Hvorfor er vi der? Cytogenetisk diagnostik 2005 (PCR, FISH, CGH) Thue Bryndorf Kromosomlaboratoriet Klinisk Genetisk Afdeling Dr. Lejeune Trisomi 21 (Downs Syndrom) Oplæg Klassisk cytogenetik (kromosomer) Nye metoder Kromosom-PCR til hurtigt at diagnosticere de hyppigste fosterkromosomfejl FISH og CGH til mere sensitiv kromosomdiagnostik 1
Prænatale prøvetyper Chorion villus biopsi Fra 11u+0d Amniocentese Fra 15u+0d Kromosomundersøgelse I Cirka 7.500/år i DK. Dyrkning af fostervands- eller chorion villus celler i 10-12 dage Standsning i delingsfase og herefter fremstilling af karyotype (d.v.s. samlet billede af alle fostrets kromosomer) og Kromosomoptælling Svartid: 2-3 uger Metafasekromosomer Karyotype 2
Kromosomundersøgelse II Hyppigste fund er NY-opståede sygdomme med ekstra eller manglende kromosomer (numeriske aneuploidier) Prænatalt detekterede kromosomfejl i DK, 1993-2000 Trisomi 21 Trisomi 18 Trisomi 13 Trisomi 13, 18, 21 i alt Kønskromosomfejl Andre 31 % 10 % 4 % 44 % 16 % 40 % Kromosom 13, 18, 21, X og Y aneuploidier udgør 60-75% af alle prænatalt detekterede kromosomfejl, men 90-95% af alle de klinisk betydende kromosomfejl hos nyfødte Kromo-fejl i fostervandsprøver Kromosomundersøgelse III Maternel alder Alle kromosomfejl % Relativ andel af trisomi 21 35 0,9 0,45 36 1,0 0,50 38 1,2 0,52 38 1,5 0,55 39 1,8 0,57 40 2,3 0,58 41 2,9 0,58 42 3,7 0,58 43 4,5 0,61 44 5,0 0,70 45 6,2 0,71 46 7,7 0,73 47 9,6 0,73 Fra Practical genetic counselling af P. S. Harper, Oxford 1993. Sensivitet Cirka 10 millioner DNA-basepar 3
F508del CACTGTAGCTGTACTACCTTCCATCTCCTCACCTATTCCAACTATCTGAATCATGTGCC CTTCTCTGTGAACCTCTATCATAATACTTGTCACACTGTATTGTAATTGTCTCTTTTACT TTCCCTTGTATCTTTTGTGCATAGCAGAGTACCTGAAACAGGAAGTATTTTAAATATTTT GAATCAAATGAGTTAATAGAATCTTTACAAATAAGAATATACACTTCTGCTTAGGATGAT AATTGGAGGCAAGTGAATCCTGAGCGTGATTTGATAATGACCTAATAATGATGGGTTTTA TTTCCAGACTTCACTTCTAATGATGATTATGGGAGAACTGGAGCCTTCAGAGGGTAAAAT TAAGCACAGTGGAAGAATTTCATTCTGTTCTCAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCAT TAAAGAAAATATCATCTTTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGTCATCAA AGCATGCCAACTAGAAGAGGTAAGAAACTATGTGAAAACTTTTTGATTATGCATATGAAC CCTTCACACTACCCAAATTATATATTTGGCTCCATATTCAATCGGTTAGTCTACATATAT TTATGTTTCCTCTATGGGTAAGCTACTGTGAATGGATCAATTAATAAAACACATGACCTA TGCTTTAAGAAGCTTGCAAACACATGAAATAAATGCAATTTATTTTTTAAATAATGGGTT CATTTGATCACAATAAATGCATTTTATGAAATGGTGAGAATTTTGTTCACTCATTAGTGA GACAAACGTCTCAATGGTTATTTATATGGCATGCATATAGTGATATGTGGT e Lys Glu Asn Ile Ile Phe Gly Val Ser Tyr Asp Glu Tyr Arg T AAA GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT TCC TAT GAT GAA TAT AGA Kromosom-PCR Nakkefoldsscanning: Færre prøver. Flere abnorme. Mere nervøse gravide. Sundhedsstyrelsen 2004: Konsekvenserne ved de ofte betydelige ventetider ved kromosomdiagnostikken søges afbødet gennem anvendelse af analysemetoder med kort svartid. Hvad er kromosom-pcr? PCR Nobelpris 1993 Kvantitativ PCR anvendes til at måle antallet af kromosomerne 13, 18, 21, X & Y Analysetid: 1½ døgn. Svartid: 4-5 dage. 4
PCR Polymerase Chain Reaction Redskab til kopiering af udvalgte DNA-segmenter 1.000.000 gange Kromosom-PCR 1. cyklus 2. cyklus 3. cyklus n cykler = 2 n kopier Kapillær-elektroforesemaskine Kromosom-PCR resultater 5
Kromosom-PCR resultater Svarbrev på Kromosom-PCR Resultatet af kromosom-pcr på din fostervandsprøve den hurtige prænatale undersøgelse for kromosom 13, 18, 21 og kønskromosomerne viser normale forhold. Det endelige resultat, som omfatter analyse af alle kromosomer, forventes inden for 3 uger og du modtager endnu et brev. Såfremt vi finder forhold, der fraviger det første resultat, bliver du kontaktet telefonisk. Perspektiv Kromosom-PCR teknikken bliver allerede nu anvendt til andre analyser udredning af mentalt retarderede børn skal til at anvendes inden for udredning af cancer og fostre med hjertefejl Hvad er FISH? DNA-baseret teknik Specifik farvning af kromosomer eller dele af kromosomer 6
FISH FISH FISH Interfase-FISH disomi Interfase-FISH FISH på cellekerner Metafase-FISH FISH på kromosompræparater 7
Interfase-FISH trisomi Interfase-FISH multicolor Normal (18/21-hybridisering) Trisomi 21 Aneuploidi screening for 13, 16, 18, 21, og 22 Mor med balanceret 1;5 translokation Prober: gul, rød, mørkeblå, lyseblå og grøn fluorescens 8
Balancerede translokationsbærere Risiko for ubalancerede fejl i kønsceller Nedsat fertilitet Spontane aborter Misdannede/retarderede børn Præimplantatorisk diagnostik (PGD) PGD ubalanceret 1;5 translokation Metafase FISH Afklaring af indviklede karyotyper 9
Translokation (ekstra materiale på kr. 18) Metafase FISH (kr. 18 maleprobe) Metafase FISH (kr. 11 maleprobe) Henvisning fra UL Hjertemisdannelse hos fostret (truncus arteriosus), obs. del 22q11 10
Mikrodeletioner Undersøgelse for 22q11 deletion 22q11 deletions-syndrom Medfødte hjertefejl Aplasi/hypoplasi af thyroidea/parathyroidea Craniofaciale misdannelser - Deletion + Deletion (A1600-01) Metafase FISH Fordel Sikker identifikation af translokeret og ekstra eller manglende materiale Metafase FISH Ulemper Man skal have en mistanke om, hvilket materiale som er translokeret og/eller duplikeret Prober er dyre Varierende probe signal kvalitet Visse områder dækkes ikke af maleprober Proberne er vanskelige at kombinere i stort tal i samme reaktion 11
Perspektiv CGH FISH teknikken finder ikke nye anvendelsesområder. Multi-PCR overtager bortset fra ved præimplantatorisk diagnostik CGH hybridisering på normale kromosomer CGH-analyse 12
CGH analyse af Tali, 3 år gammel pige Mor Fysisk og mentalt retarderet Mikrocefali Bred og flad næse Lavtsiddende ører Tynd øverste læbe Lang philtrum Høj gane Mor gravid (10 uger) B4996-02, No. 36 Dim(21q22->ter) Enh(22q13->qter CGH på Tali Dim(21q22->ter) Enh(22q13->qter) CGH på foster Enh(21q22->qter) Dim(22q13->qter) CVS - foster 13
80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 00 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 00 1Mb chip 3000 kloner med cirka 1 million basepars afstand 470 særligt udvalgte kloner fra områder, som er involveret i mental retardering Array-CGH Måske den endelige afløser for almindelig kromosomanalyse evt. i kombination med kromosom-pcr En masse nye syndromer vil blive defineret ligesom det skete i 50-60 erne, da det blev muligt at lave almindelig kromosomanalyse. Vi skal være med til at definere, hvad der er normalt Prænatal diagnostik 1980-2000 Udviklingen af prænatal diagnostik 1980-2000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 8 9 13 13 13 13 12 12 12 12 12 12 11 11 11 11 11 11 1111 10000 8000 6000 4000 2000 0 0 0 0 0 3 4 25 20 17 15 10 38 39 40 43 45 44 39 41 31 33 CVS AC 14
80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 00 Prænatal diagnostik af gravide > 35 år 1980-2000 Præ- og postnatal diagnostik af trisomi 21, 1980-2000 65 60 10000 8000 6000 4000 2000 0 64 68 68 76 73 70 72 69 68 67 66 67 68 65 61 57 56 54 53 5251 -PD +PD 200 150 100 50 0 80 24 37 40 41 36 36 39 43 39 30 31 82 84 86 88 90 92 94 96 98 00 48 46 42 4954 5148 50 prænatal postnatal Provokerede aborter 1989-95 Antal abn. Ab. Prov % +21 350 349 99,7 +18 107 107 100 +13 30 30 100 XXY 56 39 70 XYY 39 24 62 XXX 31 23 74 X 94 72 77 De novo transl. 35 20 57 Genetik på nettet Pubmed OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) Books Genetics Home Reference 15
Pubmed.com /.org /.gov Genetics Home Reference CDC Centers for Disease Control 16