2. Immunhistokemisk teknik

Transkript

1 2. Immunhistokemisk teknik Af Ole Nielsen 2.1 INDLEDNING DEFINITIONER Antigener Antistoffer PRÆPARATION: PARAFFINSNIT Fiksering Afkalkning Vævsfremføring til paraffin Skæring, montering, tørring og opbevaring af snit Afparaffinering og hydrering PRÆPARATION: CYTOLOGISK MATERIALE OG FRYSESNIT Fremstilling Tørring og opbevaring Fiksering BLOKERING AF ENDOGEN AKTIVITET Endogen enzymaktivitet Endogen biotin EPITOP DEMASKERING (RETRIEVAL) Proteolytiske enzymer Varmeinduceret epitop demaskering (HIER) BLOKERING AF USPECIFIK ANTISTOFADHÆSION PRIMÆRT ANTISTOF Valg af antistof Afprøvning af antistoffer Antistof-inkubation Antistoftiter, inkubationstid og temperatur Fortyndervæske Opbevaring og holdbarhed af antistoffer Kontrolprocedurer SKYLLEPROCEDURE Skyllebuffer Skylletid DETEKTIONSSYSTEMER Direkte teknikker Indirekte teknikker KROMOGEN/SUBSTRATOPLØSNING Horse radish peroxidase Alkalisk phosphatase KERNEFARVNING REFERENCER... 44

2 10 Immunhistokemisk teknik Figur 2.1: Flowchart over metodologiske parametre i den immunhistokemiske teknik. Materiale Væv Celler Nedfrysning Skæring af snit Montering af snit Tørring af snit Opbevaring Fiksering Fiksering Evt afkalkning Fremføring til paraffin Skæring af snit Montering af snit Tørring af snit Afparaffinering og hydrering Cytospin, dup, smear m.v. Tørring Opbevaring Fiksering Blokering af endogen aktivitet Epitop demaskering Blokering af uspecifik adhæsion Primært antistof Skylleprocedure Detektionssystem Kromogen/substratopl. Kernefarvning Montering af dækglas Anvendte forkortelser Ab(s) antibody(-ies) (antistof(fer)) AP alkaline phophatase CD cluster of differentiation CK cytokeratin ER estrogen receptor HRP mab pab PBS PgR rmab TBS horse radish (peberrod) peroxidase monoclonal antibody polyclonal antibody phosphate buffered saline progesteron receptor rabbit (kanin) mab tris buffered saline

3 Anvendt immunhistokemi Indledning Immunhistokemiske teknikker er traditionelt multi-step teknikker, hvor mange forskellige metodologiske parametre har betydning for det endelige resultat. I dette kapitel, der tager sit udgangspunkt i den praktiske immunhistokemi, som den udøves i diagnostisk sammenhæng, belyses de vigtigste parametres indflydelse på farvningsresultaterne. Der fokuseres specielt på immunenzymatiske teknikker på paraffinsnit, frysesnit og cytologisk materiale. Gennemgangen af parametrene og deres betydning for farvningsresultatet følger flowchartet, Fig Foruden den teoretiske gennemgang af de enkelte parametre anføres en række basale, praktiske præparations- og farvningsmæssige protokoller. Disse protokoller beskriver gennemprøvede, robuste og reproducerbare metoder. Teknikker, der anvendes til immunfluorescens, immunelektronmikroskopi og molekylærbiologiske undersøgelser, omtales ikke. 2.2 Definitioner Antigener Et antigen er et molekyle, der kan give anledning til dannelse af antistof ved injektion i et hvirveldyr. Langt de fleste antigener er proteiner eller proteinforbindelser, men kulhydrater og lipider kan også virke som antigener. Nogle kemiske substanser, fx metaller, er ikke i sig selv antigener, men kan i forbindelse med et protein danne en struktur, der udløser antistofdannelse. Sådanne substanser kaldes haptener. De antigene egenskaber ligger som regel i ét eller flere mindre områder af et molekyle. Disse områder kaldes antigene determinanter eller epitoper og består oftest af 4-8 aminosyrer eller monosaccharidenheder. En epitop kan bestå af en kontinuert sekvens af nabostillede aminosyrer i den primære proteinstruktur, eller af flere mindre aminosyresekvenser, der er bragt i tæt relation til hinanden gennem proteinmolekylets foldning (tertiære struktur). (Fig. 2.2). Figur 2.2: Model af antigen. De sorte områder repræsenterer antigene epitoper Antistoffer Antistoffer eller immunglobuliner (Ig) er glycoproteiner, der produceres i en organisme som reaktion på en antigenstimulation. Antistofferne binder sig med stor affinitet og specificitet til det stimulerende antigen. Antistoffer produceres i plasmaceller, der er transformerede B-lymfocytter, og afgives bl.a. til blodet, hvorfra de kan isoleres. I højere hvirveldyr findes fem klasser af immunglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM. Alle immunglobuliner er opbygget af tunge og lette proteinkæder. De fem immunglobulinklasser er bl.a. karakteriseret ved hver deres indhold af tunge kæder, α (alfa: IgA), δ (delta: IgD), ε (epsilon: IgE), γ (gamma: IgG) og µ (my: IgM). De lette kæder, der er fælles for alle immunglobulinklasser, kan enten være af type κ (kappa) eller λ (lambda). De fleste antistoffer, der anvendes til immunhistokemi, er af IgG-klassen, mens et mindre antal er af IgM-klassen. IgG-molekylet består af to tunge kæder (γ ) og to lette kæder (κ eller λ) bundet sammen med disulfidbroer i en Y-formet struktur (Fig. 2.3). På grundlag af antigene forskelle i de såkaldt konstante områder af de tunge kæder kan IgG-molekylerne yderligere inddeles i 4 subklasser: IgG1, IgG2a, IgG2b og IgG3. Med enzymerne papain og pepsin kan IgG-molekylet spaltes i flere komponenter. Papain spalter IgG i to antigen-bindende fragmenter benævnt fragment antibody (Fab) og ét fragment benævnt fragment crystalline eller fragment complement (Fc). Proteolytisk behandling med pepsin giver et F(ab )2 fragment. Fc-fragmentet indeholder bl.a. bindingssteder for Protein A, complement og receptorer på makrofager og granulocytter. Den specifikke antigenbindende egenskab ligger i den terminale, såkaldt variable region af Fab. Figur 2.3: Model af IgG molekyle. IgG er opbygget af 2 tunge og 2 lette kæder forbundet ved hjælp af disulfidbindinger. Papain spalter IgG i 2 antigenbindende fragmenter betegnet Fab og 1 fragment crystalline benævnt Fc. Pepsin proteolyse giver et F(ab )2 fragment. Fc Pepsin Fab F(ab ) 2 Papain

4 12 Immunhistokemisk teknik Den variable region indeholder den specielle aminosyresekvens og rummelige opbygning, der er komplementær til den epitop på antigenet, som det pågældende antistofmolekyle er rejst imod. Rummeligt passer epitop til antistof som en nøgle til en lås. Bindingen mellem antistof og epitop er en non-covalent binding, der oftest er en blanding af elektrostatiske kræfter, hydrogenbindinger, van der Waalske kræfter og hydrofob interaktion. Reaktionen mellem antigen og antistof er reversibel og kan beskrives som: Ag + Ab AgAb kompleks Ligevægtskonstanten K er herefter defineret som: [AbAg] 1 K = M [Ab]x[Ag] hvor [Ab] er den molære koncentration af frie antistofmolekyler, [Ag] er den molære koncentration af frit antigen, og [AbAg] den molære koncentration af antistof-antigen komplekser. Antistoffers bindingsstyrke til antigen betegnes affinitet. For antistoffer med høj affinitet er ligevægtskonstanten i størrelsesorden til For antistoffer med lav affinitet ligger ligevægtskonstanten nede omkring I immunhistokemisk sammenhæng giver antistoffer med høj affinitet naturligvis de bedste resultater, bl.a. fordi de i højere grad er i stand til at forblive bundet til antigen gennem hele proceduren. Polyklonale antistoffer Polyklonale antistoffer (pabs) er blandinger af antistoffer fra forskellige kloner. De produceres ved at immunisere et dyr (kanin, svin, ged eller lignende) med et oprenset antigen. Dyret vil rejse et immunrespons, og de producerede antistoffer kan høstes gennem gentagende tapninger af blod og efterfølgende isolering af serum. I dyret vil der oftest opformeres mange kloner af plasmaceller (polyklonalt respons), der hver for sig producerer antistofmolekyler rettet mod én af epitoperne i antigenet (Fig. 2.4). Der vil således til en hver af antigenets epitoper kunne produceres mange forskellige antistoffer, der varierer mere eller mindre med hensyn til affinitet og specificitet. Blandt disse mange forskellige antistoffer kan forekomme nogle, der krydsreagerer med epitoper på andre molekyler, end det antigen, Figur 2.4: Polyklonalt antistof (A) og monoklonalt antistof (B) rettet mod det samme antigen de er rejst imod. Sådanne krydsreagerende antistoffer bør fjernes fra antisera ved hjælp af absorption med det krydsreagerende molekyle. Kun de færreste kommercielle antistoffer findes tilgængelige i fuldserumformat. Risikoen for at det store indhold af serumproteiner vil give problemer med baggrundsfarvning er for stor. I stedet sælges de som en oprenset immunglobulinfraktion. Immunglobulinfraktionen vil foruden de specifikke antistoffer også indeholde dyrets normale cirkulerende immunglobuliner. Yderligere oprensning af antistof kan foretages ved hjælp af affinitetskromatografi, hvor man på en antigenkoblet kromatografisøjle kan isolere de specifikke antistoffer. Da pabs består af mange forskellige antistofmolekyler rettet mod mange forskellige epitoper på det samme antigen, kan affinitetsbegrebet ikke direkte anvendes. For disse beskrives bindingsstyrken ved udtrykket aviditet. Aviditeten er populært sagt en slags affinitetsmiddelværdi for de forskellige antistoffer, der indgår i det polyklonale antiserum. Monoklonale antistoffer Monoklonale antistoffer (mabs) er antistoffer, der alle stammer fra samme celleklon. I modsætning til et pab vil mab udelukkende bestå af fuldkommen ens antistofmolekyler rettet mod én og samme epitop på antigenet (Fig. 2.4). mabs produceres ved hjælp af Köhler og Milstein s hybridomteknik (1). Teknikken, der går ud på at fusionere immuniserede B-lymfocytter med myelomceller, er beskrevet i detaljer af Gatter et al. (2). Produktionen af mabs sker i sin oprindelige form ved, at en mus immuniseres med antigen, der ikke nødvendigvis er fuldstændig rent, hvorefter lymfocytterne isoleres fra milten på den immuniserede mus. Disse lymfocytter, der naturligt har en begrænset levetid, fusioneres derefter med myelomceller, der er maligne og i principet udødelige celler, og som er blevet valgt, fordi de har mistet evnen til at producere og secernere immunglobuliner. Ved fusionen mellem de to celletyper opstår der en cellehybrid, der kan secernere immunglobuliner, hvis specificitet er bestemt af musens lymfocytter, og som har myelomcellernes egenskaber med hensyn til neoplastisk proliferation. Hybridomcellerne klones og undersøges for antistofproduktion. De antistofproducerende kloner undersøges herefter med henblik på at finde dem, der producerer antistof rettet mod det immuniserende antigen. De pågældende antistoffer undersøges dernæst i flere testsystemer, her iblandt immunhistokemi, for at fastslå forhold omkring affinitet, specificitet og eventuel krydsreaktivitet for antistoffet. Når interessante kloner er identificeret, kan yderligere opformering foretages. Opformeringen foregår ofte i store

5 Anvendt immunhistokemi 13 cellekulturer, hvor antistoffet høstes som supernatant fra store dyrkningsflasker. En alternativ måde til opformering er den såkaldte ascites produktion, hvor hybridomceller sprøjtes ind i peritonealhulen på mus, hvor der udvikles en antistofproducerende tumor. Antistoffet høstes ved at tappe ascitesvæske af musen. Navngivning af mabs foregår normalt ved at angive antigenets navn efterfulgt af en tal- eller bogstavkode, der refererer til den antistofproducerende celleklon (fx anti-erα, klon 1D5). Kommercielt tilgængelige kanin mabs (rmabs) så først for alvor dagens lys i 2003, hvor NeoMarker i samarbejde med Epitomics lancerede en stribe rmabs, der fungerer glimrende på paraffinsnit. Blandt de bedste i den serie kan nævnes anti- cyclin-d1, klon SP4; anti-erα, klon SP1; anti-pgr, klon SP2; anti- Ki67, klon SP6; og anti-cox2, klon SP21. Andre SP-antistoffer fungerer dog mindre godt, og et enkelt er trukket tilbage fra markedet. Produktionen af rmabs foregår efter samme princip som for muse mabs. Når der tidligere ikke fandtes kommercielt tilgængelige rmabs, skyldes det bl.a. problemer med at finde en passende fusionspartner (myelomcelle) til kaninlymfocytter, d.v.s. en fusionspartner, der kunne skabe en stabil hybridomcellekultur med høj antistofproduktion. Dette problem og andre produktionstekniske problemer er nu løst. Da rmabs byder på fordele som fx højere affinitet end muse mabs, vil fremtiden helt sikkert bringe mange nye rmabs på markedet. 2.3 Præparation: paraffinsnit Paraffinsnit fremstilles sædvanligvis ud fra histologisk materiale. Der er dog tiltagende interesse for, med henblik på immunhistokemiske undersøgelser, også at fremstille paraffinsnit ud fra cytologisk materiale (se afsnit 2.4.1) Fiksering En essentiel del af al histologisk og cytologisk teknik er fikseringen. Ved fiksering forstås normalt en kemisk behandling, der har til formål at immobilisere og stabilisere vævets og cellernes bestanddele. I immunhistokemisk sammenhæng skal et fiksativ ideelt kunne: 1. Immobilisere antigener. 2. Bevare antigenisitet. 3. Bevare vævs- og cellestruktur. 4. Bevare permeabiliteten for immunreagenser (antistoffer mv.). Naturligvis findes det ideelle immunhistokemiske fiksativ ikke. Specielt kravet om bevarelse af antigenisitet vil ofte komme i konflikt med kravene om bevarelse af struktur og immobilisering af antigener. Med antigenisitet forstås sædvanligvis tilstedeværelsen af antistofbindende aktivitet. Da bindingen mellem antistof og epitop er stærkt afhængig af epitopens rumlige struktur, vil antigenisiteten næsten altid være under indflydelse af den kemiske påvirkning, som et hvert fiksativ vil udøve på antigener. Fiksativer kan inddeles i 2 hovedgrupper: 1. Koagulerende fiksativer ( non-cross-linking fiksativer). 2. Gelerende fiksativer ( cross-linking fiksativer). Koagulerende fiksativer Til de koagulerende fiksativer hører bl.a. etanol, metanol, picrinsyre og acetone. Ved den koagulerende fiksering åbnes proteinernes tertiære struktur og hydrofobe grupper samt reaktive grupper blotlægges. Disse blotlagte grupper vil herefter kunne reagere med grupper i andre proteinmolekyler under etablering af større uordnede aggregater (Fig. 2.5). På trods af den vidtgående strukturelle modifikation af antigenerne er antigenisiteten forbavsende velbevaret for ganske mange antigeners vedkommende. En af årsagerne til dette er, at såvel den primære som den sekundære struktur af antigenerne ikke påvirkes. Koagulerende fiksativer er således meget velegnet til fiksering af fx intermediære filamenter som CK og vimentin. Den morfologiske bevarelse af væv fikseret i rene koagulerende fiksativer er dog ikke den bedste. Samtidig er der en risiko for, at antigener med en lav molekylvægt vil ekstraheres under fikseringen. Dette er de væsentligste årsager til, at koagulerende fiksativer sjældent bruges rutinemæssigt til fiksering med henblik på paraffinindlejring. I den forbindelse er det vigtigt at bemærke, at etanol dehydrering vil virke som en koagulerende efterfiksering på væv, der kun er fikseret kort tid i formaldehyd. Immunhistokemiske metoder optimeret til formalinfikseret væv kan ikke uden videre anvendes til undersøgelser på væv fikseret i koagulerende fiksativ. Antigener, der ikke er fikseret tilstrækkeligt i formalin, vil blive helt eller delvis fikseret i alkohol under vævspræparering med risiko for at blive ekstraheret (fx S-100 protein). Figur 2.5: Gelerende og koagulerende fiksativer. Efter Lyon (3). Koagulerende fiksering Nativt protein Gelerende fiksering Polypeptidkæde Hydrofobe aminosyreradikaler Hydrofile aminosyreradikaler Tværbindinger

6 14 Immunhistokemisk teknik Gelerende fiksativer Gelerende fiksativer virker bl.a. ved at etablere tværbindinger mellem visse aminosyreradikaler i proteinerne (antigenerne) (Fig. 2.5). Foruden at give en glimrende bevarelse af vævsmorfologien er tværbindingerne med til at stabilisere antigenerne i en nativ eller kun svagt modificeret konformation, således at de ikke koagulerer under den efterfølgende dehydrering. På trods af en stabilisering i stort set nativ konformation, påvirkes antigenisiteten for mange antigener negativt af gelerende fiksering. Blandt de gelerende fiksativer er 4% neutral buffet formaldehyd (NBF) klart det foretrukne fiksativ i diagnostisk rutinesammenhæng. Formaldehyd menes at påvirke antigenisiteten på flere måder: 1. Maskering af epitoper. a. gennem konformative ændringer i antigenet. b. gennem immobilisation af nabomakromolekyler (sterisk hindring). c. gennem compleksbinding af metalioner, især Ca-ioner 2. Kemisk modifikation af reaktive aminosyrer i epitopen. 3. Ekstraktion af antigener under fikseringen eller den efterfølgende præparation. Da fiksering påvirker antigenisiteten, bør fikseringstiden så vidt mulig standardiseres. Fikseringstider på timer i NBF giver generelt de bedste resultater. Ved for kort fikseringstid er der som nævnt ovenfor risiko for, at en del af epitoperne i virkeligheden bliver alkoholfikserede, hvilket markant kan ændre betingelserne for immunhistokemisk påvisning. Marzo et al. (87) viste i et studie på prostatektomier, at antallet af p27kip1 positive epitelceller i prostata falder, hvis fikseringstiden i NBF nedsættes. Fikseringstider under 1 døgn gav væsentlig svagere reaktioner end fikseringstider på 2 døgn eller mere. Antip27 KIP1, klon 57 fungerer bedst på væv fikseret mellem 2 og 7 døgn i NBF (87). Ved for lang fikseringstid ses en tiltagende maskering af mange epitoper. Da formaldehydbindingen er delvis reversibel, er det muligt at rette op på en del af problemerne vedrørende bevarelse af antigenisitet. Langvarigt skyl (dage!) i vand efter fiksering af rehydrerede paraffinsnit kan løse en del af problemerne vedrørende maskering og kemisk modifikation af epitoper, men vil sjældent være relevant på grund af muligheden for epitopdemaskering (afsn. 2.6) Afkalkning Væv, der indeholder større mængder calciumsalte, fx knoglemateriale, kræver normalt en afkalkning, for at brugbare paraffinsnit kan produceres. I praksis benyttes mange forskellige afkalkningsmedier, som hver for sig kan påvirke antigenisiteten i vævet. Afkalkningsmedier kan inddeles i 4 hovedgrupper: 1. Stærke, uorganiske syrer, fx HCl og HNO 3 2. Kommercielle blandinger indeholdende bl.a. stærke syrer, fx Decal, New Decal, RBD, S/P, RDO mv. 3. Svage, organiske syrer, fx myresyre og eddikesyre 4. Kompleksbindere, fx EDTA. De stærke syrer og de kommercielle blandingsprodukter udmærker sig ved at afkalke vævet hurtigt. De kan dog ikke ubetinget anbefales til materiale, der efterfølgende skal anvendes til immunhistokemi. Bruges således Decal (Histolab, Västra Frölunda) til afkalkning (4-6h) på NBF fikseret væv, tabes antigenisitet helt eller delvist for de fleste antigener (4). Andre kommercielle blandingsprodukter har vist sig mere anvendelige. Arber et al. (57) fandt med RBD (Rapid Bone Decal, USA) og S/P Decal (USA) som afkalkningsmedier tilfredsstillende resultater med 52 ud af 57 antistoffer. Desværre sås med vigtige antistoffer (som anti-epithelial antigen, Ber-EP4; anti-p53, klon DO7; anti-erα, klon 1D5; anti-pgr, klon ICA; anti-elastase, klon NP57; og anti-ki67, klon MIB1) i visse tilfælde svage eller negative reaktioner sammenlignet med ikke-afkalkede kontrolpræparater. I samme undersøgelse farvede alle 57 antistoffer svarende til eller kraftigere end kontolpræparaterne, hvis EDTA-baseret afkalkning blev anvendt. Dette understreger EDTA s egenskab som skånsomt afkalkningsmedium. Ulempen er blot, at afkalkning i EDTA er meget langsom. Det kan selv for mindre biopsier være nødvendigt at afkalke i op til flere dage. Et godt alternativ til både de stærke syrer og EDTA er derfor de svage organiske syrer. Specielt gode resultater er opnået med myresyre (10% myresyre eller Kristensens opløsning, der er 4 M med hensyn til myresyre og 0,5 M med hensyn til Na-formiat), der afkalker en hel del hurtigere end EDTA. Knoglebiopsier kan således afkalkes på 3-6 timer i Kristensens opløsning. Herefter kan der produceres paraffinsnit af høj kvalitet, med mulighed for at påvise de fleste antigener, der normalt overlever NBF-fiksering og paraffinindlejring. En forudsætning for de gode resultater er selvfølgelig, at vævet er fikseret ordentligt inden afkalkningen påbegyndes. Med hensyn til bevarelse af antigenisitet afkalker Kristensens opløsning generelt ligeså skånsomt som EDTA - også hvad angår nucleære antigener som p53, Ki67, ERα og PgR (4). Der ses dog undtagelser. Anti-CD79a, klon JCB117 giver således efter afkalkning i myresyre en noget svagere reaktion, end hvad der opnås efter EDTA afkalkning, mens antielastase, klon NP57 slet ikke tåler syreafkalkning (hverken stærke syrer eller myresyre). Klon NP57 kan således kun anvendes, hvis afkalkningen foretages i EDTA (4).

7 Anvendt immunhistokemi Vævsfremføring til paraffin Forholdsvis få studier har beskæftiget sig med betydningen af forskellige dehydrerings-, klarings- og paraffinindlejringsmedier i forbindelse med immunhistokemiske farvninger. Meget tyder imidlertid på, at vævsfremføringen i et vist omfang bidrager til maskeringen af antigene epitoper i paraffinsnit. Antigener som Ki67 og terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), der lader sig påvise umiddelbart i både kryosnit og cytologisk materiale selv efter 6-24 timers fiksering i NBF, lader sig ikke uden forudgående demaskering påvise i paraffinsnit af væv fikseret den samme tid i NBF. Vævsfremføringens bidrag til epitopmaskering er på den anden side konstant og ret uafhængig af, hvilke dehydrerings- og klaringsmedier (og for den sags skyld paraffintyper), der anvendes (4,5,56). Det, der synes vigtigst for bevarelsen af antigenisiteten, er, at vævet dehydreres fuldstændigt og at paraffininfiltreringen er komplet. Forkortelse af tiden til dehydrering og paraffinindfiltrering har således for visse antistoffer (fx anti-cd20, klon L26) betydet nedsat reaktivitet Skæring, montering, tørring og opbevaring af snit Paraffinsnit bør skæres 3-5 µm tykke, strækkes fuldkommen på varmt vandbad (ca. 45 C) og monteres på glas coatede med fx poly-l-lysin eller silane, eller på elektrostatisk behandlede glas som fx SuperFrost Plus. Anvendelse af forbehandlede objektglas nedsætter drastisk risikoen for at miste snit undervejs i farvningsproceduren. Efter montering skal snittene tørres, hvorved bindingen til glasset forstærkes. De fleste epitoper tåler tørring ved 60 C i 1 time. En mere skånsom tørring opnås ved 37 C natten over (56), eventuelt efterfulgt af 60 C i 1 time. Enkelte antigener (epitoper) er meget varmefølsomme, det gælder fx proliferating cell nuclear antigen (PCNA) Ønsker man således at påvise PCNA i paraffinsnit med fx antistoffet klon PC10, opnås klart de bedste resultater ved at tørre snittene natten over ved stuetemperatur. Velfikseret og velpræpareret materiale indstøbt i paraffin synes at bevare antigenisiteten af formalinresistente epitoper godt. Der er dog undtagelser. Dash et al. (58) har vist, at androgenreceptor immunreaktiviteten aftager med tiden i paraffinblokke. Med anvendelse af mab F på 9 prostatakarcinomer registredes ved hjælp af billedanalyse et tab af immunreaktivitet i paraffinblokkene svarende til ca. 40% over en periode på 22 mdr. På trods af disse fund er den generelle holdning stadig, at antigenisiteten bevares godt i paraffinblokke, hvad talrige retrospektive studier baseret på materialer op til år gamle også viser. Til gengæld er antigenisiteten i skårne og glasmonterede paraffinsnit ikke nær så holdbar som i intakte paraffinblokke. Mange nyere studier (6,7,59,60,61,62,79,80,81) har vist, at flere antigener taber antigenisitet som funktion af snittenes alder og opbevaringstemperatur. Der har i de forskellige studier været nogen forskel på, hvilke antigener man har fundet følsomme. Følgende diagnostisk vigtige antistoffer har alle i et eller flere studier vist et varierende tab af reaktivitet i gamle snit sammenlignet med nye snit af de samme blokke: Anti-ERα, klon 1D5 og 6F11; anti-anaplastic lymphoma kinase, klon ALK-1; anti-cyclin D1, klon P2D11F11; anti-terminal deoxynucleotidyl transferase, pab; anti-p53, klon DO7 og PAb1801; anti-bcl2, klon 124; anti-chromogranin A, klon LK2H10; anti-factor VIII, pab; anti-cd3, pab; anti-cerbb-2, klon 3B5; anti-e-cadherin, klon HECD-1; anti-vimentin, klon V9; anti- CD45R0, klon UCHL-1; anti-epidermal growth factor receptor, klon EGFR.113; anti-retinoblastom gen protein, klon G3-245; anti- ACTH, pab og anti-ki67, klon MIB1. Årsagen til fænomenet er ukendt, men da tabet af reaktivitet for nogle antigener (fx p53 og ERα) ses allerede efter få ugers opbevaring (59,60,61), er det et problem, der specielt i store retrospektive studier må tages højde for. Flere studier har vist (62,79,81), at tabet af antigenisitet er størst, hvis snittene opbevares ved stuetemperatur eller højere. Opbevaret ved 4ºC er tabet væsentlig mindre, og ved -80ºC ses der intet tab efter 3 års opbevaring (62). Med vekslende held er tabet af antigenisitet forsøgt restaureret gennem forstærket epitop retrieval (forlænget kogetid i HIER-buffer eller brug af alternative buffere, se afsn ) eller opvejet ved at bruge primære antistoffer i højere koncentrationer. Som en konsekvens af ovenstående må det anbefales, at paraffinsnit, der skal opbevares mere end 14 dage, før de skal anvendes (fx positive kontrolsnit og snit til videnskabelige studier), som minimum bliver opbevaret ved 4ºC eller endnu bedre ved -20ºC eller -80ºC, og at man ved hjælp af sammenligning med friskskårne snit registrerer omfanget af et evt. tab i antigenisitet Afparaffinering og hydrering Som for enhver anden farvemetode er en komplet fjernelse af paraffin og dernæst afparaffineringsmediet (xylen, Estisol eller lignende) og rehydreringsmediet (etanol) vitale elementer i den immunhistokemiske teknik. De fleste laboratoriers standard afparaffinerings- og rehydreringsprocedure vil oftest direkte kunne overføres til immunfarvningerne.

8 16 Immunhistokemisk teknik 2.4 Præparation: cytologisk materiale og frysesnit Fremstilling Cytologiske præparater En vigtig forudsætning for succes med immuncytokemiske teknikker er optimal præparering af materialet. For cytologiske materialer (smears, cytospin-, monolayer- og duppræparater) er det vigtigt, at der anvendes coatede eller elektrostatisk behandlede objektglas, at cellerne så vidt muligt findes jævnt fordelt på objektglasset, og at cellerne er så velbevarede og intakte som muligt. Disse krav er ikke forskellige fra de præparationsmæssige krav, der stilles til almindelige cytologiske farvemetoder som May-Grünwald/Giemsa og Papanicoulaus. Dog er det med immuncytokemiske teknikker endnu vigtigere at anvende præparater, hvor cellerne ligger i ét lag og ikke for tæt. I celletætte cytologiske materialer vil der ofte opstå problemer med trapping og uspecifik adhæsion af antistofferne med baggrundsfarvning til følge. Mange problemer med cytologiske præparater kan løses ved at fremstille celleblokke i form af formalinfikserede, paraffinindstøbte centrifugater eller sedimentater, der kan håndteres som almindeligt histologisk materiale (jfr. afsnit 2.3). Protokol for fremstilling af celleblokke 1. Den ufikserede celleholdige væske centrifugeres 10 min. ved 3000 omdr./min, og supernatanten hældes fra. 2. Bundfaldet tilsættes humant plasma (3 dråber til ca. ½ ml bundfald). Plasma og bundfald blandes ved hjælp af pipetten. 3. Der tilsættes bovint trombin* (2 dråber til 3 dråber plasma). Hvis ikke opløsningen koagulerer inden for ét minut, tilsættes yderligere én dråbe trombin (gentages efter behov). Herefter tilsættes neutral buffet formalin, og materialet føres efter en fikseringstid på 24 h frem til paraffin. *Bovine Thrombin (Biofac A/S), 1 ampul à units opløses i 100 ml 0,9% NaCl. Væsken fordeles i kryorør og nedfryses ved -20º C. Frysesnit Frysesnit skæres normalt 4-6 µm tykke og monteres på coatede eller eletrostatisk behandlede glas. Som ved alle undersøgelser på frysesnit er det vigtigt, at vævet nedfryses hurtigt, så fryseartefakter undgås. Nedfrysning i isopentan ved -79ºC giver gode resultater (3). Det er ligeledes vigtigt, at skæring foregår ved den temperatur, der er optimal for den pågældende vævstype (oftest mellem -12ºC og -18ºC). Efter skæring på cryostat optøs vævsblokken som regel for at gennemgå normal fikserings- og præparationsprocedure mhp fremstilling af paraffinsnit til supplerende histokemiske evt. immunhistokemiske analyser. Ønskes paraffinsnit af tidligere nedfrosset materiale anvendt til immunhistokemi, bør fortolkning af farvningsresultaterne foretages med forsigtighed. Reaktiviteten af en del antigener har vist sig at være svækket i paraffinsnit af tidligere nedfrosset væv, i forhold til hvad den er i paraffinsnit af ikke tidligere frosset materiale fra samme patienter. Egerton et al. (82) fandt flere eksempler på betydelig svækkelse af reaktiviteten på tidligere nedfrosset materiale når antistoffer mod S- 100, synaptophysin, neuron specific enolase, carcinoembryonic antigen, chromogranin og melanosoma specific antigen (HMB45) anvendtes. Lignende fund er gjort i eget laboratorium I en række lymfomer er cyclin D1 reaktiviteten set svækket, mens spørgsmålet om klonalitet i B-lymfomer gennem påvisning af kappa og lambda kæder i flere tilfælde ikke kunne besvares, når vævet tidligere havde været nedfrosset. CryoJane teknik Med introduktionen af sentinel node (SN) proceduren indenfor operation af mammakancer og malignt melanom er antallet af frysesnit på lymfeknuder steget betydeligt på mange patologiske instituter. Lymfeknuder er i sig selv ikke vanskellige at producere gode frysesnit af. Er det lymfatiske væv infiltreret med store mængde fedtceller, som kan være tilfældet med SN, er historien dog en ganske anden. Lymfatisk væv og fedtvæv har meget forskellige skæreegenskaber, hvilket vanskeliggør tilfredsstillende snitkvalitet. Til at afhjælpe disse problemer har en såkaldt tape transfer teknik ved navn CryoJane vist sig brugbar. Ved hjælp af en speciel tape, der understøtter vævet under skæring, overføres snit til specielle objektglas. Disse er coatede med en UV-sensitiv lim. Efter UV belysning kan tapen fjernes, efterladende et intakt frysesnit af høj teknisk kvalitet. CryoJane snit kan anvendes til HE farvning, div. histokemiske teknikker og immunhistokemi (evt Haste-EnVision, se afsnit ). CryoJane systemet markedsføres af firmaet Instrumedics ( Tørring og opbevaring Efter fremstilling af cytologiske præparater og frysesnit er det i de fleste tilfælde hensigtsmæssigt at tørre vævet/cellerne på objektglasset. Tørring inden evt. fiksering (se afsn ) er med til at bevare morfologien uden nævneværdigt tab af antigenisitet. Tørretiden vil typisk være mellem 1 time og natten over. Tørringen kan evt. foregå under ventilator eller lignende. Efter endt tørring er materialet klar til evt. fiksering og efterfølgende immuncytokemi. Skal materialet ikke immunfarves umiddelbart efter tørring, bør opbevaringsformen overvejes. Opbevaret ukritisk ved stuetemperatur vil de fleste antigener blive

9 Anvendt immunhistokemi 17 tiltagende vanskelige at påvise (sammenlign afsn ). For mange antigeners vedkommende ses der efter 3 dages opbevaring ved stuetemperatur ingen eller kun marginal svækkelse af antigenisiteten. For andre antigeners vedkommende er der allerede efter 3 dages opbevaring set en betydelig svækkelse af reaktionen. Det drejer sig bl.a. om myosin af slow og fast type påvist med flere forskellige kommercielle mabs (4). Den sikreste måde at opbevare sine cytologiske materialer og frysesnit - med henblik på senere immuncytokemi - er derfor at pakke de tørrede præparater i stanniol og nedfryse dem. Ved -18 C vil antigenisiteten bevares i måneder. Ved -80 C og derunder bevares antigenisiteten sædvanligvis i årevis. Når de tørrede og frosne præparater tages ud af fryseren til immunfarvning, er det vigtigt, at de ikke pakkes ud af stanniolen, før de har opnået stuetemperatur. Udpakning af kolde præparater vil medføre kondensdannelse på materialet, hvilket kan forringe den cytologiske kvalitet Fiksering I modsætning til paraffinsnit har man med cytologiske materialer og frysesnit alle muligheder for at optimere fikseringsproceduren med henblik på optimal bevarelse af netop de antigener (epitoper) materialet skal undersøges for. Når der bortses fra epitoper, der dårligt tåler fiksering (se nedenfor) er der en lang række forskellige fiksativer til rådighed i forskellige immunhistokemiske sammenhænge. Ofte vil det være nødvendigt med en efterfølgende epitopdemaskering (se afsn. 2.6). Blandt de vigtigste fiksativer er: 1. Acetone, 100% 2. Acetone/metanol (forhold 1:1) 3. Acetone/metanol/formaldehyd (forhold 19:19:2) 4. Neutral buffet formaldehyd (NBF). 4% 5. Neutral buffet formaldehyd (NBF). 4%, efterfulgt af detergentbehandling 6. Neutral buffet formaldehyd (NBF) 4%, efterfulgt af epitopdemaskering (se afsn. 2.6) 7. Zambonis fiksativ. Der er desuden en række antistoffer, hvortil acetone ikke kan anvendes som fiksativ. Blandt disse er følgende diagnostisk vigtige antistoffer: anti-erα (mange forskellige kloner); anti-pgr (mange forskellige kloner); anti-p53 (mange forskellige kloner); anti-terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)(såvel mabs som pabs); anti-ki67, klon MIB1; anti-pcna, klon PC10; og anti-c-erbb2, pab. For nogle af disse antistoffers vedkommende er problemet øjensynligt, at antigenet helt eller delvist ekstraheres i acetone eller de efterfølgende procedurer. Acetone/metanol Acetone/metanol (1:1) er en blanding af koagulerende fiksativer. Fiksering sek giver en rimelig skånsom fiksering, som kan anbefales til hæmatologisk materiale i kombination med en forstærket (repeteret, se nedenfor) alkalisk phosphatase anti-alkalisk phosphatase (APAAP)-teknik. Acetone/metanol giver i sammenligning med ren acetonefiksering en langt bedre cytologisk bevarelse af cellerne. En væsentlig ulempe ved acetone/metanol fiksering er, at reaktiviteten for en del epitopers vedkommende svækkes i forhold til fiksering alene med acetone. Svækkelsen af reaktionen kan delvis kompenseres ved hjælp af et meget følsomt detektionssystem, fx APAAP med forstærkning. Der er epitoper, der ikke lader sig påvise efter acetone/metanol fiksering. Indenfor hæmatologien kan bl.a. følgende mabs således ikke anvendes på acetone/metanol-fik seret materiale: anti-cd10, klon SS2/36; anti-cd16, klon VIFcRIII; anti-cd13, klon My7; anti-cd33, klon VM54; anti-cd103, Ber ACT8; anti-hairy cell leukemia, klon DBA.44; og anti-glycophorin A, klon D Acetone/metanol/formaldehyd Acetone/metanol/formaldehyd (19:19:2) giver en kombineret koagulerende og gelerende fiksering. Fiksering i sek. giver yderligere forbedringer af den cytologiske bevarelse i forhold til acetone/metanol fiksering. Ulempen er, at der samtidig ses en yderligere svækkelse af immunreaktiviteten for en del epitopers vedkommende. Acetone Acetone er et rent koagulerende fiksativ. Fiksering af frysesnit i 10 min. (cytologisk materiale behøver kun fiksering i 90 sek.) ved stuetemperatur eller ved 4 C bevarer antigenisiteten udmærket for de fleste antigener. Acetonefiksering er derfor af mange det foretrukne til frysesnit og cytologisk materiale, når det fx drejer sig om påvisning af overfladeantigener. En ulempe er, at morfologien ikke altid er optimalt bevaret. Neutral buffet formalin (NBF) NBF (4%) giver en ren gelerende fiksering. Fiksering i 2-30 min. giver noget nær optimal morfologisk bevarelse på frysesnit, samtidig med at NBF er et fremragende fiksativ til specielt mange kernelokaliserede og intracytoplasmatiske antigener. På frysesnit opnås gode resultater med NBF, også for antigener, der ikke umiddelbart kan påvises på paraffinsnit. Dette fænomen er en understregning af, at ikke kun NBF-fikseringen bidrager til problemer med tab af antigenisitet i paraffinsnit.

10 18 Immunhistokemisk teknik Dehydrerings-, klarings-, og paraffininfiltreringsproceduren må ligeledes forventes at bidrage i et vist omfang til maskeringen af epitoper. Blandt de mange antigener, hvortil der med fordel anvendes NBF-fiksering, kan nævnes: S-100 protein, p53 oncoprotein, C-erbB2 oncoprotein, TdT, ERα og PgR og Ki67 antigen. Anvendes NBF til fiksering af cytologisk materiale, vil det i de fleste tilfælde være nødvendigt at foretage en form for permeabilisering af cellemembraner inden den immunhistokemiske farvning. Permeabilisering kan udføres på flere måder. Det letteste er at efterbehandle de NBF-fikserede celler med et detergent (sæbelignende stof) Ingen fiksering Især inden for muskelpatologien findes en række antigener, der bedst påvises uden nogen form for fiksering. Det drejer sig primært om proteiner med en relativ høj molekylvægt og/eller med en vis strukturel forankring i muskelcellens cytoplasma eller cellemembran. Påvisningen af slow myosin, klon WBMHCS; fast myosin, klon My32; dystrophin, klon Dy86C5; og en række dystrophinrelaterede antigener foregår derfor i praksis ved at applicere det primære antistof på de tørre frysesnit uden nogen forudgående behandling (fiksering eller lignende). Det skal dog tilføjes, at de fleste af disse antigener ikke desto mindre kan påvises i formalinfikserede muskelbiopsier med udmærkede resultater. Protokol for kombineret NBF fiksering og permeabilisering 1. Fiksering i 4% NBF 15 min. 2. Skyl i buffer 2 min. 3. Triton-X-100 (0,05%-0,5% i TBS) 10 min. 4.Skyl i buffer og fortsæt med immunfarvning. Detergentbehandlingen ekstraherer dele af lipidmaterialet i cellens membraner, hvilket gør det lettere for immunreagenserne at penetrere dem. Effekten af detergentbehandling på cytologisk materiale vil tydeligt kunne iagttages ved påvisning af fx p53 oncoprotein og andre kernerelaterede antigener som TdT, Ki67 og lignende. Specielt for p53 s vedkommende giver NBF-fiksering efterfulgt af Triton-X-100 behandling en voldsom forstærkning af reaktionen sammenlignet med den rene NBF-fiksering. NBF og varmeinduceret epitopdemaskering (HIER) Mange antistoffer giver på cytologisk materiale fremragende resultater, hvis fiksering i 4% NBF kombineres med HIER (se afsn inkl. afsn. vedr. HIER protokoller). Zambonis fiksativ Zambonis Fiksativ er et blandingsfiksativ bestående af: 2 g paraformaldehyd i 85 ml 0,15 M fosfatbuffer ph 7,3 tilsat 15 ml vandig mættet picrinsyre. Fiksativet giver en kombineret gelerende og koagulerende fiksering. Det er bl. a. anbefalet ved undersøgelser for Retinoblastom (RB) gen protein. Flere forskellige anti-rb mabs (klon G3-245, R128 og RB1), giver efter Zamboni-fiksering de bedste resultater. Tilsvarende er fiksativet anbefalet ved brug af anti-erα (klon LH1 og LH2) og anti-pgr (klon 1A6). 2.5 Blokering af endogen aktivitet Endogen enzymaktivitet De vigtigste immunenzymatiske detektionssystemer benytter sig af peroxidase, alkalisk phosphatase, glukose oxidase eller betagalactosidase som enzymlabel (markør) Blandt disse enzymer er peroxidase og alkalisk phosphatase klart de foretrukne. I lighed med beta-galactosidase forekommer begge enzymer naturligt (endogent) i en række celler i humant væv. Det kan derfor være nødvendigt at blokere eller hæmme den endogene enzymaktivitet. Peroxidase (PO) PO-aktivitet forekommer med varierede styrke i granulocytter, monocytter og makrofager. Desuden indeholder erytrocytter såkaldt pseudoperoxidaseaktivitet, der giver de samme fortolkningsmæssige problemer. I paraffinsnit af NBF fikseret materiale er egentlig peroxidaseaktivitet stort set elimineret, mens pseudoperoxidaseaktiviteten i erytrocytter overlever. En lang række forskellige kemiske forbehandlinger vil være i stand til at blokere den endogene peroxidaseaktivitet: Protokoller til blokering af endogen peroxidase aktivitet 1. 0,5% brintperoxid i metanol 10 min. eller 2. 1% - 3% brintperoxid i TBS 10 min. eller 3. 0,5% - 3% brintperoxid i etanol 10 min. eller 4. 0,3% brintperoxid og 0,1% Na-azid i TBS 10 min.

11 Anvendt immunhistokemi 19 Alle 4 protokoller kan anbefales til blokering af endogen peroxidaseaktivitet på NBF-fikserede paraffinsnit. Protokol 1 og 3 skal altid appliceres før evt. demaskering, mens protokol 2 og 4 kan appliceres enten før demaskering eller efter primært antistof (men før HRP-link!). Ingen af de 4 protokoller bør anvendes lige efter demaskering, da mange epitoper er følsomme overfor både metanol/etanol og brintperoxid. Til gengæld tyder meget på, at langt de fleste NBFfikserede epitoper, der overlever fiksering, vævspræparation og paraffinindlejring, også klarer en forbehandling med henblik på blokering af endogen peroxidaseaktivitet, hvis denne foretages før evt. demaskering. Desværre er der undtagelser. Anti-CD4, klon 1F6 reagerer med en epitop, der er meget følsom overfor brintperoxid, også selvom blokeringen foregår før demaskering. På paraffinsnit, hvor dette antistof skal anvendes, bør blokering derfor udelades eller foretages efter det primære antistof. På cytologiske materialer og frysesnit er epitoper generelt mere følsomme overfor kemiske påvirkninger, end de er i paraffinsnit af NBF fikserede væv. En del laboratorier undlader derfor at blokere for endogent peroxidaseaktivitet i disse materialer. I de fleste tilfælde lader det sig gøre uden problemer, da det bl.a. med hjælp fra et negativt kontrolsnit er muligt at identificere den endogene peroxidaseaktivitet. I hæmatologisk materiale og cytologisk materiale med kraftig blodtilblanding, hvor der kan forudses fortolkningsproblemer på grund af endogen peroxidaseaktivitet, kan protokol 4 anbefales. Li et al. (8) fandt, at der med denne protokol kunne opnås en effektiv blokering af endogen peroxidaseaktivitet uden tab af antigenisitet eller morfologiske detaljer. Undersøgelsen blev udført med 23 forskellige diagnostisk vigtige antistoffer inden for hæmatologien. Tilsvarende gode eller bedre resultater er opnået ved først at applicere protokol 4 efter det biotinylerede sekundære antistof i en labelled streptavidin biotin (LSAB) eller ABC teknik (9). For epitoper der tåler NBF fiksering kan der være en elegant alternativ løsning på problemet med endogen peroxidaseaktivitet. På cryostatsnit og mange cytologisk materialer vil en kombination af NBF fiksering og en varmebehandling ved over 95 C i HIER-buffer blokere effektivt for endogen peroxidaseaktivitet (se afsn NBF-HIER protokoller og Protokol Haste-EnVision+ ). I kombination med NBF fiksering ses således 2 positive effekter af varmebehandling: Dels en forstærkning af immunreaktionen gennem demaskering (se afsn ) og dels en blokering af endogen enzymaktivitet. En simpel løsning på problemer med endogen peroxidaseaktivitet er selvfølgelig at anvende et detektionssystem, der er baseret på alkalisk phosphatase som enzym-label (fx APAAP, se afsnit ). Alkalisk phosphatase Alkalisk phosphatase (AP) aktivitet forekommer akkurat som PO naturligt i en række celler i humant væv. AP kan klassificeres i mindst 5 grupper, alt efter hvilket væv de stammer fra (10). Den AP, der anvendes til enzymkonjugater, udvindes fra kalvetyndtarm. AP i tarm er resistent overfor enzymhæmmeren levamisol, mens AP i lever og knoglemarv er følsom for levamisol. Tilsætning af 1 mm levamisol til kromogen/substratopløsningen vil derfor effektivt blokere endogen AP aktivitet relateret til disse celler og væv, mens enzymlabel ikke påvirkes. Dette gør AP-baserede detektionsystemer (fx APAAP) meget anvendelige til hæmatologiske materialer. Undersøgelser (11) har dog vist, at tilsætning af 1 mm levamisol i visse detektionssystemer. (LSAB-AP) kan have en vis hæmmende effekt på enzymlabel. Afhængig af graden af endogen AP anbefales det således at bruge lavere koncentrationer af levamisol (0,25 mm - 0,5 mm), der ikke har vist hæmmende effekt på AP-label. Alternativt kan snittene opvarmes til 65ºC, hvorved APaktiviteten elimineres. AP-baserede detektionssystemer har deres begrænsninger specielt på materiale fra mave-tarmkanalen og placenta, da levamisol ikke hæmmer den endogene AP i disse væv. Der kan også i visse tilfælde ses levamisolresistent AP i tumorer. I et cytologisk studie af 25 non-hæmopoietiske tumorer fandes levamisolresistent AP i 4 tilfælde (10), der ikke udgik fra ventrikel/tarm eller placenta Endogen biotin Avidin-biotin og steptavidin-biotin detektionssystemer (ABC, LSAB mv., se afsn. 2.10) benytter sig af den naturlige affinitet, avidin og steptavidin har for biotin (vitamin H). Biotin forekommer i store mængder sammen med enzymet pyruvat carboxylase i mitochondrier. Det betyder, at der i mitochondrie-rige celler er risiko for falsk positiv reaktion svarende til streptavidins eller avidins reaktion med endogen biotin. Artefaktet ses specielt i metabolisk aktive celler som fx lever, nyre, binyre, spytkirtler mv. En del karcinomer, heriblandt mamma- og colonkarcinomer vil potentielt også kunne give anledning til denne falske positive reaktion. Sædvanligvis forekommer endogen biotin intracytoplasmatisk, men kan også ses intranucleært. I graviditetsrelateret endometrium er der således i 32 af 69 prøver set biotinholdige intranucleære inklusioner (12), der selvfølgelige ikke må forveksles med virus inklusioner (fx herpes simplex). Problemet med endogen biotin er naturligvis kun relateret til de biotinbaserede detektionssystemer og har tidligere kun været et reelt problem på cytologisk materiale og kryostatsnit. I paraffinsnit maskeres det meste biotin nemlig effektivt og gav således sjældent problemer med falsk

12 20 Immunhistokemisk teknik vende fortyndede æggehvider, der indeholder store mængder avidin. Prisen bringes hermed ned på 10 øre pr. glas. Da de fortyndede æggehvider og biotinopløsningen (0,2% i PBS) tilmed er holdbare og kan genbruges (æggehvider 1 uge, biotin 1 måned), kan hele proceduren foregå i farveskåle uden krævende håndtering af de enkelte glas. Millers protokol til blokering af endogen biotin 1. Skyl i dest vand 5 min. 2. Fortyndede æggehvider (2 æggehvider, fyld op til 200 ml med dest vand) 15 min. 3. Grundigt skyl i flere hold dest vand 5 min. 4. Biotin (Merck No ) 0,2% i PBS, ph 7,2 med 15mM natriumazid 15 min. 5. PBS eller TBS 2 min. Figur 2.6: Blokering af endogen biotin. positiv reaktion i ikke-demaskerede snit. Med introduktionen af varmeinduceret epitopdemaskering (se afsn. 2.6) er problemet vokset, og specielt efter den tiltagende brug af mere effektive kogemedier som EDTA/EGTA og Tris-HCl ved højt ph er problemet blevet påtrængende. Giver endogen biotin fortolkningsmæssige problemer, bør der enten vælges alternativt detektionssystem (fx APAAP eller et af de mange polymersystemer - se afsn ) eller en forbehandling med blokering af endogen biotin for øje (Fig. 2.6). Protokol til blokering af endogen biotin 1. Avidin 0,1% 10 min. 2. PBS eller TBS 2 min. 3. Biotin 0,01% 10 min. 4. PBS eller TBS 2 min. Blokeringen iværksættes umiddelbart før blokering af uspecifik antistofadhæsion, hvilket for paraffinsnit selvfølgelig betyder, at biotinblokeringen udføres efter evt. epitop demaskering. Protokollen (evt. udført med kit) giver i de fleste tilfælde en tilfredsstillende blokering af biotin i paraffinsnit og frysesnit. Udover den ekstra håndtering af glassene er også prisen en væsentlig ulempe ved denne protokol. Anvendes kommercielle kits, er prisen generelt høj: blokering ved hjælp af DakoCytomations kit koster således 4,69 kr. pr. glas og Vectors kit koster 3,31 kr. Zymeds kit koster kun 2,16 kr. pr. glas, men er ikke helt så effektivt til at blokere endogent biotin som de to øvrige (4). Det er ikke væsentlig billigere at købe de rene varer selv, da rent avidin er forbavsende kostbart. Miller et al. (63) har beskrevet et simpelt og brugbart alternativ til de dyre kits. I stedet for at bruge ren avidin kan man an- Ved kontakt med buffersalte er der risiko for, at æggehvide-protein vil udfælde i snittene, hvorfor der skal skylles grundigt i destilleret vand. 2.6 Epitop demaskering (retrieval) I paraffinsnit af NBF-fikseret materiale vil mange antigene epitoper ikke eller kun dårligt kunne påvises. Det har vist sig, at en stor del af disse epitoper ikke er ødelagte, men blot er maskerede. Mange maskerede epitoper kan demaskeres og dermed gøres immunreaktive igen. De to vigtigste, principielt forskellige teknikker, der i dag bruges til demaskering af antigene epitoper er: 1. Forbehandling med proteolytiske enzymer. 2. Varmeinduceret epitop demaskering (HIER = heat-induced epitop retrieval). Hertil kommer andre metoder, der er nødvendige til specielle antigener, fx behandling med 100% myresyre til amyloider, samt diverse kombinationer af proteolyse og HIER (se tabel 2.2) Ultralyd har ligeledes været anvendt til epitop retrieval. For enkelte antigener synes ultralyd at have en vis demaskerende effekt, men dog væsentlig mindre effekt end HIER (86). Som generel demaskeringsteknik synes ultralyd derfor uinteressant Proteolytiske enzymer Anvendelsen af proteolytiske enzymer til demaskering af antigene epitoper blev introduceret i 70 erne (13,14) og har siden vundet stor udbredelse. Teknikken gjorde det muligt at påvise et stort antal antigener, der tidligere var vanskelige eller umulige at påvise i paraffinsnit af NBF fikseret materiale. Mange forskellige enzymer kan anvendes. Trypsin, pepsin eller pronase E er de mest populære.

13 Anvendt immunhistokemi 21 Protokoller til proteolytisk forbehandling a. Trypsin protokol: Trypsin 250, Difco Tris-buffer 0,05M, ph 7,8 med 0,050 g 0,1% CaCl ml Afhængig af fikseringstiden i NBF forbehandles 5-20 min. ved 37 C. Inden inkubation i enzymopløsning forvarmes snittene 5 min. i destilleret vand ved 37 C. b. Pepsin protokol: Pepsin, Sigma No. P7012 HCl, 0,01 M 37 C 0,160 g 40 ml Afhængig af fikseringstiden i NBF forbehandles min. ved 37 C. Inden inkubation i enzymopløsning forvarmes snittene 5 min. i destilleret vand ved 37 C. c. Pronase E (Protease type 14) protokol: Protease type XIV,Sigma No. P5147 TBS 0,05M, ph 7,4 37 C 0,025 g Afhængig af fikseringstiden i NBF forbehandles 5-15 min. ved 37 C. Inden inkubation i enzymopløsning forvarmes snittene 5 min. i destilleret vand ved 37 C. d. Proteinase K protokol*: 50 ml Proteinase K, DakoCytomation S µl Tris-buffer 0,05M, ph 7,5 stuetemp. 50 ml Afhængig af fikseringstiden i NBF forbehandles 5-15 min. ved stuetemperatur. Denne protokol kan med fordel appliceres immunostainere som Tech- Mate og Autostainer. *Proteinase K opløsningen kan købes klar til brug. Biokemisk er enzymernes reaktivitet og specificitet velkendt. Trypsin katalyserer således spaltningen af peptidbindinger i hvilke aminosyrerne arginin og lysin forekommer. Chymotrypsin, som findes i de fleste kommercielle trypsinprodukter, hydrolyserer navnligt peptidbindinger, hvor de aromatiske aminosyrers carboxylsyrer indgår. Pepsin angriber en del forskellige peptidbindinger, men peptidbindinger, hvor de aromatiske aminosyrers aminogrupper indgår, spaltes hurtigst. Pronase E, der udvindes fra Streptomyces griseus, er som de fleste andre bakterielle proteaser meget lidt specifik med hensyn til hvilke peptidbindinger, der angribes. Pronase E er således i stand til at katalysere spaltningen af størstedelen af de typer peptidbindinger, der forekommer i humant væv. Tilsvarende gælder proteinase K. Er enzymernes biokemiske reaktivitet og specificitet velkendt, så er baggrunden for deres demaskerende effekt i immunhistokemisk sammenhæng til gengæld noget uklar. Den positive effekt på muligheden for at påvise maskerede epitoper beror givet vis på flere faktorer. Blandt de vigtigste er: 1. Evnen til spaltning af peptidbindinger i umiddelbar nærhed af de NBF-inducerede tværbindinger (methenbroer). Dette er med til at åbne op for en del af de skjulte epitoper. En direkte spaltning af methenbroerne synes mindre sandsynligt. 2. Fraspaltning af blokerende nabomolekyler. 3. Permeabiliteten af vævet øges gennem spaltningen af proteinerne. Selvom trypsin, pepsin og pronase biokemisk er forskellige med hensyn til hvilke peptidbindinger de spalter i proteinerne, vil der i mange tilfælde kun ses mindre forskelle i deres evne til at demaskere en given epitop. I de fleste tilfælde er pronasen dog mest effektiv, hvilket forklarer dette enzyms popularitet. Pepsin har vist sig særlig velegnet til demaskering af epitoper i extracellulære strukturproteiner som collagen III, collagen IV, fibronectin, laminin og P-component. De gode resultater opnås specielt, hvis inkubationen i pepsin forlænges til 1-2 timer. Pronase E er især velegnet anti-lmw-ck, klon CAM 5.2, og anti-cd21, klon 1F8. Udover den positive effekt er der også væsentlige ulemper forbundet med forbehandlingen med proteolytiske enzymer. For det første er der en hel del epitoper, der ikke tåler enzymforbehandling, hvilket naturligvis udelukker teknikken som universel demaskeringsteknik. For det andet er der alvorlige problemer med standardisering af metoden. Problemerne stammer væsentligst fra det faktum, at inkubationstiden for den proteolytiske forbehandling er stærkt afhængig af fikseringstiden i NBF. Alle undersøgelser viser, at jo længere tids fiksering der er anvendt i NBF, jo længere tids proteolytisk forbehandling skal iværksættes for at opnå den ønskede epitop-demaskering. Omvendt skal enzymforbehandlingstiden nedsættes for væv, der kun er fikseret i kort tid i NBF. For lang tids enzymforbehandling i forhold til fikseringstiden vil give en gradvis fordøjelse af vævssnittet med tab af morfologiske detaljer til følge. For at optimere den enzymatiske forbehandling er det med andre ord nødvendigt at kende fikseringstiden på det væv, man ønsker at behandle. Standardisering af den proteolytiske forbehandling kompliceres yderligere ved, at den optimale proteolysetid også kan variere fra celletype til celletype. For keratinpåvisning i forskellige epiteltyper er således beskrevet en betydelig tidsvariation for optimal proteolysetid (15). Endelig skal det nævnes, at falsk positiv reaktion kan ses ved anvendelse af anti-ck20, klon Ks20.8, hvis der anvendes proteolytisk forbehandling, specielt hvis vævet kun er kortvarigt fikseret (<24 h) Varmeinduceret epitop demaskering (HIER) På baggrund af en række biokemiske studier af Fraenkel-Conrat et al. (16-18) tilbage i 40 erne vedr. formaldehyd-protein reaktioner udviklede Shi et al i 1991 (19) det, vi i dag kender som varme induceret epitop dema-

14 22 Immunhistokemisk teknik skering (Heat-Induced Epitop Retrieval - HIER). Teknikken har på dramatisk vis forbedret mulighederne for immunhistokemi på paraffinsnit. HIER åbner mulighed for at anvende antistoffer på paraffinsnit, som tidligere med konventionel teknik (proteolyse mv.) kun gav svagt positiv reaktion eller slet ingen (20-23,76). Blandt de vigtigste antistoffer i denne gruppe, der omfatter mere end 40, kan nævnes: anti-ki67, klon MIB1; anti-erα, klon 1D5; anti-pgr, klon ICA og 1A6; anti-bcl-2, klon 124; anti-cd5, klon 4C7; anti-cd8, klon C8/144B; anti-cd 23, klon 1B12; anti-cd44, klon DF1485; anti-cd44v6, klon 2F10; anti-cd79a, klon JCB117; anti-rb, klon G3-245; anti-cd4, klon 1F6; anti-e-cadherin, klon HECD-1; anti-tdt, pab; anti-dystrophin, klon Dy4; og anti-cyclin D1, klon DSC-6, P2D11F11 og SP4 samt pab fra Biocare. Der findes en endnu større gruppe antistoffer, omfattende 50-80% af de på patologiafdelinger anvendte, som før introduktionen af HIER gav åbenlyst svagere reaktioner på paraffinsnit end frysesnit. Efter HIER kan der nu for denne store gruppe antistoffer opnås resultater på paraffinsnit, der med hensyn til farvningsintensitet og detektionsgrænser modsvarer, hvad der optimalt kan opnås på frysesnit. Til denne gruppe hører mange antistoffer mod bl.a. CK er og CD-markører (fx anti-cd3, anti-cd20, anticd30, anti-cd45, anti-cd54 og anti-cd68) samt de fleste p53 antistoffer. HIER-teknikken bygger på opvarmning af afparaffinerede og rehydrerede paraffinsnit i passende buffer eller saltopløsning. Shi s originale metode benyttede sig af mikrobølgeovn (MBO) som varmekilde og af en mættet blythiocyanatopløsning eller rent destilleret vand som kogemedium. Siden Shi s originale arbejde er talrige modifikationer blevet publiceret. Cattoretti et al (20) introducerede i 1993 citratbuffer 0,01 M, ph 6, som kogemedium. Citratbuffer har siden været det mest benyttede kogemedium i HIER teknikken, men afløses nu i tiltagende omfang af alternative buffere (se nedenfor). Den præcise mekanisme bag HIER teknikken er ikke kendt. Meget tyder dog på at varmepåvirkningen af vævssnittene bl.a. har følgende indvirkning: a. Formaldehydinducerede tværbindinger (methenbroer) brydes. b. Komplekst bundne og epitopmaskerende Ca-ioner fjernes. c. Vævet rehydreres med forbedret penetration til følge. d. En vis proteindenaturering forekommer, hvilket kan blotlægge skjulte epitoper. Det skal her bemærkes, at formalinfiksering synes at have en beskyttende virkning mod denaturering af proteiner ved opvarmning - en proces, der ville denaturere ikke-fikserede proteiner. Der indgår i HIER-teknikken en række variabler, nogle med stor betydning og andre med mindre betydning for epitop demaskeringen: Varmekilde, temperatur og tid Som varmekilde er flere alternativer afprøvet. Mikrobølgeovn (MBO) med eller uden trykkoger, almindelig kogeplade, autoklave, steamer, vandbad og trykkoger (19,20,24,25,68,69) er alle varmekilder, der med succes har været anvendt i HIER-teknikken. Det synes således ikke særligt kritisk, hvilken varmekilde der anvendes. Vigtigere end selve varmekilden er temperaturen i kogemediet, og den tid, snittene befinder sig deri (26,69). I den traditionelle HIER-teknik, hvor mikrobølgeovnen anvendes, opnås sædvanligvis tilfredsstillende epitopdemaskering efter kogning ved 100 C i 10 til 15 min. I autoklave, trykkoger, eller MBO-trykkoger er det p.g.a. trykket muligt at bruge temperaturer over 100 C ( C). Dette kan for visse epitoper give en mere effektiv demaskering. Leong et al (86) sammenlignede på 42 diagnostiske rutineantistoffer såkaldt superheating (5 min. 120 C ved 1,9 bar i Milestone Mega T/T) med traditionel kogning i mikrobølgeovn. De fandt for ca. 30 af antistofferne kraftigere reaktioner efter superheating end efter mikrobølgekogning. Lignende forsøg i eget lab (4) har ikke afsløret samme tydelige fordele ved superheating. Mulige årsager kan være, at Leong primært brugte citratbuffer som kogebuffer og at kogetiden i mikrobølgeovn kun var på 10 min. I modsætning hertil har egne forsøg (4) været baseret på T- EG buffer ph9 (se afsn. vedr. kogemedium) og en kogetid på 15 min. i mikrobølgeovnen. En mindre forlængelse af kogetiden (samlet kogetid min.) i mikrobølgeovnen kan øjensynligt give samme resultat som anvendelsen af superheating (4,69) og være mere skånsomt ved vævet. Cyklisk kogning i form af 3-4 x 5 min hævdes for visse epitoper ligeledes at være mere effektiv end én sammenhængende kogeperiode (75), mens andre ikke har fundet nogen fordel herved. Det forhold, at lavere temperatur (T) kræver længere kogetid (t), understreges af Shi et al. s (70) resultater med anti-ki67, klon MIB1 på tonsilvæv. Identisk og optimal demaskering af MIB1 epitopen blev opnået under følgende varmebehandlingsforhold (T x t): 100 C x 20 min., 90 C x 30 min., 80 C x 50 min., 70 C x 10 timer. Udover at kaste lys over nogle meget centrale forhold omkring HIER antyder disse resultater desuden, at epitopdemaskering ikke nødvendigvis altid behøver at foregå under egentlig kogning, men også kan foregå ved lavere temperaturer. Koopal et al. s resultater (77) understøtter dette. I deres undersøgelse gav 16 af 16

15 Anvendt immunhistokemi 23 antistoffer identiske eller kraftigere reaktioner, når demaskering blev foretaget natten over ved 80 C i Tris-HCl ph 9 ( low-temperature HIER ) sammenlignet med MBO-kogning i Tris-HCl ph 9,5 + 5% urea. Den morfologiske bevarelse angives som værende god efter behandlingen natten over ved 80 C, men desværre uden nogen detaljeret sammenligning til de MBO-behandlede snit. Når HIER-behandling ved lavere temperaturer - på trods af en voldsom forlængelse af inkubationstiden i kogemediet - alligevel kan være interessant, hænger det netop sammen med problemer med den morfologiske bevaring af visse væv. Kogning og høje temperaturer i øvrigt får kollagene fibre til at kvælde op og dermed løsne sig fra glasset. Det er et fænomen, der ind i mellem kan give visse fortolkningsmæssige problemer specielt i bindevævsrige tumorer. Da tendensen til kvældning af kollagen aftager med faldende HIER-temperatur, er demaskering ved lavere temperatur som alternativ til MBO-kogning ikke uinteressant. Undersøgelser i eget laboratorium har vist (4), at kvældning af kollagen helt kan undgås, hvis HIER-behandlingen foregår ved max. 60ºC. Forlænges behandlingen samtidig til timer, opnås resultater, der oftes er lig med eller kun marginalt svagere end, hvad der opnås efter kogning. Disse fund er gjort med TEG-buffer som kogemedium (se afsn. vedr. kogemedium) og har medført, at ved receptor undersøgelser (ER og PgR påvisning) på mammacancer har denne lowtemperature HIER (se afsn. vedr. HIERprotokoller) været anvendt som rutinemetode i Odense siden Shi et al (88) viste, at HIER ved lavere temperaturer end 100 C ikke blot er et spørgsmål om at forbedre morfologien i snittene. Det kan også være nødvendigt for at opnå optimal demaskering af specielt varme-sensitive antigener/epitoper. Shi et al fandt med et pab mod COX-2 (PG27), at traditionel kogningsdemaskering i citrat buffer ph 6 gav negative resultater. Ved at sænke temperaturen i citrat bufferen til 90 C opnåedes derimod en meget god demaskering. Optimal demaskering blev opnået med inkubationstider på min., mens inkubation natten over svækkede reaktionen voldsomt. Som konsekvens af disse fund anbefaler Shi et al. at inkludere en eller flere varianter af low-temperature HIER i test-batteriet til sceening for optimal epitop demaskering (Tabel 2.1 og 2.2). Som nævnt synes valg af varmekilde ikke særlig kritisk. Den mikrobølgeinducerede varmebehandling er dog på mange måder den hurtigste og letteste måde at udføre HIER på. Da almindelige husholdnings-mikrobølgeovne er anvendelige, kræver denne teknik heller ikke den store investering. Problematikken omkring hot-spots og cold-spots i MBO-teknikken har været diskuteret, men synes uden betydning for reproducerbarheden, hvis den praktiske udførsel af HIER metoden standardiseres (se HIERprotokoller nedenfor). Figur 2.7: Intensiteten af immunreaktioner relateret til ph i kogemediet. Tre forskellige mønstre af ph-afhængighed har vist sig: Én gruppe antistoffer udviser kun ringe ph-relateret variation (A). En anden gruppe viser i svagt sure medier et dramatisk fald i intensitet (B), mens en tredje gruppe giver kraftigere reaktioner med et stigende ph. Efter Shi et al. (27). Firmaet BioCare har gennem udviklingen af deres såkaldte Decloaker bidraget til at gøre trykkogning til et attraktivt alternativ til mikrobølgekogning. Decloaker en består af et lille trykkammer med indbygget elektrisk kogeplade. Den simple konstruktion gør instrumentet meget billigere end de fleste mikrobølgetrykkogere. Decloaker en er til gengæld noget dyrere end både husholdningsmikrobølgeovne og traditionelle husholdnings-trykkogere. I forhold til traditionelle trykkogere burde resultaterne være mere reproducerbare med Decloaker på grund af det indbyggede program for opvarmning. Erfaringer i Aalborg tyder dog på, at en præcis kalibrering og dermed stabilitet kan være vanskelig at opnå med Decloaker. DakoCytomation har for nylig lanceret en tilsvarende trykkoger, Pascal. Uanset hvilken metode der anvendes til opvarmning, skal snittene efter kogning køle af i kogemediet, idet en direkte placering af glassene i kold PBS/TBS kan skade både vævsmorfologi og antigenisitet. Kogemedium Mange forskellige kogemedier har været afprøvet og anbefalet til HIER (26-29). Specielt 2 generelle egenskaber ved kogemedierne synes at have en stor betydning for, hvor effektivt de fungerer i HIER-teknikken. Disse egenskaber er: 1. Kogemediets ph. 2. Kogemediets evne til at kompleksbinde eller udfælde calciumioner. Shi et al (27) fandt, at ændringer i kogemediets ph kan resultere i dramatiske forskelle i den demaskerende effekt. Efter at have undersøgt immunfarvning med et panel af mabs (ialt 9) efter HIER i forskellige kogemedier med ph variende fra 1 til 10, fandt man tre forskellige mønstre af ph-afhængighed (Fig. 2.7).

16 24 Immunhistokemisk teknik En gruppe på fem antistoffer viste ingen nævneværdig variation i farvningsintensiteten inden for hele ph-området. To antistoffer (anti-ki67, klon MIB1; og anti-erα, klon 1D5) viste en V-formet kurve med et dramatisk fald i farvningsintensitet efter HIER i buffer med ph 3-5. Ved lavt ph og højt ph var reaktionen kraftig. Endelig viste to antistoffer (anti-cd43, klon MT1; og anti-melanosoma specific antigen, klon HMB45) ingen reaktion ved lavt ph, men herefter en gradvis forstærkning af reaktionen med stigende ph i kogemediet. Undersøgelsen viste, at Tris-HCl ved højt ph er langt mere velegnet som generelt kogemedium end citratbuffer ph 6. Lignende resultater kommer andre studier til (28,70,72), omend det er værd at bemærke, at Tris-HCl ved ph 1 med nogle antistoffer (ex: anti-ki67, klon MIB1) giver endnu bedre demaskering end Tris-HCl ved ph 10 (70) En kedelig ulempe ved Tris-HCl ph 1 er, at der ikke sjældent ses en svag falsk positiv reaktion i en del kerner! Ydermere synes den generelle morfologiske bevaring at være ringere efter kogning ved ph 1 end ved ph 10. Morgan et al (29,71) fandt, at kompleksbinding eller udfældning af vævsbundne calciumioner og muligvis andre divalente metal kationer er et kritisk step i HIER-teknikken. Som en konsekvens af dette må det antages, at en medvirkende årsag til maskering af epitoper er en tæt kompleksbinding af calciumioner og/eller andre divalente metal kationer til antigener (proteiner) under NBF-fiksering. Undersøgelsen viste med Ki67-antigenet og mab MIB1 som udgangspunkt, at stærke kompleksbindere som EGTA og EDTA anvendt ved ph 8 er mere effektive til epitopdemaskering end den noget svagere kompleksbinder citrat. EDTA s effektivitet på NBF- og B5-fikseret materiale er tydeligt blevet dokumenteret af Pileri et al. (72) Ud af 55 antistoffer, der kræver HIER, gav 1mM EDTA ph 8 i sammenligning med Tris-HCl ph 8 og citratbuffer ph 6 de bedste resultater med de 49. Siden 1996 er 2 modifikationer af Morgan s EGTA/EDTA-HIER metode, gennem 2 uafhængige udviklingsarbejder, blevet rutine-demaskeringsmetode for flere og flere antistoffer. Brugen af T-EG buffer ph 9 (10mM Tris-base + 0,5mM EGTA) udspringer fra Patologisk Institut i Odense, mens TE buffer ph 9 (10mM Tris-HCl ph mm EDTA) stammer fra Patologisk Institut i Aalborg. De 2 buffere er uhyre effektive og giver stort set identiske resultater. I direkte sammenligning på 33 forskellige rutineantistoffer har T-EG buffer ph 9 og 1mM EDTA ph 8 givet noget nær den samme meget effektive demaskering (4). En uheldig egenskab, T-EG/TE bufferne deler med 1mM EDTA ph 8 og 0,1M Tris-HCl ph 10, er en voldsom forstærkning af falsk positiv reaktion som følge af endogen biotin. EGTA/EDTA-holdige buffere og Tris-- HCl ved højt ph er alle meget effektive til at demaskere endogen biotin. Det skal dog understreges, at problemet synes mindre med T-EG/TE end med 1mM EDTA ph 8. Dette sammen med en lidt bedre morfologi er de vigtigste argumenter for at vælge T-EG- eller TE-bufferen fremfor 1mM EDTA ph 8. Mange af de større antistofproducenter fremstiller og sælger HIER-buffere produceret ud fra mere eller mindre hemmelige recepter. Med én undtagelse synes ingen af disse miksturer at kunne noget i HIER-henseende, som ikke kan opnås ved anvendelse af T-EG/TE buffer, citrat buffer eller Tris-HCl buffer ved ph 1 eller ph 10. Undtagelsen er DakoCytomations Target Retrieval Solution, ph 6,1 kode S1699/S1700 (TRS). Denne modificerede citratbuffer er med de fleste antistoffer mere effektiv med hensyn til demaskering end standard citratbuffer ph 6. Til gengæld er den overfor de fleste antistoffer langt mindre effektiv end specielt T-EG/TE buffer og Tris-HCl ph 10. Når TRS alligevel er værd at nævne, skyldes det, at det for et mindre antal antistoffer har vist sig, at være den eneste HIER buffer, der giver brugbare resultater (4, 74). Blandt disse antistoffer kan nævnes: anti-cd5, klon Leu-1; anti-cd21, klon 1F8; anti-cd27 klon 137B4; antiepithelial antigen, klon Ber-EP4; antiepithelial-related antigen, klon MOC-31; antiepidermal growth factor receptor, klon E30, og anti-serotonin, klon 5HT-H209. TRS har på nuværende tidspunkt været testet på i alt ca. 350 forskellige primære antistoffer. I godt 20 tilfælde er de bedste resultater opnået med netop TRS (4). TRS bør derfor indgå i det batteri af buffere, som afprøves når et nyt antistof tages i anvendelse (se afsn ). TRS er dyrere end både citrat og T-EG/TE buffer. Dog kan opløsningen angiveligt genbruges op til 20 gange (74). Flere studier har vist, at en kombination af proteolytisk forbehandling og HIER for nogle epitoper giver en mere effektiv demaskering, end hvis HIER eller proteolyse anvendes alene (74). Lignende fund er gjort i eget laboratorium (4). En del diagnostisk vigtige muskelmembran relaterede antigener er vanskellige at detektere tilfredsstillende i paraffinsnit. Epitoper på nogle af disse antigener har gavn af kombinations-demaskeringer som angivet i Tabel 2.2. Følgende antistoffer giver de bedste resultater med mild proteolyse efterfulgt af HIER i T-EG buffer (teknik 11): Anti-dystrophin klon DY4/6D3 og klon 34C5; anti-sarcoglycan delta, klon δ-sarc/12c1; anti-myosin neonatal, klon WB-MHCn; antisarcoglycan beta, klon β-sarc/5b1; antisarcoglycan gamma, klon 35DAG/21B5; antispectrin, klon R8C2/3D5. Følgende antistoffer giver til gengæld de bedste resultater hvis HIER i citrat ph 6 efterfølges af mild proteolyse (teknik 12): Anti-caveolin 3, klon 26;

17 Anvendt immunhistokemi 25 anti-dysferlin, klon Ham1/7B6; anti-laminin alfa5, klon 4C7; anti-myosin developmental, klon RNMy2/9D2 og anti-sarcoglycan alfa, klon Ad1/20A6. Det er således ved kombinationsdemaskeringerne ikke ligegyldigt, hvilken HIER buffer der anvendes, og hvilken rækkefølge de 2 demaskeringer gøres i! Både for HIER-teknikken og den proteolytiske forbehandling gælder, at der er en teoretisk risiko for at introducere nye krydsbindende sites i det forbehandlede væv. I praksis har det vist sig, at der sjældent introduceres krydsbindinger, der volder fortolkningsmæssige problemer. Forinden et nyt antistof med tilhørende epitopdemaskeringsteknik tages i brug i rutinesammenhæng, er en kritisk vurdering af positive reaktioner nødvendig, herunder evt. sammenligning med resultater opnået på frysesnit af de samme væv. For pabs skal man også være opmærksom på, at forskellige demaskeringsteknikker kan favorisere forskellige af antistoffets kloner. Man kan således opleve, at S-100 pab giver forskellige farveresultater efter proteolytisk og HIER forbehandling: Mens de fleste celler viser samme farveintensitet uanset forbehandlingen, vil nogle, fx follikulære dendritiske celler ved de almindeligt anvendte antistofkoncentrationer være S-100 negative efter proteolytisk forbehandling, men positive efter HIER. Tilsvarende forskel er set efter farvning af forskellige tumorer, fx gastrointestinal stromal tumor. HIER på cytologisk materiale Brugen af HIER-teknikken er ikke begrænset til paraffinsnit. Også inden for cytologien er der store anvendelsesmuligheder. Reynolds et al (30) fandt på smears og imprints, at reaktionen for 12 af 14 antistoffer kunne forstærkes ved HIER efter formalinfiksering. Blandt antistofferne, der gav kraftigere reaktioner, var vigtige antistoffer som anti-erα, klon 1D5; anti-p53, klon PAb1801; anti-c-erbb2, pab; anti-cd20, klon L26; og anti-cd45 (LCA), klon 2B11 og PD7/26. Undersøgelser i Odense og Aalborg føjer yderligere til denne liste: anti-pgr, klon ICA og klon PgR636; anti-cyclind1, klon P2D11F11; og anti-ki67, klon MIB1, anti-vimentin, klon 3B4, anti-pan-ck, klon AE1/AE3, antimelanosoma specific antigen, klon HMB45; og anti-melan A, klon A103. Undersøgelserne viste også, at de bedste resultater som regel opnås på cytologisk materiale efter NBF fiksering, og at fikseringstid bør være minimum 15 min. Ved kortere fikseringstid i NBF eller ved brug af svagere fiksativer som acetone og etanol er der en risiko for tab af cytologiske detaljer. Det gælder for det cytologiske materiale som for det histologiske, at der med alternative kogemedier kan opnås yderligere forbedringer sammenlignet med citratbuffer. Kogning i TRS giver for mange antistoffer betydeligt bedre resultater end citrat. Anvendes T- EG/TE buffer kan opnås yderligere forbedring mht demaskerende effekt. Desværre er den cytologiske bevaringsgrad efter kogning i en af disse buffere ikke god. Foretages demaskering i stedet ved lavere temperatur svarende til TEG95 protokollen (se nedenfor vedr. HIER protokoller) opnås foruden en yderst effektiv demaskering også god cytologisk bevarelse. I TEG95 protokollen bringes T-EG bufferen i kog i MBO, hvorefter bufferen tages ud af ovnen og prøvematerialet anbringes i den varme buffer 15 min. Specielt gode resultater er bl.a. opnået med anti-pgr, klon PgR 636; anti-erα, klon 1D5 og klon 6F11; anti-tyrosinase, klon T311; anti-ttf-1, klon SPT24 og anti-synaptophysin klon snp88 (4). Væskebaseret cytologi (Liquid based cytologi, LBC) vinder i disse år mere og mere indpas indenfor patologien. I stedet for manuelt at udstryge prøvematerialet opsamles det i en alkoholbaseret præserveringsvæske, hvorfra der maskinelt kan produceres meget ensartede aftryk (ThinPrep eller AutoCytePrep), som efter alkoholfiksering (96% etanol eller spray-fix) kan anvendes til analyse. Teknologien er primært udviklet til cervix-cytologisk materiale, men kan anvendes til de fleste cytologiske materialer. Immuncytokemiske undersøgelser kan med fordel udføres på ThinPrep og AutoCytePrep. En forudsætning er naturligvis for de enkelte antistoffer at finde de optimale fikserings- og HIERbetingelser. Forsøg i eget laboratorium med 21 diagnostiske rutineantistoffer og 6 forskellige fikserings-hier protokoller viste, at TEG100 protokollen for de 19 antistoffer gav klart de bedste resultater. Blandt de 19 antistoffer var anti-erα, klon 6F11; anti-ki67, klon MIB1; anti-ttf1, klon SPT24; anti-ck, klon AE1+AE3: anti-vimentin, klon V9; anti- CD45, klon 2B11+PD7/26. Cellernes ophold (fra timer til dage) i præserveringsvæsken og den efterfølgende alkoholfiksering nødvendiggør en mere effektiv HIER behandling end blot kogning i citratbuffer eller behandling i 95 C varm T-EG buffer. I TEG100 protokollen koges materialet 15 min i T-EG buffer. Den forlængede fiksering i alkohol gør, at den cytologiske bevaringsgrad af cellerne er god, selv efter kogning i T-EG buffer. HIER teknikken kan også med nogen succes anvendes som forbehandling til immuncytokemiske undersøgelser på Papanicolau- eller Giemsafarvede smears. HIER er i stand til at demaskere en del antigener i de farvede smears, samtidig med at den er effektiv til at affarve cellerne. Identifikation af Ki67- antigenet med klon MIB1 i Papanicolaufarvede smears har bl.a. vist sig nyttig til at skelne mellem normale celler og carcinoma in situ i atrofiske cervix smears (31). For at bevare cytologiske detaljer i smearet anbefales det at fiksere de rehydrerede celler i 4% NBF i 15 min. før HIER iværksættes (4).

18 26 Immunhistokemisk teknik Tabel 2.1: Test-battery til screening for optimal HIER-teknik, efter Shi et al. (73). Buffer a ph1 ph6 ph10 120ºC, 10 min b Snit#1 Snit#4 Snit#7 100ºC, 10 min. Snit#2 Snit#5 Snit#8 90ºC, 10 min. Snit#3 Snit#6 Snit#9 a 10mM Tris-HCl anvendes ved ph 1, 10mM Citrate ved ph 6 og 100 mm Tris-HCl ved ph 10. b 120ºC opnås ved hjælp af autoklave eller trykkoger. Samme effekt kan opnås ved forlænget MBO-kogning (20 min.). I tidligere Giemsa farvede præparater er mange antigener specielt vanskelige at påvise. Her kan citratbufferen med fordel erstattes med TE/T-EG buffer. Tilfredsstillende resultater er således opnået på Giemsapræparater med anti-ki67, klon MIB1; og anti-erα, klon 1D5; efter 15 min. MBO-kogning i T-EG buffer (med forfiksering 15 min. i 4% NBF). Der er dog ved denne teknik risiko for falsk negative reaktioner, som kan være vanskelige at identificere! HIER og standardisering Med introduktionen af varmebaseret epitop demaskering først i 90 erne og specielt med lanceringen af den citratbuffer-baserede teknik syntes mulighederne gode for en øget standardisering indenfor immunhistokemien. Der var en overgang et begrundet håb om, at én standard HIER procedure kunne konstrueres. Denne skulle udviske alle fikseringsprocedurens varierende påvirkninger (maskeringer) af antigene epitoper og hermed fjerne et væsentlig grundlag for de resultatmæssige uoverensstemmelser, som den immunhistokemiske litteratur desværre er præget af. Nu 5-6 år senere synes udviklingen ikke entydigt at have bragt os nærmere en standard HIER teknik, der kan bruges til alle antistoffer - tværtimod er udbuddet af HIER modifikationer næsten endeløs. Når vi alligevel i dag er tættere på en vis form for standardisering indenfor HIER-teknikkerne end for 5-6 år siden, skyldes det især et par forskergruppers ihærdige og metodiske arbejde med at afdække de enkelte parametres betydning for HIER-teknikken (27,29). I dag bør HI- ER-standardiseringen tage udgangspunkt i, at der ikke findes én HIER metode, der er optimal for alle antistoffer (epitoper). I stedet bør de enkelte laboratorier i højere grad standardisere måden hvorpå de tester nye (og gamle!) antistoffer på. Shi et al (70, 73) anbefaler at HIER-standardisering tager udgangspunkt i at fastlægge, hvad de betegner som maximal retrieval (maksimal demaskering) for et givet antistof ved hjælp af et HIER test-battery omfattende de vigtigste HIER parametre: ph, temperatur og tid (Tabel 2.1). Den HIER-teknik, der giver maximal retrieval, bør herefter anvendes rutinemæssigt til det pågældende antistof. Et lignende test-batteri har været i brug i eget laboratorium siden 1996 med succes (Tabel 2.2). Test batteriet til sceening for optimal epitop retrieval indeholder foruden de vigtigste elementer fra Shi s test batteri også non-hier teknikker og vigtige HIER parametre ( bl.a. calcium kompleksbinding), der ikke er med i Shi s initiale batteri. HIER protokoller - MBO-teknik Protokol A - Traditionel cyklisk kogning af 1 slideholder (24 glas). 1. Snit anbringes i grå 24 stk s Tissue Tek slideholders. Evt. tomme pladser fyldes med blanke objektglas. Slideholder anbringes i Tissue-Tek farveskål med 250 ml kogemedium. 2. Farveskål med snit anbringes centralt i mikrobølgeovnen. Der koges 5 min. med effekt på W 3. Fordampet medium erstattes ved efterfyldning med destilleret vand. Der koges 5 min. 4. Trin 3 gentages (ved forlænget kogetid gentages trin 3 det nødvendige antal gange). 5. Efter kogning anbringes kogemedium med snit på bordet til nedkøling 15 min. 6. Skyl i buffer og fortsæt farvningsproceduren. Protokol B - Kogning af 3 slideholders (72 glas). Protokol B foretages med 3 fyldte Tissue Tek slideholders i 3 Tissue Tek farveskåle med 250 ml kogemedium. Protokol B gør det muligt at foretage 3 forskellige kogeprocedurer på én gang. Det være sig kogning i 3 forskellige buffere eller kombinationen af 2 farveskåle med en rutinemæssig 15 min. kogning og 1 farveskål med en forlænget 25 min. kogning. I tilfælde hvor der ikke er behov for 3 farveskåle med kogebuffer, fyldes der op med farveskål(e) med dest vand og slideholder(s) med blanke glas således, at mængden af kogemedium og glas altid er den samme. Protokol B kræver at mikrobølgeovnen er udstyret med drejeplade. 1. Snit anbringes i grå 24 stk s Tissue Tek slideholders. Evt. tomme pladser fyldes med blanke objektglas. Slideholder anbringes i Tissue-Tek farveskål med 250 ml kogemedium. 3 farveskåle anbringes perifert på drejepladen i mikrobølgeovnen, som angivet på figuren. 2. Start mikrobølgeovnen på fuld effekt ( W) med drejepladen aktiveret. Notér tidspunktet for hvornår kogemedierne kommer i kog. Dette gøres de første gange metoden bruges, herefter kendes opvarmningtiden, der er nødvendig for den enkelte ovn. Denne tid kan bruges efterfølgende. For en Moulinex Y51 med effekt 900W skal bruges 11 min. for at bringe 3 farveskåle i kog.

19 Anvendt immunhistokemi Når alle 3 kogemedier er bragt i kog, nedsættes effekten således, at væskerne simrekoger, kogningen fortsætter i 15 min. For hver enkelt mikrobølgeovn må dette effekttrin fastlægges via forsøg med blanke glas. Målet er, at væskerne koger mest muligt uden at koge for meget over (tab af væske). For en Moulinex Y51 er det optimale effektrin for simrekogning 400W. 4. Efter kogning anbringes kogemedium med snit på bordet til nedkøling 15 min. Fortsæt til trin En evt. farveskål med snit, der skal koges 25 min., flyttes nu til midten af ovnen og der koges yderligere 10 min. på et extra nedsat effektrin (skal igen fastlægges via forsøg for den enkelte ovn). For en Moulinex Y51 er det optimale effekttrin 170W. 6. Efter kogning anbringes kogemedium med snit på bordet til nedkøling 15 min. 7. Skyl i buffer og fortsæt farvningsproceduren. Protokol C - 24 timers Low-temperature HIER 1. Snit anbringes i grå 24 stk s Tissue-Tek slideholder. Evt. tomme pladser fyldes med blanke objektglas. Slideholder anbringes i Tissue-Tek farveskål med 250 ml kogemedium. 2. Farveskål med snit anbringes i varmeskab ved 60 C. Inkubationtid 24 timer. 3. Efter varmebehandlingen anbringes farveskål med snit på bordet til nedkøling 15 min. 4. Skyl i buffer og fortsæt farvningsproceduren. NBF-HIER protokoller til cytologisk materiale Citrat protokol og TRS protokol 1. NBF 4% 15 min 2. Ethanol 96% skyl 15 sek 3. Ethanol 96% 10 min 4. Rindende vand 5 min 5. Kogning i citratbuffer eller TRS 15 min (Protokol B) TEG100 protokol 1. NBF 4% 15 min 2. Ethanol 96% skyl 15 sek 3. Ethanol 96% 10 min 4. Rindende vand 5 min 5. Kogning i T-EG buffer 15 min (Protokol B) TEG95 protokol 1. NBF 4% 15 min 2. Ethanol 96% skyl 15 sek 3. Ethanol 96% 10 min 4. Rindende vand 5 min 5. Demaskering i T-EG buffer ved 95 C (a) 15 min (a) Objektglas anbringes i grå 24 stk s Tissue-Tek slideholder. Evt. tomme pladser fyldes med blanke objektglas. 250 ml T-EG buffer i Tissue-Tek farveskål bringes til kogning i mikrobølgeovn. Farveskålen fjernes fra ovnen og stilles på bordet og slideholder med præparaterne anbringes straks i den varme buffer (ca. 95 C). Efter demaskering skylles i rindende vand. Dehydreringen/fikseringen i ethanol efter NBF betyder, at chromogen-udfældningen i cellerne bliver mere homogen (ligner hvad der opnås på paraffinsnit) end, hvis dette trin udelades. Uden ethanol bliver reaktionsproduktet specielt med AEC meget granulært! Udvalgte HIER buffere T-EG buffer ph 9, 10mM+0,5mM Tris (Sigma T-1378) 1,211 g EGTA Titriplex VI (Merck 8435) 0,190 Dest. vand Opløsningen behøver ingen ph-justering. ph er normalt mellem 8,95 og 9,1 TE buffer ph 9, 10mM+1mM Tris (Sigma T-1378) EDTA Titriplex III (Merck 8418) Dest. vand Opløsningen behøver ingen ph-justering. ph er normalt mellem 8,90 og 9,05 Citrat buffer 10mM, ph 6 Citronsyre, monohydrat Dest. vand ph justeres til 6,0 med 2M NaOH. Tilsæt destilleret vand til EDTA 1mM, ph 8 EDTA Titriplex III (Merck 8418) Dest. vand ph justeres til ph 8,0 med 1M NaOH. 2.7 Blokering af uspecifik antistofadhæsion 1000 ml 1,211 g 0,372 g 1000 ml 2,1 g 00 ml 1000 ml 0,372 g 1000 ml Såkaldt uspecifik baggrundsfarvning kan i visse tilfælde volde problemer i immunhistokemiske teknikker. Problemet ses oftest ved anvendelse af pab med ringe aviditet ( affinitet ). Årsagen til denne baggrundsfarvning er, at immunglobuliner udover den specifikke interaktion med antigene epitoper også er i stand til at binde sig til vævsproteiner ved hjælp af svagere, uspecifikke bindinger. Antistofmolekyler vil specielt kunne adhærere til vævssnittet gennem elektrostatisk tiltrækning og hydrofob interaktion. Den traditionelle måde at imødegå uspecifik antistofadhæsion er dels gennem forbehandling med blocking protein og dels tilsætning af blocking protein til antistofopløsningerne.

20 28 Immunhistokemisk teknik Ved at præinkubere med proteinopløsning opnås en blokering af vævsproteinernes mulighed for bl.a. hydrofob interaktion med antistofmolekyler. Valg af proteinopløsning er naturligvis vigtig. Proteinet skal være i stand til at konkurrere effektivt med IgG-molekyler med hensyn til hydrofob interaktion. Tidligere anvendtes næsten udelukkende sera fra ikke-immuniserede dyr ( normal sera ) til denne forbehandling. Betydningen af denne forbehandling er aftaget i takt med udviklingen af bedre antistoffer og visualiseringsteknikker. I nogle tilfælde ses normalserum faktisk at give en forøgelse af baggrundsfarvningen! I dag anvendes i vid udstrækning bovint serum albumin (BSA), casein opløsninger og/eller detergentia (fx Triton X-100 og Tween 20), ikke alene som forbehandling, men også som tilsætning til fortynderbuffere. Casein synes specielt at være et godt og effektivt universalmiddel til blokering af uspecifik antistofadhæsion (32). Protokoller til blokering af uspecifik antistofadhæsion: 1. Casein 0,5 % i PBS eller TBS min. eller 2. Normal serum, 5 % i PBS eller TBS 10 min. eller 3. BSA, 2 % i PBS eller TBS 10 min. eller 4. Detergent (Tween 20 eller Triton X-100), 0,25 % - 1 % i PBS eller TBS 10 min. Ved brug af mabs og gode oprensede pabs (Ig-fraktion eller bedre) i de gængse detektionssystemer er BSA forbehandling eller grundig vask i buffer med detergent (jvf. protokol 4) sædvanligvis fuldt tilstrækkeligt. Disse forbehandlinger kombineres sædvanligvis med tilsætning af 1 % BSA til antistof opløsningerne. Anvendes fuldsera antistoffer eller benyttes ekstremt følsomme detektionssystemer som TSA (afsn ) stilles ofte større krav til blokering af antistof-adhæsion. I disse tilfælde bør casein anvendes. Blokering af Fc-receptorer Fc-receptorer er membranproteiner, der binder sig til Fc-delen på antistofmolekyler med en forholdsvis høj bindingsstyrke. Fc-receptorer findes fortrinsvis på granulocytter og makrofager. Uspecifik baggrundsfarvning på grund af antistoffers binding til Fc-receptorer ses normalt ikke på paraffinsnit. Formalinfiksering og vævspræparation ændrer Fc-receptorerne, således at de normalt ikke længere er i stand til at binde antistofferne. På acetonefikserede frysesnit og cytologisk materiale kan problemet til gengæld ses. Generelt volder det ikke de store problemer, men i makrofag-rige cytologiske materialer såsom bronkio-alveolær lavage (BAL) væsker kan den Fc-receptor betingede reaktion være generende. Problemet er især tydeligt, hvis der anvendes mabs af subklasserne IgG2a (fx anti-cd20, klon L26; og anti-ck20, klon Ks20.8) eller IgG3. Dette skyldes, at især disse subklasser af muse IgG bindes til visse humane Fc-receptorer (52). Problemet med Fc-receptorer kan undgås ved at anvende F(ab )2 fragmenter af antistofferne (både primære og sekundære antistoffer) i stedet for hele IgG-molekyler. En simpel alternativ løsning på problemet, der normalt virker tilfredsstillende, er at forbehandle med 5% humant immunglobulin inden inkubation med primært antistof. Fc-receptorerne i prøvematerialet binder Ig og blokeres herved. I visse tilfælde kan det være nødvendigt også at inkludere 1% humant Ig i antistofopløsningerne. 2.8 Primært antistof Valg af antistof Udbudet af kommercielle antistoffer er enormt, og der kommer hver dag nye til. Det kan derfor være vanskeligt at vælge hvilke(t) antistof(fer), man skal købe til påvisning af et givet diagnostisk interessant antigen. Gennem opslagsværker som Linscott s Directory (33) og Manufacture s Specifikations & Reference Synopsis ( MSRS ) (34) vil det være muligt at få et rimeligt overblik over udbudet og hvem, der producerer/forhandler de pågældende antistoffer. På trods af opdateringsblade mv. forældes disse opslagsværker hurtigt. On-line versionerne på internettet er derfor at foretrække. På denne adresse finder man MSRS s on-line database med data på mere end kommercielle primære antistoffer. Databasen er brugervenlig med i alt 11 forskellige søgefelter. Den opdateres løbende og kan på trods af et årligt abonnement på 98 USD anbefales. En gratis demo-version af databasen er tilgængelig på samme adresse. Linscott s Directory s on-line version findes på adressen: Databasen indeholder mere end forskellige produkter, overvejende primære antistoffer. Det koster på årsbasis 75 USD at abonnere på den service. En gratis demoversion af databasen er tilgængelig på adressen. Databasen er ikke så stor og knap så brugervenlig som MSRS databasen. Til gengæld indeholder den andet end primære antistoffer. Blandt internettets mange gratis glæder findes også mange websites, der mere eller mindre er helliget antistoffer og immunhistokemi. Blandt disse kan følgende varmt anbefales: