En model for rygradens dannelse Af har for nylig forsvaret sit speciale i biofysik. Artiklen bygger på dette speciale. E-mail: pbj. mastermail@ gmail. com Morphogenese Grundlæggende er der tre processer der styrer fosterudviklingen i alle dyr. Celledelingen leverer råmaterialet til udviklingen, men ville på egen hånd ikke frembringe andet end en voksende bold af identiske celler. Det er differentiationen der bryder delingssymmetrien og sørger for at når en celle bliver til to som bliver til fire osv, så er der forskel på hvilke gener der er tæne og slukkede i de resulterende celler. Morphogenesen (Formens skabelse) dækker over alle de processer der er ansvarlige for dannelse og vedligeholdelse af form og struktur. Lige fra de første spor af akser og polaritet i fostret, til korrekt aggregering af differentierede celler ved dannelse af væv og organer. Disse processer involverer en række komplicerede intra- og intercellulære signalveje og signalstoffer, migration af celler og væv og regulering af celledeling samt en masse andre ting. En overordnet udfordring i udforskningen af alle disse processer er at forstå, hvordan fostret og de individuelle celler holder styr på tid og sted i løbet af udviklingen, så tingene sker på rette tid og rette sted.
Gamma 5 Figur : Et ca. to dage gammelt kyllingefoster. Den senere hovedregion ses til højre, den somitiske region er i mien og PSM-regionen udgør den posterior ende af fostret. Længst til venstre findes en population af stamceller, den såkale tailbud, der ved celledeling forlænger fostret og PSM i posterior retning Somitogenese Et go eksempel på de omtalte problemstillinger er somitogenesen (dannelsen af somiter), som har været emnet for mit speciale. Somitter er små celleklumper, der dannes parvis, langs med den primære Anterior- Posterior (hoved-hale) akse i fostret, og derved udstikker placeringen af den senere rygrad. Somitterne er forstadier til ryghvirvler og ribben, samt den muskulatur der udspænder det aksiale skelet, og det er altafgørende, at de dannes korrekt. Somitogenese foregår i alle hvirveldyr, hvilket bl.a. involverer pattedyrene. Figur viser et kyllingefoster undervejs i somitogenesen. Den fremtidige hovedregion ses længst til højre, efterfulgt af en region med dannede somitter og længst til venstre det såkal præ-somitiske-mesoderm væv (PSM), der ligger bi-lateralt langs den senere rygrad. Somiterne udstykkes gradvist i par fra den forreste ende af PSM. Samtidig, og i ca. samme tempo, vokser bagenden af fostret, ved celledeling i den posteriore retning, hvilket medfører en forlængelse af PSM bagtil. Resultatet er at PSM bevarer en nogenlunde konstant længde til trods for, at den udstykkes til somiter fortil. Par af Somitter dannes med en fast frekvens, som for musens vedkommende er ca. to timer. PSM i mus har ca. samme længde som seks somitter, hvilket betyder, at fra en nydannet celle bliver en del af PSM i posterior enden, til den bliver del af en somit i anterior enden, går der
En model for rygradens dannelse Gamma 5 hours hours 4 hours 6 hours 8 hours hours hours Epithelial somite S S Anterior S S S- S PSM S- Notochord Somitogenesis Tailbud Determination front Posterior Axis extension Figur : Skematisk fremstilling af somitogenesen. Nye celler (prikker) tilføres PSM fra den posterior ende som følge af fostrets vækst. Med ca. to timers mellemrum segmenteres et par somiter fra den anterior ende af PSM. Dette medfører en relativ anterior bevægelse af PSM cellerne. De første tegn på segmenteringsprocessen kan opserveres ved den såkale determination front. omkring timer. I den tid bevæger cellen sig relativt set frem igennem PSM, men ligger i absolut forstand næsten stille (Se figur ). Der er nu to oplagte spørgsmål at stille: Hvordan holder cellen styr på tiden, så den ved, hvornår den er nået frem til forenden af PSM og skal aktivere sit segmenteringsprogram for at blive del af en somit, og hvordan koordinerer den sin skæbne med de omkringliggende celler, så hver somit afgrænser en gruppe af celler. Den fremherskende forklaringsmodel involverer et intracellulært ur, med en vis synkronisering med naboceller og en gradient af et signalstof (en morphogen) igennem PSM. Cellen menes således at aflæse sin fremadskridende position ud fra en faldende koncentrationen af signalstof i dens omgivelser. Ved et vist threshold (determination front i figur ), aktiveres segmenteringsprogrammet, og li senere dannes selve somiterne. Mekanismen bag uret menes at være en oscillerende ekspression af et eller flere gener i cellerne med en to timers periode. Uret og gradienten kobles sammen, med antagelsen af at ekspressionsniveauet (fasen) gør cellen skiftevis moagelig ( time) og umoagelig ( time) for gra-
Gamma 5 dienten. Dette giver mulighed for gruppering af mange celler i hver somit. Der findes forskellige variationer af denne model, men gennemgående er sammenspillet imellem en gradient og et intracellulært ur []. Oscillerende gen-uryk Det er idag vist eksperimentelt, at der findes morphogen gradienter i PSM, samt at cellerne i de bageste / af PSM har oscillerende genuryk. De første af disse oscillerende gener var medlemmer af hes familien samt lunatic fringe (lfng) og blev opdaget i slutningen af 99 erne. Disse gener reguleres alle af det samme signaleringssystem i cellen, nemlig Notch signalvejen. De har nogle interessante egenskaber som inhibitorer af deres egen og hinandens ekspression. Man mente derfor længe, at segmenteringsurets mekanisme skulle findes i feedback netværk i Notch signalvejen. Det har imidlertid vist sig mere kompliceret end som så, efterhånden som man har vist at andre signalveje og komponenter er involveret. Det drejer sig f.eks. om Wnt signalering, en vigtig signalvej der er aktiv i et hav af processer i både fosterudviklingen og den voksne krop. Flere gener, hvis ekspression reguleres af Wnt signalering, har vist sig at oscillere i PSM-væv med samme periode som de Notch regulerede gener. En af disse gener er axin []. Den er særlig interessant, fordi man ved at proteinet kan inhibere ekspressionen af Wnt regulerede gener, herunder altså også sin egen ekspression. Med udgangspunkt i det, var det primære formål med projektet, at konstruere en intracellulær oscillator baseret på Wnt signalvejen og autoinhibering. Modellering af biologiske systemer I modelleringen af et molekylærbiologisk system, som f.eks. et signalsystem, ønsker man at opskrive dynamikken, der udspiller sig imellem de involverede komponenter (gener, proteiner, receptorer), på matematisk form. Det forudsætter naturligvis, at der eksisterer en detaljeret molekylærbiologisk beskrivelse af systemet. Man skal vide hvilke proteiner der kan
En model for rygradens dannelse Gamma 5 binde DNA og føre til aktivering eller inhibering af ekspression af forskellige gener, hvilke komplekser der kan dannes imellem proteiner og konsekvenserne af deres dannelse, hvordan degraderes og modificeres proteiner i cellen, hvilke receptorer binder hvilke signalstoffer (ligander) og hvordan virker de. Enkeltvis kan disse interaktioner normalt beskrives med ret simple led, baseret på mere eller mindre simple statistiske og kinetiske overvejelser. Man kan således opskrive en differentialligning for hver af de relevante aktører, indeholdende alle interaktionsleddene. Modellering vil i sagens natur, næsten altid involvere en reduktion af systemets kompleksitet. Man søger den kerne af interaktioner, der er primært ansvarlig for systemets dynamik. Jo færre variable, og dermed ligninger, der kan kopiere systemets opførsel, desto bedre. Det betyder, at man f.eks. ignorerer svage og langsomme links imellem aktører, samt ensrettede reaktioner imellem variable der ikke udøver et feedback på resten af systemet. Hertil kommer forskellige antagelser om hurtige reaktioner og indstilling af ligevægt, som ofte tillader reduktioner af de opskrevne ligninger. Wnt signalering Figur.A illustrerer det jeg efter granskning af molekylærbiologisk forskning har vurderet til at være nøgleaktørerne i den kanoniske Wnt signalering i PSM-væv i mus. Essensen af kanonisk Wnt signalering er reguleringen af β-catenin koncentrationen i cellen. β-catenin er en aktiverende transkriptionsfaktor og regulerer dermed ekspressionen af gener i kernen. I fravær af aktiv Wnt signalering degraderes β-catenin af det såkale destruction complex bestående af β og, og der sker derfor ingen genekspression. Wnt signaleringen aktiveres, når receptoren (Frizzled og LRP5/6) i cellemembranen binder en wnt ligand. Det har flere konsekvenser, men bla. menes det at rekruttere protein til cellemembranen, hvor den binder LRP co-receptoren. Dermed konkurreres væk fra destruction complex dannelse, hvilket mindsker β-catenin degradering og dermed fører til en akkumulering af β-catenin i cellen og i kernen, hvilket endeligt fører til genekspression. Med forøgelsen af genekspression dannes mere, hvilket igen øger 4
Gamma 5 (a) Wnt Frizzled (b) Wnt Frizzled LRP5/6 Dsh p LRP5/6 catenin catenin p catenin catenin catenin m m Figur : Essensen af Wnt signalering i PSM væv i mus. A: systemet med variable. B: Det reducerede system med 6 variable. destruction complex koncentrationen og degraderingen af β-catenin, hvormed det negative feedback loop er etableret. Der er variable og dermed koblede differentialligninger. Fjernelse af de to variable, der alligevel bare degraderedes, samt antagelse om hurtig dynamik i bindingen og degraderingen af ved LRP5/6, reducerer systemet til 6 variable, som det ses på figur og repræsenteres af følgende 6 differentialligninger. dc d[ga] db dg da da m = c fc B[GA] c bc C αc () = c f[ga] GA c b[ga] [GA] c fc B[GA] + c bc C + αc () = S c fc B[GA] + c bc C () = c f[ga] GA + c b[ga] [GA] (4) = c f[ga] GA + c b[ga] [GA] + c tla A m c A A k A + A (5) = c tsa B h A m τ Am (6) 5
En model for rygradens dannelse Gamma 5 Her er C destruction complex og [GA] er et underkompleks bestående af β og. De øvrige variable repræsenterer β-catenin, β, og -mrna. Et go eksempel på den simple anden ordens kinetik der antages at ligge bag dannelse og opsplitning af komplekser, er ligning () for [GA] komplekset. Af første led fremgår det at dannelsen af [GA] er proportional med koncentrationen af hver af de to komponenter G og A, med en formationskonstant c f[ga]. Ligeledes er der en sandsynlighed for at [GA] opsplittes, som er proportional med [GA]-koncentrationen med en opsplitningskonstant c b[ga]. Tredje og fjerde led repræsenterer på samme måde reaktionen, hvor [GA] binder B under dannelse af C, samt opsplitning af C igen. Alle disse led indgår naturligvis i ligningerne for alle de involverede variable med omvene fortegn. Et andet interessant led, der fremkommer ved reduktionen fra til 6 variable, er degraderingsleddet i ligning 5 for (sidste led). Det er et såkal mættet degraderingsled i modsætning til f.eks degraderingsleddet for m i ligningen nedenunder. Fordi degraderingen af afhænger af dens rekruttering og binding til LRP5/6 har dens degraderingsrate en øvre grænse, her givet ved konstanten C A. Det er en vigtig forskel, fordi det effektivt letter ophobningen af og dermed introducerer forsinkelser i systemet. Forsinkelser der er vigtige for systemets evne til at oscillere. Resultater Som det fremgår af ligningerne, er der mange konstanter involveret. Nogle af disse er nogenlunde velkarakteriserede fra eksperimenter i lignende systemer, og andre kan anslås med nogenlunde præcision. Endeligt er kvalificerede gæt og parameterrumsudforskning også nødvendig. Figur 4 demonstrerer systemets opførsel, i det jeg har defineret Wnt som referencetilstanden. Der er tydeligvis oscillationer i de to viste tidsserier. Store sinusidale svingninger for og spiky oscillationer for β-catenin. Selv små koncentrationer af er nok til at fremme dannelsen af destruction complex tilstrækkeligt til at holde β-catenin i skak. Kun i den korte periode, hvor er i bund opnås en lille akkumulering. Det ses, at oscillationerne har perioder i omegnen af to timer. Ved hjælp af stabilitetsanalyse kan det bekræftes, at oscillationerne i referencetilstanden er vedvarende. 6
Gamma 5 5 4 koncentration [nm] 5 5 β catenin β catenin koncentration 4 5 6 time [min] Figur 4: Tidsserier for og β-catenin i reference tilstanden for parameterværdierne. Bemærk den dobbelte y-akse. Udforskning af parameterrummet De parametre giver et -dimensionalt parameterrum, som det er umuligt at udforske systematisk. Jeg har derfor set på relevante underrum i faserummet og søgt efter oscillerende områder. Det har især drejet sig om det underrum, der udspændes af formations og opsplitningskonstanterne for destruction complexet og underkomplekset [GA]. Der er således ialt tale om 4 konstanter, som dog kan behandles under et, ved at betragte forholdene imellem dem, de såkale dissociationskonstanter: D C = c bc c fc og D [GA] = c b[ga] c f[ga]. Figur 5 viser resultaterne fra 6 kørsler for forskelllige værdier af D C og D [GA]. Alle andre parametre fastholdes i referencetilstanden. Hvert kvadrat svarer til én kørsel, og farven angiver amplituden af en oscillation for et sent tidspunkt af kørslen (t>75 min). De helt mørke områder angiver således parameterværdier, hvor oscillationer enten ikke forefindes, eller hvor oscillationerne har stærk dæmpning, imens de lysere områder angiver vedvarende oscillationer eller svagt dæmpede oscillationer. Det er de vedvarende og svagt dæmpede oscillationer, der er mest interessante, idet de har størst biologisk relevans i somitogenesen. 7
En model for rygradens dannelse Gamma 5 D C [nm] Reference state A 4 5 5 5 D [nm] [ga] Figur 5: Farveplot af parameterplanen udspæn af dissociationskonstanterne D C og D [GA]. Farveskalaen angiver amplituden af oscillationer for t > 75. (Se onlineversion af Gamma for at se farverne bedre.) De fire tidsserier i figur 6 demonstrerer den store forskel der er på oscillationernes karakter afhængigt af hvor i planen man kigger. Hver tidsserie svarer til den tilsvarende nummererede prik i figur 5. Første serie udviser dæmpede oscillationer imens den anden tidsserie har vedvarende kraftige oscillationer. Der er ingen oscillationer i tidserie og endeligt fås små vedvarende oscillationer i den sidste tidsserie. Disse parameterrumsundersøgelser kan udvides til at inkludere flere parametre, og giver tilsammen et inryk af, hvordan parametrene spiller sammen, og af rubusthed og udbredelse af oscillerende domæner i parameterrummet. Sammenkobling med Notch signalsystemet Som allerede nævnt oscillerer de Notch- og Wnt-regulerede gener med omtrent samme periode. Yderligere interessant er det, at de oscillerer ude af fase. Der er således god grund til at tro, at der er interaktion imellem de to systemer, hvilket man da også har dokumenteret eksperimentelt. Somiterne dannes som udgangspunkt ikke korrekt, hvis bare et af de to 8
Gamma 5 5 4 4 4 Tidsserie β catenin Tidsserie β catenin koncentration [nm] β catenin koncentration koncentration [nm] β catenin koncentration 4 5 6 time [min] 4 5 6 time [min] 5 4 5 4 4 Tidsserie Tidsserie β catenin 4 Tidsserie 4 β catenin koncentration [nm] β catenin koncentration koncentration [nm] β catenin koncentration 4 5 6 time [min] 4 5 6 time [min] Figur 6: De fire tidsserier der svarer til de nummerede prikker i figur 5. Bemærk dobbelt y-akse. systemer er sat ud af funktion. En kandidat til rollen som formidler imellem de to signalveje er β. β spiller en rolle som phosphorylende aktør i begge systemer, hvilket i Wnt fører til degradering af β-catenin og i Notch til degradering (måske) af transkriptionsfaktoren N icd. En situation hvor de to systemer konkurrerer om β kan måske forklare kobling og faseforskel. Denne mulighed gav anledning til en udvidelse af modellen til også at inkludere Notch signalvejen. Det samlede system fremgår af figur 7. Notch signalering fungerer ved at en ligand fra en nabocelle binder Notch receptoren, hvilket løsriver en intracellulær del af Notch, N icd. Denne fungerer som transkriptionsfaktor i ekspressionen af generne hes og lfng. Hes proteinet inhiberer desuden både sin egen og lfng transkription, og Lfng protein inhiberer frigivelsen af N icd. Alt i alt en række interessante 9
En model for rygradens dannelse Gamma 5 feedback mekanismer. De variable som systemet består af, beskrives ved følgende sæt af differentialligninger, som dog ikke vil blive diskuteret yderligere her: dc dg db da da m d[ga] dn dh m dh dl m dl d[ng] = c fc B[GA] c bc C αc = c f[ga] GA + c b[ga] [GA] c f[ng] NG + c b[ng] [NG] + γ[ng] = S c fc B[GA] + c bc C = c f[ga] GA + c b[ga] [GA] + c tla A m c A A k A + A = c tsa B h A m τ Am = c f[ga] GA c b[ga] [GA] c fc B[GA] + c bc C + αc = S N k s k s + L N τ N c f[ng] NG + c b[ng] [NG] = c tsh ( N h N k N + N h N = c tlh H m H τ H = c tsl ( N h N k N + N h N = c tll L m L τ L ) k H H k H + H h H k H k H + H h H ) τ Hm L m τ Lm = c f[ng] NG c b[ng] [NG] γ[ng] Simulation af systemet viser, at Wnt oscillatoren er i stand til at inducere oscillationer i Notch systemet, og at disse oscillationer har en lille faseforskel. Dette fremgår af figur 8. I det viste eksempel er de to negative feedback loops i Notch meget svage. Ved kraftig inhibering dæmpes Notch svingningerne betydeligt, hvilket - ihvertfald til dels - skyldes, at dynamikken, som den beskrives af de brugte ligninger, er for hurtig. Der mangler en forsinkelse af det negative feedback. En udvidelse eller ændring af Notch ligningssystemet kan muligvis udbedre dette. 4
Gamma 5 (c) Wnt Frizzled LRP5/6 Notch catenin N icd N icd Lfng Dll catenin mlfng m Hes7 mhes7 Yderligere kompleksitet Figur 7: Det samlede Wnt-Notch system. Kompleksiteten bag segmenteringsuret og somitogenesen generelt vokser hele tiden, efterhånden som nye aktører og signalveje impliceres i processen []. Hertil kommer forskelle imellem forskellige dyr samt en vis grad af redundans. At både Notch og Wnt signalvejen er involveret synes sikkert, men præcist hvordan det foregår, og hvem der styrer hvem er stadig uklart. Den foreslåede Wnt oscillator kan forklare oscillerende Wnt target gener, men er af forskellige grunde en usandsynlig kandidat som kernen i segmenteringsuret. Interessen for kvantitative modeller for somitogenese og andre morphogenetiske processor er stærk stigende, og det er ikke mindst iblan fysikere med kendskab til komplekse systemer og ikke-lineær dynamik. Der er stadig visse faglige barrierer imellem biologien og fysikken og matematikken, men biokompleksitet er et ekstremt spændende felt med stort behov for teoretiske tilgangsvinkler. Noget man som fysiker har rigtig gode forudsætninger for. 4
En model for rygradens dannelse Gamma 5.5 Nicd β cat concentration [nm].5.5 5 Lfng/Hes 5 4 5 6 time [min] Figur 8: Tidsserie for det samlede Wnt-Notch system. Det øverste panel angiver oscillationerne af transkriptionsfaktorerne i de systemer, og nederste panel angiver de protein oscillationer det udmønter sig i, i de to systemer. Litteratur [] K.J.Dale and O.Porquie: A clock-work somite. Bioessays, ():7-8, [] A. Aulehla and B.G. Herrmann. Segmentation in vertebrates: Clock and gradient finally joined. Genes Dev, 8(7):6-7, 4 [] M.L.Dequeant, E.Glynn, K.Gaudenz, M.Wahl, J.Chen, A.Mushegian and O.Pourquie. A complex oscillating network of signaling genes underlies the mouse segmentation clock. Science, 4(585):595-8, 6 4