Forskningsinteresser: Cellulær signaltransduktion

Transkript

1 Præsentation af forelæser: Docent Else K Hoffmann, Ph.D Molekylærbiologisk Institut August Krogh Bygningen, 5.sal, endelaboratoriet ud mod Jagtvej ekhoffmann@aki.ku.dk telf: Forskningsinteresser: Cellulær signaltransduktion Sammenhængen mellem regulering af cellestørrelse og styring af celleproliferation eller programmeret celledød (apoptose). Calcium som intracellular messenger. Regulering af Ion kanaler studeret ved patch-clamp teknik. Cytoskelletets rolle i celleregulering Små G- proteiner, MAP Kinaser og Tyrosin Kinaser Betydningen af frie ilt radikaler Effekter af forskellige former for cellestress Vi tilbyder bachelorprojekter indenfor alle de nævnte forskningsområder

2 Medlemmer af forskningsgruppen: Videnskabelige ansatte: Docent Else K Hoffmann Lektor Ian Lambert, Lektor Søren Tvorup Christensen, Lektor Stine Falsig Pedersen, Adjunkt Lotte Pedersen Forskningsadjunkt Carlo Ossum Post Doc Kristian Arild Poulsen Ph.D. studerende: Thomas K Klausen, Heidi Jones, Kristian Poulsen, Tune Wulff, Linda Schneider, Cristian Clement, Jakob Morville Schrøder, og Martin Friis. Specialestuderende og bachelorstuderende:

3 Kapitel 18 : Cellecyklus kontrol og celledød (side 611) 18_01_cell_cycle.jpg Celler dannes ved deling af allerede eksisterende celler Før de kan dele sig igen må de gro vækst deling

4 Kapitel 18 : Cellecyklus kontrol og celledød 18_01_cell_cycle.jpg De to helt basale formål 1. DNA i hvert chromosom skal fordobles og det skal organeller og makromolekyler også 2. Chromosomet og resten skal deles lige til hver dattercelle så begge får hele genomet

5 Tre hovedspørgsmål: Hvordan duplikerer cellerne deres indhold? Hvordan deler de det duplikerede materiale og deler sig i to? Hvordan styrer de hele det maskineri der er nødvendigt for disse to ting? De to første spørgsmål er diskuteret andre steder i bogen, her diskuterer vi det tredje nemlig: Hvordan styres og koordineres trinene i cellecyclus?? Cellecyclus kontrolsystemerne spiller en central rolle i at regulere celleantallet i de enkelte væv. Når det ikke styres kan der opstå cancer (ukontrolleret vækst) eller degenerative sygdomme som f.eks. Alzheimer s ( manglende celledeling og induktion af kontrolleret celledød).

6 Varigheden af én cellecyklus Befrugtede frøæg Hvor lang tid har de til alt dette? 30 minutter Gær timer Tarmceller 12 timer Pattedyr fibroblaster 20 timer Humane leverceller 1 år

7 Et godt modelsystem Oocytvækst og deling af ægcellen i Xenopus Det ubefrugtede æg gror i mange måneder i ovariet uden at dele sig. Når det så bliver befrugtet deler det sig meget hurtigt (hver 30 min uden at vokse) og cellerne bliver mindre og mindre. Der er næsten ingen G1 og G2 fase

8 Cellecyklus studeret i et cellefrit system Cytoplasma fra frøæg (Xenopus æg) og kerner fra spermatozo. Spermatozo kernerne kan gå gennem cyclus er af DNA replikation og mitose. Giver gode muligheder for at teste en masse tings effekt på cellecyklus

9 Cellecyklus i pattedyrceller studeres på pattedyr celler i kultur i plastikskåle med vækstmedium. Der bruges udødeliggjorte cellelinier der kan dele sig uendeligt antal gange Rottefibroblaster i scanning elektronmikroskop

10 Cellecyklus deles i fire faser- I M fasen deler de sig, resten er Interfasen (G1,S,G2). I hele interfasen vokser de. 18_02_four_phases.jpg Kromosomerne kondenseres Oversigt over cellecyklus I S fasen fordobles DNAet

11 Nogle metoder til at studere progressionen gennem cellecyklus

12 Man kan kende de celler der er i S fasen ved at inkorperere et eller andet synligt i det nysyntetiserede DNA. I A er der mærket med radioaktiv thymidin som går ind i DNA og cellerne i S-fasen ses ved autoradiografi. I B er det en thymidin analog der er inkorporeret og S fase cellerne genkendes ved et fluorescerende antistof mod denne thymidin analog.

13 Ved hjælp af hastigheden for indbygning af radioaktiv thymidin i cellerne ( i DNA) kan man kende celler i forskellig fase af cellecyklus. S fase celler er selvfølgelig dem der indbygger langt mest thymidin per tidsenhed. Hvis man giver en kort puls mærker man kun celler i S fasen. Hvis man tæller at f.eks 40% af cellerne bliver mærket med en kort puls ja så er 40 % af cellerne i S fase og længden af S fasen må være 40 % af hele cellecyklus.

14 En metode til at identificere celler i de forskellige faser i cellecyklus. 1. Cellerne mærkes med et stof der fluorescerer når det binder til DNA. 2. De analyseres i en fluorescence aktiveret cellesorteringsmaskine (FACS). 3. Celler i G1 har halvt så meget DNA som celler i G2 hvor DNAet er blevet fordoblet i løbet af S fasen.

15 Et centralt kontrol system styrer de vigtigste processer i cellecyklus Man kan sammenligne med en vaskemaskine hvor de enkelte funktioner kan styres. Den skal først tage vand ind, så tage sæbe ind, så blande det, så vaske, så skylde og centrifugere. Hvis det er svært at få rent kan vasketiden forlænges etc. Sammenligningen (som er bogens) er ikke helt god da vaskemaskinen ikke kan forlænge et af trinene (f.eks. Vasketrinnet ) selv under vejs, hvis tøjet ikke er blevet rent. Det tilsvarende kan cellen Cellecyclus kan stoppes ved en række checkpoints og trinet før forlænges

16 18_03_control_system.jpg Et cellecyklus kontrolsystem kontrollerer at DNA replikation mitose osv kommer efter specifikke punkter i cyklus (checkpoints) Cellerne kan blive længere i G1 hvis de f.eks sulter de kan endda gå i venteposition i speciel fase i slutningen af G1 kaldet G0

17 Check points virker som et bremsesystem 18_04_Feedback.jpg De to vigtigste checkpoints ligger ved overgangen fra G1 til S og ved overgangen fra G2 til M Bliver de stoppet her går de i G0, nerveceller og skeletmuskelceller bliver der resten af deres tid

18 Hvordan fungerer cellecyclus kontrolsystemet? Cellecykluskontrolsystemet grunder sig på cyklisk aktiverede protein kinaser og protein phosphataser. 18_05_ Proteinkinaserne Cdks.jpgaktiveres af Cycliner og kaldes derfor Cyclin-dependent protein kinases eller Cdks Den aktive kinase som trigger specifikke cellecyclus processer Cycliner kaldes sådan fordi deres koncentration varierer på en cyklisk måde gennem cellecyklus

19 Forskellige Cyclin-Cdk komplexer trigger forskellige trin i cellecyklus 18_13_Cdks_cyclins.jpg cdk 1 Cdk2

20 Det cyclin molekyle der hjælper med at drive cellerne ind i M fasen 18_06_M_Cdk.jpg hedder M-cyclin og her ser hvordan dets koncentration skifter på en cyklisk måde sådan at det stiger hen mod M fasen og falder i starten af interfasen Dets kompleks med kinasen kaldet M-Cdk stiger så lidt forsinket i M fasen. Når M fasen er slut falder det brat. Dette gør det fordi concentrationen af proteinet M-cyclin nedbrydes sidst i mitosen.

21 18_13_Cdks_cyclins.jpg cdk 1 Cdk2

22 Hvordan opdagede man cycliner, Cdk er og M- Cdk komplekset? Modne Xenopus æg er 18_08_Xenopus_egg.jpg velegnede til den slags studier

23 18_09_MPF_discover.jpg Cellen indeholdt komplekset M-Cdk som er komplekset mellem M-cyclin og Cyclin dependent kinase(cdk) Cellen indeholdt ikke M- Cdk

24 18_13_Cdks_cyclins.jpg cdk 1 Cdk2

25 Den måde fandt man M-Cdk og fandt at den oscillerede gennem 18_10_MPF_oscillates.jpg cellecyklus.

26 Det cyclin molekyle der hjælper med at drive cellerne ind i M fasen hedder M-cyclin 18_06_M_Cdk.jpg og her ser hvordan dets koncentration skifter på en cyklisk måde sådan at den stiger hen mod M fasen og falder lige i starten af interfasen Dets kompleks med kinasen kaldes M-Cdk og dets aktivitet stiger lidt forsinket og meget brat ved overgangen til M fasen. Det skyldes både en fosforylering og en defosforylering

27 Cdk skal phosphoryleres for at blive aktiv og det muliggør cyclin Det aktive site er blokeret af et loop som udfoldes når cyclin binder. Derpå kan en Cdk-aktiverende kinase (CAK) fosforylere Cdk

28 Cdk aktiviteten kan også hæmmes af andre phosphoryleringer som det 18_11_M_Cdk_active.jpg er tilfældet ved M-Cdk hvor dephosphoryleringen af den hæmmende phophatgruppe er det sidste der sker lige ved indgangen til M fasen.

29 De aktiverede M-Cdk er kan aktivere flere phosphataser som kan aktivere flere M-Cdkér o.s.v., derfor stiger M-Cdk aktiviteten så brat 18_12_more_M_Cdk.jpg

30 Det cyclin molekyle der hjælper med at drive cellerne ind i M fasen hedder M-cyclin 18_06_M_Cdk.jpg og her ser hvordan dets koncentration skifter på en cyklisk måde sådan at den stiger hen mod M fasen og falder lige i starten af interfasen Dets kompleks med kinasen kaldes M-Cdk og dets aktivitet stiger lidt forsinket og meget brat ved overgangen til M fasen. Den endelige stigning skyldes dephosphorylering af en hæmmende fosfatgruppe som grundet positive feed back er selvaccellererende

31 Opsummering af overgangen fra G2 til M fasen 1. I G2 fasen stiger concentrationen af proteinet M-cyclin ( cyclin B )gradvist. 2. M-cyclin forbindes med kinasen Cdk1 hvorpå den fosforyleres, det fosforylerede kompleks M-Cdk er stadig ikke aktivt da der både er hæmmende og fremmende fosfatgrupper på det. 3. Lige i starten af M fasen defosforyleres M-Cdk sådan at de hæmmende phospatgrupper fjernes. Dette kræver fosforylering af en fosfatase denne kan fosforyleres af M-Cdk 4. Dvs at M-Cdk protein komplekset bliver både fosforyleret og dephosphoryleret i G2 og ved overgang til M og en proteinfosfatase bliver fosforyleret lige ved overgangen mellem G2 og M

32 18_13_Cdks_cyclins.jpg Cyclin B cdk 1 M-Cdk aktiviteten nedreguleres så igen af M- cyclin degradering sidst i mitosen. Cdk2 Cyclin A

33 Her ses hvordan M-Cdk aktiviteten nedreguleres 18_07_cyclin_degradat.jpg igen af M-cyclin degradering sidst i mitosen. ubiquitinkæde M-cyclin molekylet ubiquitineres dvs der sættes flere molekyler af ubiquitin på på bestemte aminosyrer og M-cyclin molekylet nedbrydes derefter i proteasomet. Denne ubiquitinering styres af et proteinkompleks en ubiquitin ligase kaldet anaphase promoting complex (APC)

34 Forskellige Cyclin-Cdk komplexer trigger forskellige trin i cellecyklus S-Cdk starter DNA replikationen Reguleringen af S-Cdk foregår helt parallelt med reguleringen af M-Cdk som B lige er gennemgået 18_13_Cdks_cyclins.jpg Cyclin Hvordan trigger den så DNA reklikationen cdk? (næste slide) 1 Cdk2 Cyclin A

35 DNA replikation starter ved Store protein komplekser kaldet Origin recognition complex (ORC) der binder forskellige steder på DNA i chromosomet kaldet origins of replication Regulatorisk protein 18_14_S_Cdk.jpg Initiering af DNA replikation i S fasen Dannes i G1

36 De mekanismer der sikrer at cellens DNA kun replikeres én gang i hver cellecyklus S-Cdk spiller en dobbelt rolle: 1. Når Cyclin-Cdk komplekset S-Cdk er aktiveret sent i G-1 starter den initieringen af DNA syntesen ved det prereplikative kompleks ved fosforylering af ORC eller Origin recognition complekset 2. Derpå fosforylerer S-Cdk den anden del af det prereplikative compleks nemlig proteinet Cdc6 så dette kan deassocieres fra ORC og nedbrydes hvorefter processen stopper og ikke kan starte igen før efter at koncentrationen igen stiger af Cdc6 i næste G1

37 Regulatorisk protein 18_14_S_Cdk.jpg Initiering af DNA replikation i S fasen Dannes i G1 Dobbelt rolle

38 Cellecyklus kontrol systemet kan stoppe cellecyklus ved de forskellige checkpoints men hvordan? Ikke særlig velkendt dog kender man efterhånden en del proteiner der hæmmer cyclin afhængige protein kinaser (Cdk s). Det bedst beskrevne eksempel er stop af cellerne i G1 efter DNA skader eller andre former for stress påvirkninger. Her er det transkriptionsfaktoren p-53 og Cdk inhibitor proteinet p21 der er de vigtige.

39 Hvordan DNA skader stopper cellecyclus i G1 18_15_cell_cycle_G1.jpg Ved hæmning af Cyclin-Cdk complekserne G1/S-Cdk og S- Cdk som normalt driver cellen ind i S fasen

40 De seks mest almindelige mutationer i p53, de gule er sidekæderne i disse Strukturen af p53 Hjertet af p53 Zn 2+ Arg 175 gly245 Arg 249 Arg 248 Arg 273 helix2 DNA Arg 282 Loop 1

41 En del kendte carcinogener virker via at mutere p53. Det gælder f.eks. Benzopyrene som findes i cigaretrøg. Denne omsættes i leveren til et mutagent stof som fremkalder mutationer i p53. Et andet eksempel er aflatoxin som findes i muggent korn. Tumor fremkaldende virus virker ligeledes ofte ved at danne proteiner der hæmmer p53. Der kan laves spændende bachelorprojekter om forskellige aspekter af p53

42 Når cellen er stoppet ved checkpoint i G1 har den følgende tre muligheder: Den kan vente, den kan gå i G0, den kan gå videre i S 18_16_G1_checkpoint.jpg Nerveceller og skeletmuskelceller bliver der

43 Hvornår går cellen i G0? Hvis de mangler vækstfaktorer og stimulus fra andre celler Hvornår går celler i programmeret celledød (apoptose)? Bl.a. hvis det beskadigede DNA ikke kan repareres

44 Oversigt over cellens chekpoints 18_17_arrest_checkpt.jpg