2. Immunhistokemisk teknik

Transkript

1 2. Immunhistokemisk teknik Af Ole Nielsen 2.1 INDLEDNING DEFINITIONER Antigener Antistoffer PRÆPARATION: PARAFFINSNIT Fiksering Afkalkning Vævsfremføring til paraffin Skæring, montering, tørring og opbevaring af snit Afparaffinering og hydrering PRÆPARATION: CYTOLOGISK MATERIALE OG FRYSESNIT Fremstilling Tørring og opbevaring Fiksering BLOKERING AF ENDOGEN AKTIVITET Endogen enzymaktivitet Endogen biotin EPITOP DEMASKERING (RETRIEVAL) Proteolytiske enzymer Varmeinduceret epitop demaskering (HIER) BLOKERING AF USPECIFIK ANTISTOFADHÆSION PRIMÆRT ANTISTOF Valg af antistof Afprøvning af antistoffer Antistof-inkubation Antistoftiter, inkubationstid og temperatur Fortyndervæske Opbevaring og holdbarhed af antistoffer Kontrolprocedurer SKYLLEPROCEDURE Skyllebuffer Skylletid DETEKTIONSSYSTEMER Direkte teknikker Indirekte teknikker KROMOGEN/SUBSTRATOPLØSNING Horse radish peroxidase Alkalisk phosphatase KERNEFARVNING REFERENCER... 44

2 10 Immunhistokemisk teknik Figur 2.1: Flowchart over metodologiske parametre i den immunhistokemiske teknik. Materiale Væv Celler Nedfrysning Skæring af snit Montering af snit Tørring af snit Opbevaring Fiksering Fiksering Evt afkalkning Fremføring til paraffin Skæring af snit Montering af snit Tørring af snit Afparaffinering og hydrering Cytospin, dup, smear m.v. Tørring Opbevaring Fiksering Blokering af endogen aktivitet Epitop demaskering Blokering af uspecifik adhæsion Primært antistof Skylleprocedure Detektionssystem Kromogen/substratopl. Kernefarvning Montering af dækglas Anvendte forkortelser Ab(s) antibody(-ies) (antistof(fer)) AP alkaline phophatase CD cluster of differentiation CK cytokeratin ER estrogen receptor HRP mab pab PBS PgR rmab TBS horse radish (peberrod) peroxidase monoclonal antibody polyclonal antibody phosphate buffered saline progesteron receptor rabbit (kanin) mab tris buffered saline

3 Anvendt immunhistokemi Indledning Immunhistokemiske teknikker er traditionelt multi-step teknikker, hvor mange forskellige metodologiske parametre har betydning for det endelige resultat. I dette kapitel, der tager sit udgangspunkt i den praktiske immunhistokemi, som den udøves i diagnostisk sammenhæng, belyses de vigtigste parametres indflydelse på farvningsresultaterne. Der fokuseres specielt på immunenzymatiske teknikker på paraffinsnit, frysesnit og cytologisk materiale. Gennemgangen af parametrene og deres betydning for farvningsresultatet følger flowchartet, Fig Foruden den teoretiske gennemgang af de enkelte parametre anføres en række basale, praktiske præparations- og farvningsmæssige protokoller. Disse protokoller beskriver gennemprøvede, robuste og reproducerbare metoder. Teknikker, der anvendes til immunfluorescens, immunelektronmikroskopi og molekylærbiologiske undersøgelser, omtales ikke. 2.2 Definitioner Antigener Et antigen er et molekyle, der kan give anledning til dannelse af antistof ved injektion i et hvirveldyr. Langt de fleste antigener er proteiner eller proteinforbindelser, men kulhydrater og lipider kan også virke som antigener. Nogle kemiske substanser, fx metaller, er ikke i sig selv antigener, men kan i forbindelse med et protein danne en struktur, der udløser antistofdannelse. Sådanne substanser kaldes haptener. De antigene egenskaber ligger som regel i ét eller flere mindre områder af et molekyle. Disse områder kaldes antigene determinanter eller epitoper og består oftest af 4-8 aminosyrer eller monosaccharidenheder. En epitop kan bestå af en kontinuert sekvens af nabostillede aminosyrer i den primære proteinstruktur, eller af flere mindre aminosyresekvenser, der er bragt i tæt relation til hinanden gennem proteinmolekylets foldning (tertiære struktur). (Fig. 2.2). Figur 2.2: Model af antigen. De sorte områder repræsenterer antigene epitoper Antistoffer Antistoffer eller immunglobuliner (Ig) er glycoproteiner, der produceres i en organisme som reaktion på en antigenstimulation. Antistofferne binder sig med stor affinitet og specificitet til det stimulerende antigen. Antistoffer produceres i plasmaceller, der er transformerede B-lymfocytter, og afgives bl.a. til blodet, hvorfra de kan isoleres. I højere hvirveldyr findes fem klasser af immunglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM. Alle immunglobuliner er opbygget af tunge og lette proteinkæder. De fem immunglobulinklasser er bl.a. karakteriseret ved hver deres indhold af tunge kæder, α (alfa: IgA), δ (delta: IgD), ε (epsilon: IgE), γ (gamma: IgG) og µ (my: IgM). De lette kæder, der er fælles for alle immunglobulinklasser, kan enten være af type κ (kappa) eller λ (lambda). De fleste antistoffer, der anvendes til immunhistokemi, er af IgG-klassen, mens et mindre antal er af IgM-klassen. IgG-molekylet består af to tunge kæder (γ ) og to lette kæder (κ eller λ) bundet sammen med disulfidbroer i en Y-formet struktur (Fig. 2.3). På grundlag af antigene forskelle i de såkaldt konstante områder af de tunge kæder kan IgG-molekylerne yderligere inddeles i 4 subklasser: IgG1, IgG2a, IgG2b og IgG3. Med enzymerne papain og pepsin kan IgG-molekylet spaltes i flere komponenter. Papain spalter IgG i to antigen-bindende fragmenter benævnt fragment antibody (Fab) og ét fragment benævnt fragment crystalline eller fragment complement (Fc). Proteolytisk behandling med pepsin giver et F(ab )2 fragment. Fc-fragmentet indeholder bl.a. bindingssteder for Protein A, complement og receptorer på makrofager og granulocytter. Den specifikke antigenbindende egenskab ligger i den terminale, såkaldt variable region af Fab. Figur 2.3: Model af IgG molekyle. IgG er opbygget af 2 tunge og 2 lette kæder forbundet ved hjælp af disulfidbindinger. Papain spalter IgG i 2 antigenbindende fragmenter betegnet Fab og 1 fragment crystalline benævnt Fc. Pepsin proteolyse giver et F(ab )2 fragment. Fc Pepsin Fab F(ab ) 2 Papain

4 12 Immunhistokemisk teknik Den variable region indeholder den specielle aminosyresekvens og rummelige opbygning, der er komplementær til den epitop på antigenet, som det pågældende antistofmolekyle er rejst imod. Rummeligt passer epitop til antistof som en nøgle til en lås. Bindingen mellem antistof og epitop er en non-covalent binding, der oftest er en blanding af elektrostatiske kræfter, hydrogenbindinger, van der Waalske kræfter og hydrofob interaktion. Reaktionen mellem antigen og antistof er reversibel og kan beskrives som: Ag + Ab AgAb kompleks Ligevægtskonstanten K er herefter defineret som: [AbAg] 1 K = M [Ab]x[Ag] hvor [Ab] er den molære koncentration af frie antistofmolekyler, [Ag] er den molære koncentration af frit antigen, og [AbAg] den molære koncentration af antistof-antigen komplekser. Antistoffers bindingsstyrke til antigen betegnes affinitet. For antistoffer med høj affinitet er ligevægtskonstanten i størrelsesorden til For antistoffer med lav affinitet ligger ligevægtskonstanten nede omkring I immunhistokemisk sammenhæng giver antistoffer med høj affinitet naturligvis de bedste resultater, bl.a. fordi de i højere grad er i stand til at forblive bundet til antigen gennem hele proceduren. Polyklonale antistoffer Polyklonale antistoffer (pabs) er blandinger af antistoffer fra forskellige kloner. De produceres ved at immunisere et dyr (kanin, svin, ged eller lignende) med et oprenset antigen. Dyret vil rejse et immunrespons, og de producerede antistoffer kan høstes gennem gentagende tapninger af blod og efterfølgende isolering af serum. I dyret vil der oftest opformeres mange kloner af plasmaceller (polyklonalt respons), der hver for sig producerer antistofmolekyler rettet mod én af epitoperne i antigenet (Fig. 2.4). Der vil således til en hver af antigenets epitoper kunne produceres mange forskellige antistoffer, der varierer mere eller mindre med hensyn til affinitet og specificitet. Blandt disse mange forskellige antistoffer kan forekomme nogle, der krydsreagerer med epitoper på andre molekyler, end det antigen, Figur 2.4: Polyklonalt antistof (A) og monoklonalt antistof (B) rettet mod det samme antigen de er rejst imod. Sådanne krydsreagerende antistoffer bør fjernes fra antisera ved hjælp af absorption med det krydsreagerende molekyle. Kun de færreste kommercielle antistoffer findes tilgængelige i fuldserumformat. Risikoen for at det store indhold af serumproteiner vil give problemer med baggrundsfarvning er for stor. I stedet sælges de som en oprenset immunglobulinfraktion. Immunglobulinfraktionen vil foruden de specifikke antistoffer også indeholde dyrets normale cirkulerende immunglobuliner. Yderligere oprensning af antistof kan foretages ved hjælp af affinitetskromatografi, hvor man på en antigenkoblet kromatografisøjle kan isolere de specifikke antistoffer. Da pabs består af mange forskellige antistofmolekyler rettet mod mange forskellige epitoper på det samme antigen, kan affinitetsbegrebet ikke direkte anvendes. For disse beskrives bindingsstyrken ved udtrykket aviditet. Aviditeten er populært sagt en slags affinitetsmiddelværdi for de forskellige antistoffer, der indgår i det polyklonale antiserum. Monoklonale antistoffer Monoklonale antistoffer (mabs) er antistoffer, der alle stammer fra samme celleklon. I modsætning til et pab vil mab udelukkende bestå af fuldkommen ens antistofmolekyler rettet mod én og samme epitop på antigenet (Fig. 2.4). mabs produceres ved hjælp af Köhler og Milstein s hybridomteknik (1). Teknikken, der går ud på at fusionere immuniserede B-lymfocytter med myelomceller, er beskrevet i detaljer af Gatter et al. (2). Produktionen af mabs sker i sin oprindelige form ved, at en mus immuniseres med antigen, der ikke nødvendigvis er fuldstændig rent, hvorefter lymfocytterne isoleres fra milten på den immuniserede mus. Disse lymfocytter, der naturligt har en begrænset levetid, fusioneres derefter med myelomceller, der er maligne og i principet udødelige celler, og som er blevet valgt, fordi de har mistet evnen til at producere og secernere immunglobuliner. Ved fusionen mellem de to celletyper opstår der en cellehybrid, der kan secernere immunglobuliner, hvis specificitet er bestemt af musens lymfocytter, og som har myelomcellernes egenskaber med hensyn til neoplastisk proliferation. Hybridomcellerne klones og undersøges for antistofproduktion. De antistofproducerende kloner undersøges herefter med henblik på at finde dem, der producerer antistof rettet mod det immuniserende antigen. De pågældende antistoffer undersøges dernæst i flere testsystemer, her iblandt immunhistokemi, for at fastslå forhold omkring affinitet, specificitet og eventuel krydsreaktivitet for antistoffet. Når interessante kloner er identificeret, kan yderligere opformering foretages. Opformeringen foregår ofte i store

5 Anvendt immunhistokemi 13 cellekulturer, hvor antistoffet høstes som supernatant fra store dyrkningsflasker. En alternativ måde til opformering er den såkaldte ascites produktion, hvor hybridomceller sprøjtes ind i peritonealhulen på mus, hvor der udvikles en antistofproducerende tumor. Antistoffet høstes ved at tappe ascitesvæske af musen. Navngivning af mabs foregår normalt ved at angive antigenets navn efterfulgt af en tal- eller bogstavkode, der refererer til den antistofproducerende celleklon (fx anti-erα, klon 1D5). Kommercielt tilgængelige kanin mabs (rmabs) så først for alvor dagens lys i 2003, hvor NeoMarker i samarbejde med Epitomics lancerede en stribe rmabs, der fungerer glimrende på paraffinsnit. Blandt de bedste i den serie kan nævnes anti- cyclin-d1, klon SP4; anti-erα, klon SP1; anti-pgr, klon SP2; anti- Ki67, klon SP6; og anti-cox2, klon SP21. Andre SP-antistoffer fungerer dog mindre godt, og et enkelt er trukket tilbage fra markedet. Produktionen af rmabs foregår efter samme princip som for muse mabs. Når der tidligere ikke fandtes kommercielt tilgængelige rmabs, skyldes det bl.a. problemer med at finde en passende fusionspartner (myelomcelle) til kaninlymfocytter, d.v.s. en fusionspartner, der kunne skabe en stabil hybridomcellekultur med høj antistofproduktion. Dette problem og andre produktionstekniske problemer er nu løst. Da rmabs byder på fordele som fx højere affinitet end muse mabs, vil fremtiden helt sikkert bringe mange nye rmabs på markedet. 2.3 Præparation: paraffinsnit Paraffinsnit fremstilles sædvanligvis ud fra histologisk materiale. Der er dog tiltagende interesse for, med henblik på immunhistokemiske undersøgelser, også at fremstille paraffinsnit ud fra cytologisk materiale (se afsnit 2.4.1) Fiksering En essentiel del af al histologisk og cytologisk teknik er fikseringen. Ved fiksering forstås normalt en kemisk behandling, der har til formål at immobilisere og stabilisere vævets og cellernes bestanddele. I immunhistokemisk sammenhæng skal et fiksativ ideelt kunne: 1. Immobilisere antigener. 2. Bevare antigenisitet. 3. Bevare vævs- og cellestruktur. 4. Bevare permeabiliteten for immunreagenser (antistoffer mv.). Naturligvis findes det ideelle immunhistokemiske fiksativ ikke. Specielt kravet om bevarelse af antigenisitet vil ofte komme i konflikt med kravene om bevarelse af struktur og immobilisering af antigener. Med antigenisitet forstås sædvanligvis tilstedeværelsen af antistofbindende aktivitet. Da bindingen mellem antistof og epitop er stærkt afhængig af epitopens rumlige struktur, vil antigenisiteten næsten altid være under indflydelse af den kemiske påvirkning, som et hvert fiksativ vil udøve på antigener. Fiksativer kan inddeles i 2 hovedgrupper: 1. Koagulerende fiksativer ( non-cross-linking fiksativer). 2. Gelerende fiksativer ( cross-linking fiksativer). Koagulerende fiksativer Til de koagulerende fiksativer hører bl.a. etanol, metanol, picrinsyre og acetone. Ved den koagulerende fiksering åbnes proteinernes tertiære struktur og hydrofobe grupper samt reaktive grupper blotlægges. Disse blotlagte grupper vil herefter kunne reagere med grupper i andre proteinmolekyler under etablering af større uordnede aggregater (Fig. 2.5). På trods af den vidtgående strukturelle modifikation af antigenerne er antigenisiteten forbavsende velbevaret for ganske mange antigeners vedkommende. En af årsagerne til dette er, at såvel den primære som den sekundære struktur af antigenerne ikke påvirkes. Koagulerende fiksativer er således meget velegnet til fiksering af fx intermediære filamenter som CK og vimentin. Den morfologiske bevarelse af væv fikseret i rene koagulerende fiksativer er dog ikke den bedste. Samtidig er der en risiko for, at antigener med en lav molekylvægt vil ekstraheres under fikseringen. Dette er de væsentligste årsager til, at koagulerende fiksativer sjældent bruges rutinemæssigt til fiksering med henblik på paraffinindlejring. I den forbindelse er det vigtigt at bemærke, at etanol dehydrering vil virke som en koagulerende efterfiksering på væv, der kun er fikseret kort tid i formaldehyd. Immunhistokemiske metoder optimeret til formalinfikseret væv kan ikke uden videre anvendes til undersøgelser på væv fikseret i koagulerende fiksativ. Antigener, der ikke er fikseret tilstrækkeligt i formalin, vil blive helt eller delvis fikseret i alkohol under vævspræparering med risiko for at blive ekstraheret (fx S-100 protein). Figur 2.5: Gelerende og koagulerende fiksativer. Efter Lyon (3). Koagulerende fiksering Nativt protein Gelerende fiksering Polypeptidkæde Hydrofobe aminosyreradikaler Hydrofile aminosyreradikaler Tværbindinger

6 14 Immunhistokemisk teknik Gelerende fiksativer Gelerende fiksativer virker bl.a. ved at etablere tværbindinger mellem visse aminosyreradikaler i proteinerne (antigenerne) (Fig. 2.5). Foruden at give en glimrende bevarelse af vævsmorfologien er tværbindingerne med til at stabilisere antigenerne i en nativ eller kun svagt modificeret konformation, således at de ikke koagulerer under den efterfølgende dehydrering. På trods af en stabilisering i stort set nativ konformation, påvirkes antigenisiteten for mange antigener negativt af gelerende fiksering. Blandt de gelerende fiksativer er 4% neutral buffet formaldehyd (NBF) klart det foretrukne fiksativ i diagnostisk rutinesammenhæng. Formaldehyd menes at påvirke antigenisiteten på flere måder: 1. Maskering af epitoper. a. gennem konformative ændringer i antigenet. b. gennem immobilisation af nabomakromolekyler (sterisk hindring). c. gennem compleksbinding af metalioner, især Ca-ioner 2. Kemisk modifikation af reaktive aminosyrer i epitopen. 3. Ekstraktion af antigener under fikseringen eller den efterfølgende præparation. Da fiksering påvirker antigenisiteten, bør fikseringstiden så vidt mulig standardiseres. Fikseringstider på timer i NBF giver generelt de bedste resultater. Ved for kort fikseringstid er der som nævnt ovenfor risiko for, at en del af epitoperne i virkeligheden bliver alkoholfikserede, hvilket markant kan ændre betingelserne for immunhistokemisk påvisning. Marzo et al. (87) viste i et studie på prostatektomier, at antallet af p27kip1 positive epitelceller i prostata falder, hvis fikseringstiden i NBF nedsættes. Fikseringstider under 1 døgn gav væsentlig svagere reaktioner end fikseringstider på 2 døgn eller mere. Antip27 KIP1, klon 57 fungerer bedst på væv fikseret mellem 2 og 7 døgn i NBF (87). Ved for lang fikseringstid ses en tiltagende maskering af mange epitoper. Da formaldehydbindingen er delvis reversibel, er det muligt at rette op på en del af problemerne vedrørende bevarelse af antigenisitet. Langvarigt skyl (dage!) i vand efter fiksering af rehydrerede paraffinsnit kan løse en del af problemerne vedrørende maskering og kemisk modifikation af epitoper, men vil sjældent være relevant på grund af muligheden for epitopdemaskering (afsn. 2.6) Afkalkning Væv, der indeholder større mængder calciumsalte, fx knoglemateriale, kræver normalt en afkalkning, for at brugbare paraffinsnit kan produceres. I praksis benyttes mange forskellige afkalkningsmedier, som hver for sig kan påvirke antigenisiteten i vævet. Afkalkningsmedier kan inddeles i 4 hovedgrupper: 1. Stærke, uorganiske syrer, fx HCl og HNO 3 2. Kommercielle blandinger indeholdende bl.a. stærke syrer, fx Decal, New Decal, RBD, S/P, RDO mv. 3. Svage, organiske syrer, fx myresyre og eddikesyre 4. Kompleksbindere, fx EDTA. De stærke syrer og de kommercielle blandingsprodukter udmærker sig ved at afkalke vævet hurtigt. De kan dog ikke ubetinget anbefales til materiale, der efterfølgende skal anvendes til immunhistokemi. Bruges således Decal (Histolab, Västra Frölunda) til afkalkning (4-6h) på NBF fikseret væv, tabes antigenisitet helt eller delvist for de fleste antigener (4). Andre kommercielle blandingsprodukter har vist sig mere anvendelige. Arber et al. (57) fandt med RBD (Rapid Bone Decal, USA) og S/P Decal (USA) som afkalkningsmedier tilfredsstillende resultater med 52 ud af 57 antistoffer. Desværre sås med vigtige antistoffer (som anti-epithelial antigen, Ber-EP4; anti-p53, klon DO7; anti-erα, klon 1D5; anti-pgr, klon ICA; anti-elastase, klon NP57; og anti-ki67, klon MIB1) i visse tilfælde svage eller negative reaktioner sammenlignet med ikke-afkalkede kontrolpræparater. I samme undersøgelse farvede alle 57 antistoffer svarende til eller kraftigere end kontolpræparaterne, hvis EDTA-baseret afkalkning blev anvendt. Dette understreger EDTA s egenskab som skånsomt afkalkningsmedium. Ulempen er blot, at afkalkning i EDTA er meget langsom. Det kan selv for mindre biopsier være nødvendigt at afkalke i op til flere dage. Et godt alternativ til både de stærke syrer og EDTA er derfor de svage organiske syrer. Specielt gode resultater er opnået med myresyre (10% myresyre eller Kristensens opløsning, der er 4 M med hensyn til myresyre og 0,5 M med hensyn til Na-formiat), der afkalker en hel del hurtigere end EDTA. Knoglebiopsier kan således afkalkes på 3-6 timer i Kristensens opløsning. Herefter kan der produceres paraffinsnit af høj kvalitet, med mulighed for at påvise de fleste antigener, der normalt overlever NBF-fiksering og paraffinindlejring. En forudsætning for de gode resultater er selvfølgelig, at vævet er fikseret ordentligt inden afkalkningen påbegyndes. Med hensyn til bevarelse af antigenisitet afkalker Kristensens opløsning generelt ligeså skånsomt som EDTA - også hvad angår nucleære antigener som p53, Ki67, ERα og PgR (4). Der ses dog undtagelser. Anti-CD79a, klon JCB117 giver således efter afkalkning i myresyre en noget svagere reaktion, end hvad der opnås efter EDTA afkalkning, mens antielastase, klon NP57 slet ikke tåler syreafkalkning (hverken stærke syrer eller myresyre). Klon NP57 kan således kun anvendes, hvis afkalkningen foretages i EDTA (4).

7 Anvendt immunhistokemi Vævsfremføring til paraffin Forholdsvis få studier har beskæftiget sig med betydningen af forskellige dehydrerings-, klarings- og paraffinindlejringsmedier i forbindelse med immunhistokemiske farvninger. Meget tyder imidlertid på, at vævsfremføringen i et vist omfang bidrager til maskeringen af antigene epitoper i paraffinsnit. Antigener som Ki67 og terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), der lader sig påvise umiddelbart i både kryosnit og cytologisk materiale selv efter 6-24 timers fiksering i NBF, lader sig ikke uden forudgående demaskering påvise i paraffinsnit af væv fikseret den samme tid i NBF. Vævsfremføringens bidrag til epitopmaskering er på den anden side konstant og ret uafhængig af, hvilke dehydrerings- og klaringsmedier (og for den sags skyld paraffintyper), der anvendes (4,5,56). Det, der synes vigtigst for bevarelsen af antigenisiteten, er, at vævet dehydreres fuldstændigt og at paraffininfiltreringen er komplet. Forkortelse af tiden til dehydrering og paraffinindfiltrering har således for visse antistoffer (fx anti-cd20, klon L26) betydet nedsat reaktivitet Skæring, montering, tørring og opbevaring af snit Paraffinsnit bør skæres 3-5 µm tykke, strækkes fuldkommen på varmt vandbad (ca. 45 C) og monteres på glas coatede med fx poly-l-lysin eller silane, eller på elektrostatisk behandlede glas som fx SuperFrost Plus. Anvendelse af forbehandlede objektglas nedsætter drastisk risikoen for at miste snit undervejs i farvningsproceduren. Efter montering skal snittene tørres, hvorved bindingen til glasset forstærkes. De fleste epitoper tåler tørring ved 60 C i 1 time. En mere skånsom tørring opnås ved 37 C natten over (56), eventuelt efterfulgt af 60 C i 1 time. Enkelte antigener (epitoper) er meget varmefølsomme, det gælder fx proliferating cell nuclear antigen (PCNA) Ønsker man således at påvise PCNA i paraffinsnit med fx antistoffet klon PC10, opnås klart de bedste resultater ved at tørre snittene natten over ved stuetemperatur. Velfikseret og velpræpareret materiale indstøbt i paraffin synes at bevare antigenisiteten af formalinresistente epitoper godt. Der er dog undtagelser. Dash et al. (58) har vist, at androgenreceptor immunreaktiviteten aftager med tiden i paraffinblokke. Med anvendelse af mab F på 9 prostatakarcinomer registredes ved hjælp af billedanalyse et tab af immunreaktivitet i paraffinblokkene svarende til ca. 40% over en periode på 22 mdr. På trods af disse fund er den generelle holdning stadig, at antigenisiteten bevares godt i paraffinblokke, hvad talrige retrospektive studier baseret på materialer op til år gamle også viser. Til gengæld er antigenisiteten i skårne og glasmonterede paraffinsnit ikke nær så holdbar som i intakte paraffinblokke. Mange nyere studier (6,7,59,60,61,62,79,80,81) har vist, at flere antigener taber antigenisitet som funktion af snittenes alder og opbevaringstemperatur. Der har i de forskellige studier været nogen forskel på, hvilke antigener man har fundet følsomme. Følgende diagnostisk vigtige antistoffer har alle i et eller flere studier vist et varierende tab af reaktivitet i gamle snit sammenlignet med nye snit af de samme blokke: Anti-ERα, klon 1D5 og 6F11; anti-anaplastic lymphoma kinase, klon ALK-1; anti-cyclin D1, klon P2D11F11; anti-terminal deoxynucleotidyl transferase, pab; anti-p53, klon DO7 og PAb1801; anti-bcl2, klon 124; anti-chromogranin A, klon LK2H10; anti-factor VIII, pab; anti-cd3, pab; anti-cerbb-2, klon 3B5; anti-e-cadherin, klon HECD-1; anti-vimentin, klon V9; anti- CD45R0, klon UCHL-1; anti-epidermal growth factor receptor, klon EGFR.113; anti-retinoblastom gen protein, klon G3-245; anti- ACTH, pab og anti-ki67, klon MIB1. Årsagen til fænomenet er ukendt, men da tabet af reaktivitet for nogle antigener (fx p53 og ERα) ses allerede efter få ugers opbevaring (59,60,61), er det et problem, der specielt i store retrospektive studier må tages højde for. Flere studier har vist (62,79,81), at tabet af antigenisitet er størst, hvis snittene opbevares ved stuetemperatur eller højere. Opbevaret ved 4ºC er tabet væsentlig mindre, og ved -80ºC ses der intet tab efter 3 års opbevaring (62). Med vekslende held er tabet af antigenisitet forsøgt restaureret gennem forstærket epitop retrieval (forlænget kogetid i HIER-buffer eller brug af alternative buffere, se afsn ) eller opvejet ved at bruge primære antistoffer i højere koncentrationer. Som en konsekvens af ovenstående må det anbefales, at paraffinsnit, der skal opbevares mere end 14 dage, før de skal anvendes (fx positive kontrolsnit og snit til videnskabelige studier), som minimum bliver opbevaret ved 4ºC eller endnu bedre ved -20ºC eller -80ºC, og at man ved hjælp af sammenligning med friskskårne snit registrerer omfanget af et evt. tab i antigenisitet Afparaffinering og hydrering Som for enhver anden farvemetode er en komplet fjernelse af paraffin og dernæst afparaffineringsmediet (xylen, Estisol eller lignende) og rehydreringsmediet (etanol) vitale elementer i den immunhistokemiske teknik. De fleste laboratoriers standard afparaffinerings- og rehydreringsprocedure vil oftest direkte kunne overføres til immunfarvningerne.

8 16 Immunhistokemisk teknik 2.4 Præparation: cytologisk materiale og frysesnit Fremstilling Cytologiske præparater En vigtig forudsætning for succes med immuncytokemiske teknikker er optimal præparering af materialet. For cytologiske materialer (smears, cytospin-, monolayer- og duppræparater) er det vigtigt, at der anvendes coatede eller elektrostatisk behandlede objektglas, at cellerne så vidt muligt findes jævnt fordelt på objektglasset, og at cellerne er så velbevarede og intakte som muligt. Disse krav er ikke forskellige fra de præparationsmæssige krav, der stilles til almindelige cytologiske farvemetoder som May-Grünwald/Giemsa og Papanicoulaus. Dog er det med immuncytokemiske teknikker endnu vigtigere at anvende præparater, hvor cellerne ligger i ét lag og ikke for tæt. I celletætte cytologiske materialer vil der ofte opstå problemer med trapping og uspecifik adhæsion af antistofferne med baggrundsfarvning til følge. Mange problemer med cytologiske præparater kan løses ved at fremstille celleblokke i form af formalinfikserede, paraffinindstøbte centrifugater eller sedimentater, der kan håndteres som almindeligt histologisk materiale (jfr. afsnit 2.3). Protokol for fremstilling af celleblokke 1. Den ufikserede celleholdige væske centrifugeres 10 min. ved 3000 omdr./min, og supernatanten hældes fra. 2. Bundfaldet tilsættes humant plasma (3 dråber til ca. ½ ml bundfald). Plasma og bundfald blandes ved hjælp af pipetten. 3. Der tilsættes bovint trombin* (2 dråber til 3 dråber plasma). Hvis ikke opløsningen koagulerer inden for ét minut, tilsættes yderligere én dråbe trombin (gentages efter behov). Herefter tilsættes neutral buffet formalin, og materialet føres efter en fikseringstid på 24 h frem til paraffin. *Bovine Thrombin (Biofac A/S), 1 ampul à units opløses i 100 ml 0,9% NaCl. Væsken fordeles i kryorør og nedfryses ved -20º C. Frysesnit Frysesnit skæres normalt 4-6 µm tykke og monteres på coatede eller eletrostatisk behandlede glas. Som ved alle undersøgelser på frysesnit er det vigtigt, at vævet nedfryses hurtigt, så fryseartefakter undgås. Nedfrysning i isopentan ved -79ºC giver gode resultater (3). Det er ligeledes vigtigt, at skæring foregår ved den temperatur, der er optimal for den pågældende vævstype (oftest mellem -12ºC og -18ºC). Efter skæring på cryostat optøs vævsblokken som regel for at gennemgå normal fikserings- og præparationsprocedure mhp fremstilling af paraffinsnit til supplerende histokemiske evt. immunhistokemiske analyser. Ønskes paraffinsnit af tidligere nedfrosset materiale anvendt til immunhistokemi, bør fortolkning af farvningsresultaterne foretages med forsigtighed. Reaktiviteten af en del antigener har vist sig at være svækket i paraffinsnit af tidligere nedfrosset væv, i forhold til hvad den er i paraffinsnit af ikke tidligere frosset materiale fra samme patienter. Egerton et al. (82) fandt flere eksempler på betydelig svækkelse af reaktiviteten på tidligere nedfrosset materiale når antistoffer mod S- 100, synaptophysin, neuron specific enolase, carcinoembryonic antigen, chromogranin og melanosoma specific antigen (HMB45) anvendtes. Lignende fund er gjort i eget laboratorium I en række lymfomer er cyclin D1 reaktiviteten set svækket, mens spørgsmålet om klonalitet i B-lymfomer gennem påvisning af kappa og lambda kæder i flere tilfælde ikke kunne besvares, når vævet tidligere havde været nedfrosset. CryoJane teknik Med introduktionen af sentinel node (SN) proceduren indenfor operation af mammakancer og malignt melanom er antallet af frysesnit på lymfeknuder steget betydeligt på mange patologiske instituter. Lymfeknuder er i sig selv ikke vanskellige at producere gode frysesnit af. Er det lymfatiske væv infiltreret med store mængde fedtceller, som kan være tilfældet med SN, er historien dog en ganske anden. Lymfatisk væv og fedtvæv har meget forskellige skæreegenskaber, hvilket vanskeliggør tilfredsstillende snitkvalitet. Til at afhjælpe disse problemer har en såkaldt tape transfer teknik ved navn CryoJane vist sig brugbar. Ved hjælp af en speciel tape, der understøtter vævet under skæring, overføres snit til specielle objektglas. Disse er coatede med en UV-sensitiv lim. Efter UV belysning kan tapen fjernes, efterladende et intakt frysesnit af høj teknisk kvalitet. CryoJane snit kan anvendes til HE farvning, div. histokemiske teknikker og immunhistokemi (evt Haste-EnVision, se afsnit ). CryoJane systemet markedsføres af firmaet Instrumedics ( Tørring og opbevaring Efter fremstilling af cytologiske præparater og frysesnit er det i de fleste tilfælde hensigtsmæssigt at tørre vævet/cellerne på objektglasset. Tørring inden evt. fiksering (se afsn ) er med til at bevare morfologien uden nævneværdigt tab af antigenisitet. Tørretiden vil typisk være mellem 1 time og natten over. Tørringen kan evt. foregå under ventilator eller lignende. Efter endt tørring er materialet klar til evt. fiksering og efterfølgende immuncytokemi. Skal materialet ikke immunfarves umiddelbart efter tørring, bør opbevaringsformen overvejes. Opbevaret ukritisk ved stuetemperatur vil de fleste antigener blive

9 Anvendt immunhistokemi 17 tiltagende vanskelige at påvise (sammenlign afsn ). For mange antigeners vedkommende ses der efter 3 dages opbevaring ved stuetemperatur ingen eller kun marginal svækkelse af antigenisiteten. For andre antigeners vedkommende er der allerede efter 3 dages opbevaring set en betydelig svækkelse af reaktionen. Det drejer sig bl.a. om myosin af slow og fast type påvist med flere forskellige kommercielle mabs (4). Den sikreste måde at opbevare sine cytologiske materialer og frysesnit - med henblik på senere immuncytokemi - er derfor at pakke de tørrede præparater i stanniol og nedfryse dem. Ved -18 C vil antigenisiteten bevares i måneder. Ved -80 C og derunder bevares antigenisiteten sædvanligvis i årevis. Når de tørrede og frosne præparater tages ud af fryseren til immunfarvning, er det vigtigt, at de ikke pakkes ud af stanniolen, før de har opnået stuetemperatur. Udpakning af kolde præparater vil medføre kondensdannelse på materialet, hvilket kan forringe den cytologiske kvalitet Fiksering I modsætning til paraffinsnit har man med cytologiske materialer og frysesnit alle muligheder for at optimere fikseringsproceduren med henblik på optimal bevarelse af netop de antigener (epitoper) materialet skal undersøges for. Når der bortses fra epitoper, der dårligt tåler fiksering (se nedenfor) er der en lang række forskellige fiksativer til rådighed i forskellige immunhistokemiske sammenhænge. Ofte vil det være nødvendigt med en efterfølgende epitopdemaskering (se afsn. 2.6). Blandt de vigtigste fiksativer er: 1. Acetone, 100% 2. Acetone/metanol (forhold 1:1) 3. Acetone/metanol/formaldehyd (forhold 19:19:2) 4. Neutral buffet formaldehyd (NBF). 4% 5. Neutral buffet formaldehyd (NBF). 4%, efterfulgt af detergentbehandling 6. Neutral buffet formaldehyd (NBF) 4%, efterfulgt af epitopdemaskering (se afsn. 2.6) 7. Zambonis fiksativ. Der er desuden en række antistoffer, hvortil acetone ikke kan anvendes som fiksativ. Blandt disse er følgende diagnostisk vigtige antistoffer: anti-erα (mange forskellige kloner); anti-pgr (mange forskellige kloner); anti-p53 (mange forskellige kloner); anti-terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)(såvel mabs som pabs); anti-ki67, klon MIB1; anti-pcna, klon PC10; og anti-c-erbb2, pab. For nogle af disse antistoffers vedkommende er problemet øjensynligt, at antigenet helt eller delvist ekstraheres i acetone eller de efterfølgende procedurer. Acetone/metanol Acetone/metanol (1:1) er en blanding af koagulerende fiksativer. Fiksering sek giver en rimelig skånsom fiksering, som kan anbefales til hæmatologisk materiale i kombination med en forstærket (repeteret, se nedenfor) alkalisk phosphatase anti-alkalisk phosphatase (APAAP)-teknik. Acetone/metanol giver i sammenligning med ren acetonefiksering en langt bedre cytologisk bevarelse af cellerne. En væsentlig ulempe ved acetone/metanol fiksering er, at reaktiviteten for en del epitopers vedkommende svækkes i forhold til fiksering alene med acetone. Svækkelsen af reaktionen kan delvis kompenseres ved hjælp af et meget følsomt detektionssystem, fx APAAP med forstærkning. Der er epitoper, der ikke lader sig påvise efter acetone/metanol fiksering. Indenfor hæmatologien kan bl.a. følgende mabs således ikke anvendes på acetone/metanol-fik seret materiale: anti-cd10, klon SS2/36; anti-cd16, klon VIFcRIII; anti-cd13, klon My7; anti-cd33, klon VM54; anti-cd103, Ber ACT8; anti-hairy cell leukemia, klon DBA.44; og anti-glycophorin A, klon D Acetone/metanol/formaldehyd Acetone/metanol/formaldehyd (19:19:2) giver en kombineret koagulerende og gelerende fiksering. Fiksering i sek. giver yderligere forbedringer af den cytologiske bevarelse i forhold til acetone/metanol fiksering. Ulempen er, at der samtidig ses en yderligere svækkelse af immunreaktiviteten for en del epitopers vedkommende. Acetone Acetone er et rent koagulerende fiksativ. Fiksering af frysesnit i 10 min. (cytologisk materiale behøver kun fiksering i 90 sek.) ved stuetemperatur eller ved 4 C bevarer antigenisiteten udmærket for de fleste antigener. Acetonefiksering er derfor af mange det foretrukne til frysesnit og cytologisk materiale, når det fx drejer sig om påvisning af overfladeantigener. En ulempe er, at morfologien ikke altid er optimalt bevaret. Neutral buffet formalin (NBF) NBF (4%) giver en ren gelerende fiksering. Fiksering i 2-30 min. giver noget nær optimal morfologisk bevarelse på frysesnit, samtidig med at NBF er et fremragende fiksativ til specielt mange kernelokaliserede og intracytoplasmatiske antigener. På frysesnit opnås gode resultater med NBF, også for antigener, der ikke umiddelbart kan påvises på paraffinsnit. Dette fænomen er en understregning af, at ikke kun NBF-fikseringen bidrager til problemer med tab af antigenisitet i paraffinsnit.

10 18 Immunhistokemisk teknik Dehydrerings-, klarings-, og paraffininfiltreringsproceduren må ligeledes forventes at bidrage i et vist omfang til maskeringen af epitoper. Blandt de mange antigener, hvortil der med fordel anvendes NBF-fiksering, kan nævnes: S-100 protein, p53 oncoprotein, C-erbB2 oncoprotein, TdT, ERα og PgR og Ki67 antigen. Anvendes NBF til fiksering af cytologisk materiale, vil det i de fleste tilfælde være nødvendigt at foretage en form for permeabilisering af cellemembraner inden den immunhistokemiske farvning. Permeabilisering kan udføres på flere måder. Det letteste er at efterbehandle de NBF-fikserede celler med et detergent (sæbelignende stof) Ingen fiksering Især inden for muskelpatologien findes en række antigener, der bedst påvises uden nogen form for fiksering. Det drejer sig primært om proteiner med en relativ høj molekylvægt og/eller med en vis strukturel forankring i muskelcellens cytoplasma eller cellemembran. Påvisningen af slow myosin, klon WBMHCS; fast myosin, klon My32; dystrophin, klon Dy86C5; og en række dystrophinrelaterede antigener foregår derfor i praksis ved at applicere det primære antistof på de tørre frysesnit uden nogen forudgående behandling (fiksering eller lignende). Det skal dog tilføjes, at de fleste af disse antigener ikke desto mindre kan påvises i formalinfikserede muskelbiopsier med udmærkede resultater. Protokol for kombineret NBF fiksering og permeabilisering 1. Fiksering i 4% NBF 15 min. 2. Skyl i buffer 2 min. 3. Triton-X-100 (0,05%-0,5% i TBS) 10 min. 4.Skyl i buffer og fortsæt med immunfarvning. Detergentbehandlingen ekstraherer dele af lipidmaterialet i cellens membraner, hvilket gør det lettere for immunreagenserne at penetrere dem. Effekten af detergentbehandling på cytologisk materiale vil tydeligt kunne iagttages ved påvisning af fx p53 oncoprotein og andre kernerelaterede antigener som TdT, Ki67 og lignende. Specielt for p53 s vedkommende giver NBF-fiksering efterfulgt af Triton-X-100 behandling en voldsom forstærkning af reaktionen sammenlignet med den rene NBF-fiksering. NBF og varmeinduceret epitopdemaskering (HIER) Mange antistoffer giver på cytologisk materiale fremragende resultater, hvis fiksering i 4% NBF kombineres med HIER (se afsn inkl. afsn. vedr. HIER protokoller). Zambonis fiksativ Zambonis Fiksativ er et blandingsfiksativ bestående af: 2 g paraformaldehyd i 85 ml 0,15 M fosfatbuffer ph 7,3 tilsat 15 ml vandig mættet picrinsyre. Fiksativet giver en kombineret gelerende og koagulerende fiksering. Det er bl. a. anbefalet ved undersøgelser for Retinoblastom (RB) gen protein. Flere forskellige anti-rb mabs (klon G3-245, R128 og RB1), giver efter Zamboni-fiksering de bedste resultater. Tilsvarende er fiksativet anbefalet ved brug af anti-erα (klon LH1 og LH2) og anti-pgr (klon 1A6). 2.5 Blokering af endogen aktivitet Endogen enzymaktivitet De vigtigste immunenzymatiske detektionssystemer benytter sig af peroxidase, alkalisk phosphatase, glukose oxidase eller betagalactosidase som enzymlabel (markør) Blandt disse enzymer er peroxidase og alkalisk phosphatase klart de foretrukne. I lighed med beta-galactosidase forekommer begge enzymer naturligt (endogent) i en række celler i humant væv. Det kan derfor være nødvendigt at blokere eller hæmme den endogene enzymaktivitet. Peroxidase (PO) PO-aktivitet forekommer med varierede styrke i granulocytter, monocytter og makrofager. Desuden indeholder erytrocytter såkaldt pseudoperoxidaseaktivitet, der giver de samme fortolkningsmæssige problemer. I paraffinsnit af NBF fikseret materiale er egentlig peroxidaseaktivitet stort set elimineret, mens pseudoperoxidaseaktiviteten i erytrocytter overlever. En lang række forskellige kemiske forbehandlinger vil være i stand til at blokere den endogene peroxidaseaktivitet: Protokoller til blokering af endogen peroxidase aktivitet 1. 0,5% brintperoxid i metanol 10 min. eller 2. 1% - 3% brintperoxid i TBS 10 min. eller 3. 0,5% - 3% brintperoxid i etanol 10 min. eller 4. 0,3% brintperoxid og 0,1% Na-azid i TBS 10 min.

11 Anvendt immunhistokemi 19 Alle 4 protokoller kan anbefales til blokering af endogen peroxidaseaktivitet på NBF-fikserede paraffinsnit. Protokol 1 og 3 skal altid appliceres før evt. demaskering, mens protokol 2 og 4 kan appliceres enten før demaskering eller efter primært antistof (men før HRP-link!). Ingen af de 4 protokoller bør anvendes lige efter demaskering, da mange epitoper er følsomme overfor både metanol/etanol og brintperoxid. Til gengæld tyder meget på, at langt de fleste NBFfikserede epitoper, der overlever fiksering, vævspræparation og paraffinindlejring, også klarer en forbehandling med henblik på blokering af endogen peroxidaseaktivitet, hvis denne foretages før evt. demaskering. Desværre er der undtagelser. Anti-CD4, klon 1F6 reagerer med en epitop, der er meget følsom overfor brintperoxid, også selvom blokeringen foregår før demaskering. På paraffinsnit, hvor dette antistof skal anvendes, bør blokering derfor udelades eller foretages efter det primære antistof. På cytologiske materialer og frysesnit er epitoper generelt mere følsomme overfor kemiske påvirkninger, end de er i paraffinsnit af NBF fikserede væv. En del laboratorier undlader derfor at blokere for endogent peroxidaseaktivitet i disse materialer. I de fleste tilfælde lader det sig gøre uden problemer, da det bl.a. med hjælp fra et negativt kontrolsnit er muligt at identificere den endogene peroxidaseaktivitet. I hæmatologisk materiale og cytologisk materiale med kraftig blodtilblanding, hvor der kan forudses fortolkningsproblemer på grund af endogen peroxidaseaktivitet, kan protokol 4 anbefales. Li et al. (8) fandt, at der med denne protokol kunne opnås en effektiv blokering af endogen peroxidaseaktivitet uden tab af antigenisitet eller morfologiske detaljer. Undersøgelsen blev udført med 23 forskellige diagnostisk vigtige antistoffer inden for hæmatologien. Tilsvarende gode eller bedre resultater er opnået ved først at applicere protokol 4 efter det biotinylerede sekundære antistof i en labelled streptavidin biotin (LSAB) eller ABC teknik (9). For epitoper der tåler NBF fiksering kan der være en elegant alternativ løsning på problemet med endogen peroxidaseaktivitet. På cryostatsnit og mange cytologisk materialer vil en kombination af NBF fiksering og en varmebehandling ved over 95 C i HIER-buffer blokere effektivt for endogen peroxidaseaktivitet (se afsn NBF-HIER protokoller og Protokol Haste-EnVision+ ). I kombination med NBF fiksering ses således 2 positive effekter af varmebehandling: Dels en forstærkning af immunreaktionen gennem demaskering (se afsn ) og dels en blokering af endogen enzymaktivitet. En simpel løsning på problemer med endogen peroxidaseaktivitet er selvfølgelig at anvende et detektionssystem, der er baseret på alkalisk phosphatase som enzym-label (fx APAAP, se afsnit ). Alkalisk phosphatase Alkalisk phosphatase (AP) aktivitet forekommer akkurat som PO naturligt i en række celler i humant væv. AP kan klassificeres i mindst 5 grupper, alt efter hvilket væv de stammer fra (10). Den AP, der anvendes til enzymkonjugater, udvindes fra kalvetyndtarm. AP i tarm er resistent overfor enzymhæmmeren levamisol, mens AP i lever og knoglemarv er følsom for levamisol. Tilsætning af 1 mm levamisol til kromogen/substratopløsningen vil derfor effektivt blokere endogen AP aktivitet relateret til disse celler og væv, mens enzymlabel ikke påvirkes. Dette gør AP-baserede detektionsystemer (fx APAAP) meget anvendelige til hæmatologiske materialer. Undersøgelser (11) har dog vist, at tilsætning af 1 mm levamisol i visse detektionssystemer. (LSAB-AP) kan have en vis hæmmende effekt på enzymlabel. Afhængig af graden af endogen AP anbefales det således at bruge lavere koncentrationer af levamisol (0,25 mm - 0,5 mm), der ikke har vist hæmmende effekt på AP-label. Alternativt kan snittene opvarmes til 65ºC, hvorved APaktiviteten elimineres. AP-baserede detektionssystemer har deres begrænsninger specielt på materiale fra mave-tarmkanalen og placenta, da levamisol ikke hæmmer den endogene AP i disse væv. Der kan også i visse tilfælde ses levamisolresistent AP i tumorer. I et cytologisk studie af 25 non-hæmopoietiske tumorer fandes levamisolresistent AP i 4 tilfælde (10), der ikke udgik fra ventrikel/tarm eller placenta Endogen biotin Avidin-biotin og steptavidin-biotin detektionssystemer (ABC, LSAB mv., se afsn. 2.10) benytter sig af den naturlige affinitet, avidin og steptavidin har for biotin (vitamin H). Biotin forekommer i store mængder sammen med enzymet pyruvat carboxylase i mitochondrier. Det betyder, at der i mitochondrie-rige celler er risiko for falsk positiv reaktion svarende til streptavidins eller avidins reaktion med endogen biotin. Artefaktet ses specielt i metabolisk aktive celler som fx lever, nyre, binyre, spytkirtler mv. En del karcinomer, heriblandt mamma- og colonkarcinomer vil potentielt også kunne give anledning til denne falske positive reaktion. Sædvanligvis forekommer endogen biotin intracytoplasmatisk, men kan også ses intranucleært. I graviditetsrelateret endometrium er der således i 32 af 69 prøver set biotinholdige intranucleære inklusioner (12), der selvfølgelige ikke må forveksles med virus inklusioner (fx herpes simplex). Problemet med endogen biotin er naturligvis kun relateret til de biotinbaserede detektionssystemer og har tidligere kun været et reelt problem på cytologisk materiale og kryostatsnit. I paraffinsnit maskeres det meste biotin nemlig effektivt og gav således sjældent problemer med falsk

12 20 Immunhistokemisk teknik vende fortyndede æggehvider, der indeholder store mængder avidin. Prisen bringes hermed ned på 10 øre pr. glas. Da de fortyndede æggehvider og biotinopløsningen (0,2% i PBS) tilmed er holdbare og kan genbruges (æggehvider 1 uge, biotin 1 måned), kan hele proceduren foregå i farveskåle uden krævende håndtering af de enkelte glas. Millers protokol til blokering af endogen biotin 1. Skyl i dest vand 5 min. 2. Fortyndede æggehvider (2 æggehvider, fyld op til 200 ml med dest vand) 15 min. 3. Grundigt skyl i flere hold dest vand 5 min. 4. Biotin (Merck No ) 0,2% i PBS, ph 7,2 med 15mM natriumazid 15 min. 5. PBS eller TBS 2 min. Figur 2.6: Blokering af endogen biotin. positiv reaktion i ikke-demaskerede snit. Med introduktionen af varmeinduceret epitopdemaskering (se afsn. 2.6) er problemet vokset, og specielt efter den tiltagende brug af mere effektive kogemedier som EDTA/EGTA og Tris-HCl ved højt ph er problemet blevet påtrængende. Giver endogen biotin fortolkningsmæssige problemer, bør der enten vælges alternativt detektionssystem (fx APAAP eller et af de mange polymersystemer - se afsn ) eller en forbehandling med blokering af endogen biotin for øje (Fig. 2.6). Protokol til blokering af endogen biotin 1. Avidin 0,1% 10 min. 2. PBS eller TBS 2 min. 3. Biotin 0,01% 10 min. 4. PBS eller TBS 2 min. Blokeringen iværksættes umiddelbart før blokering af uspecifik antistofadhæsion, hvilket for paraffinsnit selvfølgelig betyder, at biotinblokeringen udføres efter evt. epitop demaskering. Protokollen (evt. udført med kit) giver i de fleste tilfælde en tilfredsstillende blokering af biotin i paraffinsnit og frysesnit. Udover den ekstra håndtering af glassene er også prisen en væsentlig ulempe ved denne protokol. Anvendes kommercielle kits, er prisen generelt høj: blokering ved hjælp af DakoCytomations kit koster således 4,69 kr. pr. glas og Vectors kit koster 3,31 kr. Zymeds kit koster kun 2,16 kr. pr. glas, men er ikke helt så effektivt til at blokere endogent biotin som de to øvrige (4). Det er ikke væsentlig billigere at købe de rene varer selv, da rent avidin er forbavsende kostbart. Miller et al. (63) har beskrevet et simpelt og brugbart alternativ til de dyre kits. I stedet for at bruge ren avidin kan man an- Ved kontakt med buffersalte er der risiko for, at æggehvide-protein vil udfælde i snittene, hvorfor der skal skylles grundigt i destilleret vand. 2.6 Epitop demaskering (retrieval) I paraffinsnit af NBF-fikseret materiale vil mange antigene epitoper ikke eller kun dårligt kunne påvises. Det har vist sig, at en stor del af disse epitoper ikke er ødelagte, men blot er maskerede. Mange maskerede epitoper kan demaskeres og dermed gøres immunreaktive igen. De to vigtigste, principielt forskellige teknikker, der i dag bruges til demaskering af antigene epitoper er: 1. Forbehandling med proteolytiske enzymer. 2. Varmeinduceret epitop demaskering (HIER = heat-induced epitop retrieval). Hertil kommer andre metoder, der er nødvendige til specielle antigener, fx behandling med 100% myresyre til amyloider, samt diverse kombinationer af proteolyse og HIER (se tabel 2.2) Ultralyd har ligeledes været anvendt til epitop retrieval. For enkelte antigener synes ultralyd at have en vis demaskerende effekt, men dog væsentlig mindre effekt end HIER (86). Som generel demaskeringsteknik synes ultralyd derfor uinteressant Proteolytiske enzymer Anvendelsen af proteolytiske enzymer til demaskering af antigene epitoper blev introduceret i 70 erne (13,14) og har siden vundet stor udbredelse. Teknikken gjorde det muligt at påvise et stort antal antigener, der tidligere var vanskelige eller umulige at påvise i paraffinsnit af NBF fikseret materiale. Mange forskellige enzymer kan anvendes. Trypsin, pepsin eller pronase E er de mest populære.

13 Anvendt immunhistokemi 21 Protokoller til proteolytisk forbehandling a. Trypsin protokol: Trypsin 250, Difco Tris-buffer 0,05M, ph 7,8 med 0,050 g 0,1% CaCl ml Afhængig af fikseringstiden i NBF forbehandles 5-20 min. ved 37 C. Inden inkubation i enzymopløsning forvarmes snittene 5 min. i destilleret vand ved 37 C. b. Pepsin protokol: Pepsin, Sigma No. P7012 HCl, 0,01 M 37 C 0,160 g 40 ml Afhængig af fikseringstiden i NBF forbehandles min. ved 37 C. Inden inkubation i enzymopløsning forvarmes snittene 5 min. i destilleret vand ved 37 C. c. Pronase E (Protease type 14) protokol: Protease type XIV,Sigma No. P5147 TBS 0,05M, ph 7,4 37 C 0,025 g Afhængig af fikseringstiden i NBF forbehandles 5-15 min. ved 37 C. Inden inkubation i enzymopløsning forvarmes snittene 5 min. i destilleret vand ved 37 C. d. Proteinase K protokol*: 50 ml Proteinase K, DakoCytomation S µl Tris-buffer 0,05M, ph 7,5 stuetemp. 50 ml Afhængig af fikseringstiden i NBF forbehandles 5-15 min. ved stuetemperatur. Denne protokol kan med fordel appliceres immunostainere som Tech- Mate og Autostainer. *Proteinase K opløsningen kan købes klar til brug. Biokemisk er enzymernes reaktivitet og specificitet velkendt. Trypsin katalyserer således spaltningen af peptidbindinger i hvilke aminosyrerne arginin og lysin forekommer. Chymotrypsin, som findes i de fleste kommercielle trypsinprodukter, hydrolyserer navnligt peptidbindinger, hvor de aromatiske aminosyrers carboxylsyrer indgår. Pepsin angriber en del forskellige peptidbindinger, men peptidbindinger, hvor de aromatiske aminosyrers aminogrupper indgår, spaltes hurtigst. Pronase E, der udvindes fra Streptomyces griseus, er som de fleste andre bakterielle proteaser meget lidt specifik med hensyn til hvilke peptidbindinger, der angribes. Pronase E er således i stand til at katalysere spaltningen af størstedelen af de typer peptidbindinger, der forekommer i humant væv. Tilsvarende gælder proteinase K. Er enzymernes biokemiske reaktivitet og specificitet velkendt, så er baggrunden for deres demaskerende effekt i immunhistokemisk sammenhæng til gengæld noget uklar. Den positive effekt på muligheden for at påvise maskerede epitoper beror givet vis på flere faktorer. Blandt de vigtigste er: 1. Evnen til spaltning af peptidbindinger i umiddelbar nærhed af de NBF-inducerede tværbindinger (methenbroer). Dette er med til at åbne op for en del af de skjulte epitoper. En direkte spaltning af methenbroerne synes mindre sandsynligt. 2. Fraspaltning af blokerende nabomolekyler. 3. Permeabiliteten af vævet øges gennem spaltningen af proteinerne. Selvom trypsin, pepsin og pronase biokemisk er forskellige med hensyn til hvilke peptidbindinger de spalter i proteinerne, vil der i mange tilfælde kun ses mindre forskelle i deres evne til at demaskere en given epitop. I de fleste tilfælde er pronasen dog mest effektiv, hvilket forklarer dette enzyms popularitet. Pepsin har vist sig særlig velegnet til demaskering af epitoper i extracellulære strukturproteiner som collagen III, collagen IV, fibronectin, laminin og P-component. De gode resultater opnås specielt, hvis inkubationen i pepsin forlænges til 1-2 timer. Pronase E er især velegnet anti-lmw-ck, klon CAM 5.2, og anti-cd21, klon 1F8. Udover den positive effekt er der også væsentlige ulemper forbundet med forbehandlingen med proteolytiske enzymer. For det første er der en hel del epitoper, der ikke tåler enzymforbehandling, hvilket naturligvis udelukker teknikken som universel demaskeringsteknik. For det andet er der alvorlige problemer med standardisering af metoden. Problemerne stammer væsentligst fra det faktum, at inkubationstiden for den proteolytiske forbehandling er stærkt afhængig af fikseringstiden i NBF. Alle undersøgelser viser, at jo længere tids fiksering der er anvendt i NBF, jo længere tids proteolytisk forbehandling skal iværksættes for at opnå den ønskede epitop-demaskering. Omvendt skal enzymforbehandlingstiden nedsættes for væv, der kun er fikseret i kort tid i NBF. For lang tids enzymforbehandling i forhold til fikseringstiden vil give en gradvis fordøjelse af vævssnittet med tab af morfologiske detaljer til følge. For at optimere den enzymatiske forbehandling er det med andre ord nødvendigt at kende fikseringstiden på det væv, man ønsker at behandle. Standardisering af den proteolytiske forbehandling kompliceres yderligere ved, at den optimale proteolysetid også kan variere fra celletype til celletype. For keratinpåvisning i forskellige epiteltyper er således beskrevet en betydelig tidsvariation for optimal proteolysetid (15). Endelig skal det nævnes, at falsk positiv reaktion kan ses ved anvendelse af anti-ck20, klon Ks20.8, hvis der anvendes proteolytisk forbehandling, specielt hvis vævet kun er kortvarigt fikseret (<24 h) Varmeinduceret epitop demaskering (HIER) På baggrund af en række biokemiske studier af Fraenkel-Conrat et al. (16-18) tilbage i 40 erne vedr. formaldehyd-protein reaktioner udviklede Shi et al i 1991 (19) det, vi i dag kender som varme induceret epitop dema-

14 22 Immunhistokemisk teknik skering (Heat-Induced Epitop Retrieval - HIER). Teknikken har på dramatisk vis forbedret mulighederne for immunhistokemi på paraffinsnit. HIER åbner mulighed for at anvende antistoffer på paraffinsnit, som tidligere med konventionel teknik (proteolyse mv.) kun gav svagt positiv reaktion eller slet ingen (20-23,76). Blandt de vigtigste antistoffer i denne gruppe, der omfatter mere end 40, kan nævnes: anti-ki67, klon MIB1; anti-erα, klon 1D5; anti-pgr, klon ICA og 1A6; anti-bcl-2, klon 124; anti-cd5, klon 4C7; anti-cd8, klon C8/144B; anti-cd 23, klon 1B12; anti-cd44, klon DF1485; anti-cd44v6, klon 2F10; anti-cd79a, klon JCB117; anti-rb, klon G3-245; anti-cd4, klon 1F6; anti-e-cadherin, klon HECD-1; anti-tdt, pab; anti-dystrophin, klon Dy4; og anti-cyclin D1, klon DSC-6, P2D11F11 og SP4 samt pab fra Biocare. Der findes en endnu større gruppe antistoffer, omfattende 50-80% af de på patologiafdelinger anvendte, som før introduktionen af HIER gav åbenlyst svagere reaktioner på paraffinsnit end frysesnit. Efter HIER kan der nu for denne store gruppe antistoffer opnås resultater på paraffinsnit, der med hensyn til farvningsintensitet og detektionsgrænser modsvarer, hvad der optimalt kan opnås på frysesnit. Til denne gruppe hører mange antistoffer mod bl.a. CK er og CD-markører (fx anti-cd3, anti-cd20, anticd30, anti-cd45, anti-cd54 og anti-cd68) samt de fleste p53 antistoffer. HIER-teknikken bygger på opvarmning af afparaffinerede og rehydrerede paraffinsnit i passende buffer eller saltopløsning. Shi s originale metode benyttede sig af mikrobølgeovn (MBO) som varmekilde og af en mættet blythiocyanatopløsning eller rent destilleret vand som kogemedium. Siden Shi s originale arbejde er talrige modifikationer blevet publiceret. Cattoretti et al (20) introducerede i 1993 citratbuffer 0,01 M, ph 6, som kogemedium. Citratbuffer har siden været det mest benyttede kogemedium i HIER teknikken, men afløses nu i tiltagende omfang af alternative buffere (se nedenfor). Den præcise mekanisme bag HIER teknikken er ikke kendt. Meget tyder dog på at varmepåvirkningen af vævssnittene bl.a. har følgende indvirkning: a. Formaldehydinducerede tværbindinger (methenbroer) brydes. b. Komplekst bundne og epitopmaskerende Ca-ioner fjernes. c. Vævet rehydreres med forbedret penetration til følge. d. En vis proteindenaturering forekommer, hvilket kan blotlægge skjulte epitoper. Det skal her bemærkes, at formalinfiksering synes at have en beskyttende virkning mod denaturering af proteiner ved opvarmning - en proces, der ville denaturere ikke-fikserede proteiner. Der indgår i HIER-teknikken en række variabler, nogle med stor betydning og andre med mindre betydning for epitop demaskeringen: Varmekilde, temperatur og tid Som varmekilde er flere alternativer afprøvet. Mikrobølgeovn (MBO) med eller uden trykkoger, almindelig kogeplade, autoklave, steamer, vandbad og trykkoger (19,20,24,25,68,69) er alle varmekilder, der med succes har været anvendt i HIER-teknikken. Det synes således ikke særligt kritisk, hvilken varmekilde der anvendes. Vigtigere end selve varmekilden er temperaturen i kogemediet, og den tid, snittene befinder sig deri (26,69). I den traditionelle HIER-teknik, hvor mikrobølgeovnen anvendes, opnås sædvanligvis tilfredsstillende epitopdemaskering efter kogning ved 100 C i 10 til 15 min. I autoklave, trykkoger, eller MBO-trykkoger er det p.g.a. trykket muligt at bruge temperaturer over 100 C ( C). Dette kan for visse epitoper give en mere effektiv demaskering. Leong et al (86) sammenlignede på 42 diagnostiske rutineantistoffer såkaldt superheating (5 min. 120 C ved 1,9 bar i Milestone Mega T/T) med traditionel kogning i mikrobølgeovn. De fandt for ca. 30 af antistofferne kraftigere reaktioner efter superheating end efter mikrobølgekogning. Lignende forsøg i eget lab (4) har ikke afsløret samme tydelige fordele ved superheating. Mulige årsager kan være, at Leong primært brugte citratbuffer som kogebuffer og at kogetiden i mikrobølgeovn kun var på 10 min. I modsætning hertil har egne forsøg (4) været baseret på T- EG buffer ph9 (se afsn. vedr. kogemedium) og en kogetid på 15 min. i mikrobølgeovnen. En mindre forlængelse af kogetiden (samlet kogetid min.) i mikrobølgeovnen kan øjensynligt give samme resultat som anvendelsen af superheating (4,69) og være mere skånsomt ved vævet. Cyklisk kogning i form af 3-4 x 5 min hævdes for visse epitoper ligeledes at være mere effektiv end én sammenhængende kogeperiode (75), mens andre ikke har fundet nogen fordel herved. Det forhold, at lavere temperatur (T) kræver længere kogetid (t), understreges af Shi et al. s (70) resultater med anti-ki67, klon MIB1 på tonsilvæv. Identisk og optimal demaskering af MIB1 epitopen blev opnået under følgende varmebehandlingsforhold (T x t): 100 C x 20 min., 90 C x 30 min., 80 C x 50 min., 70 C x 10 timer. Udover at kaste lys over nogle meget centrale forhold omkring HIER antyder disse resultater desuden, at epitopdemaskering ikke nødvendigvis altid behøver at foregå under egentlig kogning, men også kan foregå ved lavere temperaturer. Koopal et al. s resultater (77) understøtter dette. I deres undersøgelse gav 16 af 16

15 Anvendt immunhistokemi 23 antistoffer identiske eller kraftigere reaktioner, når demaskering blev foretaget natten over ved 80 C i Tris-HCl ph 9 ( low-temperature HIER ) sammenlignet med MBO-kogning i Tris-HCl ph 9,5 + 5% urea. Den morfologiske bevarelse angives som værende god efter behandlingen natten over ved 80 C, men desværre uden nogen detaljeret sammenligning til de MBO-behandlede snit. Når HIER-behandling ved lavere temperaturer - på trods af en voldsom forlængelse af inkubationstiden i kogemediet - alligevel kan være interessant, hænger det netop sammen med problemer med den morfologiske bevaring af visse væv. Kogning og høje temperaturer i øvrigt får kollagene fibre til at kvælde op og dermed løsne sig fra glasset. Det er et fænomen, der ind i mellem kan give visse fortolkningsmæssige problemer specielt i bindevævsrige tumorer. Da tendensen til kvældning af kollagen aftager med faldende HIER-temperatur, er demaskering ved lavere temperatur som alternativ til MBO-kogning ikke uinteressant. Undersøgelser i eget laboratorium har vist (4), at kvældning af kollagen helt kan undgås, hvis HIER-behandlingen foregår ved max. 60ºC. Forlænges behandlingen samtidig til timer, opnås resultater, der oftes er lig med eller kun marginalt svagere end, hvad der opnås efter kogning. Disse fund er gjort med TEG-buffer som kogemedium (se afsn. vedr. kogemedium) og har medført, at ved receptor undersøgelser (ER og PgR påvisning) på mammacancer har denne lowtemperature HIER (se afsn. vedr. HIERprotokoller) været anvendt som rutinemetode i Odense siden Shi et al (88) viste, at HIER ved lavere temperaturer end 100 C ikke blot er et spørgsmål om at forbedre morfologien i snittene. Det kan også være nødvendigt for at opnå optimal demaskering af specielt varme-sensitive antigener/epitoper. Shi et al fandt med et pab mod COX-2 (PG27), at traditionel kogningsdemaskering i citrat buffer ph 6 gav negative resultater. Ved at sænke temperaturen i citrat bufferen til 90 C opnåedes derimod en meget god demaskering. Optimal demaskering blev opnået med inkubationstider på min., mens inkubation natten over svækkede reaktionen voldsomt. Som konsekvens af disse fund anbefaler Shi et al. at inkludere en eller flere varianter af low-temperature HIER i test-batteriet til sceening for optimal epitop demaskering (Tabel 2.1 og 2.2). Som nævnt synes valg af varmekilde ikke særlig kritisk. Den mikrobølgeinducerede varmebehandling er dog på mange måder den hurtigste og letteste måde at udføre HIER på. Da almindelige husholdnings-mikrobølgeovne er anvendelige, kræver denne teknik heller ikke den store investering. Problematikken omkring hot-spots og cold-spots i MBO-teknikken har været diskuteret, men synes uden betydning for reproducerbarheden, hvis den praktiske udførsel af HIER metoden standardiseres (se HIERprotokoller nedenfor). Figur 2.7: Intensiteten af immunreaktioner relateret til ph i kogemediet. Tre forskellige mønstre af ph-afhængighed har vist sig: Én gruppe antistoffer udviser kun ringe ph-relateret variation (A). En anden gruppe viser i svagt sure medier et dramatisk fald i intensitet (B), mens en tredje gruppe giver kraftigere reaktioner med et stigende ph. Efter Shi et al. (27). Firmaet BioCare har gennem udviklingen af deres såkaldte Decloaker bidraget til at gøre trykkogning til et attraktivt alternativ til mikrobølgekogning. Decloaker en består af et lille trykkammer med indbygget elektrisk kogeplade. Den simple konstruktion gør instrumentet meget billigere end de fleste mikrobølgetrykkogere. Decloaker en er til gengæld noget dyrere end både husholdningsmikrobølgeovne og traditionelle husholdnings-trykkogere. I forhold til traditionelle trykkogere burde resultaterne være mere reproducerbare med Decloaker på grund af det indbyggede program for opvarmning. Erfaringer i Aalborg tyder dog på, at en præcis kalibrering og dermed stabilitet kan være vanskelig at opnå med Decloaker. DakoCytomation har for nylig lanceret en tilsvarende trykkoger, Pascal. Uanset hvilken metode der anvendes til opvarmning, skal snittene efter kogning køle af i kogemediet, idet en direkte placering af glassene i kold PBS/TBS kan skade både vævsmorfologi og antigenisitet. Kogemedium Mange forskellige kogemedier har været afprøvet og anbefalet til HIER (26-29). Specielt 2 generelle egenskaber ved kogemedierne synes at have en stor betydning for, hvor effektivt de fungerer i HIER-teknikken. Disse egenskaber er: 1. Kogemediets ph. 2. Kogemediets evne til at kompleksbinde eller udfælde calciumioner. Shi et al (27) fandt, at ændringer i kogemediets ph kan resultere i dramatiske forskelle i den demaskerende effekt. Efter at have undersøgt immunfarvning med et panel af mabs (ialt 9) efter HIER i forskellige kogemedier med ph variende fra 1 til 10, fandt man tre forskellige mønstre af ph-afhængighed (Fig. 2.7).

16 24 Immunhistokemisk teknik En gruppe på fem antistoffer viste ingen nævneværdig variation i farvningsintensiteten inden for hele ph-området. To antistoffer (anti-ki67, klon MIB1; og anti-erα, klon 1D5) viste en V-formet kurve med et dramatisk fald i farvningsintensitet efter HIER i buffer med ph 3-5. Ved lavt ph og højt ph var reaktionen kraftig. Endelig viste to antistoffer (anti-cd43, klon MT1; og anti-melanosoma specific antigen, klon HMB45) ingen reaktion ved lavt ph, men herefter en gradvis forstærkning af reaktionen med stigende ph i kogemediet. Undersøgelsen viste, at Tris-HCl ved højt ph er langt mere velegnet som generelt kogemedium end citratbuffer ph 6. Lignende resultater kommer andre studier til (28,70,72), omend det er værd at bemærke, at Tris-HCl ved ph 1 med nogle antistoffer (ex: anti-ki67, klon MIB1) giver endnu bedre demaskering end Tris-HCl ved ph 10 (70) En kedelig ulempe ved Tris-HCl ph 1 er, at der ikke sjældent ses en svag falsk positiv reaktion i en del kerner! Ydermere synes den generelle morfologiske bevaring at være ringere efter kogning ved ph 1 end ved ph 10. Morgan et al (29,71) fandt, at kompleksbinding eller udfældning af vævsbundne calciumioner og muligvis andre divalente metal kationer er et kritisk step i HIER-teknikken. Som en konsekvens af dette må det antages, at en medvirkende årsag til maskering af epitoper er en tæt kompleksbinding af calciumioner og/eller andre divalente metal kationer til antigener (proteiner) under NBF-fiksering. Undersøgelsen viste med Ki67-antigenet og mab MIB1 som udgangspunkt, at stærke kompleksbindere som EGTA og EDTA anvendt ved ph 8 er mere effektive til epitopdemaskering end den noget svagere kompleksbinder citrat. EDTA s effektivitet på NBF- og B5-fikseret materiale er tydeligt blevet dokumenteret af Pileri et al. (72) Ud af 55 antistoffer, der kræver HIER, gav 1mM EDTA ph 8 i sammenligning med Tris-HCl ph 8 og citratbuffer ph 6 de bedste resultater med de 49. Siden 1996 er 2 modifikationer af Morgan s EGTA/EDTA-HIER metode, gennem 2 uafhængige udviklingsarbejder, blevet rutine-demaskeringsmetode for flere og flere antistoffer. Brugen af T-EG buffer ph 9 (10mM Tris-base + 0,5mM EGTA) udspringer fra Patologisk Institut i Odense, mens TE buffer ph 9 (10mM Tris-HCl ph mm EDTA) stammer fra Patologisk Institut i Aalborg. De 2 buffere er uhyre effektive og giver stort set identiske resultater. I direkte sammenligning på 33 forskellige rutineantistoffer har T-EG buffer ph 9 og 1mM EDTA ph 8 givet noget nær den samme meget effektive demaskering (4). En uheldig egenskab, T-EG/TE bufferne deler med 1mM EDTA ph 8 og 0,1M Tris-HCl ph 10, er en voldsom forstærkning af falsk positiv reaktion som følge af endogen biotin. EGTA/EDTA-holdige buffere og Tris-- HCl ved højt ph er alle meget effektive til at demaskere endogen biotin. Det skal dog understreges, at problemet synes mindre med T-EG/TE end med 1mM EDTA ph 8. Dette sammen med en lidt bedre morfologi er de vigtigste argumenter for at vælge T-EG- eller TE-bufferen fremfor 1mM EDTA ph 8. Mange af de større antistofproducenter fremstiller og sælger HIER-buffere produceret ud fra mere eller mindre hemmelige recepter. Med én undtagelse synes ingen af disse miksturer at kunne noget i HIER-henseende, som ikke kan opnås ved anvendelse af T-EG/TE buffer, citrat buffer eller Tris-HCl buffer ved ph 1 eller ph 10. Undtagelsen er DakoCytomations Target Retrieval Solution, ph 6,1 kode S1699/S1700 (TRS). Denne modificerede citratbuffer er med de fleste antistoffer mere effektiv med hensyn til demaskering end standard citratbuffer ph 6. Til gengæld er den overfor de fleste antistoffer langt mindre effektiv end specielt T-EG/TE buffer og Tris-HCl ph 10. Når TRS alligevel er værd at nævne, skyldes det, at det for et mindre antal antistoffer har vist sig, at være den eneste HIER buffer, der giver brugbare resultater (4, 74). Blandt disse antistoffer kan nævnes: anti-cd5, klon Leu-1; anti-cd21, klon 1F8; anti-cd27 klon 137B4; antiepithelial antigen, klon Ber-EP4; antiepithelial-related antigen, klon MOC-31; antiepidermal growth factor receptor, klon E30, og anti-serotonin, klon 5HT-H209. TRS har på nuværende tidspunkt været testet på i alt ca. 350 forskellige primære antistoffer. I godt 20 tilfælde er de bedste resultater opnået med netop TRS (4). TRS bør derfor indgå i det batteri af buffere, som afprøves når et nyt antistof tages i anvendelse (se afsn ). TRS er dyrere end både citrat og T-EG/TE buffer. Dog kan opløsningen angiveligt genbruges op til 20 gange (74). Flere studier har vist, at en kombination af proteolytisk forbehandling og HIER for nogle epitoper giver en mere effektiv demaskering, end hvis HIER eller proteolyse anvendes alene (74). Lignende fund er gjort i eget laboratorium (4). En del diagnostisk vigtige muskelmembran relaterede antigener er vanskellige at detektere tilfredsstillende i paraffinsnit. Epitoper på nogle af disse antigener har gavn af kombinations-demaskeringer som angivet i Tabel 2.2. Følgende antistoffer giver de bedste resultater med mild proteolyse efterfulgt af HIER i T-EG buffer (teknik 11): Anti-dystrophin klon DY4/6D3 og klon 34C5; anti-sarcoglycan delta, klon δ-sarc/12c1; anti-myosin neonatal, klon WB-MHCn; antisarcoglycan beta, klon β-sarc/5b1; antisarcoglycan gamma, klon 35DAG/21B5; antispectrin, klon R8C2/3D5. Følgende antistoffer giver til gengæld de bedste resultater hvis HIER i citrat ph 6 efterfølges af mild proteolyse (teknik 12): Anti-caveolin 3, klon 26;

17 Anvendt immunhistokemi 25 anti-dysferlin, klon Ham1/7B6; anti-laminin alfa5, klon 4C7; anti-myosin developmental, klon RNMy2/9D2 og anti-sarcoglycan alfa, klon Ad1/20A6. Det er således ved kombinationsdemaskeringerne ikke ligegyldigt, hvilken HIER buffer der anvendes, og hvilken rækkefølge de 2 demaskeringer gøres i! Både for HIER-teknikken og den proteolytiske forbehandling gælder, at der er en teoretisk risiko for at introducere nye krydsbindende sites i det forbehandlede væv. I praksis har det vist sig, at der sjældent introduceres krydsbindinger, der volder fortolkningsmæssige problemer. Forinden et nyt antistof med tilhørende epitopdemaskeringsteknik tages i brug i rutinesammenhæng, er en kritisk vurdering af positive reaktioner nødvendig, herunder evt. sammenligning med resultater opnået på frysesnit af de samme væv. For pabs skal man også være opmærksom på, at forskellige demaskeringsteknikker kan favorisere forskellige af antistoffets kloner. Man kan således opleve, at S-100 pab giver forskellige farveresultater efter proteolytisk og HIER forbehandling: Mens de fleste celler viser samme farveintensitet uanset forbehandlingen, vil nogle, fx follikulære dendritiske celler ved de almindeligt anvendte antistofkoncentrationer være S-100 negative efter proteolytisk forbehandling, men positive efter HIER. Tilsvarende forskel er set efter farvning af forskellige tumorer, fx gastrointestinal stromal tumor. HIER på cytologisk materiale Brugen af HIER-teknikken er ikke begrænset til paraffinsnit. Også inden for cytologien er der store anvendelsesmuligheder. Reynolds et al (30) fandt på smears og imprints, at reaktionen for 12 af 14 antistoffer kunne forstærkes ved HIER efter formalinfiksering. Blandt antistofferne, der gav kraftigere reaktioner, var vigtige antistoffer som anti-erα, klon 1D5; anti-p53, klon PAb1801; anti-c-erbb2, pab; anti-cd20, klon L26; og anti-cd45 (LCA), klon 2B11 og PD7/26. Undersøgelser i Odense og Aalborg føjer yderligere til denne liste: anti-pgr, klon ICA og klon PgR636; anti-cyclind1, klon P2D11F11; og anti-ki67, klon MIB1, anti-vimentin, klon 3B4, anti-pan-ck, klon AE1/AE3, antimelanosoma specific antigen, klon HMB45; og anti-melan A, klon A103. Undersøgelserne viste også, at de bedste resultater som regel opnås på cytologisk materiale efter NBF fiksering, og at fikseringstid bør være minimum 15 min. Ved kortere fikseringstid i NBF eller ved brug af svagere fiksativer som acetone og etanol er der en risiko for tab af cytologiske detaljer. Det gælder for det cytologiske materiale som for det histologiske, at der med alternative kogemedier kan opnås yderligere forbedringer sammenlignet med citratbuffer. Kogning i TRS giver for mange antistoffer betydeligt bedre resultater end citrat. Anvendes T- EG/TE buffer kan opnås yderligere forbedring mht demaskerende effekt. Desværre er den cytologiske bevaringsgrad efter kogning i en af disse buffere ikke god. Foretages demaskering i stedet ved lavere temperatur svarende til TEG95 protokollen (se nedenfor vedr. HIER protokoller) opnås foruden en yderst effektiv demaskering også god cytologisk bevarelse. I TEG95 protokollen bringes T-EG bufferen i kog i MBO, hvorefter bufferen tages ud af ovnen og prøvematerialet anbringes i den varme buffer 15 min. Specielt gode resultater er bl.a. opnået med anti-pgr, klon PgR 636; anti-erα, klon 1D5 og klon 6F11; anti-tyrosinase, klon T311; anti-ttf-1, klon SPT24 og anti-synaptophysin klon snp88 (4). Væskebaseret cytologi (Liquid based cytologi, LBC) vinder i disse år mere og mere indpas indenfor patologien. I stedet for manuelt at udstryge prøvematerialet opsamles det i en alkoholbaseret præserveringsvæske, hvorfra der maskinelt kan produceres meget ensartede aftryk (ThinPrep eller AutoCytePrep), som efter alkoholfiksering (96% etanol eller spray-fix) kan anvendes til analyse. Teknologien er primært udviklet til cervix-cytologisk materiale, men kan anvendes til de fleste cytologiske materialer. Immuncytokemiske undersøgelser kan med fordel udføres på ThinPrep og AutoCytePrep. En forudsætning er naturligvis for de enkelte antistoffer at finde de optimale fikserings- og HIERbetingelser. Forsøg i eget laboratorium med 21 diagnostiske rutineantistoffer og 6 forskellige fikserings-hier protokoller viste, at TEG100 protokollen for de 19 antistoffer gav klart de bedste resultater. Blandt de 19 antistoffer var anti-erα, klon 6F11; anti-ki67, klon MIB1; anti-ttf1, klon SPT24; anti-ck, klon AE1+AE3: anti-vimentin, klon V9; anti- CD45, klon 2B11+PD7/26. Cellernes ophold (fra timer til dage) i præserveringsvæsken og den efterfølgende alkoholfiksering nødvendiggør en mere effektiv HIER behandling end blot kogning i citratbuffer eller behandling i 95 C varm T-EG buffer. I TEG100 protokollen koges materialet 15 min i T-EG buffer. Den forlængede fiksering i alkohol gør, at den cytologiske bevaringsgrad af cellerne er god, selv efter kogning i T-EG buffer. HIER teknikken kan også med nogen succes anvendes som forbehandling til immuncytokemiske undersøgelser på Papanicolau- eller Giemsafarvede smears. HIER er i stand til at demaskere en del antigener i de farvede smears, samtidig med at den er effektiv til at affarve cellerne. Identifikation af Ki67- antigenet med klon MIB1 i Papanicolaufarvede smears har bl.a. vist sig nyttig til at skelne mellem normale celler og carcinoma in situ i atrofiske cervix smears (31). For at bevare cytologiske detaljer i smearet anbefales det at fiksere de rehydrerede celler i 4% NBF i 15 min. før HIER iværksættes (4).

18 26 Immunhistokemisk teknik Tabel 2.1: Test-battery til screening for optimal HIER-teknik, efter Shi et al. (73). Buffer a ph1 ph6 ph10 120ºC, 10 min b Snit#1 Snit#4 Snit#7 100ºC, 10 min. Snit#2 Snit#5 Snit#8 90ºC, 10 min. Snit#3 Snit#6 Snit#9 a 10mM Tris-HCl anvendes ved ph 1, 10mM Citrate ved ph 6 og 100 mm Tris-HCl ved ph 10. b 120ºC opnås ved hjælp af autoklave eller trykkoger. Samme effekt kan opnås ved forlænget MBO-kogning (20 min.). I tidligere Giemsa farvede præparater er mange antigener specielt vanskelige at påvise. Her kan citratbufferen med fordel erstattes med TE/T-EG buffer. Tilfredsstillende resultater er således opnået på Giemsapræparater med anti-ki67, klon MIB1; og anti-erα, klon 1D5; efter 15 min. MBO-kogning i T-EG buffer (med forfiksering 15 min. i 4% NBF). Der er dog ved denne teknik risiko for falsk negative reaktioner, som kan være vanskelige at identificere! HIER og standardisering Med introduktionen af varmebaseret epitop demaskering først i 90 erne og specielt med lanceringen af den citratbuffer-baserede teknik syntes mulighederne gode for en øget standardisering indenfor immunhistokemien. Der var en overgang et begrundet håb om, at én standard HIER procedure kunne konstrueres. Denne skulle udviske alle fikseringsprocedurens varierende påvirkninger (maskeringer) af antigene epitoper og hermed fjerne et væsentlig grundlag for de resultatmæssige uoverensstemmelser, som den immunhistokemiske litteratur desværre er præget af. Nu 5-6 år senere synes udviklingen ikke entydigt at have bragt os nærmere en standard HIER teknik, der kan bruges til alle antistoffer - tværtimod er udbuddet af HIER modifikationer næsten endeløs. Når vi alligevel i dag er tættere på en vis form for standardisering indenfor HIER-teknikkerne end for 5-6 år siden, skyldes det især et par forskergruppers ihærdige og metodiske arbejde med at afdække de enkelte parametres betydning for HIER-teknikken (27,29). I dag bør HI- ER-standardiseringen tage udgangspunkt i, at der ikke findes én HIER metode, der er optimal for alle antistoffer (epitoper). I stedet bør de enkelte laboratorier i højere grad standardisere måden hvorpå de tester nye (og gamle!) antistoffer på. Shi et al (70, 73) anbefaler at HIER-standardisering tager udgangspunkt i at fastlægge, hvad de betegner som maximal retrieval (maksimal demaskering) for et givet antistof ved hjælp af et HIER test-battery omfattende de vigtigste HIER parametre: ph, temperatur og tid (Tabel 2.1). Den HIER-teknik, der giver maximal retrieval, bør herefter anvendes rutinemæssigt til det pågældende antistof. Et lignende test-batteri har været i brug i eget laboratorium siden 1996 med succes (Tabel 2.2). Test batteriet til sceening for optimal epitop retrieval indeholder foruden de vigtigste elementer fra Shi s test batteri også non-hier teknikker og vigtige HIER parametre ( bl.a. calcium kompleksbinding), der ikke er med i Shi s initiale batteri. HIER protokoller - MBO-teknik Protokol A - Traditionel cyklisk kogning af 1 slideholder (24 glas). 1. Snit anbringes i grå 24 stk s Tissue Tek slideholders. Evt. tomme pladser fyldes med blanke objektglas. Slideholder anbringes i Tissue-Tek farveskål med 250 ml kogemedium. 2. Farveskål med snit anbringes centralt i mikrobølgeovnen. Der koges 5 min. med effekt på W 3. Fordampet medium erstattes ved efterfyldning med destilleret vand. Der koges 5 min. 4. Trin 3 gentages (ved forlænget kogetid gentages trin 3 det nødvendige antal gange). 5. Efter kogning anbringes kogemedium med snit på bordet til nedkøling 15 min. 6. Skyl i buffer og fortsæt farvningsproceduren. Protokol B - Kogning af 3 slideholders (72 glas). Protokol B foretages med 3 fyldte Tissue Tek slideholders i 3 Tissue Tek farveskåle med 250 ml kogemedium. Protokol B gør det muligt at foretage 3 forskellige kogeprocedurer på én gang. Det være sig kogning i 3 forskellige buffere eller kombinationen af 2 farveskåle med en rutinemæssig 15 min. kogning og 1 farveskål med en forlænget 25 min. kogning. I tilfælde hvor der ikke er behov for 3 farveskåle med kogebuffer, fyldes der op med farveskål(e) med dest vand og slideholder(s) med blanke glas således, at mængden af kogemedium og glas altid er den samme. Protokol B kræver at mikrobølgeovnen er udstyret med drejeplade. 1. Snit anbringes i grå 24 stk s Tissue Tek slideholders. Evt. tomme pladser fyldes med blanke objektglas. Slideholder anbringes i Tissue-Tek farveskål med 250 ml kogemedium. 3 farveskåle anbringes perifert på drejepladen i mikrobølgeovnen, som angivet på figuren. 2. Start mikrobølgeovnen på fuld effekt ( W) med drejepladen aktiveret. Notér tidspunktet for hvornår kogemedierne kommer i kog. Dette gøres de første gange metoden bruges, herefter kendes opvarmningtiden, der er nødvendig for den enkelte ovn. Denne tid kan bruges efterfølgende. For en Moulinex Y51 med effekt 900W skal bruges 11 min. for at bringe 3 farveskåle i kog.

19 Anvendt immunhistokemi Når alle 3 kogemedier er bragt i kog, nedsættes effekten således, at væskerne simrekoger, kogningen fortsætter i 15 min. For hver enkelt mikrobølgeovn må dette effekttrin fastlægges via forsøg med blanke glas. Målet er, at væskerne koger mest muligt uden at koge for meget over (tab af væske). For en Moulinex Y51 er det optimale effektrin for simrekogning 400W. 4. Efter kogning anbringes kogemedium med snit på bordet til nedkøling 15 min. Fortsæt til trin En evt. farveskål med snit, der skal koges 25 min., flyttes nu til midten af ovnen og der koges yderligere 10 min. på et extra nedsat effektrin (skal igen fastlægges via forsøg for den enkelte ovn). For en Moulinex Y51 er det optimale effekttrin 170W. 6. Efter kogning anbringes kogemedium med snit på bordet til nedkøling 15 min. 7. Skyl i buffer og fortsæt farvningsproceduren. Protokol C - 24 timers Low-temperature HIER 1. Snit anbringes i grå 24 stk s Tissue-Tek slideholder. Evt. tomme pladser fyldes med blanke objektglas. Slideholder anbringes i Tissue-Tek farveskål med 250 ml kogemedium. 2. Farveskål med snit anbringes i varmeskab ved 60 C. Inkubationtid 24 timer. 3. Efter varmebehandlingen anbringes farveskål med snit på bordet til nedkøling 15 min. 4. Skyl i buffer og fortsæt farvningsproceduren. NBF-HIER protokoller til cytologisk materiale Citrat protokol og TRS protokol 1. NBF 4% 15 min 2. Ethanol 96% skyl 15 sek 3. Ethanol 96% 10 min 4. Rindende vand 5 min 5. Kogning i citratbuffer eller TRS 15 min (Protokol B) TEG100 protokol 1. NBF 4% 15 min 2. Ethanol 96% skyl 15 sek 3. Ethanol 96% 10 min 4. Rindende vand 5 min 5. Kogning i T-EG buffer 15 min (Protokol B) TEG95 protokol 1. NBF 4% 15 min 2. Ethanol 96% skyl 15 sek 3. Ethanol 96% 10 min 4. Rindende vand 5 min 5. Demaskering i T-EG buffer ved 95 C (a) 15 min (a) Objektglas anbringes i grå 24 stk s Tissue-Tek slideholder. Evt. tomme pladser fyldes med blanke objektglas. 250 ml T-EG buffer i Tissue-Tek farveskål bringes til kogning i mikrobølgeovn. Farveskålen fjernes fra ovnen og stilles på bordet og slideholder med præparaterne anbringes straks i den varme buffer (ca. 95 C). Efter demaskering skylles i rindende vand. Dehydreringen/fikseringen i ethanol efter NBF betyder, at chromogen-udfældningen i cellerne bliver mere homogen (ligner hvad der opnås på paraffinsnit) end, hvis dette trin udelades. Uden ethanol bliver reaktionsproduktet specielt med AEC meget granulært! Udvalgte HIER buffere T-EG buffer ph 9, 10mM+0,5mM Tris (Sigma T-1378) 1,211 g EGTA Titriplex VI (Merck 8435) 0,190 Dest. vand Opløsningen behøver ingen ph-justering. ph er normalt mellem 8,95 og 9,1 TE buffer ph 9, 10mM+1mM Tris (Sigma T-1378) EDTA Titriplex III (Merck 8418) Dest. vand Opløsningen behøver ingen ph-justering. ph er normalt mellem 8,90 og 9,05 Citrat buffer 10mM, ph 6 Citronsyre, monohydrat Dest. vand ph justeres til 6,0 med 2M NaOH. Tilsæt destilleret vand til EDTA 1mM, ph 8 EDTA Titriplex III (Merck 8418) Dest. vand ph justeres til ph 8,0 med 1M NaOH. 2.7 Blokering af uspecifik antistofadhæsion 1000 ml 1,211 g 0,372 g 1000 ml 2,1 g 00 ml 1000 ml 0,372 g 1000 ml Såkaldt uspecifik baggrundsfarvning kan i visse tilfælde volde problemer i immunhistokemiske teknikker. Problemet ses oftest ved anvendelse af pab med ringe aviditet ( affinitet ). Årsagen til denne baggrundsfarvning er, at immunglobuliner udover den specifikke interaktion med antigene epitoper også er i stand til at binde sig til vævsproteiner ved hjælp af svagere, uspecifikke bindinger. Antistofmolekyler vil specielt kunne adhærere til vævssnittet gennem elektrostatisk tiltrækning og hydrofob interaktion. Den traditionelle måde at imødegå uspecifik antistofadhæsion er dels gennem forbehandling med blocking protein og dels tilsætning af blocking protein til antistofopløsningerne.

20 28 Immunhistokemisk teknik Ved at præinkubere med proteinopløsning opnås en blokering af vævsproteinernes mulighed for bl.a. hydrofob interaktion med antistofmolekyler. Valg af proteinopløsning er naturligvis vigtig. Proteinet skal være i stand til at konkurrere effektivt med IgG-molekyler med hensyn til hydrofob interaktion. Tidligere anvendtes næsten udelukkende sera fra ikke-immuniserede dyr ( normal sera ) til denne forbehandling. Betydningen af denne forbehandling er aftaget i takt med udviklingen af bedre antistoffer og visualiseringsteknikker. I nogle tilfælde ses normalserum faktisk at give en forøgelse af baggrundsfarvningen! I dag anvendes i vid udstrækning bovint serum albumin (BSA), casein opløsninger og/eller detergentia (fx Triton X-100 og Tween 20), ikke alene som forbehandling, men også som tilsætning til fortynderbuffere. Casein synes specielt at være et godt og effektivt universalmiddel til blokering af uspecifik antistofadhæsion (32). Protokoller til blokering af uspecifik antistofadhæsion: 1. Casein 0,5 % i PBS eller TBS min. eller 2. Normal serum, 5 % i PBS eller TBS 10 min. eller 3. BSA, 2 % i PBS eller TBS 10 min. eller 4. Detergent (Tween 20 eller Triton X-100), 0,25 % - 1 % i PBS eller TBS 10 min. Ved brug af mabs og gode oprensede pabs (Ig-fraktion eller bedre) i de gængse detektionssystemer er BSA forbehandling eller grundig vask i buffer med detergent (jvf. protokol 4) sædvanligvis fuldt tilstrækkeligt. Disse forbehandlinger kombineres sædvanligvis med tilsætning af 1 % BSA til antistof opløsningerne. Anvendes fuldsera antistoffer eller benyttes ekstremt følsomme detektionssystemer som TSA (afsn ) stilles ofte større krav til blokering af antistof-adhæsion. I disse tilfælde bør casein anvendes. Blokering af Fc-receptorer Fc-receptorer er membranproteiner, der binder sig til Fc-delen på antistofmolekyler med en forholdsvis høj bindingsstyrke. Fc-receptorer findes fortrinsvis på granulocytter og makrofager. Uspecifik baggrundsfarvning på grund af antistoffers binding til Fc-receptorer ses normalt ikke på paraffinsnit. Formalinfiksering og vævspræparation ændrer Fc-receptorerne, således at de normalt ikke længere er i stand til at binde antistofferne. På acetonefikserede frysesnit og cytologisk materiale kan problemet til gengæld ses. Generelt volder det ikke de store problemer, men i makrofag-rige cytologiske materialer såsom bronkio-alveolær lavage (BAL) væsker kan den Fc-receptor betingede reaktion være generende. Problemet er især tydeligt, hvis der anvendes mabs af subklasserne IgG2a (fx anti-cd20, klon L26; og anti-ck20, klon Ks20.8) eller IgG3. Dette skyldes, at især disse subklasser af muse IgG bindes til visse humane Fc-receptorer (52). Problemet med Fc-receptorer kan undgås ved at anvende F(ab )2 fragmenter af antistofferne (både primære og sekundære antistoffer) i stedet for hele IgG-molekyler. En simpel alternativ løsning på problemet, der normalt virker tilfredsstillende, er at forbehandle med 5% humant immunglobulin inden inkubation med primært antistof. Fc-receptorerne i prøvematerialet binder Ig og blokeres herved. I visse tilfælde kan det være nødvendigt også at inkludere 1% humant Ig i antistofopløsningerne. 2.8 Primært antistof Valg af antistof Udbudet af kommercielle antistoffer er enormt, og der kommer hver dag nye til. Det kan derfor være vanskeligt at vælge hvilke(t) antistof(fer), man skal købe til påvisning af et givet diagnostisk interessant antigen. Gennem opslagsværker som Linscott s Directory (33) og Manufacture s Specifikations & Reference Synopsis ( MSRS ) (34) vil det være muligt at få et rimeligt overblik over udbudet og hvem, der producerer/forhandler de pågældende antistoffer. På trods af opdateringsblade mv. forældes disse opslagsværker hurtigt. On-line versionerne på internettet er derfor at foretrække. På denne adresse finder man MSRS s on-line database med data på mere end kommercielle primære antistoffer. Databasen er brugervenlig med i alt 11 forskellige søgefelter. Den opdateres løbende og kan på trods af et årligt abonnement på 98 USD anbefales. En gratis demo-version af databasen er tilgængelig på samme adresse. Linscott s Directory s on-line version findes på adressen: Databasen indeholder mere end forskellige produkter, overvejende primære antistoffer. Det koster på årsbasis 75 USD at abonnere på den service. En gratis demoversion af databasen er tilgængelig på adressen. Databasen er ikke så stor og knap så brugervenlig som MSRS databasen. Til gengæld indeholder den andet end primære antistoffer. Blandt internettets mange gratis glæder findes også mange websites, der mere eller mindre er helliget antistoffer og immunhistokemi. Blandt disse kan følgende varmt anbefales:

21 Anvendt immunhistokemi 29 SciQuest er et internetfirma, der har specialiseret sig i formidling af køb og salg af Scientific Products. På firmaets website: findes on-line databasen AntibodyResource med mere end antistoffer fra de fleste større antistofproducenter. Tjenesten er gratis, men kræver log in med bruger id og password. Firmaet abcam, der bl.a. lever af at sælge antistoffer over internettet, har en meget kraftfuld søgetjeneste, der ikke alene søger hos abcam selv, men også i andre antistofproducenters online kataloger. Denne søgemaskine er meget enkel og populær. Et par meget brugbare databaser hver med antistoffer findes hos: BioCompare: LabVelocity: Bag adressen: gemmer sig en privat hjemmeside med et væld af nyttige links til andre internetadresser med antistoffer som hovedemne. Der er således links til mere end 250 on-line firmaer, der sælge antistoffer. Hos de fleste af disse firmaer er det muligt via lokale databaser at finde datablade og andre oplysninger frem på firmaets produkter. Også adressen giver mulighed for at finde antistoffer i forbindelse med opstilling af immunhistokemiske algoritmer. Den er gratis at bruge, men kræver password (der fås på samme adresse). På NordiQC s hjemmeside: publiceres resultaterne af de kvalitetssikrings runder, som IHC-laboratorier i Norden tilbydes at deltage i. Hvert år tilbydes 3 runder, hver med detektion af ca. 5 forskellige epitoper. Hjemmesiden indeholder en hastigt voksende database med detaljerede beskrivelser af diagnostisk vigtige epitoper. Optimale protokoller fra de enkelte kvalitetssikringsrunder kan frit downloades. Denne hjemmeside er et must for laboratorier, der beskæftiger sig med diagnostisk immunhistokemi. Med datablade, litteratur-referencer og anden information om de pågældende antistoffer i hånden er det så op til den enkelte bruger at vurdere, hvilke af antistofferne der kan være brugbare til den påtænkte applikation. Blandt de brugbare antistoffer skal herefter vælges det bedste antistof. Det sidste er ofte umuligt at få en uvildig vurdering af. Er ressourcerne tilstede, er det bedste, man kan gøre, at kontakte producenterne med henblik på at få en lille gratis prøve. Man kan således uden omkostninger til antistof-indkøb teste og eventuelt sammenligne flere forskellige antistoffer mod det antigen, der ønskes undersøgt Afprøvning af antistoffer Erhverves et nyt antistof, skal der altid foretages en grundig afprøvning, inden det anvendes i diagnostisk sammenhæng. Der bør være to klare mål med afprøvningen af antistoffet: 1. Procedureteknisk optimering (fortynding, epitop demaskering, fiksering, mv). 2. Vurdering af antistoffets reaktivitet og specificitet. Afprøvningen af antistoffet bør foretages med det eller de detektionssystemer, som laboratoriet normalt anvender og tage udgangspunkt i de præparationstyper, som antistoffet tænkes anvendt på. Paraffinsnit vil i de fleste tilfælde være det primære applikationsområde, alligevel må det anbefales også at inkludere frysesnit af relevante væv, især når det drejer sig om antistoffer, der ikke er veldokumenterede. Dette åbner mulighed for en sammenligning af resultaterne på de to forskellige præparationstyper. Det er selvfølgelig vigtigt, at reaktiviteten af antistoffet er den samme på de to præparationstyper. Er dette ikke tilfældet, skal det registreres og årsagen evt. findes. I praksis vil en del antistoffer give svagere reaktioner på paraffinsnit end på frysesnit. Ligeledes vil nogle antistoffer give svagere reaktioner på cryosnit end på paraffinsnit. Et mindre antal nyere mabs (bl.a.: anti-cd5, klon 4C7; anti-cd2, klon AB75; anti-cd13, klon 38C12 og anti-cd14, klon 7), der fungerer godt på paraffinsnit, kan således ikke anvendes på cryosnit. Intensitetsforskelle i reaktionen i de to præparationstyper er i sig selv ikke nødvendigvis nogen katastrofe. Det vigtigste er, at der opnås det samme reaktionsmønster på de to præparationstyper (de samme celler/- strukturer skal være positive/negative) og at reaktionsmønstret sammenholdes med og fortolkes i sammenhæng med de i litteraturen beskrevne resultater. Materiale til antistofafprøvninger 1. Paraffinsnit af multiblokke/tissue microarrays 2. Frysesnit 3. Cytologisk materiale.

22 30 Immunhistokemisk teknik Anvendelsen af større multiblokke (35-38) eller tissue microarrays (91) giver gode muligheder for på én gang at optimere den tekniske brug af antistoffet og samtidig vurdere antistoffets reaktivitet overfor en lang række normale og patologiske væv. Anvendelse af multiblokke i afprøvningen af nye antistoffer er derfor meget vigtig. Parametre til afprøvning på paraffinsnit 1. Fikseringstiden i NBF (6-168 timer) 2. Epitop demaskering. Medtages tonsilvæv fikseret henholdsvis 6, 24, 48 og 168 timer i multiblokkene, er det muligt for de fleste antigeners vedkommende at undersøge fikseringstidens betydning for antigenisiteten. Et brugbart alternativ til tonsilvæv er fx tyndtarm. Det er uhyre vigtigt at få fastlagt den optimale epitop demaskering for alle nye antistoffer (Tabel 2.2 og afsn ). Parametre til afprøvning på frysesnit og cytologisk materiale a. Acetone 10 min. b. 4% NBF 2-30 min. c. Acetone/metanol (1:1) sek. d. På cytologisk materiale bør NBF-fiksering kombineret med detegent forbehandling (se afsn ) og NBF-fiksering kombineret med HIER (se afsn ) også afprøves. På frysesnit og cytologisk materiale er det vigtigt at finde den fikseringsprotokol og forbehandlingsprotokol, der giver de bedste resultater med det pågældende antistof. De nævnte fikseringer samt producentens anbefalede protokol bør som minimum afprøves. Opnås der ikke tilfredsstillende resultater med en af disse protokoller, må alternative fiksativer undersøges (se afsn ) Antistof-inkubation Inkubation med primært antistof og de øvrige immunoreagenser foregår normalt ved at pådryppe horisontalt lejrede materialer en passende mængde reagens (50-200µl). Før antistoffet appliceres, tørres overskydende væske bort omkring materialet og der etableres evt. en hydrofob barriere ved hjælp af fedtstift (DAKO-Pen eller lignende). Den hydrofobe barriere sikrer, at antistoffet ikke løber af. For at undgå fordampning og udtørring skal inkubationen foregår i fugtkammer. Materialet må på intet tidspunkt udtørre. Selv udtørring af paraffinsnit umiddelbart efter endt afparaffinering har vist en tydelig negativ effekt på flere membranlokaliserede antigener. Den traditionelle dråbe-inkubation er, på grund af den gentagende håndtering af det enkelte præparat, meget arbejdskrævende, men kan ikke for det primære antistof undgås uden automatisering (se nedenfor). Derimod kan man ved daglig farvning af store batches opnå en rationalisering ved at applicere detektionssystemet via farvevugger (racks) i større farveskåle (39,40). Automatisering Automatisering af hele farvningsproceduren er selvfølgelig den ultimative løsning på den omfattende håndtering af præparaterne. Mange firmaer tilbyder forskellige løsninger, der automatiserer mere eller mindre af farvningsproceduren. Fire firmaer dominerer pt verdensmarkedet for immunostainers: Bio- Genex, LabVision, Ventana og Dako- Cytomation. LabVision og DakoCytomations AutoStainer og BioGenexs i6000 minder meget om hinanden. Begge er åbne systemer, der arbejder med horisontalt lejrede objektglas og en computerstyret robotarm med dispensor, der applicerer alle immunoreagenserne. Fælles for disse immunostainers er desuden, at de ikke kræver specielle reagenser eller utensiler. Kapaciteten på instrumenterne er moderat: BioGenex i6000 kan håndtere 60 objektglas. DakoCytomations Autostainer klarer 48 glas ad gangen, mens LabVisions Autostainer fås til 36, 48 eller 72 glas. Eridan - et helt nyt fuldautomatisk instrument fra DakoCytomation med introduktion i fås med en kapacitet på 60 glas. Ventana har flere instrumenter: TechMate500, NexES, BenchMark og Discovery. BenchMark og Discovery er avancerede instrumenter med en kapacitet på henholdsvis 30 og 20 glas. Kapaciteten er ikke høj, til gengæld kan hele den immunhistokemiske protokol (og ISH protokoller) automatiseres. Begge instrumenter har separat temperaturregulering af objektglas, hvilket gør såvel afparaffinering som epitopdemaskering mulig. Ulempen ved disse instrumenter er dels, at man mere eller mindre er bundet til at bruge Ventanas reagenser, hvilket betyder, at analyseprisen bliver noget højere end på de konkurrerende åbne systemer, dels har vanskeligere ved at optimere sine protokoller. TechMate500 er en helt anden type instrument. TechMate500, der i Europa tidl. blev forhandlet af DakoCytomation, virker efter kapillærprincippet (7). Dette system kræver, at vævssnit eller cytologisk materiale monteres på specielle capillary gap slides, og at man bruger specielle pads (filtrerpapir) til at fjerne immunoreagenser fra kapillærrummet igen. Nødvendigheden af specielle glas og pads er med til at fordyre analysen på dette instrument. TechMate500 er i stand til

23 Anvendt immunhistokemi 31 samtidigt at håndtere 2-4 slideholders med hver max. 60 glas. Farvningskapaciteten er med andre ord væsentlig højere på Tech- Mate500 end på de øvrige instrumenter. Hvilken immunostainer, et laboratorium bør vælge, hænger naturligvis sammen med laboratoriets størrelse og struktur, samt hvor mange og hvilke analyser maskinen dagligt skal udføre Antistoftiter, inkubationstid og temperatur Den optimale antistoftiter (fortynding) er - foruden detektionssystemet (se afsn. 2.10) og kromogenet (se afsn. 2.11) - stærkt afhængig af inkubationstiden, samt af den temperatur hvorved inkubationen foregår. Mange laboratorier inkuberer min ved stuetemperatur, nogle bruger timer (natten over) ved 4 C. Der er en klar økonomisk fordel at inkubere længere end 30 min, idet de fleste antistoffer kan fortyndes yderligere. Fortyndingen ved 30 min s - inkubation kan multipliceres med 2-5 ved forøgelse af inkubationstiden til 1-2 timer, og med 4-10 ved 16 timers inkubation. Ydermere vil signal/støjforholdet, specielt for mange pabs, forbedres betydeligt ved længere inkubation. Den yderligere fortynding af antistoffet nedsætter nemlig risikoen for uspecifik adhæsion til vævsproteiner. Endelig medfører en længere inkubationstid, at den variation i inkubationstiden, der nødvendigvis opstår ved manuel pådrypning af antistof, får relativt mindre betydning. Fordelen ved at anvende en relativt kort inkubationstid er naturligvis, at immunfarvningen kan færdiggøres hurtigere, ideelt samme dag som den er rekvireret. Da de fleste immunostainere samtidig fungerer bedst med inkubationstider på maksimalt 60 min, er det ikke overraskende, at de fleste diagnostiske rutinelaboratorier anvender inkubationstider på min. Inkubationstider på væsentligt under 30 min. kan opnås ved at hæve inkubationstemperaturen til 37 C eller mere - ikke alene for det primære antistof, men også for visualiseringssystemet. Dette kan dog være forbundet med en større risiko for uspecifik baggrundsfarvning. Interessen for at nedsætte inkubationstiden til et minimum er tæt forbundet med ønsket om - i specielle tilfælde - at kunne supplere traditionel frysesnitsundersøgelse med immunhistokemi. Listen over hasteteknikker, der kan anvendes peroperativt, er forholdsvis lang. Blandt de mest interessante er klart metoderne fra Chilosi et al. (41) og Kämmerer et al. (83). Chilosi s teknik er en simpel og hurtig ét steps metode, der bygger på anvendelsen af Enhanced Polymer One-step Staining (EPOS, se afsn ) reagenser og opvarmning i mikrobølgeovn. Teknikken Tabel 2.3: Fortyndervæsker til primære antistoffer a. 1% BSA i 0,05 M tris-hcl-buffer ph 7,4 med 0,15 M NaCl og 15 mm Na-azid. b. 1% BSA i 0,05 M tris-hcl-buffer ph 6,0 med 15 mm Na-azid. c. 1% BSA i 0,05 M tris-hcl-buffer ph 8,6 med 15 mm Na-azid. d. 1% BSA i 0,05 M tris-hcl-buffer ph 7,4 med 0,50 M NaCl og 15 mm Na-azid. e. 0,5% Casein i 0,05 M tris-hcl-buffer ph 7,4 med 0,15 M NaCl og 15 mm Na-azid. f. 1% BSA i 0,05 M tris-hcl-buffer ph 7,4 med 0,075 M NaCl og 15 mm Na-azid. Detergent i form af Tween20, 0,05%-0,1% kan med fordel tilsættes. gør det muligt på frysesnit fx at skelne lymfomer fra lavt differentierede carcinomer ved hjælp af CD45- og CK-farvninger udført på under 10 min! Ulempen ved metoden er, at den i sagens natur kun kan udføres med primære antistoffer, der findes i EPOS format (kun ca. 30 forskellige primære antistoffer findes i EPOS format). Kämmerer et al. s metode er en 2-lags EnVision+ baseret metode (se afsnit ) og dermed langt mere fleksibel, hvad angår valgt af primære antistoffer. Alle inkubationer foregår på varmeplade ved 37 C. Herved nedbringes den samlede farvetid til ca. 15 min. I forhold til Chilosis metode svarer dette dog til en forlængelse på ca. 5 min. Til gengæld er Kämmerers metode mere sensitiv (4) og pt det bedste bud på en peroperativ hasteteknik (se Haste- EnVision+, afsnit ). Før et nyt antistof kan tages i brug, skal det titreres. En række forskellige fortyndinger af antistoffet skal afprøves i det detektionssystem, som antistoffet skal anvendes i. Normalt vil producenten anbefale, at antistoffet anvendes i en given fortynding (fx 1:10) eller indenfor et givet fortyndingsområde (fx 1:10-1:40). Titreringen kan derfor med fordel tage udgangspunkt i producentens angivelser, men naturligvis omfatte både højere og - især - lavere koncentrationer af antistoffet. Da producentens angivelser oftest tager udgangspunkt i et standard visualiseringssystem, kan man, når man har optimereret sit system jfr. ovenstående regne med, at mange antistoffer skal benyttes i en fortynding, der er 5-50 x den oplyste! Når den primære titrering tager udgangspunkt i producentens anbefalinger, vil dobbelt op fortyndinger som oftest være tilstrækkelige (fx 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 etc.). Er der ingen anbefalinger fra producenten, er det nødvendigt at afsøge et større koncentrationsområde og derfor også have større afstand mellem de enkelte fortyndinger. I stedet for dobbelt op fortyndinger kan fortyndingstrin på gange 4 anvendes (fx 1:10, 1:40, 1:160, 1:640 ect.).

24 32 Immunhistokemisk teknik I anden omgang kan dobbelt op fortyndinger så anvendes omkring den fortynding, der i første omgang gav de bedste resultater. Den optimale titer for pabs ligger normalt mellem 1:100 og 1: mabs, der leveres som supernatantantistoffer, har oftest en titer på mellem 1:5 og 1:200, mens mabs i form af ascitesvæske kan have en optimal titer på op til 1: Rå ascites-abs er sjældent kommercielt tilgængelige, idet de normalt altid fra producentens side vil være fortyndet til en titer, der svarer til supernatant-antistofferne Fortyndervæske Den væske/buffer, der anvendes til at fortynde antistofferne, har ikke blot til formål at regulere koncentrationen af antistoffet under inkubationen. Fortyndervæsken bør vælges således, at den besidder flere andre kvaliteter. Fortyndervæsken skal således have et passende ph og saltindhold, så risikoen for, at antistoffet adhærerer uspecifikt til vævsproteiner, er minimal, samtidig med at antistof-antigen reaktionen ikke påvirkes negativt. Fortyndervæsken bør ligeledes indeholde et såkaldt carrierprotein, der skal beskytte antistofopløsninger med lavt proteinindhold mod antistofpolymerisation og antistofadsorbtion til overfladen af reagensglas. Tilsætning af 1% BSA vil have denne beskyttende effekt på antistofopløsninger. Samtidig virker BSA som blocking protein og vil dermed nedsætte risikoen for uspecifik antistofadhæsion via hydrofob interaktion. En god universal fortyndervæske er derfor buffer a (Tabel 2.3). Den har i mange år været den foretrukne buffer til fortynding af både mabs of pabs. Nyere undersøgelser tyder dog på at buffere med neutralt ph som buffer a ikke nødvendigvis giver de bedste betingelser for mabs. Boenisch (84,85) fandt i forsøg med 14 forskellige mabs, at de fleste - på HIERbehandlede paraffinsnit - gav de kraftigste reaktioner i Tris buffer ved ph 6,0 mens et enkelt (klon BLA.36, B-celle markør) gav de bedste resultater i Tris buffer ved ph 8,6. Boenisch fandt ligeledes at tilsætningen af 0,15M NaCl svækkede reaktiviteten af en del af de testede mabs. Konklusionen, Boenisch drog af sine arbejder, var bl.a. 1. At PBS ikke bør anvendes som fortynderbuffer til mabs. 2. At buffer b ( 0,05M Tris ph 6,0) er mere velegnet som generel fortyndervæske til mabs end buffer a. 3. At optimeringen af brugen af et (nyt) mab altid bør inkludere testning af minimum buffer a, b og c som fortynderbuffer. Forsøg i eget laboratorium har kun delvist kunne reproducere Boenischs fund. Vi finder (4) også at PBS generelt giver svagere reaktioner med en del mabs, end TBS gør. Ligeledes ses ph og saltkoncentrationen i fortynderbuffer at påvirke immunreaktionerne, men hvor Boenisch kun noterer sig fordele ved manipulering af disse parametre, ser vi også væsentlig ulemper, der i mange tilfælde overskygger evt. fordele. Problemet med de radikale ændringer i ph og saltkoncentration som foreslået af Boenisch er, at langt de fleste antistoffer, vi har testet under disse forhold, giver tiltagende problemer med baggrundssværtning, hvilket vanskeliggør fortolkning af farvningsresultaterne. Årsagen til denne diskrepans er uklar. En del af forklaringen kan være, at Boenisch primært har benyttet sig af meget korte inkubationstider (10 min.), hvor vi har benyttet os af længere inkubationstider (60 min.). Ændringer i ph og saltkoncentration ændrer ladningsforholdene på såvel antistof som antigen. Målet er at genskabe det oprindelige forhold, hvor antigen og antistof oftest har modsat ladning. Herved vil elektrostatisk tiltrækning (ionbinding) i højere grad bidrage ved antistofantigen reaktionen. Elektrostatisk tiltrækning sikrer hurtigere binding af antistof til antigen, hvilket specielt ses tydeligt ved korte inkubationstider, omvendt vil uspecifik elektrostatisk tiltrækning til modsat ladede proteiner generelt favoriseres ved en forlænget inkubationstid. Bedre resultater er i rutinediagnostisk praksis opnået ved anvendelse af buffer f (4,89), hvor saltkoncentrationen i forhold til buffer a er halveret. Dette giver for mange mabs lidt kraftigere reaktioner (mabs kan ofte fortyndes lidt ekstra) uden problemer med baggrundssværtning. Buffer d og e er alternativer, der med fordel kan tages i anvendelse, hvis der arbejdes med Abs, der giver specielt mange problemer med uspecifik baggrundsfarvning. Bemærk, at Na-azid hæmmer peroxidase og derfor ikke må være tilstede i for høje koncentrationer i visualiseringens sidste lag Opbevaring og holdbarhed af antistoffer De fleste antistofproducenter anbefaler at opbevare antistoffer ved 4 C eller -20 C. Da antistofopløsninger ikke tåler gentagende cykler af nedfrysning og optøning deles antistoffer, der skal opbevares ved -20 C i små portioner i fx eppendorf-rør. Holdbarheden af koncentrerede antistofopløsninger er generelt god. Opbevaret under de anbefalede betingelser er antistofferne holdbare i årevis. Specielt vil opbevaring ved -20 C eller ved -80 C betyde, at antistofferne kun taber minimalt i aktivitet over en lang årrække. Antistofkonjugater og fortyndede antistofopløsninger bør generelt opbevares ved 4 C. De fleste fortyndede antistoffer vil ved denne temperatur have en holdbarhed på adskillige måneder, forudsat at en passende bufferopløsning inkluderende 15 mm Na-azid er anvendt til

25 Anvendt immunhistokemi 33 fortyndingen (Tabel 2.3) I praksis betyder dette, at arbejdsopløsninger af mange antistoffer kan fremstilles i større mængder, fx hvad der svarer til 4-6 ugers forbrug Kontrolprocedurer Den initiale afprøvning af et nyt antistof kan betragtes som en overordnet reagenskontrol. En kontrol, der i alle tilfælde er nødvendig for, at et givet antistof kan tages i anvendelse. Herefter kræver enhver immunhistokemisk analyse med det pågældende antistof en sideløbende kontrolprocedure, der kan vise, at et evt. negativt resultat skyldes fravær af antigen i det undersøgte præparat og ikke en fejl i analysen (falsk negativ reaktion). Kontrolproceduren skal ligeledes kunne vise, at et evt. positivt analyseresultat skyldes et reelt indhold af antigen og ikke krydsreagerende substanser, endogen enzymaktivitet, endogen biotin eller lignende (falsk positiv reaktion). En tilfredsstillende grad af kontrol på disse forhold opnås gennem: 1. kontrolsnit med kendt positivt/negativt reaktionsmønster inkluderet i analysen 2. substitution af det primære antistof på nabosnit med non-immun reagens. Ad 1) De bedste kontrolmuligheder opnås klart ved at anvende snit fra en multiblok. Multiblokken bør indeholde en række normalvæv og tumorvæv, der er præpareret som testpræparatet. Vævene til multiblokken bør endvidere vælges således, at antigenet forekommer i varierende koncentrationer. Inkluderes snit fra en veldesignet multiblok, vil det være muligt at vurdere antistoffets reaktionsmønster i den aktuelle analyse, samtidig med at sensitiviteten af analysen kan monitoreres. Kontrolsnit og testsnit monteres på samme glas! Ad 2) Der er flere muligheder for substitution af primært antistof: a. med primært antistof, der er absorberet med oprenset antigen b. med et andet irrelevant antistof c. med non-immun serum fra den samme dyre art hvori det primære antistof er rejst d. med fortynderbuffer. Den immunologisk mest korrekte substitutionskontrol er den første (a). Tilgængeligheden af (eller mangel på samme) og prisen på rene antigener gør dog denne form for kontrol urealistisk ved almindelige diagnostiske rutineundersøgelser. Den anden mulighed (b) for substitution er næsten altid tilstede ved diagnostiske undersøgelser, da der her traditionelt appliceres større eller mindre paneler af antistoffer rettet mod forskellige antigener. Substitution med fortynderbuffer (d) er simpel og altid mulig at udføre, og den gør det let at registrere reaktivitet, der kan tilskrives detektionssystemet og/eller kromogen/- substratopløsningen (endogen enzymaktivitet, endogen biotin, krydsreaktivitet af sekundært antistof eller lignende). Vel vidende, at de beskrevne kontroller langt fra er fyldestgørende med hensyn til en præcis karakterisering af et antistofs specificitet (42), kan følgende kontrolforanstaltninger anbefales til sikring af den daglige kvalitet på de immunhistokemiske analyser: 1. Der bruges kun primære antistoffer, der er procedureteknisk optimeret. Antistoffernes reaktivitet og specificitet skal være veldokomenteret og reproduceret i eget laboratorium. 2. Snit monteres på glas med positive kontrolsnit (gerne fra multiblokke). 3. Antistofundersøgelser bør altid laves som panelundersøgelser. 4. Det primære antistof erstattes med fortynderbuffer på nabosnit til de snit, der skal immunfarves. Der skal medtages ét snit for hver demaskeringsprocedure. Vimentin kontrol På arkivmaterialer (paraffin), hvor kendskabet til fikseringstid og præparationsprotokolen i det hele taget er sparsomt, kan det være nyttigt at inkludere en såkaldt vimentin kontrol (43). Vimentin hører til de intermediære filamenter. Det findes i næsten alle mesenkymale celler. Påvisning af vimentin, der således findes stort set i alle væv, kan bruges til at vurdere graden af fikserings- og præparationsmæssige ændringer (maskering - evt. destruktion) af epitoper i et givet vævssnit. I praksis gøres dette ved at påvise vimentin ved hjælp af et mab, klon V9, som detekterer en epitop på vimentin, der bl.a. er følsom overfor forlænget fikseringstid i formaldehyd. Det har vist sig, at mange epitoper på andre antigener viser fikserings- eller præparationsmæssigt betingede ændringer i antigenisiteten, der er analoge med ændringer i V9 epitopens antigenisitet. Kvaliteten af farvningsresultaterne opnået med V9 kan derfor til en vis grad extrapoleres til andre antistoffer og dermed være til hjælp ved fortolkningen af farvningsresultaterne for disse. Betydningen af at inddrage en vimentin kontrol er dog aftaget i takt med udviklingen af HIER teknikken. Demaskeringsproblemet er forskelligt for de antistoffer, der kræver proteolytisk forbehandling og dem, der kræver varmeforbehandling. 2.9 Skylleprocedure Før applikation af detektionssystem skylles ( vaskes ) grundigt i buffer med henblik på at fjerne overskydende antistof.

26 34 Immunhistokemisk teknik Figur 2.8: Signaturforklaring til Fig buffer er mere end tilstrækkelige til at undgå problemer med baggrundsfarvning. Brigati et al. (7) fandt, at 3 gange 30 sek. skyl med detergentholdig buffer er tilstrækkelig til at undgå misfarvning af glas og væv ved immunfarvning efter kapillærkræfternes princip, der anvendes i de automatiske immunostainer som TechMate og CodeOn. Det skal dog bemærkes, at skylletider på under 5 min. efter inkubation med polymerkonjugater bør undgås, da der er risiko for, dette vil efterlade overskydende konjugat i prøvematerialet. Da antigen-antistof bindingen er reversibel, bør ukritisk forlængelse af skylleproceduren (timer) undgås, specielt vis antistoffer med lav affinitet anvendes. Forsøg med forlængelse af skylleproceduren til 16 timer har vist en tydelig svækkelse af farvningsintensiteten i forhold til det normale 5 min. skyl (4) Skyllebuffer TBS og PBS er de foretrukne skyllebuffere. Der er ikke beskrevet væsentlige kvalitative forskelle på disse to, men egne erfaringer (Aalborg) peger på TBS som den bedste. PBS bør undgås ved AP-baserede detektionssystemer, da phosphationer virker hæmmende på alkalisk phosphatase aktivitet. Azid-tilsætning til skyllebuffer og fortynderbuffer har været mistænkt for at hæmme peroxidaseaktivitet. Tilsætning af detergent til skyllebuffer anbefales af flere. På paraffinsnit vil tilsætning af Triton X-100 eller Tween 20 i op til 1% nedsætte risikoen for uspecifik antistofadhæsion, samtidig med at penetrationen af immunreagenserne forbedres. Tilsætning af detergent til skyllebuffer er obligatorisk for immunostainere Skylletid De fleste immunhistokemiske farvningsprotokoller opererer med skylletider mellem antistofinkubationerne på ialt 5 til 20 min. Meget tyder på, at selv ialt 5 min. s skyl i flere hold 2.10 Detektionssystemer Teknikker til detektion at antigenbundet antistof kan principielt inddeles i de direkte og de indirekte teknikker. Teknikkerne er illustreret i Figg Signaturforklaring til disse er givet i Fig Direkte teknikker I de direkte teknikker (Fig. 2.9) er det primære antistof direkte konjugeret til label (enzym eller fluorokrom). Detektion af antigenet kan derfor foregå via et enkelt step. Den type teknikker er simple og hurtige at udføre, men ikke særlig sensitive. Traditionelle direkte immunenzymatiske teknikker bruges stort set ikke længere. Direkte immunfluorescensteknikker bruges til gengæld stadig i et vist omfang ved påvisning af immunglobulinaflejringer ved glomerulonefritis og bulløse hudlidelser. Den direkte immunflourescensteknik er også indenfor immun-- dobbeltfarvning meget anvendt, specielt i studier af co-lokalisation af to eller flere antigener i samme celle. Figur 2.9: Direkte teknik. Direkte polymerforstærkningsteknik Den direkte immunenzymatiske teknik har for nylig fået en renæssance gennem den såkaldte polymerforstærkningsteknik lanceret af DakoCytomation under navnet EPOS (Enhanced Polymer Onestep Staining) (Fig. 2.10). Systemet søger at løse de direkte teknikkers ringe sensitivitet gennem kobling af et større antal antistofmolekyler og peroxidase- eller phospatasemolekyler til den samme fleksible polymerforbindelse (dextran). Uden helt at nå de følsomme multistep-detektionssystemers sensitivitet har EPOS-teknikken bragt den direkte immunenzymatiske teknik tilbage som et alternativ indenfor specielle applikationer. EPOS kan således på frysesnit i en 10 min s teknik bruges til at skelne lymfomer (CD45+) fra carcinomer (CK+) (41).

27 Anvendt immunhistokemi 35 Figur 2.12: APAAP-teknik (A) og PAP-teknik (B). 2- og 3-lags teknikker Figur 2.10: Enhanced Polymer One-step Staining (EPOS). På baggrund af deres egen polymerteknologi har firmaet Zymed ligeledes udviklet en direkte teknik. Zymed anvender polypeptider som backbone i deres polymer. P.t. har firmaet kun et produkt byggende på denne teknologi: Sentinel Lymph Node Rapid IHC Kit, hvormed det er muligt at detektere cytokeratin i cryosnit på under 10 min. Se også nedenfor om indirekte polymerforstærkningsteknik Indirekte teknikker Antallet af forskellige indirekte detektionssystemer er meget stort. Den drivende kraft for udviklingen af de mange modifikationer har været ønsket om at kombinere den specifikke detektion af antigenbundet primært antistof med en så stor amplifikation (forstærkning) af signalet som muligt. I dag findes således mange kommercielt tilgængelige, robuste og meget sensitive detektionsystemer. De vigtigste systemer er: a. 2- og 3-lags teknikker b. Peroxidase anti-peroxidase (PAP) og Alkalisk phosphatase anti-alkalisk phosphatase (APAAP). c. Avidin-biotin systemer d. Polymerforstærkningsteknik. e. Tyramid Signal Amplifikation (TSA). Figur 2.11: Tolagsteknik (A) og trelagsteknik (B) 2-lags teknikken (Fig. 2.11) er det simpleste indirekte detektionssystem. I denne teknik inkubers først med umærket primært antistof, fulgt af sekundært antistof rettet mod immunglobulin fra den dyreart, hvorfra det primære antistof stammer (fx mus). Det sekundære antistof er konjugeret med den ønskede label: horse radish [=peberrod] peroxidase (HRP), alkalisk phosphatase (AP) eller lignende. En fordel ved dette system er, at det enzymkonjugerede sekundære antistof kan anvendes til detektion af alle primære antistoffer, der er produceret i den pågældende dyreart (mus). Da der til hvert primære antistofmolekyle vil kunne bindes flere sekundære antistofmolekyler, er dette system væsentlig mere sensitivt end det direkte system. Sensitiviteten kan yderligere forbedres, hvis der efter det sekundære antistof inkuberes med et tertiært antistof (3-lags teknik, se Fig. 2.11) rettet mod immunglobulin fra dyrearten, der leverer det sekundære antistof (fx ged eller kanin). Peroxidase anti-peroxidase (PAP) og alkalisk phosphatase anti-alkalisk phosphatase (APAAP) PAP og APAAP benytter sig begge af præformerede, opløselige immunkomplekser dannet udfra en blanding af enzym (HRP eller AP) og antistof rettet mod det pågældende enzym (Fig. 2.12). Det er vigtigt for begge teknikkerne, at antistoffet, der anvendes i immunkomplekset, er rejst i samme dyreart som det primære antistof, da det sekundære antistof ( link-antistof ) skal kunne binde de to sammen. Link-antistoffet skal nødvendigvis anvendes i overskud, således at det, efter binding til det primære antistof med den ene Fab-arm, har den anden Fab-arm fri til binding af antistoffet, der indgår i immunkomplekset. Protokol for APAAP med repeat 1. Inkubation med primært museantistof. 2. Skyl med TBS fra sprøjteflaske. 3. Skyl i 2 hold TBS i alt 4 min. 4. Inkubér med Rabbit anti-mouse Ig (DakoCytomation Z259) fortyndet 1:25 i 1% BSA/TBS med 15 mm Na-azid. Inkubationstid 30 min.

28 36 Immunhistokemisk teknik Figur 2.13: ABC-teknik (A) og LSAB-teknik (B) 5. Skyl med TBS fra sprøjteflaske. 6. Skyl i 2 hold TBS i alt 4 min. 7. Inkubér med APAAP-compleks (DakoCytomation D651) fortyndet 1:50 i 1% BSA/TBS med 15 mm Na-azid. Inkubationstid 30 min. 8. Skyl med TBS fra sprøjteflaske. 9. Skyl i 2 hold TBS i alt 4 min. 10. Gentag step 4 til 9. Inkubationstider for antistofopløsningerne medsættes til 10 min. 11. Fremkald AP-aktivitet med Fast Red TR, New Fuchsin eller BCIP-NBT. 12. Skyl, kernefarvning, dækglas. Avidin-biotin systemer Disse systemer bygger på den høje affinitet, avidin og streptavidin har for det lille protein biotin (Fig. 2.13). (Stept-)avidin har 4 binding sites for biotin og binder molekylet med en styrke, der langt overgår den styrke, hvormed antigen og antistof bindes til hinanden. Avidin er et basisk glycoprotein, der findes i store mængder i æggehvide. Ved neutralt ph vil nativt avidin have en positiv ladning, der vil kunne tiltrækkes stærke negative ladninger i vævet. Der er ligeledes en risiko for, at oligosaccharidkæder i molekylet kan bindes til lectinlignende substanser i vævet. Disse forhold gør, at man i avidin-biotin systemer oftest benytter sig af kemisk modificeret avidin eller af streptavidin. Den kemiske modifikation af avidinet går ud på at regulere det isoelektriske punkt for molekylet til neutralområdet (ph 7), samtidig med at de fleste oligosaccharidkæder fraspaltes. Streptavidin besidder de samme kemiske egenskaber overfor biotin som avidin, men det savner indhold af oligosaccharidkæder, samtidig med at molekylet har et neutralt isoelektriske punkt. Disse egenskaber har gjort streptavidin til et populært alternativ til avidin i immunhistokemisk sammenhæng. Streptavidin udvindes af bakterien Streptomyces avidinii. Alle (strept)avidin-biotin teknikker bygger sædvanligvis på anvendelsen af biotinylerede sekundære antistoffer. Det lille biotin molekyle (vitamin H) konjugeres i stort antal let og skånsomt til antistofmolekyler. For at forbedre (strept)avidinets mulighed for at binde biotin, konjugeres dette via en såkaldt spacer-arm til antistofmolekylet. Specielt 2 varianter af (strept)avidin-biotin teknikkerne har vundet stor udbredning. Labelled (strept)avidin biotin Labelled (strept)avidin biotin (LSAB/LAB) (44) er en meget populær teknik, i hvilken (strept)avidinet er direkte konjugeret med label (Fig. 2.13). Som label anvendes oftest HRP eller AP, men principielt kan alle typer labels anvendes. LSAB/LAB teknikkerne udmærker sig ved at være meget sensitive og forholdsvis billige og simple at udføre, hvorfor teknikken på mange laboratorier er den foretrukne til rutinediagnostik. Eneste væsentlige ulempe ved systemet er problemerne med endogen biotin i visse væv. Ligesom med APAAP-teknikken kan inkubationsproceduren repeteres. Dette kan være nyttigt, hvis et eller andet går galt i første runde med en svag eller falsk negativ reaktion til følge, eller hvis man generelt ønsker at forbedre sensitiviteten. Protokol LSAB-HRP. Universalmetode for primære antistoffer fra kanin og mus 1. Inkubation med primært antistof (kanin eller mus) 2. Skyl med TBS fra sprøjteflaske 3. Skyl i 2 hold TBS i alt 4 min. 4. Inkubation med blanding af biotinyleret ged anti-kanin Ig (DakoCytomation E432) og biotinyleret ged anti-mus Ig (DakoCytomation E433) E432 og E433 kan anvendes i fortynding 1:100 -> 1:200 Antistofferne fortyndes i 1% BSA/TBS med 15 mm Na-azid. Inkubationstid 30 min. 5. Skyl med TBS fra sprøjteflaske 6. Skyl i 2 hold TBS i alt 4 min. 7. Inkubation med HRP-conjugeret streptavidin (DakoCytomation P397) P397 fortyndes 1:100-1:300 i TBS. Inkubationstid 30 min. 8. Skyl i 2 hold TBS i alt 5 min. 9. Fremkald HRP med Diaminobenzidin eller Aminoethylcarbazol. 10. Skyl, kernefarvning, dækglas. Avidin-Biotin-Complex teknikken (ABC) I ABC-teknikken (45) appliceres et kompleks bestående af (strept)avidin og en biotinyleret label (HRP eller AP), indeholdende frie bindingssteder for biotin (Fig. 2.13). Komplekset binder sig til biotinmolekyler på det sekundære antistof. Den præcise sammensætning og størrelse af komplekset kendes ikke. Hsu s (45) originale teknik benytter sig af en molær ratio mellem avidin og biotin-hrp på 2:1, hvilket teoretisk giver et stort overskud af avidin i complekset. Ændringer i ratio påvirker metodens sensitivitet. Det meget sensitive kommercielle kit Vector Elite ABC-Kit anvender således en ratio på 1:1 (46). Elite ABC complekserne indeholder sandsynligvis flere labelmolekyler end det originale ABC-

29 Anvendt immunhistokemi 37 kompleks. En lovende ny modifikation på ABCsystemet er den såkaldte StreptAvidin/reverse molar ratio ABC (SA/rABC) (46). Teknikken benytter sig af komplekser med en omvendt (reverse) avidin biotin-hrp ratio. I praksis betyder dette, at complekset har et stort overskud af label og bindingssteder for avidin. For at få optimalt udbytte af komplekset inkuberes efter det biotinylerede sekundære antistof med streptavidin (SA). Med SA/rABC er opnået en væsentlig forbedring af sensitiviteten i forhold til den traditionelle ABC teknik. I ELISA assays er registreret en 3-folds sensitivitetsforbedring. Lignende forbedringer er tillige opnået på semi-tynde plastsnit (46). Animal research kit (ARK) systemet Hovedparten af de kommercielle mabs stammer fra mus. Dette er af stor betydning for dyreekperimentelle studier på mus. Skal immunhistokemiske studier foregå på denne type materiale vil man derfor ofte være nødsaget til at bruge primære museantistoffer. Anvendelsen af museantistoffer på musevæv stiller specielle krav til detektionssystemet. Traditionelle indirekte teknikker, hvor sekundære antistoffer (biotinylerede, enzymkonjugerede eller lign.) rettet mod muse Ig indgår, kan i sagens natur ikke anvendes, da disse antistoffer binder sig lige effektivt til endogent muse Ig som til det primære museantistof. En løsning på dette problem kan være at benytte direkte teknikker eller hapten-mærkede primære antistoffer (f.eks. FITC eller biotin). Ulempen ved direkte teknikker er manglende følsomhed (med mindre EPOS anvendes), samt det faktum at kun ganske få primære antistoffer findes enzymkonjugerede. Langt flere primære antistoffer findes hapten-mærkede. Specielt FITC- og biotinmærkede antistoffer findes der en del af. Det er dog stadig sådan, at hovedparten af de primære antistoffer ikke kan findes i en hapten-mærket variant. Det er derfor nødvendigt selv at foretage biotinylering eller lign. Det er Fig 2.14: EnVision teknik dog ikke alle laboratorier, der råder over den nødvendige teknologi til på traditionel vis at biotinylere. Ydermere kræver den traditionelle biotinylering ofte mere primært antistof, end der måske er til rådighed. DakoCytomations ARK-system er derfor et fortrinligt alternativ. Systemet benytter sig af, hvad man kunne kalde, en immunologisk biotinylering. Biotinyleringen foregår i reagensglas ved at blande eget primært muse antistof med et overskud af biotinyleret Fab sekundært antistof (anti-mus Ig) fra ARK-kittet. Det sekundære biotinylerede anti-mus antistof binder sig til det primære antistof, som herved indirekte biotinyleres. Overskydende biotinyleret Fab sekundært antistof bindes efterfølgende ved at tilsætte muse serum Ig til opløsningen. Opløsningen er herefter klar til brug (inkubation). Denne biotinyleringens-metode stiller ikke store krav til mængden af primært antistof, men forudsætter kendskab til Igkoncentrationen af det primære antistof. ARK teknikken består således af følgende trin: 1. Biotinylering af primært antistof. 2. Biotinyleret primært antistof appliceres på snit eller celler. 3. Detektion af primært antistof vha. Strept- Avidin-HRP, efterfulgt af DABfremkaldning. ARK systemet udemærker sig ved stort set at eliminere problemet med endogent Ig i muse væv. I sammenligning (4) med alternative systemer som HistoMouse fra Zymed og MOM fra Vector giver ARK systemet klart det bedste signal/støjforhold. Indirekte polymerforstærkningsteknik EnVision EnVision (Fig. 2.14) er en indirekte polymerforstærkningsteknik. Den er udviklet af DakoCytomation og bygger - som EPOS systemet - på en nyudviklet polymerteknologi. I EnVision-systemet anvendes en fleksibel polymer (dextran), hvortil HRP eller AP og ged anti-mus og/eller ged anti-kanin immunglobuliner er koblet. Efter inkubation med primære antistoffer fra mus eller kaniner kan den efterfølgende detektion og amplifikation opnås gennem inkubation med denne mærkede polymer. Systemet er derfor meget enkelt og brugervenligt at arbejde med. Systemet har angiveligt en sensitivitet, der ligger på linje med mange kommercielle LSABog ABC-kits (47). Et nyt EnVision system, En- Vision+ blev lanceret i Systemets reaktivitet er blevet forbedret i forhold til det oprindelige system bl.a. gennem anvendelse af en blanding af dextran polymerer med forskellig molekylvægt. EnVision+ systemet er sammenlignet med en lang række detektionssystemer og fundet mere følsom end de fleste (64,65). Ofte kan de primære antistoffer fortyndes 2-4 gange mere ved anvendelse af EnVision+ sammenlignet med et traditio-

30 38 Immunhistokemisk teknik nelt non-kit LSAB system (64). I sammenligning med Vectors meget følsomme Elite ABC Kit er der med få undtagelser opnået identiske resultater hvad angår følsomhed (64). EnVision+ systemets store fordel er, at det udover at eliminere problemerne med endogen biotin også kombinerer høj følsomhed med nedsat assay-tid og reduceret håndtering. Den eneste væsentlige ulempe ved EnVision+ systemet synes at være prisen. På trods af den, i forhold til non-kit LSAB og Elite ABC, høje pris er systemet de senere år med rette blevet et meget populært detektionssystem inden for immunhistokemien. Erfaringer i eget laboratorium har kun været positive, med én undtagelse. EnVision+ systemet har givet problemer indenfor muskelpatologien. Immunhistokemien anvendes på muskelbiopsier i høj grad til at påvise normal eller aberrerende forekomst af en lang række muskelmembran relaterede antigener (dystrophiner, sarcoglycaner, lamininer mv.). Disse undersøgelser kan foretages både på cryosnit og paraffinsnit. Forsøg med 18 forskellige muskelmembran relaterede antigener viste, at EnVision+ på cryosnit i alle 18 tilfælde gav markant svagere reaktion i sammenligning med eget non-kit LSAB system. Dette var tilfældet uanset om snittene var ufikserede eller fikserede i acetone. På paraffinsnit af NBF fikseret muskel sås ligeledes de kraftigste reaktioner med LSAB systemet, men forskellen var generelt mere beskeden. Årsagen til dette fænomen skal sikkert søges i det faktum, at EnVision molekylerne er ganske store og muskelmembraner er meget tætte strukturer. Som konsekvens af den forholdsvis ringe følsomhed på muskelsnit, er EnVision+ på dette område erstattet med Power- Vision+ (se nedenfor). Kämermerer et al. beskrev i 2001 (83) en speciel haste-variant af Envision+, der kan anvendes peroperativt på cryosnit. Den samlede farvetid for metoden er ca. 15 min. I modsætning til haste-metoder baseret på EPOS metoden er det her muligt at anvende alle primære kanin og muse antistoffer. Gennem brug af primære antistoffer i højere koncentrationer end normalt (2-10 x højere koncentrationer) og en generel inkubationstemperatur på 37 C lykkes det at opnå forbavsende høj følsomhed. Følsomheden er naturligvis lavere end hvis traditionel EnVision+ protokol anvendes, men ikke voldsomt meget. I den originale protokol anvendes acetone fiksering i 1 min. efterfulgt af en kort tørring af snittene. En modificeret fikseringsprotokol (4, 92) har givet forbedret morfologisk og cytologisk bevarelse af såvel traditionelle cryosnit som CryoJane snit (se afsnit 2.4.1), samtidig med at problemer med endogen peroxidaseaktivitet stort set er elimineret. Denne fikseringsprotokol benytter en kombination af fiksering i 4 % NBF i 2 min. efterfulgt af demaskering i TEG/TE-buffer ved 95 C i 30 sek. Den forbedrede morfologiske og cytologiske bevarelse af cryosnittene har specielt været tydelig på lymfatisk materiale (Sentinel Node mv.). Mange antistoffer synes at give kraftigere reaktioner efter denne kombinationsfiksering end efter acetone fiksering alene. På traditionelle cryosnit af meget kollagenrige væv som hud og mamma kan der desværre være en risiko for tab af snit. På CryoJane snit ses dette problem ikke, da vedhæftningen af snittene her er meget stærkere. For laboratorier, der ikke har CryoJane teknologien til rådighed, kan det således være nødvendigt på nogle væv - at sænke temperaturen i TEG/TE-bufferen til 60 C. Herved bevares alle væv, men man får desværre ikke hæmmet den endogene peroxidaseaktivitet. Protokol EnVision+ 1. Inkubation med primært antistof (kanin eller mus). Inkubationtid min. 2. Skyl med TBS fra sprøjteflaske 3. Skyl i 2 hold TBS i alt 4 min. 4. Inkubation med peroxidasemærket Ready-to-use EnVision+ polymer. Til primære kanin antistoffer anvendes DakoCytomation K4003. Til muse antistoffer anvendes DakoCytomation K4001. Inkubationstid 30 min. 5. Skyl med TBS fra sprøjteflaske 6. Skyl i 2 hold TBS i alt 4 min. 7. Fremkald HRP med Diaminobenzidin eller Aminoethylcarbazol. 8. Skyl, kernefarvning, dækglas. Protokol Haste-EnVision+ 1. Cryosnit skæres og monteres på SuperFrost Plus glas. Snit tørres minimum 60 sek. 2. NBF 4% 2 min. 3. Skyl i TBS 10 sek. 4. TEG-buffer ved 95 C 30 sek. 5. Skyl i TBS 10 sek. 6. Primært antistof ved 37 C 3 min. 7. Skyl i TBS 20 sek. 8. EnVision+ (DakoCytomation K4001 eller K4003) ved 37 C 3 min. 9. Skyl i TBS 20 sek. 10. DAB+ (DakoCytomation K3468) ved 37 C 3 min. 11. Skyl i postevand 10 sek. 12. Dest. vand 5 sek. 13. Mayers Hæmatoxylin 15 sek. 14. Skyl i postevand ved ca. 42 C 30 sek. 15. Dækglas monteres med Aquatex PowerVision/PowerVision+ Firmaet ImmunoVision Technologies bragte i 1999 et nyt 2-lags detektionssystem på markedet ved navn PowerVision. PowerVision tilhører som EnVision og EPOS polymerforstærkningsteknikkerne. Hvor polymeren i EnVision er forholdsvis store dextran molekyler, benytter man sig i PowerVision af små såkaldte multifunktionelle polymeriserbare molekyler, muligvis acrylsyre, biacrylsyre eller disses derivater, til at skabe nogle mere

31 Anvendt immunhistokemi 39 Fig 2.15: PowerVision teknik Fig 2.16: PowerVision+ teknik En general ulempe ved alle 3-lags polymerteknikkerne er naturligvis den forlængede analysetid på ca. 25 min. i forhold til 2-lags teknikkerne. Protokol PowerVision+ kompakte polymerer, hvori der indgår enzymmolekyler (HRP) og link-antistofmolekyler i en passende ratio (mange enzymmolekyler pr. link-antistof) (Fig 2.15). I teorien skulle disse meget kompakte polymerer eliminere de steriske og penetrationsmæssige problemer, som polymerforstærkningssystemerne ellers kan være forbundet med (78). Shi et al testede systemet og sammenlignede det med 3 kommercielle avidin-biotin baserede 3-lags metoder (men ikke med EnVision!) (78). PowerVision viste sig at være meget mere følsom (faktor 4-8 med hensyn til fortynding af primære antistof) end de øvrige systemer. I direkte sammenligning med EnVision+ synes PowerVision en smule mere følsom i detektionen af kerneantigener, mens EnVision+ er en smule mere effektiv i detektionen af membran- og cytoplasmatiske antigener (4). I 2002 blev en forbedret udgave af systemet lanceret, det såkaldte PowerVision+ kit (Fig. 2.16). I plus-versionen er sensitiviteten væsentlig forbedret for detektionen af primære museantistoffer. Den forbedrede sensitivitet opnås gennem inkubation med en såkaldt Post Antibody Block, der i praksis er et sekundært link antistof (kanin anti-mus Ig). Inkubationstiden i Post Antibody Block er 20 min. PowerVision+ må derfor nu betragtes som en 3-lags polymerforstærkningsteknik. I sammenligning med 2-lags polymerforstærkningsteknikkerne EnVision+ (Dako- Cytomation), MACH2 (BioCare) og Picture (Zymed). giver PowerVision+ med alle testede mabs klart de kraftigste reaktioner. I forhold til EnVision+ giver PowerVision+ en sensitivitetsforbedring, der målt på fortynding af primært antistof ligger på en faktor 2-8 (4,90). Et lignende 3-lags polymer system blev lanceret af BioGenex i Dette system går under betegnelsen: Super Sensitive Non-Biotin HRP Detektion System og er hvad angår følsomhed på højde med Power- Vision+ (4). 1. Inkubation med primært antistof (kanin eller mus) Inkubationtid min. 2. Skyl med TBS fra sprøjteflaske 3. Skyl i 2 hold TBS i alt 4 min. 4. Inkubation med Post-antibody Blocking. inkubationstid 20 min. 5. Skyl med TBS fra sprøjteflaske 6. Skyl i 2 hold TBS i alt 4 min. 7. Inkubation med Poly-HRP anti-mus/kanin IgG Inkubationstid 30 min. 8. Skyl med TBS fra sprøjteflaske 9. Skyl i 2 hold TBS i alt 4 min. 10. Fremkald HRP med Diaminobenzidin eller Aminoethylcarbazol. 11. Skyl, kernefarvning, dækglas. Figur 2.17: Tyramid signal amplifikations-teknik.

32 40 Immunhistokemisk teknik Advance Advance er DakoCytomations svar på konkurrenternes meget følsomme 3-lags polymer systemer. Advance er en 3-lags teknik byggende på DakoCytomations egen dextran teknologi. Advance matcher de øvrige 3-lags polymer teknikker, hvad angår sensitivitet ved anvendelse af mabs (4), men er mere følsom ved anvendelse af pabs. Tyramid signal amplifikation Tyramid signal amplifikation (TSA) (Fig. 2.17) er i sig selv ikke et egentligt detektionssystem, men derimod et uhyre effektiv metode til at forstærke alle HRP-baserede detektionssystemer. Metoden er første gang beskrevet af Bobrow et al. i 1989 (48) til solid-phase immunoassays. Bobrow kaldte sin originale metode for catalyzed reporter deposition (CARD). Siden har modifikationer af metoden fået mange forskellige betegnelser. Blandt disse er TSA, som i dag nok er den mest anvendte. Adams (54) modificerede i 1992 den oprindelige metode med henblik på brug ved immunhistokemiske teknikker. Teknikken benytter sig af HRP s evne til oxidativ kondensering, herunder specielt dimerisering, af phenolforbindelser gennem en fri radikal mekanisme. Efter en traditionel peroxidaseteknik (fx LSAB) inkuberes med biotinyleret tyramid (phenolforbindelse) og brintperoxid. HRP i det vævsbundne immunkompleks katalyserer aktiveringen af tyramidet (til et fri radikal). Passende fortynding af det biotinylerede tyramid gør, at det frie radikal mellemprodukt vil bindes til elektronrige aminosyreradikaler (tyrosin, tryptophan, phenylanalin mv.) fremfor at dimerisere. Da det frie radikal er uhyre reaktivt, vil reaktionen foregå i umiddelbar nærhed af katalysatoren HRP. Man opnår med andre ord, at store mængder biotin - via tyramidet bindes covalent til vævsproteiner i nærheden af det antigen, der undersøges. Biotinet kan herefter påvises på normal vis ved hjælp af fx HRP-konjugeret streptavidin. Alt i alt forlænges den samlede farvetid med ca. 45 min. ved at anvende TSA teknikken, til gengæld forbedres sensitiviteten dramatisk. Merz et al. (49) beskriver, at sensitiviteten forbedres så voldsomt, at primære antistoffer kan fortyndes gange mere og stadig give identiske resultater sammenlignet med en standard ABC-teknik. Nyere undersøgelser (4,66,67) bekræfter metodens kolossale følsomhed, omend folds fortyndinger af primære antistoffer hører til sjældenhederne. Mere end 100 antistoffer er blevet afprøvet, de fleste kan fortyndes 5 til 50 gange yderligere i TSA-systemet og stadig give identiske eller bedre resultater end standardteknikker som LSAB og ABC. Tillige er en række antistoffer, der ikke tidligere er beskrevet til paraffinsnit, med TSAteknikken fundet brugbare (fx anti-cd6, klon ST23; anti-cd7, klon IOT7; anti-cd9, klon P-1/33; anti-cd11a, klon MHM24; anti-cd16, klon DJ130; anti-cd22, klon 4KB128; anti-cd23, klon MHM6; anti-cd33, klon WM54; anti-cd68, klon T-1/82a; anti-e-cadherin, klon 36). Der er set en ganske stor variation i effekten af forstærkningen for de forskellige antistoffer (67) Anti-EBV-LMP, klon C1-4 kan således fortyndes 500 gange ekstra i TSA-systemet, mens anti-cd41, klon 5B12 kun kan fortyndes 2,5 gange. Årsagen til de store forskelle hænger muligvis sammen med forskelle i det kemiske mikromiljø, der omgiver de enkelte epitoper (67). Bindingen af aktiveret tyramid til vævet kræver forekomst af elektronrige substanser som bl.a. tyrosin- og tryptophan- -aminosyreradikaler. Variationer i forekomsten af disse substanser formodes at påvirke effektiviteten af tyramid amplifikationen. TSA-teknologien udnyttes af 2 kommercielle kits. Catalyzed Signal Amplifikation (CSA) fra DakoCytomation og TSA fra NEN Life Science. Begge kit er relativt dyre. I forhold til non-kit LSAB skal beregnes 8-10 kr ekstra pr. glas. En væsentlig billigere løsning er at biotinylere tyramidet selv. Følges Adams (54) simple anvisninger, kan der for ca kr fremstilles biotinyleret tyramid nok til ca snit! NEN Life Science producerer foruden biotinyleret tyramid også en række fluorochromkonjugerede tyramid varianter. Med anvendelse af henholdvis fluorescein-, tetramethylrhodamine-, coumarin-, eller cyanin3-konjugeret tyramid istedet for biotinyleret tyramid kan opnås meget intens fluororescens. Fluororescens-TSA er langt mere følsom end fx en LSAB baseret fluororescensteknik. Primære antistoffer vil kunne fortyndes 5-20 gange mere. TSA protokol NEN s TSA-Indirect-kit i kombination med et velfungerende non-kit LSAB system, danner basis for nedenstående protokol for paraffinsnit. Afparaffinering, hydrering og epitop demaskering foretages som sædvanlig, hvorefter metoden er: 1. Blokering af endogen biotin med DakoCytomation Kit X Skyl med 0,05% Tween20 i TBS (TBST) 3 hold i alt 6 min. 3. Inkubation med 0,5% Blocking Reagent i TBS (TNB-buffer) 25 min. 4. Inkubation med primært antistof fortyndet i TNB-buffer. 5. Skyl med TBST fra sprøjteflaske 6. Skyl i 3 hold TBST i alt 9 min. 7. Inkubation med biotinyleret sekundært antistof. Til primære kanin antistoffer anvendes biotinyleret ged anti-kanin Ig (DakoCytomation E432) og til primære muse antistoffer biotinyleret ged anti-mus Ig (DakoCytomation E433). Begge antistoffer fortyndes 1:200 i TNB-buffer. Inkubationstid 30 min. 8. Skyl med TBST fra sprøjteflaske 9. Skyl i 3 hold TBST i alt 9 min.

33 Anvendt immunhistokemi Blokering af endogen peroxidaseaktivitet. Inkubation med ChemMate Peroxidase Blocking Solution (DakoCytomation S2023) 10 min. 11. Skyl med TBST fra sprøjteflaske 12. Skyl i 3 hold TBST i alt 9 min. 13. Inkubation med HRP-konjugeret streptavidin (DakoCytomation P397) P397 fortyndes 1:300 i TNB-buffer. Inkubationstid 30 min. 14. Skyl med TBST fra sprøjteflaske 15. Skyl i 3 hold TBST i alt 9 min. 16. Inkubation med Biotinyleret Tyramid fortyndet 1:50 i Amplification Diluent. Inkubationstid 5-10 min. 17. Skyl med TBST fra sprøjteflaske 18. Skyl i 3 hold TBST i alt 9 min. 19. Inkubation med HRP-konjugeret streptavidin (DakoCytomation P397) P397 fortyndes 1:300 i TNB-buffer. Inkubationstid 30 min. 20. Skyl med TBST fra sprøjteflaske 21. Skyl i 3 hold TBST i alt 9 min. 22. Skyl i TBS 2 min. 23. Fremkald HRP med Diaminobenzidin eller Aminoethylcarbazol. 24. Skyl, kernefarvning, dækglas. Modifikation med hjemmelavet biotinyleret tyramid - efter Adams (54). 40 ml boratbuffer, 50mM, ph 8,0 tilsættes under omrøring 100 mg Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce 21335). Herefter tilsættes 31,2 mg Tyramine Hydrochlorid (Sigma T2879). Opløsningen omrørres natten over. Opløsningen bliver tiltagende mælket og viskøs. Næste dag filtreres opløsningen gennem 0,45µm syringe filter. Opløsningen opbevares i Eppendorf- eller Nunc-rør ved -80 C. Før brug optøs stamopløsningen og fortyndes 1:100 (1:50-1:200) i 50mM TBS, ph 8,0 indeholdende 0,0005-0,001% brintperoxid. Blocking reagent fra NEN-kittet kan ligeledes erstattes uden konsekvens for kvaliteten. Casein (Sigma C-5890) er en fuldgod og billig erstatning. DakoCytomation Kit til blokering af endogen biotin kan erstattes af Miller s (63) protokol, der er mindst ligeså effektiv. Med hensyn til blokering af endogen biotin er det dog værd at bemærke, at ingen af de 2 protokoller er i stand til at blokere den endogene biotin forekomst 100% ved TSA teknikken. Der vil som regel restere en smule reaktion i de mest biotinrige væv som nyre, lever og binyre. Denne reaktion vil kun sjældent give fortolkningsmæssige problemer. Udelades blokeringen af endogen biotin vil mange normalvæv og tumorvæv til gengæld give en voldsom baggrundsfarvning, der vil vanskeliggøre identifikation og fortolkning af den specifikke immunreaktion. TSA-Plus Problemer med endogent biotin kan i TSA systemet nu helt undgås ved at anvende det såkaldte TSA Plus kit (NEN Life Science). Dette system baserer amplifikationen på DNP-tyramid og anti-dnp antistoffer. Systemet er således helt biotin-frit, hvorved blokering af endogent biotin helt kan undgås. Systemet er oprindeligt udviklet til In Situ Hybridisering, men kan med fordel anvendes til IHC, hvor det ifølge fabrikanten leverer en højere sensitivitet end den traditionelle TSA teknik. Et lignende biotin-frit system fås hos DakoCytomation under navnet CSA-II. Tyramidet er her mærket med FITC. DakoCytomation anbefaler CSA-II til immunhistokemi med mabs Kromogen/- substratopløsning Horse radish peroxidase Indenfor immunhistokemien er horse radish peroxidase (HRP, horse radish = peberrod) den foretrukne enzymlabel. HRP er i sig selv usynlig, men kan visualiseres gennem flere simple histokemiske teknikker anvendende brintperoxid som substrat og adskellige forskellige kromogener. Blandt kromogenerne skiller 3-Amino-9Ethyl-Carbazol (AEC) og 3,3 -Diaminobenzidin (DAB) sig klart ud som de foretrukne. Protokoller til visualisering af horse radish peroxidase (HRP) aktivitet a. AEC protokol: AEC 0,8% i acetone 10 ml Acetatbuffer 0,05 M ph 5,0 200 ml 30% H 2 O µl Opløsningen filtreres før brug. Inkubationstid: 20 min. Opløsningen kan genbruges flere gange inden for 60 min. AEC stamopløsning (0,8% AEC i acetone) er holdbar minimum 1 mdr. ved stuetemperatur. b. DAB protokol: Diaminobenzidin 50 mg TBS 0,05M, ph 7,4 100 ml 30% H 2 O 2 50 µl Opløsningen filtreres før brug. Inkubationstid: 10 min. Opløsningen kan genbruges flere gange inden for 60 min. For at undgå gentagne afvejninger af DAB-pulver, der er under mistanke for at være carcinogent, kan man anvende DAB-tabletter (fx DakoCytomation S3000). Desværre er det en ret kostbar løsning. Langt billigere er det at købe 5 g (på forhånd afvejet) DAB og opløse det hele på én gang i 100 ml dest. vand. Herved fremkommer en x100 koncentreret stamopløsning, der opbevares ved - 20 C i passende små portioner (fx 1 ml). Stamopløsningen kan så efter optøning fortyndes 1:100 i buffer og tilsættes brintperoxid (se også nedenfor om kommercielle kit til HRP påvisning).

34 42 Immunhistokemisk teknik AEC og DAB fungerer som elektrondonor i den enzymkatalyserede omsætning af brintperoxid. Begge oxideres til farvede tungtopløselige produkter. AEC giver et brillant rødbrunt reaktionsprodukt, der er opløseligt i alkohol. AEC-fremkaldte præparater kræver derfor montering med hydrofile monteringsmidler. Præparater fremkaldt med AEC bør opbevares mørkt, da stærk lyspåvirkning kan få reaktionsproduktet til at blege ( fade ) i intensitet. DAB giver et brunt reaktionsprodukt, der er uopløseligt i alkohol og andre organiske opløsningsmidler. Sensitiviteten af de 2 protokoller er i flere arbejder blevet sammenlignet. De Jong et al (50) fandt, at de 2 protokoller var lige sensitive. Scopsi og Larsson (51) fandt derimod, at DAB var en smule mere sensitiv end AEC. En væsentlig fordel ved DAB er dog, at sensitiviteten med forholdsvis enkle midler kan forbedres betydeligt. Blandt mange forskellige protokoller kan specielt 3 meget simple og meget reproducerbare teknikker anbefales. Protokoller til forstærkede DAB reaktioner c. DAB/imidazol (0,1M) protokol: Imidazol 700 mg TBS, ph 7,4 100 ml ph justeres til 7,4 med 1N HCl Diaminobenzidin 50 ml 30% H 2 O 2 35 µl Opløsningen filtreres før brug. Inkubationstid: 5-10 min. Opløsningen kan genbruges flere gange inden for 60 min. 0,1M imidazol i TBS er holdbar 1 mdr. ved stuetemperatur. d. DAB-Nikkel protokol: Diaminobenzidin 50 mg Acetatbuffer 0,1M, ph 6,0 100 ml Nikkelsulfat 0,8 g 30% H 2 O 2 35 µl DAB opløses først, dernæst nikkelsulfat. Opløsningen filtreres før brug. Inkubationstid: 10 min. Opløsningen kan genbruges flere gange inden for 60 min. DAB/nikkel fremkaldning giver et intenst blåsort reaktionsprodukt, der er uopløseligt i alkohol og xylen. Den blåsorte farve gør, at DAB/nikkel protokollen med fordel kan anvendes i dobbeltfarvningsprotokoller. I den forbindelse er det dog vigtigt at bemærke, at reaktionsproduktet efter DAB/nikkel bleger meget hurtigt i præparater, der er monteret med hydrofile monteringsmidler som fx AquaTex og AquaMount. e. Kobbersulfat (0,5%) protokol: Kobbersulfat 0,5 g PBS, TBS eller fysiologisk saltvand 100 ml Efter fremkaldning med DAB eller DAB/imidazol protokol kan yderligere forstærkning opnås ved at inkubere 5-10 min. i 0,5% kobbersulfat. Det originale DAB reaktionsprodukt bliver herved mørkere og mere intens i farven. Specielt kombinationen af DAB/imidazol protokollen og kobbersulfat efterbehandling kan pga af sin enkelhed og forbedrede sensitivitet anbefales. Kobbersulfat kan genbruges flere dage. Kommercielle kits til HRP påvisning På det kommercielle marked findes mange udmærkede og brugervenlige 2-komponent og endog enkelte Ready-to-use 1-komponent kits af både DAB og AEC. Blandt de kommercielle DAB kits skal fremhæves den fra KemEnTec (4170) og DakoCytomations DAB+ (K3468). Begge kits kan med fordel kombineres med efterbehandling i kobbersulfat. For AEC s vedkommende synes det med kits muligt at opnå en vis sensitivitetsforbedring i forhold til en standard AEC protokol. DakoCytomation s Ready-to-use AEC+ (K3469) giver således en sensitivitetsforbedring, der svarer til en fortyndingsfaktor på ca. 2 for de de primære antistoffer. Prisen på de fleste kits udelukker desværre muligheden for immersions-inkubation i farveskåle, inkubationen må i stedet foretages som en mere arbejdskrævende dråbeinkubation på hvert enkelt glas. NovaRed Firmaet Vector, der primært har specialiseret sig indenfor detektionssystemer og chromogen/substrat kits, lancerede i 1999 et nyt følsomt kit til HRP påvisning. Systemet hedder Vector NovaRed. NovaRed giver et rødbrunt reaktionsprodukt, lidt mørkere end AECs reaktionsprodukt. Snit fremkaldt med NovaRed kan dehydreres og monteres med hydrofobe monteringsmidler som PerTex, VectaMount eller lignende. Til gengæld er reaktionsproduktet ikke stabilt i det hydrofile monteringsmiddel, AquaTex. NovaRed matcher den kobbersulfat-forstærkede DAB/imidazol protokol, hvad angår følsomhed (4). NovaRed er derfor et glimrende tilbud til dem, der ønsker et HRP-chromogen i AEC-farve men med en følsomhed og monteringsegenskaber som de bedste DAB protokoller. I forhold til andre kommercielle kits er prisen rimelig. 1 ml arbejdsopløsning koster ca. 3 kr. DakoCytomations DAB+ (K3468) koster til sammenligning næsten det dobbelte! Alkalisk phosphatase Indenfor hæmatologien er alkalisk phosphatase (AP) et vigtigt alternativ til HRP som enzymlabel. Påvisning af AP-aktivitet kan

35 Anvendt immunhistokemi 43 opnås gennem flere forskellige og velfungerende histokemiske teknikker. To principielt forskellige teknikker anvendes i de fleste tilfælde. Den ene teknik er den såkaldte simultankoblingsreaktion, hvor AP katalyserer fraspaltningen af phosphat fra en naphtholphosphatesterforbindelse. Efter fraspaltning kobler naphtholforbindelsen til diazoniumforbindelser (kromogen), der er tilsat substratopløsningen. Koblingsproduktet er farvet og tungtopløseligt i vandige medier. Specielt 2 simultan-koblingsreaktioner, der hver for sig benytter sig af forskellige kromogen-substrat kombinationer, kan på grund af deres sensitivitet og reproducerbarhed anbefales. Det drejer sig om Fast Red TR/Naphthol-AS-MX Phosphat ( Fast Red TR ) og New Fuchsin/Naphthol-AS-BI Phosphat ( New Fuchsin ). Den anden teknik til påvisning af AP er den såkaldte Indoxyl-Tetrazolium teknik, hvor AP katalyserer fraspaltningen af phosphat fra en indoxylphosphatester. Den frie indolyl-forbindelse er herefter i stand til at reducere tetrazoliumsalte, der herved udfældes i vævet som farvede og tungtopløselige formazaner. Til denne type teknikker hører Bromo-Chloro-Indoxyl-Phosphat/Nitro B Tetrazolium (BCIP-NBT) metoden (50) BCIP-NBT er en sensitiv metode, men på trods af dette ikke særlig udbredt inden for immunhistokemien. BCIP-NBT giver et intenst blåsort granulært reaktionsprodukt, der er stabilt i etanol og xylen. BCIP-NBT substratopløsningen udmærker sig ved at være mere stabil end Fast Red TR og New Fuchsin opløsningerne, hvilket gør det muligt at forlænge inkubationstiden betydeligt. I visse in situ hybridiserings-teknikker anvendes således inkubationstider på 16 timer i BCIP-NBT, hvilket giver en betydelig forbedring af sensitiviteten. Den meget lange inkubationstid er kun mulig i kraft af dels den gode holdbarhed af BCIP-NBT og dels af det faktum, at AP enzymet ikke inaktiveres så hurtigt som HRP under enzymreaktionen. Protokoller til visualisering af alkalisk phosphatase (AP) aktivitet a. Fast Red TR protokol: Naphthol AS-MX Phosphate Sigma No. N5000 Tris buffer 0,1 M ph 8,2 10 ml 50 ml Levamisol 1 M 50 µl Fast Red TR salt Sigma No. F mg Naphthol AS-MX opløses i Tris buffer. Opløsning er holdbar 14 dage ved 4 C. Lige før brug tilsættes Levamisol og Fast Red TR salt. I LSAB-AP teknikken nedsættes mængden af levamisol til 25µl (se afsn ). Når Fast Red TR er gået i opløsning filtreres. Inkubationstid: min. Ønskes et blåt reaktionsprodukt erstattes Fast Red TR med Fast Blue BB (Sigma F3378). b. New Fuchsin protokol: Stamopløsning A: Naphthol AS-BI Phosphat Sigma No. N mg N,N-Dimethylformamid Merck No µl Stamopløsning B: Natriumnitrit 4%, frisk fremstillet 250 µl New Fuchsin 5% i 2 M HCl, Merck No µl Tris buffer 0,05M, ph 8,7 50 ml Levamisol 1 M 50 µl New Fuchsin og natriumnitrit blandes under omrystning i 60 sek. Blandingen foregår i stinkskab, da der kan udvikles nitrøse dampe. Herefter tilsættes Tris buffer og til sidst Levamisol. I LSAB-AP teknikken nedsættes mængden af levamisol til 25µl (se afsn ). Arbejdsopløsning De frisk fremstillede stamopløsning blandes grundigt (opl. B i opl. A). Den færdige arbejdsopløsning filtreres før brug. Inkubationstid: min. Fast Red TR og New Fuchsin protokollerne giver klare røde reaktionsprodukter, der er uopløselige i vandige medier. Fast Red TR reaktionsproduktet er ikke stabilt i organiske opløsningsmidler, hvorfor montering med hydrofile monteringsmidler er påkrævet. New Fuchsin reaktionsproduktet er angivet til at være stabilt i etanol og xylen (50), hvilket gør montering med hydrofobe monteringsmidler mulig. Egne undersøgelser har dog vist, at selv efter en hurtig dehydrering i etanol synes reaktionen svagere (og lysere i farvenuancen) i hydrofobt monterede præparater end i hydrofilt monterede præparater. Montering med hydrofilt monteringsmiddel synes derfor at være det sikreste - også for New Fuchsin fremkaldte præparater. Fast Red TR opløsningen er mere simpel at fremstille end New Fuchsin. Samtidig giver Fast Red reaktionsproduktet en intens orangerød fluorescens (53), der i fluorescensmikroskopet giver mulighed for en væsentlig mere sensitiv detektion af reaktionsproduktet, end den traditionelle lysmikroskopiske undersøgelse kan. En væsentlig ulempe ved Fast Red TR er, at reaktionsproduktet i acetone og NBF-fikserede frysesnit er meget granulært og med en udpræget tendens til diffusion ud fra den primære lokalisation af AP. Med New Fuchsin ses ikke de samme problemer på frysesnit. Reaktionsproduktet er mere amorft og homogent uden synlig tendens til diffusion. Lysmikroskopisk er New Fuchsin angivet til at være en smule mere sensitivt end Fast Red TR (50). På trods af dette må det anbefales, bl.a. på grund af den simple protokol og fluorokrom egenskaberne, at anvende Fast Red TR til cytologisk materiale og paraffinsnit. Til gengæld bør New Fuchsin rutinemæssigt anvendes på frysesnit. Kommercielle kits til AP-påvisning Udbudet af kits til AP-påvisning er stort. Hvad angår sensitivitet er der gode muligheder for at finde produkter, der giver en forbedret

36 44 Immunhistokemisk teknik sensitivitet i forhold til standardprotokollerne for Fast Red og New Fuchsin. En mindre, sammenlignende undersøgelse af 4 kommercielle kits og de 2 standardprotokoller viste, at alle 4 kits var mere følsomme end standardprotokollerne (4). Specielt gode resultater blev opnået med DakoCytomation s Fast Red kit (K0597), DakoCytomation s New Fuchsin kit (K0596) samt Vector-Red og Vector Blue fra Vector Laboratories. Alle 4 kits gav en sensitivitetsforbedring svarende til en fortyndingsfaktor på de primære antistoffer på minimum Kernefarvning For at kunne iagttage den præcise lokalisation af reaktionsproduktet i forhold til vævsog cellemorfologien afsluttes den immunhistokemiske farvemetode sædvanligvis med en kernefarvning. Valg af kernefarvning afhænger af det anvendte kromogen. Farvning i Mayers Hæmatoxylin eller lignende vandige Hæmatoxylinopløsninger fungerer fint sammen med de fleste kromogener (Fast Red, New Fuchsin, AEC og DAB). En farvetid i Mayers hæmatoxylin på 2 min. er det almindelige, men ved påvisning af kernelokaliserede antigener kan farvetiden med fordel nedsættes til 30 sek. Mayers hæmatoxylin tåler montering med både hydrofile monteringsmidler (AquaMount, AquaTex, Glycergel o.l.) og hydrofobe midler (PerTex, DPX o.l.). Ethylgrøn (Methylgrøn) eller Neutralrød (50) kan med fordel anvendes, hvis BCIP-NBT bruges som kromogen. Ethylgrøn har ligeledes været anvendt i kombination med DAB og DAB-Nikkel. Det forudsætter blot, at der anvendes hydrofobe monteringsmidler, da Ethylgrøn ikke er særlig stabil i de hydrofile. Anvendes Ethylgrøn skal man yderligere være opmærksom på, at farvbarheden af cellekerner nedsættes efter HIER forbehandling (på grund af DNA denaturering). Azur B kan med fordel anvendes som kernefarvning i stærkt pigmenterede melanocytiske læsioner (55), hvor det kan være svært at skelne melanins egenfarve fra kromogener som AEC og specielt DAB. Azur B giver - foruden den blå kernefarvning - en intens grønblå farvning af melanin i melanofager, hvorved pigmentet let adskilles fra kromogenet Referencer 1. Kohler G, Milstein C. (1975). Continuous cultures of fused cells producing antibody of pre-difined specificity.nature 256: Gatter KC, Falini B, Mason DY. (1984). The use of monoclonal antibodies in histopathological diagnosis. Recent Advances in Histopathology. Churchill Livingstone side Lyon H. (1985). Histokemi I og II. DSR Forlag Landbohøjskolen KBH. 4 Egne ikke publiserede data. 5 Rasmussen BB, Hjort KN, Mellerup I, Sether G, Christensen N. (1992). Vegetable oils instead of xylene in tissue processing.apmis 100: Prioleau J, Schnitt SJ. (1995). p53 antigen loss in stored paraffin slides.the New England Journal Of Medicine 332: Brigati DJ, Budgeon LR, Unger ER, Koebler D, Cuomo C, Kennedy T, Permodo JM. (1988). Immunocytochemistry is automated: Development of a robotic workstation based upon the capillary action principle. The Journal of Histotechnology 11: Li C-Y, Ziesmer SC, Villareal OL. (1987). Use of azide and hydrogen peroxide as an Iinhibitor for endogenous in the immunoperoxidase method.the Journal of Histochemistry and Cytochemistry 35: Miller RT, Groothuis CL. (1990). Improved avidinbiotin immunoperoxidase method for terminal deoxyribonucleotidyl transferase and immunophenotypic characterization of blood cells.american Journal of Clinical Pathology 93: Yam LT, Janckila AJ, Epremian BE, Li C-Y. (1989). Diagnostic significance of levamisol-resistant alkaline phosphatase in cytochemistry and immunocytochemistry. American Journal of Clinical Pathology 91: Thisted K. (1995). The use of levamisol in immunohistochemistry. Pathology Research and Practice 191: Yokoyama S, Kashima K, Inoue S, Daa T, Nakayama I Moriuchi A. (1993). Biotin-containing intranuclear inclusions in endometrial glands during gestation and puerperium. American Journal of Clinical Pathology 99: Huang S, Minassian H, More JD. (1976). Application of immunoflourescent staining in paraffin sections improved by trypsin digestion. Laboratory Investigation 35: Curran RC, Gregory J. (1977). The unmasking of antigens in paraffin sections of tissue by trypsin. Experientia 33: Battifora H, Kopinski M. (1986). The influence of protease digestion and duration of fixation on the immunostaining of keratins. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 34: Fraenkel-Conrat H, Brandon BA, Olcott HS. (1947). The reaction of formaldehyde with proteins. IV. Participation of indole groups. Journal of Biological Chemistry 168: Fraenkel-Conrat H, Olcott HS. (1948). Reactions of formaldehyde with proteins. VI. Cross-linking of amino groups with phenol imidazol, or indole groups. Journal of Biological Chemistry 174: Fraenkel-Conrat H, Olcott HS. (1948). The reaction of formaldehyde with proteins. V. Cross-linking between amino and primary amide or guanidyl groups. Journal of the American Chemical Society 70: Shi SR, Key ME, Kalra KL. (1991). Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: An enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 39: Cattoretti G, Pileri S, Parravicini C, Becker MHG, Poggi S, Bifulco C, Key G, D Amato L, Sabattini E, Feudale E, Reynolds F, Gerdes J, Rilke F. (1993). Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffinembedded tissue sections. Journal of Pathology 171: Werner M, Wasielewski RV, Komminoth P. (1996). Antigen retrieval, signal amplification and intensification in immunohistochemistry. Histochemistry and Cell Biology 105: Gown AM, Wever ND, Battifora H. (1993). Microwavebased antigenic unmasking. A revolutionary new technique for rutine immunohistochemistry. Applied Immunohistochemistry 1: Leong ASY, Milios J. (1993). An assessment of the efficacy of the microwave antigen-retrieval procedure on a range of tissue antigens. Applied Immunohistochemistry 1: Bankfalvi A, Navabi H, Bier B, Böcker W, Jasani B, Schmid KW. (1994). Wet autoclave pretreatment for antigen retrieval in diagnostic immunohistochemistry. Journal of Pathology 174: Norton AJ, Jordan S, Yeomans P. (1994). Brief, hightemperature heat denaturation (pressure cooking).: A simpel and effective method of antigen retrieval for

37 Anvendt immunhistokemi 45 rutinely processed tissues. Journal of Pathology 173: Shi SR, Gu J, Kalra KL, Chen T, Cote RJ, Taylor CR. (1995). Antigen retrieval technique: A novel approach to immunohistochemistry on rutinely processed tissue sections. Cell Vision 2: Shi SR, Imam SA, Young L, Cote RJ, Taylor CR. (1995). Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of ph using monoclonal antibodies. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 43: Beckstead JH. (1994). Improved antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Applied Immunohistochemistry 2: Morgan JM, Navabi H, Schmid KW, Jasani B. (1994). Possible role of tissue-bound calcium ions in citratmediated high-temperature antigen retrieval. Journal of Pathology 174: Reynolds GM, Young FI, Young JA, Williams A, Rowlands DC. (1994). Microwave oven antigen retrieval applied to the immunostaining of cytopathology specimens. Cytopathology 5: Hølund B, Gundersen P, Holm K (1995). Can Ki67 detection be used in selection between normal cells and carcinoma in situ in smears? 9th World Congress. Cervical Pathology & Colposcopy. Abstract Tacha DE, McKinney L. (1992). Casein reduces nonspecific background staining in immunolabeling techniques. The Journal of Histotechnology 15: Linscott 34 MSRS 35 Battifora H. (1986). The multitumor (sausage) tissue block: Novel method for immunohistochemical antibody testing. Laboratory Investigation 55: Kraaz W, Risberg B, Hussein A. (1988). Multiblock: an aid in diagnostic immunohistochemistry. The Journal of Clinical Pathology 41: Miller RT, Groothuis CL. (1991). Multitumor sausage blocks in immunohistochemistry. Simplified method of preparation, practical uses, and roles in quality assurance. American Journal of Clinical Pathology 96: True LD. (1991). Parallel array method of embedding multiple tissue samples in a single paraffin block. The Journal of Histotechnology 14: Stross WP, Jones M, Mason DY. (1989). Automation of APAAP immunocytochemical technique. The Journal of Clinical Pathology 42: Pfeiffer P, Grabau DA, Nielsen O, Clausen PP. (1996). Immunohistochemical bulk staining of slides using a rack peroxidase-labelled streptavidin-biotin technique. Applied Immunohistochemistry 4: Chilosi M, Lestani M, Pedron S, Montagna L, Benedetti A, Pizzolo G, Menestrina F. (1994). A rapid immunostaining method for frozen sections. Biotechnic and Histochemistry 69: Larsson LI (1988). Immunocytochemistry: Theory and practice CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. 43 Battifora H. (1991). Assesment of antigen damage in immunohistochemistry. The vimentin internal control. American Journal of Clinical Pathology 96: Guesdon JL, Terynck T, Avrameas S. (1979). The use of avidib-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 27: Hsu SM, Raine L, Fanger H. (1981). Use of avidinbiotin-peroxidase complex (ABC). in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP). procedures. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 29: Isabella MG, Rüdiger WV, (1995). The SA/rABC technique: A new ABC procedure for detection of antigens at increased sensitivity. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 43: DakoCytomation. 48 Bobrow MN, Harris TD, Shaughnessy KJ, Litt GJ. (1989). Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Journal of Immunological Methods 125: Merz H, Malisius R, MannWeiler S, Zhou R, Hartmann W, Orscheschek K, Moubayed P, Feller AC. (1995). Immunomax: A maximized immunohistochemical method for the retrieval and enhancement of hidden antigens. Laboratory Investigation 73: De Jong ASH, Van Vark MVK, Raap AK. (1985). Sensitivity of various visualization methods for peroxidase and alkaline phosphatase activity in immunoenzyme histochemistry. Histochemical Journal 17: Scopsi L, Larsson LI (1986). Increased sensitivity in peroxidase immunocytochemistry. A comparative study of a number of peroxidase visualizing methods employing a model system. Histochemistry 84: Boenish T (1989). Handbook. Immunochemical staining methods: s Speel EJM, Schutte B, Wiegant J, Ramaekers FCS, Hopman AHN. (1992). A novel fluorescence detection method for In Situ Hybridization, based on the alkaline phosphatase-fast Red reaction. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 40: Adams JC. (1992). Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 40: Sayadi H, Fitzgibbon JF, Swanson PE, Wick MR. (1995). Azure B as a counterstain in the immunohistological evaluation of heavily pigmented nevomelanocytic lesion. Applied Immunohistochemistry 3: Williams JH, Mepham BL, Wright DH. (1997). Tissue preparation for immunocytochemistry. The Journal of Clinical Pathology 50: Arbner JM, Arbner DA, Jenkins KA, Battifora H. (1996). Effect of decalcification and fixation in paraffin-section immunohistochemistry. Applied Immunohistochemistry 4: Dash RC, Ballo MS, Layfield LJ. (1998). Decay of androgen receptor immunoreactivity in archived tissue by using monoclonal antibody F Applied Immunohistochemistry 6: Jacobs TW, Prioleau JE, Stillman IE, Schnitt SJ. (1996). Loss of tumor marker-immunostaining intensity on stored paraffin slides of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute 88: Bertheau P, Cazals-Hatem D, Meignin V, de Roquancourt A, Vérola O, Lesourd A, Séné C, Brocheriou C, Janin A. (1998). Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology 51: Shin HJC, Kalapurakal SK, Lee JJ, Ro JY, Hong WK, Lee JS. (1997). Comparison of p53 immunoreactivity i fresh-cut versus stored slides with and without microwave heating. Modern Pathology 10: Grabau DA, Nielsen O, Hansen S, Nielsen MM, Lænkholm A-V, Knoop A, Pfeiffer P. (1998). Influence of storage temperature and high-temperature antigen retrieval buffers on results of immunohistochemical staining in sec-tion stored for long periods. Applied Immunohistochemistry 6: Miller RT, Kubier P. (1997). Blocking of endogenous avidin-binding activity in immunohistochemistry. The use of egg whites. Applied Immunohistochemistry 5: Vyberg M, Nielsen S. (1998). Dextran polymer conjugate two-step visualization system for immunohistochemistry. A comparison of EnVision+ with two threestep avidin-biotin techniques. Applied Immunohistochemistry 6: Sabattini E, Bisgaard K, Ascani S, Poggi S, Piccioli M, Ceccarelli C, Pieri F, Fraternali-Orcioni G, Pileri SA. (1998). The EnVision+ system: A new immunohistochemical method for diagnostics and research. Critical comparison with APAAP, ChemMate, CSA, LABC, and SABC techniques. Journal of Clinical Pathology 51: Erber WN, Willis JI, Hoffman GJ. (1997). An enhanced immunocytochemical method for staining bone marrow trephine sections. Journal of Clinical Pathology 50: von Wasielewski R, Mengel M, Gignac S, Wilkens L, Werner M, Georgii A. (1997). Tyramine amplification technique in routine immunohistochemistry. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 45: Brassil KE (1997). Antigen retrieval in immunohistochemistry - a new method using a domestic micro-

38 46 Immunhistokemisk teknik wave pressure cooker. Australian Journal of Medical Science 18: Taylor CR, Shi S-R, Chen C, Young L, Yang C, Cote RJ. (1996). Comparative study of antigen retrieval heating methods: Microwave, microwave and pressure cooker, autoclave and steamer. Biotechnic & Histochemistry 71: Shi S-R, Cote RJ, Chaiwun B, Young LL, Shi Y, Hawes D, Chen T, Taylor CR. (1998). Standardization of immunohistochemistry based on antigen retrieval technique for routine formalin-fixed tissue sections. Applied Immunohistochemistry 6: Morgan JM, Navabi H, Jasani B. (1997). Role of calcium chelation in high-temperature antigen retrieval at different ph values. Journal of Pathology 182: Pileri SA, Roncador G, Ceccarelli C, Piccioli M, Briskomatis A, Sabattini E, Ascani S, Santini D, Piccaluga PP, Leone O, Damiani S, Ercolessi C, Sandri F, Pieri F, Leoncini L, Falini B. (1997). Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: Comparison of different methods. Journal of Pathology 183: Shi S-R, Cote RJ, Taylor CR. (1997). Antigen retrieval immunohistochemistry: Past, present and future. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 45: Leong ASY, Milios J. (1996). Epitop retrieval with microwaves. A comparison of citrate buffer and EDTA with three commercial retrieval solutions Applied Immunohistochemistry 4: Vyberg M (2000) Personlig meddelelse. 76 Taylor CR, Shi S-R, Cote RJ. (1996). Antigen retrieval for immunohistochemistry. Applied Immunohistochemistry 4: Koopal SA, Iglesias Coma M, Tiebosch ATMG, Suurmeijer AJH. (1998). Low-temperature heating overnight in Tris-HCl buffer ph 9 is a good alternative for antigen retrieval in formalin-fixed paraffinembedded tissue. Applied Immunohistochemistry 6: Shi S-R, Guo J, Cote RJ, Young LL, Hawes D, Shi Y, Thu S, Taylor CR. (1999). Sensitivity and detection efficiency of a novel two-step detectionssystem (PowerVision). for immunohistochemistry. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 7: Wester K, Wahlund E, Sundström C, Ranefall P, Bengtson E, Russell PJ, Ow KT, Malmström PU, Busch C (2000). Paraffin section storage and Immunohistochemistry. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 8: Olapade-Olaopa EO, Ogunbiyi JO, MacKay EH, Muronda CA, Alonge TO, Danso AP, Shittu OB, Terry TR, Wong AJ, Habib FK. (2001). Further characterization of storage-related alterations in immunoreactivity of archival tissue sections. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 9: Van der Broeck LJCM, Van der Vijver MJ. (2000). Assessement of problems in diagnostic and research immunohistochemistry associated with epitope instability in stored paraffin sections. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 8: Edgerton ME, Roberts SA, Montone KT. (2000). Immunohistochemical performance of antibodies on previously frozen tissue. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 8: Kämmerer U, Kapp M, Gassel AM, Richter T, Tank C, Dietl J, Ruck P. (2001). A new rapid immunohistochemical staining technique using the EnVision antibody complex. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 49: Boenisch T. (1999). Diluent buffer ions and ph: Their influence on the performance of monoclonal antibodies in immunohistochemistry. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 7: Boenisch T. (2001). Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: A comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 9: Leong AS-Y, Lee ES, Yin H, Kear M, Haffajee Z, Pepperall D. (2002). Superheating antigen retrieval. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 10: Marzo AMD, Fedor HH, Gage WR, Rubin MA. (2002). Inadequate formalin fixation decreases reliability of p27kip1 immunochemical staining: Probing optimal fixation time using high-density tissue microarrays. Human Pathology 33: Shi S-R, Cote RJ, Liu C, Yu MC, Castelao JE, Ross RK, Taylor CR. (2002). A modified reduced-temperature antigen retrieval protocol effective for use with a polyclonal antibody to Cyclooxygenase-2 (PG 27). Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 10: Nielsen S (2002). Personlig meddelelse. 90 Petrosyan K, Tamayo R, Joseph D. (2002). Sensitivity of a novel biotin-free detection reagent (PowerVision+). for immunohistochemistry. Journal of Histotechnology 25: Skacel M, Skilton B, Pettay JD, Tubbs RR. (2002). Tissue microarrays: A powerful tool for highthroughput analysis of clinical specimens: A review of the method with validation data. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology 10:1. 92 Nielsen L, Jensen J. (2003). Endogen peroxidase? Metastase?: KL1 på Sentinel Node frysesnit. Erfaringer fra Vejle Sygehus. Poster ved Histologisk årsmøde for bioanalytikere.