoisvæske af influenzavira.a 2/Asia stamme Singapore, som er dyrket gennem 424 muselungepassager og derpå gennem 33 rugeægspassager, blandes med 20 ml phosphatpuffer med ph-værdi 7,0 og rystes i 30 minutter i rysteapparatet.
110208 c) 40 ml af en blandingsallantoisvæske af influenzavira A 2/Asia - stamme Singapore, som er dyrket gennem 81 rugeægspassager, blandes - med 20 ml phosphatpufret aluminiumhydroxid med en ph-værdi på 7,0 og rystes i 30 minutter i rysteapparatet. -d) 40 ml af en blandingsallantoisvæske af influenzavira A 2/Asia stamme Singapore, som er dyrket gennem 424 muselungepassager og derpå gennem 33 rugeægspassager, blandes med 20 ml phosphatpufret aluminiumhydroxid med -peværdi 7,0 og rystes i 30 minutter i rysteappa- - ratet. Alle fire vacciner har samme viruskoncentration på 850 HAE/ml. De. prøves ved det direkte musebeskyttelsesforsøg. Inficeringen fore-. tages ved vaccinerne a og b efter 99 dages forløb, og ved vaccinerne c og d efter 100 dages forløb. Resultaterne fremgår af følgende tabel: Vaccinens art Overlevdnde Direkte musebeskyttelsesforsøg Gennemsnitligt dissektionsresultat, immunitetsgraden udtrykt ved de ovenfor forklarede bedømmelsesværdier De over- De overlevende levende og de døde Den brøkdel af musene, der udviser dissektionsresultat 0,25-0 Rugeægspassagerække 81 11/20 55% 2,44 1,39 1/20 Muselunge- og rugeægspassage-.række 424/33 18/20 90% 1,15 0,88 7/20 Rugeægspassagerække 81 med A1(OH) 3 17/20 85% 1,19 0,69 6,20 Muselunge- og rugeægspassagerække 424/33 med Al(OH) 3 20/20 100% 0,39 0,39 13/20 Kontrol 0/20 3,83 0/20
110208 Tabellen viser, at inden for de to vaccinepar immuniserer vaccinerne (a og c) af den rene allantoisrække svagere end vaccinerne (b og d) af de vira, som før allantoi -srækken er formeret gennem muselungerne. Den kraftigere virkning fremgår af antallet af overlevende mus, af tallene for gennemsnitsdissektionsresultaterne og af hyppigheden af resultaterne "0,25-0 (stærk partiel til fuldstændig immunitet)". Disse data beviser de overlegne egenskaber af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dyrkede influenzavira i forhold til de efter den kendte teknik dyrkede influenzavira. Forskellene er særlig store ved vaccine b i forhold til vaccine a, men også entydige ved vaccine d i forhold til vaccine c. Eksempel 2 5 ml af en blandingsallantoisvæske af et influenzavirus fremstillet ved 454 muselungepassager og 29 rugeægspassager tilsættes 45 ml Tyrode-kogsalt-opløsning (1:10) og blandes med 50 ml Al(OH) 3. Derved fortyndes allantoisvæsken til 1:20, deri indeholder 32 HAE/- 0,25 ml, og Al(OH) 3 -indholdet er 0,75%. Vaccinen bedømmes ved den direkte musebeskyttelsesprøve med 6 mus. Belastningsinfektionen foretages efter 102 - dages forløb. Vaccinen giver fuldstændig beskyttelse. Alle 6 mus, som inficeres til belastning af immuniteten, forbliver i live, og de har et gennemsnitligt lungedissektionsresultat på kun 0,25-0. Forsøget viser, at det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dyrkede influenzavirus selv i 20 ganges fortynding stadig tillader fremstillingen af en vaccine, som giver en fuldstændig immunitetsbeskyttelse. Ved et på tilsvarende måde gennemført forsøg med allantoisfortyndingen 1:40 (16 HAE/0,25 ml) beskyttes stadig 80% (1 ud af 6 mus dør), det gennemsnitlige dissektionsresultat er for de 6 mus en immunitetsgrad på 0,85, og hos 4 af de 6 mus findes der ved dissektionen en immunitetsgrad mellem 0,25 og 0. Immunitetsbeskyttelsen er således trods den 40 gange så store allantoisfortynding mindst lige så stor som immunitetsbeskyttelsen af den i eksempel 1 c angivne, efter den-kendte teknik fremstillede vaccine med ufortyndet allantoisvæske af den rene rugeægspassage-række.
110208 En vaccine af det samme virus, der indeholder allantoisvæsken med en slutfortynding på 1:16-40 HAE/0,25 ml vaccine - og 0,1% Al(OH) 3, beskytter alle 6 mus fuldstændigt. Ved dissektionen findes der en gennemsnitlig immunitetsgrad på 0,25, og hos 5 af de 6 mus er immunitetsgraden mellem 0,25 og 0. Også denne vaccineammensætning viser, at de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dyrkede vira fremkalder en god immunitetsbeskyttelse. Eksempel 3 100 ml af en allantoisvæske, hvis vira er renset for uspecificerede ledsagestoffer ved 2 ganges ultracentrifugering (1 time ved 20.000 omdrejninger pr. minut) og optagelse af sedimentet i phosphatpuffer med ph-værdi 7,0, tilsættes 0,037% formaldehyd, får lov at henstå i 12 timer ved 20 C og tilsættes derefter Al(OH) 3 til en koncentration på 0,5%. Ved det direkte musebeskyttelsesforsøg fås der følgende resultater: Direkte musebeskyttelsesforsøg Inficering efter Døde Gennemsnitligt Den brøkdel dissektionsresultat, af musene, immunitetsgraden der udviser udtrykt ved de dissektionsovenfor forklarede resultat bedømmelsesværdier 0,25-0 41 dage 0/25 0,21 22/25 Resultaterne viser, at det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dyrkede virus også giver en god beskyttelse, når viruset inaktiveres med formaldehyd. Eksempel 4 Et influenzavirus type B, stamme Marburg 5, overføres efter 166 muselungepassager - titeren er 10-3 til 10-4 for mus letale enheder/ml - på hønseæg, allantoisvæsken udvindes, og der fremstilles fra en yderligere rugeægspassage under anvendelse af pufret Al(OH) 3 en aluminiumhydroxid-adsorbatvaccine. 24 mus immuniseres med denne vaccine og inficeres 40 dage efter immuniseringen med 100 letale doser.
9 110208 De overlever alle. 20 af dem har på den 12. dag lungediagnoser mellem 0,25 og 0, (stærk partiel til fuldstændig immunitet). Derimod dør 14 ud af 15 kontrolmus. Patentkra v. Fremgangsmåde til fremstilling af influenza-vacciner, kendetegnetved, at man dyrker influenzavira, der er patogene for pattedyrs respiratoriske systems epitel, i lungevæv af pattedyr, indtil patogeniteten for det respiratoriske systems epitel har nået et maksimum og ikke mere aftager ved derpå følgende rugeægspassager, og derefter overfører dem til under rugning værende, fertile hønseæg, bringer dem til formering deri og på i og for sig kendt måde fremstiller en vaccine ud fra den virusholdige allantoisvæske, Fremdragne publikationer: Journal of Bacteriology, 57 (1949), nr. 4, 399-403 Antonie van Leeuwenhoek, 18 (1952), nr. 2, 139-152 J. Exp. Ked. 101 (1955), 627 Bull. World Hlt h. Org., 6 (1952), 473-480.