PART 2 Early Embryonic Development

Transkript

1 PART 2 Early Embryonic Development Chapter 7 Fertilization: Beginning of a new organism Søren Tvorup Christensen Section for Cell and Developmental Biology Dept. Biology University of Copenhagen stchristensen@bio.ku.dk

2 Generel oversigt for befrugtning Kontakt og genkendelse mellem sædcellen og ægcellen I denne proces sørges ofte for at sikre genkendelse indenfor samme art Regulering af sædcellens indtrængning i ægcellen I denne proces sikres, at kun én sædcelle befrugter ægcellen Fusionering af det genetiske materiale fra sædcellen og ægcellen Aktivering af ægcellens stofskifte og start på den embryonale udvikling

3 Sæd indeholder miniature mennesker, som får næring til vækst i moderens skød. Aristoteles ( BC) Opfinderen af mikroskopet Anton van Leeuwenhoek ( ) 1678: Spermatozoa = sperm animals (parasitter), som intet har at gøre med reproduktion 1685: sædceller er kim, der hver indeholder et preformeret foster; finder dog aldrig bevis for dette Opfinder af det såkaldte screw-barrel mikroskop Nicolas Hartsoeker ( ) 1694: medopdager af sædcellen, og tilslutter sig Leeuwenhoeks hypotese fra Kalder det preformerede menneske for homunculus, som han skitserer (se billede th.)

4 Henneguya salminicola er en almindelig vævsparasit i laksefisk, og deres morfologi har ligheder med sædceller. Da disse parasitter første gang blev observeret i fæces på en dreng med diarre, troede lægerne at der var tale om sædceller, og at drengen havde været udsat for en seksualforbrydelse Henneguya

5 Slutningen af 1700 tallet: Påviste som den første at sæd er nødvendig for befrugtning af ægget, og demonstrerede den første succesfulde kunstige befrugtning af en hund. Viste bl.a. at filtreret tudsesæd uden sædceller ikke kan befrugte tudseæg. Lazzaro Spallanzani ( ) Jean-Léon Le Prevost ( ) Jean Baptiste André Dumas ( ) 1824: sædceller er ikke parasitter, men aktive komponenter i befrugtningsprocessen, hvor sædcellerne trænger ind i ægcellen Baggrund: 1) sædceller er kun tilstede i kønsmodne individer 2) muldyr producerer ikke sædceller fader: æsel moder: hest

6 1876: Med detaljerede mikroskopianalyser af sæd og æg fra søpindsvin påvises at befrugtning skyldes sammensmeltning mellem én sædcelle og ægget, og at alle kerner i embryonet stammer fra den originale kerne dannet ved befrugtningen. Oscar Hertwig ( ) Herman Fol ( ) Toxopneustes lividus Sperm cell impact

7 Eksterne Interne akrosomale 2 akrosomale 4 membran membran Oversigt over en sædcelles opbygning A: Hovedregionen B: Nakkeregionen C: Mellemregionen D: Haleregionen E: Slutregionen plasma membran 1 akrosom 3 cellekernen 5 centriole 6 centriole datter moder mitokondrier aksonemet eksterne tætte fibre (proximale) (distale) Homo sapiens Længde: ca. 50 μm Svømmehastighed: ca. 3 mm pr. minut (60 gange dens egen længde) Akrosomet/akrosomale vesikel: deriveret fra Golgi apparatet og indeholder fordøjelsesenzymer, som benyttes til gennemtrængning af æggets overflade (modificeret sekretorisk vesikel) Haploid kerne: Mitokondrier: distale centriole: Aksonemet: Flagellen: 23 kromosomer tilfører energi til sædcellen fungerer som basallegeme for dannelse af aksonemet danner halens (flagellens) bevægende kraft region D og E

8 Toxoplasma gondii invasionsområde nucleus acrosom spermatozo invasionsområde

9 Hovedparten af cellens cytoplasma elimineres under modning af sædcellen (pattedyr) Kapacitering (forestår først når Sædcellen har nået æggelederen)

10 DAPI mitokondrier tubulin GFP-proacrosin

11 Aksonemet arrangeret af mikrotubuli i en 9+2 ultratrastruktur

12

13 Mitokondrier (ved cellens mellemstykke) ATP Aktivering af aksonemale dynein-arme Øget sliding aktivitet mellem mikrotubuli nexin Øget flagel-motilitet

14 The father of the MT sliding model Dr. Peter Satir Distinguished University Professor Albert Einstein College of Medicine, NY, USA Doctor honoris causa Københavns Universitet

15 De kvindelige reproduktionsorganer Livmoderen (uterus) Æggelederen (ovidukt) isthmus Ampulla (befrugtningssite) Infundibulim (fimbriae) Æggestokken (ovariet) livmoderhalsen (cervix) Vagina Infundibulim Sædcellens rejsetid til ampulla: >30 min

16 Sygdomme opstået som fejl i ciliers bevægelse i æggelederen Graviditet udenfor livmoderen (ektopisk gravititet)

17 motile cilia in isthmus De kvindelige reproduktionsorganer Infundibulim OOCYT cilier DAPI (cellekerner) follikel LIVMODERERN ÆGGELEDER ÆGGESTOK Isthmus-Ampulla

18 Homo Sapiens Antal sædceller pr. ejakulation: ca Antal sædceller der når ampulla: ca. 200 Sædcellers min. rejsetid til ampulla: Sædcellers max. overlevelsestid: Faktorer der har indflydelse på sædcellens svømmehastighed og tidsmæssige lokalisering til ampulla: ca. 30 minutter ca. 72 timer 1) flagelbevægelse (middel: 3 mm/min) 2) peristaltiske kræfter i livmoderen isthmus ampulla infundibulum ændret flagelslagfrekvens ændringer i ph, temperatur og osmotisk tryk; signalmolekyler ændret cilieslagfrekvens Fysisk interaktion mellem sædceller og cilier Kemoattraktanter??? ændret cilieslagfrekvens ændringer i ph, temperatur og osmotisk tryk; signalmolekyler LIV- MODERERN ÆGGELEDEREN

19 Angivelse af tidspunkt for gennemtrængningen af sædcellen under modning af ægget Funktionen af de polære legemer er stort set ukendt dog menes de at assistere i celledeling. Legemerne kan derfor betragtes som biprodukter af ægcellens delinger. Efter implantering disintegreres legemerne og er ikke en del af det udviklende foster.

20 Fra befrugtning til implantering Inner cell mass: embryonale stamceller Blastocyst Ca. 6 dage efter befrugtning har ægget delt sig og dannet en blastocyst, som binder (implantering) sig til indersiden af livmodernes væg (endometrium) Fertilization Efter implantering begynder blastocysten er udvikle sig til et embryo, som er en gruppe af celler, der senere vil blive til fosteret hos mennesker (efter ca. 8 uger)

21 Angivelse af tidspunkt for gennemtrængningen af sædcellen under modning af ægget i pattedyr Interfase arrest metafase arrest

22 Det modne æg (ovum) Beskyttelse, fødereservoir og igangsættelse af differentiering efter befrugtning: Proteiner og aminosyrer (æggeblommen) sørger for Energitilskud (før implantering i livmoderen hos pattedyr/ særdeles vigtigt for æglæggende dyr) Ribosomer og trna sørger for egen proteinsyntese mrna der translateres før og efter befrugtning af ægcellen (kap. 5). Morfogenetiske faktorer styrer celledifferentiering. Kan være placeret regionalt og segregerer til forskellige celler efter befrugtning og kløvning af ægcellen (kap. 8). Beskyttende kemikalier nedsætter risikoen for at frie æg spises af bl.a. rovdyr (eks. stoffer der giver ægget en dårlig smag); nedsætter risikoen for beskadigelse af ægget (eks.: UV-filter, DNA-repair enzymer). Søpindsvineæg (10.000x større end sædcellen)

23 vitellin-hylster PM EM-billeder af overfladen på det ubefrugtede søpindsvineæg vitellin-hylster: fibrøs måtte af extracellulær matrix (glykoproteiner), der omkranser PM i invertebrate ægceller, og benyttes til arts-specifik binding af sædcellen mikrovilli microvilli: overfladeekstensioner opbygget af bl.a. mikrofilamenter. Er en del af cortex umiddelbart under PM. Kan være involveret i at hjælpe sædcellens penetrering af ægcellen Kortikale granula (ca stk): homologe til sædcellens akrosomale vesikel (deriveret fra Golgi), og indeholder proteolytiske enzymer og mucopolysaccharider (hindrer adgang for mere end een sædcelle) samt glykoproteiner og hyalin (omkranser det tidlig embryo og sørger for støtte til blastomerer under kløvning af ægget efter befrugtning. vitellinhylster kortikale granula Gelé-lag (Jelly layer): Involveret i tiltrækning og/eller aktivering af sædcellen

24 Overfladen på ægget i pattedyrceller Polar body Corona radiata Zona pellucida: fibrøs måtte af extracellular matriks (ECM), der omkranser PM (svarer til vitellin-hylster i invertebrater). ÆGGELEDER oocyt Granulosa-celler Cumulus: celler deriveret fra folliklens granulosaceller i æggestokken, og omkranser ægget. Sørger for næring til ægget: Ægget frigøres altså til æggelederen som et oocyt-cumulus-complex (OCC) follikel cumulus-celle ÆGGESTOK

25 Modning af oocytter i æggestokken i pre-pubertale mus follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH) followed by human chorionic gonadotropin (hcg) A T=0 B T=48 C T=48+6 D T=0 E T=48 F T=48+6 * oocyte oocyte oocyte * * antrum granulosa-celler murale granulosa-celler cumulus-celler

26 Genkendelse mellem æg og sædcelle Fem trin i hvordan interaktionen styres mellem sædcellen og ægcellen 1) Kemoattraktion (kemoattraktanter udskilles fra ægget) 2) Eksocytose af sædcellens akrosomale vesikel og frigørelse af forsdøjelsesensymer 3) Fasthæftning af sædcellen til æggets extracellullære hylster (vitellin / zona pellucida) 4) Sædcellens gennemtrængning i den ekstracellulære kappe 5) Sammensmeltning af ægcellens og sædcellens membransystemer Omvendt rækkefølge for pattedyr søpindsvin mus

27 Generelt problem for marine organismer, hvor kønsceller udskilles til vandmiljøet. Hvordan finder kønscellerne sammen? og Hvordan sikres genkendelse af kønscellerne artene imellem? SVAR: arts-specifik kemoattraktion og arts-specifik sædcelleaktivering

28 Arts-specifik kemoattraktion (søanemone) Ægget er modnet og klar til befrugtning efter 2. meiotiske deling. Ved modning udskilles kemoattraktanter, der tiltrækker sædceller fra samme søanemone-art: 1) Ægget kontrollerer tiltrækning af sædcelle-type 2) Ægget kontrollerer tidspunktet for denne tiltrækning æg 2. meiotiske deling æg

29 Arts-specifik kemoattraktion (søpindsvin) resact micropipette 1 sec 20 sec 40 sec 90 sec * * * * * Tilsætning af 10 nm resact (14 aa peptide) 1) resact udskilles fra Arbacia punctulata æg og tiltrækker udelukkende Arbacia punctulata sædceller) 2) Resact virker også som sædcelle-aktiverende peptide, der øger sædcellens svømmehastighed

30 Mekanismen bag kemoattraktion (søpindsvin): Aktivering via Ca 2+ signalering resact receptor (Guanylat Cyklase) RGC cgmp Aktivering af Ca 2+ kanal Ca 2+ influx Kemoattraktion mod gradient af resact

31 Mekanismen bag kemoattraktion (søpindsvin): Aktivering via Ca 2+ signalering 1 sec

32 Arts-specifik regulering af sædcellens svømmehastighed (søpindsvin): Aktivering via mitokondriel aktivering af ATP, hvor resact også virker som sperm-activating peptide resact receptor Ca 2+ cgmp mitokondrier ATP Aktivering af aksonemale dynein-arme Øget sliding aktivitet mellem mikrotubuli Øget flagel-motilitet

33 Akrosomal reaktion (søpindsvin) 2. Interaktion mellem æg- og sædcelle Initiel kontakt med gelé-lag på ægcellen exocytose af proteolytiske enzymer (nedbryder gelé laget) + Bindin Ca 2+ -medieret fusion mellem PM of akrosomale membran Samling of aktin til forlængelse af mikrofilamenter Arts-specifik genkendelse af overfladen på ægget (mikrovilli)

34 Metode til lokalisering af bindin efter akrosomal reaktion (søpindsvin) DAB precipitat Sædcellens ekstension af aktin-mikrofilamenter DAP: diaminobenzidine æggets vitellin-hylster på en mikrovilli Sædcellens ekstension af aktin-mikrofilamenter

35 Binding af Bindin til Bindinreceptorer i æggets vitellin-hylster (søpindsvin) Strongylocentrotus purpuratus Polystyren-beads coated med Bindin receptorer (EBR1) sædcelle

36 Akrosom reaktion (søpindsvin) To forskellige arter af Strongylocentrotus

37 Binding og genkendelse af kønsceller i pattedyr (mus) Zona pellucida (ZP) Zona pellucidas ECM dannes af tre typer glycoproteiner (ZP1, ZP2 og ZP3) samt assesoriske proteiner: Zona pellucida (ZP) Genkendelse mellem sæd- og ægcelle: 1) Svag binding mellem sædcellens hoved og perifere proteiner på ZP 2) Efterfølges af stærkere binding mellem ZP og et sædcelle-overfladeprotein (SED1) 3) Kraftig binding mellem ZP3 og sædcellens ZP3 receptor (GalT), der direkte leder til den akrosomale reaktion

38 Lokalisering af ZP3-bindende proteiner på sædcellen (mus) ZP3 receptor akrosom ZP3 receptor ZP3 Zona pellucida Sædcelle-æg binding Receptor clustering Akrosom exocytose

39 Signaltransduktion fra ZP3 binding til akrosomal reaktion (mus)

40 CAPACITATION ikke alle sædceller er kompetente til at befrugte ægget - og det er sjældent de hurtigste sædceller, der befrugter ægget (kompetence) isthmus ampulla infundibulum ændret flagelslagfrekvens ændringer i ph, temperatur og osmotisk tryk; signalmolekyler ændret cilieslagfrekvens Fysisk interaktion mellem sædceller og cilier kemoattraktanter ændret cilieslagfrekvens ændringer i ph, temperatur og osmotisk tryk; signalmolekyler LIV- MODERERN ÆGGELEDEREN

41 KAPACITERING AF SÆDCELLER I PATTEDYR? Sædceller er bundet til epithelcellerne i æggelederens isthmus/ampulla region. Disse sædceller har lang levetiv ændring i membranens hvilepotentiale kapacitering Sædceller frigøres fra epithelcellelaget og vandrer til ampulla for befrugtning af ægget

42 MULIGE FUNKTIONER AF KAPACITERING Sædceller er bundet til epithelcellerne i æggelederens isthmus/ampulla region. Disse sædceller har lang levetiv 1. Kan nedregulere antallet af sædceller, der når ægget i ampulla, hvorved risikoen for polyspermia (indtrænging af flere sædceller i samme æg) nedsættes 2. Raten af kapacitering kan benyttes som reguleringsmekanisme til at forlænge levetiden for sædceller i æggelederen, hvorved sandsynligheden for befrugtning øges, selvom tidspunktet for ejakulering sker før tidspunktet for ægløsning (ovulering). kapacitering Sædceller frigøres fra epithelcellelaget og vandrer til ampulla for befrugtning af ægget

43 Fusion mellem kønsceller og Hæmning af polyspermia

44 Fusionering og indtrængning af sædcellen i ægget (søpindsvin) Kontakt gennem den akrosomale proces Kontaktdannelse af befrugtningskegle Indtrængning via sædcellens spids sædcelle ægge mikrovilli aktinmikrofilamenter (cytoplasmatisk bro) befrugtningskegle

45 Fusionering og indtrængning af sædcellen i ægget i pattedyr (hamster) Kontakt før den akrosomale proces Binding mellem sædcellen og zona pellucida Indtrængning gennem zona pellucida og parallelt med æggets plasmamembran (proteaser fra den akrosomale vesikel) zona pellucida polært legeme ECM æggets plasmamembran

46 Indtrængning gennem zona pellucida og parallelt med æggets plasmamembran (proteaser fra den akrosomale vesikel) zona pellucida Zona pellucida (ZP) Gennemtrængning af zona pellucida vha. proteaser: Skift af sædcellens genkendelse af ZP3 (før den akrosomale reaktion) til genkendelse af ZP2 (efter den akrosomale reaktion)

47 Fusionering og indtrængning af sædcellen i ægget i pattedyr (hamster) Skematisk tegning over fusionering med æggets plasmamembran sædcellens ækvatoriale domæner Sædcellens centrosom duplikeres og benyttes som spindelpol i celledeling i det befrugtede æg

48 Polyspermia og dets konsekvenser (søpindsvin) dispermia Fusion af tre haploide kerner, som hver indeholder 18 kromosomer kromosomer organiseret i metafasen (D) flageller Dannelse af fire spindelpoler og fudionering af triploid kerne De 54 kromosomer fordeles via spindelpolerne i et randomiseret mønster Ved anafasen i den første celledeling trækkes de duplikerede kromosomer mod hver sin pol Dannelse af fire celler med forskellige antal og typer af kromosomer tubulin DNA tubulin DNA pericentrin Dispermia menneskeæg med fire spindelpoler ved den 1. mitose Det tidlige embyon dør

49 Blokering af polyspermia 1) Hurtig blokeringsmetode (transient) Ændring i æggets membranpotentiale sekunder efter kontakt mellem den befrugtende sædcelle 2) Langsom blokeringsmetode (permanent) Den kortikale granula reaktion mekanisk blokering, der igangsættes ca. et minut efter den første fusion mellem æg og sædcelle

50 Hurtig, transient blokering af polyspermia (søpindsvin) Æg i havvand Na + Na + Na + Første kontakt mellem den befrugtende sædcelle og ægget Na + Membranpotentialet ændres til ca. 20 mv pga. Na+ influx Na + Na + Na + Na + Inside electrode outside electrode E2 æg E1 Ringer opløsning paraffin Ægmembranens hvilepotentiale: -70 mv

51 Hurtig, transient blokering af polyspermia (søpindsvin) Denne type blokering gælder hovedsageligt for æg, der befrugtes uden for organismen

52 Blokering af polyspermia 1) Hurtig blokeringsmetode (transient) Ændring i æggets membranpotentiale sekunder efter kontakt mellem den befrugtende sædcelle 2) Langsom blokeringsmetode (permanent) Den kortikale granula reaktion mekanisk blokering, der igangsættes ca. et minut efter den første fusion mellem æg og sædcelle

53 Langsom, permanent blokering af polyspermia (søpindsvin) Kortikale granula: Ved den første indtrængning af en sædcelle fusionerer granula med æggets cellemembran og frigiver deres indhold af enzymer og osmolytter, der medvirker til en fysisk blokade af andre sædceller. mikrovilli vitellinhylster kortikale Granula (ca stk)

54 Langsom, permanent blokering af polyspermia (søpindsvin) 1) Kortikal granula serin proteaser: Trypsin-lignende proteaser, der opløser de proteinbroer, der forbinder vitellin-hylsteret med PM, og fjerner bindinreceptorer inklusiv sædceller, der er bundet til disse. 2) Muco-polysaccharider: producerer en osmotisk gradient, som forårsager, at vand trænger ind i rummet mellem PM og vitellin-hylsteret, hvorved hylsteret voldsomt ekspanderer og danner det såkaldte fertiliserings-hylster. 3) Peroxidaser: hærder fertiliserings-hylsteret ved at krydslinke proteinernes tyrosiner. 4) Hyalin: forsegler det befrugtede æg med det såkaldte hyalin-lag, der samtidig støtter blastomerer under de første kløvninger af ægget.

55 Langsom, permanent blokering af polyspermia (søpindsvin) Hvordan initieres igangsættelse af den kortikale granula reaktion? Umiddelbart efter fusionering mellem sædcellen og ægget igangsættes en calcium-bølge i ægget, som påbegyndes ved fusioneringsstedet. Bølgen varer ca. 30 sec. Niveauet af Ca 2+ måles i den levende ægcelle med såkaldte Ca 2+ -fluoroforer, der emitterer lys, når de binder Ca 2+ (fura-2, aequorin)

56 Langsom, permanent blokering af polyspermia (søpindsvin) Ca2+-lagre: endoplasmatisk reticulum omkranser kortikale granula Ca 2+ -afhængige Ca 2+ -release kanaler I søpindsvin og hvirveldyr udskilles Ca 2+ fra æggets calcium-lagre (endoplasmatisk reticulum), som trigger fusionering af kortikale granula med PM og dermed exocytose af granulas indhold over hele æggets overflade Selve calcium bølgen skyldes IKKE simpel diffusion, men dannes aktivt med frigørelse af Ca 2+ i én ende af ægget og slutter i den modsatte side kortikal ER kortikal granula Æg Også i pattedyr: [Ca 2+ ]i stiger fra 0.1 til 1 μm, og bevæger sig i flere bølger, som hver især har indflydelse på forskellige aktivitet

57 Blokering af polyspermia i søpindsvin: Opsummering Early responses Også i pattedyr: [Ca 2+ ]i stiger fra 0.1 til 1 μm, og bevæger sig i flere bølger, som hver især har indflydelse på forskellige aktiviteter i ægget efter blokering af polyspermia ( late responses )

58 Late responses i befrugtning (søpindsvin) 1) Ca 2+ -afhængig inaktivering af MAPkinaser: fjerner hæmning af DNA syntese, som igangsættes til at fortsætte den mitotiske cellecyklus 2) Ca 2+ -afhængig aktivering af NAD + kinase (konverterer NAD + til NADP +, som er et co-enzym i lipid biosyntesen): rekonstruktion af nye cellemembraner under kløvning af det befrugtede æg 3) Ca 2+ -afhængig regulering af iltforbruget i ægget, hvor NADPH omdanner ilt til hydrogen peroxid i en proces, der benyttes til at kryds-linke fertiliseringshylsteret. 4) NADPH benyttes endvidere til gendannelse af glutathion og ovothioler, der kan fjerne fire radikaler, som vil inducerer DNA skader i ægget og i det tidlige embryo. 5) Aktivering af den sekundære Na + influx bølge via aktivering af Na/H exchangeren leder til øget ph i cellen (optag af Na + og tab af H + ): Stimulerer sammen med Calcium ny DNA og protein syntese samt cytoplasmatisk transport af morfogenetisk materiale.

59 Tidsmæssige forløb af Early og Late responses efter befrugtning in vitro Initiering af protein syntese forløber i to faser: 1) translation fra pre-eksisterende mrna 2) translation fra ny transkription af mrna

60 Forsøg, der påviser de to faser af proteinsyntese (søpindsvin) 1. translationsfase 2. translationsfase 1.translationsfase: Translation af preeksisterende mrna i ægcellen til syntese af bl.a. histoner, tubulin, aktin og morfogenetiske faktorer til den tidlige embryogenese eif4e: translation initiating factor befrugtning 4EBP: 4E Binding protein eif4e 4EBP P mrna translation Actinomycin: 2.translationsfase: Hæmmer af transkription Translation af ny-transkriberede mrna molekyler (actinomycin D sensitiv)

61 Fusion mellem det genetiske materiale fra ægget og sædcellen

62 Fusion af genetisk materiale (søpindsvin) I søpindsvin forekommer befrugtning af ægget EFTER den 2. meiotiske deling: Dvs. pronukleus i ægget (hunkønnet) er allerede i sin haploide form når sædcellen indtrænger ægget.

63 Fusion af genetisk materiale (søpindsvin) Pro-nucleus ( ) 4 Trin i fusioneringen: Pro-nucleus ( ) 1) Membranen omkring den haploide kerne i sædcellen vesikulerer til små lommer, hvorved det kompakte, inaktive kromatin eksponeres til æg-cytoplasmaet. 2) Det kompakte kromatin i sædcellens kerne dekondenserer (nu tillades transkription og replikation af sædcellens DNA i æg-cytoplasmaet). Herved dannes den såkaldte mandlige pro-nucleus. 3) Den mandlige pro-nucleus drejer 180, så centriolen (basallegeleme til den tidligere flagel) vender mod ægcellens pro-nucleus. Centrosomet virker som et MikroTubuli Organiserende Center (MTOC), der danner en aster (MT netværk), hvorpå de to pronuclei vandrer mod hinanden vha. MT-associerede motormolekyler. 4) Fusion mellem de to pronuclei, og senere dannelse af den diploide zygote kerne DNA syntese kan begynde både før og efter fusionering. Dette afhænger af graden af Ca 2+ frigørelse tidligere under befrugtningen MT dyneiner MT MT

64 Fusion af genetisk materiale (søpindsvin) 1846: Es entsteht so vollständig das Bild einer Sonne im Ei." Oscar Hertwig ( )

65 Generel oversigt for befrugtning Kontakt og genkendelse mellem sædcellen og ægcellen I denne proces sørges ofte for at sikre genkendelse indenfor samme art Regulering af sædcellens indtrængning i ægcellen I denne proces sikres, at kun én sædcelle befrugter ægcellen Fusionering af det genetiske materiale fra sædcellen og ægcellen Aktivering af ægcellens stofskifte og start på den embryoniske udvikling

66 i eftermiddag opgavetimer i seminarrum A og B

67 Befrugtning Processen hvormed to kønsceller (gameter) fusionerer og danner et nyt individ med et genom sammenlagt fra begge forældre

68 Fusion af genetisk materiale (pattedyr) I de fleste pattedyr forekommer befrugtning af ægget når æggets pronucleus er i metafase-stop FØR den 2. meiotiske deling: De inducerede Ca 2+ bølger under befrugtning stimulerer færdiggørelsen af meiosen ved at nedbryde cyklin og securin, som holder metafasekromosomerne i metafasen sammen. Dernæst er ægget i sin haploide form som tillader fusion med sædcellens kerne.

69 Fusion af genetisk materiale (mennesket) DAPI tubulin * flagel flagel 0 timer 15 timer Den modne ubefrugtede ægcelle i sin første meiotiske deling med begyndende polært legeme Indtrængning af sædcelle*, kondensering af MT med aster dannelse, og ægcellens afslutning af 2. meiotiske deling ( ) Samling af pronuclei fra sæd- og ægcellen via MT udgående fra sædcellen pronuclues, centrosomet fordobles og påbegynder dannelse af et bipolært MT aster Ved den første mitotiske profase kondenserer kromosomerne fra de respektive pronuclei, og klargøres til separation i det mitotiske spindel Ved prometafasen intermixes kromosomer fra de respektive pronuclei, og det mitotiske spindel starter den første mitotiske deling Hvordan gøres sædcellens DNA klar til blanding med ægcellens? DNA et i sædcellens kerne er bundet til et kompakt netværk af basiske proteiner (protaminer), der er bundet sammen af disulfidbroer. Disse broer nedbrydes af ægcellens cytoplasmatiske indhold af glutathioner, hvorved DNA et foldes ud Hvornår dannes den diploide kerne? pga. de cellulære begivenhederne skitseret i fig. 7.34E - først ved to-celle stadiet efter den første kløvning.

70 Metode til undersøgelse over ZP1, ZP2 og ZP3 s rolle i binding af Sædcellen til zona pellucida (mus) Inhibitions-assay Binding af sædceller til zona pellucida undersøges i en vandig opløsning i fravær og i nærvær af forskellige koncentrationer af ZP1, ZP2 og ZP3 samt ZP3 uden glyko-delen (dens sukkerrester)

71 Metode til lokalisering af bindin efter akrosomal reaktion (søpindsvin) DAP precipitat Sædcellens ekstension af aktin-mikrofilamenter DAP: diaminobenzidine æggets vitellin-hylster på en mikrovilli Sædcellens ekstension af aktin-mikrofilamenter

72 Akrosom reaktion i pattedyr (hamster) kerne