Immunhistokemi kombineret med special farvninger

Transkript

1 BACHELOR 2015 Immunhistokemi kombineret med special farvninger - Udført med CD3, Alcian Blue, PAS og DPAS med henblik på diagnosticering af MB Sjögrens Syndrom Maria Villadsen Studienummer Vejleder fra Metropol Lektor Annette Stenlov Klinisk vejleder Bioanalytiker underviser Camilla Christine Qvist Uddannelsessted Professionshøjskolen Metropol Sted Bispebjerg hospital/rigshospitalet Periode Anslag uden mellemrum / 64

2 Figurforklaring forside Linje 1 fra venstre CD3+Alcian Blue Delforsøg 1. Blok 16 50x forstørrelse Alcian Blue Delforsøg 1. Blok 16 50x forstørrelse CD3 + DPAS Delforsøg 5. Snit 16 50x forstørrelse Linje 2 fra venstre D-PAS + CD3. Delforsøg 1. Blok 16 50x forstørrelse PAS+CD3 Delforsøg 1. Blok 16 50x forstørrelse CD3 + PAS Delforsøg 5. Snit 16 50x forstørrelse Alcian Blue+ CD3 Delforsøg 1. Blok 16 50x forstørrelse Linje 3 fra venstre CD3 Delforsøg 1. Blok 16 50x forstørrelse PAS Delforsøg 1. Blok 16 50x forstørrelse Abstract Sjögren's Syndrome is an autoimmune illness which causes the exocrine cells of the body to produce less mucus. Affected individuals may experience dryness, mainly in the mouth and eye area. Depending on the stage of the illness the symptoms can range from an irritation through to painful. The illness is diagnosed by a pathologist who would examine a tissue biopsy from the saliva gland stained with HE along with several different histochemical and immunohistochemical staining. As the pathologist needs to switch between a lot of different object glasses and retain different findings in the various layers of the cut tissue it is a time consuming and difficult process to provide a diagnosis for the patient. This study aims to examine whether or not it is possible to combine the histochemical stains of either Alcian Blue, PAS or DPAS with the immunohistochemical dye CD3 to reduce the amount of needed tissue and stains and make the diagnosis easier and faster for the pathologist. We are using formalin fixed, paraffin-lip biopsies from patients with Sjögren's syndrome, which is pretreated with HIER and subsequent immune stained with CD3 on Dako Autostainer Link 48 followed by a special staining (DPAS with saliva, PAS or Alcian Blue) performed on Tissue-Tek Prisma to achieve the most suitable double staining. The study found that it is possible to combine DPAS, PAS and Alcian blue with CD3 as long as the CD3 is applied first. However the study also shows that when using DPAS combined with CD3 it is needed to use saliva instead of amylase powder, otherwise carbohydrates and mucus in the tissue will appear unstained. These double staining may be used by pathologists in the diagnosis of Sjögren's Syndrome. 1 / 64

3 Forord Dette bachelor projekts praktiske aspekter er udført på henholdsvis Rigshospitalets patologiafdeling og Rigshospitalet patologi: Team Bispebjerg hospital. I den anledning vil jeg gerne takke afdelingen og dets personale for at stille laboratorium, ressourcer og hjælpende hænder til rådighed under forsøgets tilblivelses periode. Jeg vil gerne sige en stor tak til Jane Andersen for hendes ekspertise inden for immunfarvninger og Ilker Ceylan for at hjælpe med at mikroskopere og vurderer vores resultater mht. CD3. Jeg vil gerne takke Katalin Kiss for muligheden for at anvende hendes ekspertise på området Sjögrens Syndrom, samt for hendes interesse i projektets udførelse. En særlig tak går til Morten Mazur Nielsen for hans støtte og hjælp gennem hele perioden hvor jeg har skrevet min bachelor. Til sidst vil jeg gerne takke de medstuderende Tanpreet Kaur og Lars Hvidtfeldt for deres opbakning, tålmodighed og et godt samarbejde under hele projektet. Den allersidste tak går til bioanalytiker underviser Camilla Christine Qvist og Lektor Annette Stenlov for deres professionelle vejledning og støtte under hele forløbet. 2 / 64

4 Indholdsfortegnelse Abstract... 1 Forord... 2 Ordforklaring... 4 Introduktion... 5 Problemformulering... 6 Metodevalg... 7 Fravalg Teori Materialer Metode Forsøgsopstilling Anvendte farveprocedurer for CD Farveprocedure for Alcian Blue - Modificeret Farveprocedure for PAS & DPAS- Modificeret Kriterier for datavurdering (resultatvurdering) Resultater Diskussion Delforsøg Delforsøg Delforsøg Delforsøg Delforsøg Katalin Kiss s vurdering af IHC/SPEC Spyt vs. Amylase Reliabilitet Validitet Konklusion Perspektivering Referenceliste/literatur Bilag / 64

5 Ordforklaring SS Sjögrens Syndrom HIER Heat induced epitope retrieval Varmebehandling af formalin fikseret væv for demaskering af epitoper. IHC Immunhistokemiske farvninger SPEC Special farvninger DPAS, Alcian Blue, PAS HE Hæmatoxylin-Eosin Den anvendte oversigtsfarvning på RHPA og RHPA team Bispebjerg. PAS DPAS Period-Acid-Schiff Diastase Period-Acid-Schiff. RTU Ready To Use Antistoffer som er blandet af producenten, og som vi ikke kender det egentlige indhold af. RHPA Rigshospitalets Patologi afdeling. ZAC Zeiss Axio Scan ZI Maskine der ønskes anvendt til automatiseret scanning af væv. Alcian Blue I dette forsøg anvendes Alcian Blue pyridin variant. Alle steder i denne opgave hvor der står Alcian Blue, menes Alcian Blue pyridin variant, medmindre andet er anført Personer Lars Hvidtfeldt Tanpreet Kaur Katalin Kiss (KK) Camilla Qvist Annette Stenlov Jane Andersen Ilker Ceylan Medstuderende på dette bachelorprojekt. Indgår når der skrives "vi" i opgaven. Medstuderende på dette bachelorprojekt Indgår når der skrives "vi" i opgaven. Overlæge på Rigshospitalet med speciale i diagnostisk af Sjögrens Syndrom. Klinisk vejleder og Bioanalytiker underviser. Lektor og vejleder fra Metropol. Bioanalytiker og fag specialist inden for immunhistokemi. Bioanalytiker og fag specialist inden for immunhistokemi. 4 / 64

6 Introduktion Sjögrens Syndrom er en autoimmun lidelse som forekommer i 1-3% af den voksne befolkning. Sygdommen forekommer hyppigst hos kvinder i års alderen og er næsten ni gange større hos kvinder end hos mænd. Patienter med denne sygdom oplever ofte tørre øjne, tør mund og træthed som kan give store irritationer eller smerter. Tørheden dog også påvirke andre steder, såsom tør hud, vagina eller luftveje. Sygdommen ses som en kronisk inflammations tilstand i eksokrine kirtler, herunder spytkirtler og tårekanaler. Sygdommen er ikke dødelig, men ses ofte sammen med andre autoimmune lidelser eller lymfekræft. [4][14] For at en patient kan diagnosticeres med Sjögrens Syndrom(SS), sammenholdes patientens kliniske symptomer med en læbebiopsi som formalin fikseres, indstøbes, skæres, sættes på glas og til sidst farves med forskellige immun- og histokemiske farvninger. Først farves et glas med HE som oversigtsfarvning. Herefter udføres forskellige special farvninger: Alcian Blue, PAS, DPAS og Immunhistokemiske farvninger(kernemarkører): CD20(klon L26), MUM5, CD79a( klon JCB117), Ki67( klon MIB-1) + CD3(polyklonalt)som kernefarves med Mayers sure hæmatoxylin. Når alle vævs snittene er farvet mikroskoperes de af en patolog. Ifølge overlæge Katalin Kiss(KK) som er specialiseret i diagnostisk af Sjögrens Syndrom på Rigshospitalet, ses der I histologiske vævs snit fra patienter med Sjögrens Syndrom en infiltration af B og T lymfocytter i de berørte områder. De steder hvor lymfocytterne ophober sig kaldes for fokus områder, og ifølge Katalin Kiss skal så skal disse områder have over >50 lymfocytter i et område for at en patient kan mistænkes for at have SS. Katalin Kiss ser på hvor stort hele vævs stykket er, og antallet af fokus områder samt størrelsen af disse. Ud fra disse parametre får Katalin Kiss en score som hun bruger til at vurdere sværhedsgraden af SS. Scoren beskriver hvor mange lymfocytter der er ophobet sig i et område på 4mm 2. [10] Sværhedsgraden af SS er i sidste ende med til at diagnosticere hvilken grad af SS som patienten har, og hermed til at bestemme hvilken behandling patienten i sidste ende skal have. Ifølge Rigshospitalets Patobank "Cyres" er der inden for det sidste år blevet diagnosticeret 33 patienter med sygdommen Sjögrens Syndrom. Dette er over en fordobling i forhold til de sidste to år. Som tingene er nu er den metode Katalin Kiss anvender, en HE farvning sammenholdt med forskellige histokemiske(special farvning(spec)) og immunhistokemiske(hc) farvninger. Her tæller hun antallet af fokus grupper i vævet samt måler hvor stort et område fokus grupperne fylder i forhold til biopsiens størrelse. Ifølge Katalin Kiss er problemet med diagnostikken lige nu at de mange forskellige glas med de forskellige farvninger gør det besværligt at tælle antallet af leukocytter. Dette skyldes blandt andet at for hvert vævs snit der skæres, kan det ske at der skæres ned i nye celle lag hvilket gør det besværligt at orientere sig i vævet og vurdere hvilke celler der allerede er blevet talt. Ydermere er læbebiopsierne meget små, og herved er der risiko for at noget af patient materialet bliver skåret væk når der anvendes mange glas med forskellige farvninger. Når 5 / 64

7 der skal skiftes mellem mange forskellige glas med forskellige farvninger, og herefter sammenholde resultaterne, bliver det en besværlig og langsommelig proces for KK. Hun er derfor interesseret i at teste hvorvidt nogle glas kan spares væk ved at kombinere CD3 med special farvningerne Alcian Blue, PAS og DPAS(Altså IHC og SPEC på et glas). Såfremt der fås nogle gode resultater vil andre Bachelor studerende afprøve andre antistoffer(cd 20(klon L26), MUM5, CD79a( klon JCB117), Ki67( klon MIB-1). Til sidst synes Katalin Kiss at det kunne være interessant at se hvorvidt det er muligt at Zeiss Axio Scan ZI (ZAC) scanneren kan bruge vores resultater til at tælle fokus grupperne automatisk. Katalin er altså interesseret i at det bliver lettere og mere overskueligt at stille diagnosen SS, både fordi det kan spare den tid hun bruger på diagnosen, men også for at patienten hurtigere får sin diagnose. I vores forsøg vil vi prøve at kombinere Alcian Blue, PAS og DPAS med antistoffet rettet mod CD3. Da forsøget ikke før har været udført er det derfor nødvendigt for os at prøve os frem for at se om vi får de bedste resultater ved at påføre vævet special farvninger først efterfulgt af CD3, eller om det bedste resultat fås ved først at påføre CD3, og derefter påføre special farvningerne. I den første del af vores forsøg vil vi udføre de forskellige special farvninger manuelt mens immun farvningerne udføres på immunstainerdakoflex48. Såfremt at vi får gode resultater med den første del af forsøget, så vil vi afprøve vores forsøg på specialfarvemaskine Tissue-Tek Prisma da vi ønsker at overføre vores forsøg til at kunne anvendes rutinemæssigt. Til vurdering af vores resultater har vi opstillet 3 scorings skemaer som kan ses i afsnittet resultatvurdering. Problemformulering Hvorledes opnås en egnet immunfarvning med antistoffet CD3 kombineret med henholdsvis PAS, D-PAS og Alcian Blue specialfarvning, på formalinfikseret paraffinindstøbt væv fra spytkirtel, til scoring af Sjögrens syndrom, ved brug af immunstainerdako flex48 samt specialfarvemaskine Tissue-Tek Prisma? 6 / 64

8 Valg af kontrol væv Metodevalg Vi anvender positive kontroller for at kunne vurdere hvorvidt vævet er blevet farvet optimalt. Samtidig er det muligt at spore hvor eventuelle fejl har fundet sted undervejs i forsøget. Den kontrol vi anvender er en formalin fikseret paraffin indstøbt blok bestående af 4 typer væv (lever, tonsil, pancreas og appendix) kaldet Multi-1. Denne kontrol anvendes fordi komponenter i de 4 vævstyper vil reagere med vores immun- og special farvninger, samtidig med at denne type af kontrol er den rutinemæssige anvendte på RPA. Multi-1 vil være på alle glas undtagen enkeltfarvninger. Dette gøres for at tjekke om farvningen er farvet korrekt, samt at der ikke har manglet farvevæske under den automatiske farvning på Dako Autostainer Link 48 samt specialfarvemaskine Tissue-Tek Prisma. Der påsættes ikke multi-1 på HE da HE i forvejen er en kontrol. Udover multi-1 vil indkørings blok 16 fungere som kontroller for vores SPEC farver. Dette gøres for et ensartet resultat. Figur 1 Objektglas med Multi-1 kontrol med de 4 vævstyper i toppen og prøvemateriale i bunden. Valg af indkørings væv Som indkørings materiale anvender vi tunge- og mundbunds biopsier, da læbebiopsier er meget små og herved kun giver sparsomt med prøvemateriale. Da der skal afprøves både IHC og SPEC farvninger på vævet, er det nødvendigt med mere prøvemateriale end læbebiopsier kan give. Dette skyldes, at ved meget lidt væv er der en risiko for at skære de fokus områder af vævet væk, som lægen Katalin Kiss er interesseret i at diagnosticere på. Katalin Kiss anbefaler herudover også at vi bruger tunge- og mundbunds biopsier. Herudover anvender vi tunge- og mundbunds biopsier til indkørings materiale da disse indeholder både slim, epitel, kulhydrater og lymfocytter ligesom læbebiopsierne gør. Valg af patient materiale Det patient materiale vi anvender, er læbebiopsier, da det er disse som RHPA anvender til at diagnosticere SS ud fra, og hermed er det der gøres rutinemæssigt. Ifølge KK anvendes læbebiopsier da disse små spytkirtler på indersiden af læben er de mest tilgængelige og vil give langt færre komplikationer for patienten, end hvis man anvender biopsier fra andre kirtler. Samtidig mener KK at da læbebiopsierne udelukkende består af mucinøse acini(epitelceller som sekrerer muciner), så vil slimfarvningerne, som kun farver disse kirtler, være et perfekt mål for kirtlernes størrelse. Herved er de optimale til at anvende da Katalin Kiss ønsker at teste hvorvidt ZAC scanneren kan anvendes til tælling af lymfocytter og arealet af kirtlerne. 7 / 64

9 Vi anvender paraffin indstøbte læbebiopsier som der allerede har været anvendt til diagnostisk af SS, og vi har valgt disse da Katalin Kiss har sagt at de er optimale at anvende. For at finde læbebiopsier har vi søgt i RHPA's patologibank "Cyres". Her har vi søgt efter indstøbte vævs blokke imellem og med koden S38300 (koden for SS) Vi søgte både materiale modtaget på Rigshospitalet Patologiafdeling og Bispebjerg Patologiafdeling da disse administrativt er en afdeling. Alle blokke med obs. SS er ikke medtaget i forsøget. Vi fandt 33 patienter hvoraf 20 er blevet godkendt af KK til at udføre vores forsøg på. Til at få en ide om hvor mange blokke der normalt laves årligt, søgte vi også på de foregående år, hvor der henholdsvis er modtaget 14 og 16 blokke med diagnostikken Sjögrens Syndrom. Valg af fikseringsmiddel Alt anvendt væv er fikseret i 3,7 % neutral buffet formaldehyd (NBF). Denne metode vælges da det er den rutinemæssige benyttede metode på RHPA samt at denne metode er godt til at bevare vævets strukturer. Proteinernes tertiære strukturer bliver stabiliseret ved at der dannes methen broer mellem proteinerne i vævet. [2][12][16] Valg af indstøbning af væv Kontroller, indkørings blokke og patient materiale(læbebiopsier) er alle indstøbte i paraffin efter fiksering i 3.7% NBF. Vævet indstøbes i paraffin for at stabilisere vævet mens det skæres, samt at paraffin menes at bevare epitoperne i vævets antigenisitet såfremt at vævet er helt gennem paraffin infiltreret. Herudover er paraffin indstøbt væv den rutinemæssige anvendte metode på RHPA. [12] [13] Valg af skæring af væv Vævet skæres på et slædemikrotom af en rutineret bioanalytiker, for et ensartet resultat. Vi anvender en rutineret bioanalytiker til skæring af vævet, grundet de studerendes manglende erfaring på dette område. Tykkelse på vævet skal være omkring 2-3μm, da der kun ønskes et lag af celler i hvert vævs snit. Skæring af paraffin indstøbt væv sker i overensstemmelse med Rigshospitalets procedurevejledning til skæring og hermed deres rutinemæssige anvendte metode. [15][12] Valg af objekt glas De snit som skal specialfarves bliver sat på superfrost glas, mens snit hvor vævet skal bruges til immunfarvninger bliver sat på superfrost+ glas. Anvendelse af objektglas Superfrost+ til immunfarvninger nedsætter risikoen for at vævs snittene falder af glassene under farvningen. Herudover anvendes disse glas da det er den rutinemæssige anvendte metode på RHPA. [12] Valg af afparaffinering Vi anvender afparaffinering for at kunne farve vævet optimalt. Ved rester af paraffin i vævet ved farvning, vil disse områder ikke blive farvet. 8 / 64

10 Til afparaffinering af snit til SPEC farvninger anvendes bade af Tissue Clear efterfulgt af bade med ethanol. Koncentrationen af alkoholen ligger på 70, 96 og 99,9% hvor snittene føres gennem de højeste procenter mod de laveste procenter hvor snittene til sidst stilles i vand. Herefter er snittene klar til at farve. Dette er den metode som anvendes for vævs snit farvet i hånden. De vævs snit som skal have IHC farvning skal stå i varmeskab indtil paraffinen er smeltet. Herefter forbehandles vævs snittene i Dako-Link som er en forbehandling med HIER hvor paraffinen blandt andet fjernes. Dette er den rutinemæssige anvendte metode på RHPA. Valg af forbehandling (HIER) Til forbehandling af vævet anvendes HIER. Denne metode vælges da der ifølge Mogens Vyberg anvendes HIER i ca. 90% af alle tilfælde [12], og er den type forbehandling som anvendes på RPA, og herved anses som den mest almindelige. Derudover er HIER den forbehandling som anvendes ved brug af CD3, hvilket er endnu en grund til at anvende HIER. Valg af buffer til HIER Vi anvender buffer ved høj ph (ph 9), da dette ifølge Dako er den ph hvorved CD3 har sit optimum. Herudover er ph9 for antistoffet CD3 det antistof som RHPA anvender rutinemæssigt. De steder i vores forsøg hvor vi har forbehandlet vores special kontroller med HIER har således været ved ph 9 for at teste hvorvidt vores forbehandling har haft indflydelse på vores resultater. Valg af antistoffer CD3 anvendes som en kernemarkør for lymfocytter, hvorved det anvendes til at påvise lymfocyt fokus grupper i vævet som forekommer ved Sjögrens Syndrom. Vi vælger at anvende det polyklonale antistof CD3, da dette antistof ofte anvendt til diagnose af SS ifølge Katalin Kiss, og hermed er et antistof hun har ønsket at få afprøvet. Ydermere siger Jane at CD3 er et af de nemmeste antistoffer at begynde med da dette er meget stabilt. Vi anvender det polyklonale CD3 og får hermed har en højere sensitivitet, og dermed øger chancen for at få noget farvet. Dette gøres fordi det er de antistoffer der anvendes rutinemæssigt på RPA. Da antistoffet er af RTU karakter, er det fremstillet af firmaet, og herved er koncentrationen af opløsningen ikke oplyst. Vi anvender Dako s antistoffer, da det det er den leverandør afdelingen anvender. Valg af HE Vi anvender HE som en oversigtsfarvning da dette bruges rutinemæssigt på RPA. Vi vælger at have en HE farvning på alle indkøringsblokke, så hvis der senere bliver tvivl om noget i morfologien, så kan vi anvende vores HE snit som en kontrol. Der vælges dog ikke at bedømme eller tage højde HE snittene under forsøget da dette ikke er relevant for vores forsøg. 9 / 64

11 Valg af manuel farvning Vi vælger at farve special(spec) farvningerne manuelt indtil vi vurderer at de forskellige parametre er optimale nok til at vi kan afprøve vores forsøg på Tissue-Tek Prisma. Dette gøres både fordi det er besværligt for os at skulle have en fag ansvarlig til at programmere maskinen til at ændre forskellige parametre hver gang vi ændrer noget i vores forsøg, samt at maskinen bliver brugt i rutinen, så det er ikke sikkert at alle de farvevæsker vi skal anvende har en plads i maskinen samt at hvis der er travlt i rutinen er det ikke sikkert at vi kan få vores snit farvet når det passer os. IHC farvningerne farves ikke i manuelt. Valg af farvemaskiner Dako Autostainer Link 48 Farvning af vævs snittene indeholdende et IHC element, altså CD3, bliver farvet på Dako Autostainer Link 48 fordi det er den anvendte maskine på RPA. Alle farvninger sker i henhold til afdelingens farveprotokoller da vi ikke er interesseret i at ændre nogen parametre i farvningen. De anvendte reagenser og farveprotokoller som anvendes er dem som rutinemæssigt anvendes på RHPA. Dako Autostainer Link 48 den maskine vi kender og som vi har modtaget mest undervisning i samt at det CD3 antistof vi anvender, er lavet af Dako hvorved det giver mening at bruge Dako Autostainer Link 48. Tissue-Tek Prisma Når vi har vurderet at vores SPEC farvninger er optimale nok til at blive afprøvet rutinemæssigt vil (DPAS, PAS, Alcian Blue) bliver farvet på Tissue-Tek Prisma. HE oversigtsfarvning farver vi altid på da Tissue-Tek Prisma da denne metode er den rutinemæssige anvendte metode på RPA. Denne maskine anvendes fordi vores forsøg blandt andet går ud på at undersøge hvorvidt det er muligt at anvende en kombination af immun- og histokemiske farvninger i rutinen på RPA, derfor ønsker vi at få resultater som kan sammenlignes med nuværende rutine. Dog vil der forekomme ændringer i farve forskrifterne hvis vi under forsøget vurderer at dette vil give en mere optimal farvning for vores forsøg. Valg af special farvninger Alcian Blue bruges til at påvise sure muciner, PAS påviser sure kulhydrater og glycoproteiner og DPAS påviser. Vi vælger disse farvninger da de i forvejen indgår som en del af SS diagnosticering i rutinen på RPA, samt at alle tre farvninger anvendes som oversigtsfarvning i cytoplasma og omkringliggende væv og derfor forventes at kunne anvendes i kombination med CD3. Desuden er disse farvninger ønsket afprøvet af Katalin Kiss da hun vil bruge slimfarvningerne for at bestemme arealet af spytkirtel væv og immunfarvningen for lymfocytter for at få talt disse. Valg af Amylase eller spyt På RHPA anvendes i dag amylase i rutinen ved farvning af DPAS. Men tidligere har den metode man anvendte været at bioanalytikeren har spyttet på de glas hvor der i dag anvendes amylase. Derfor kan vi ved uforventede resultater med amylase anvende spyt da det tidligere har været brugt i rutinen samt at Katalin Kiss siger at det kan vi godt såfremt amylase ikke virker optimalt. 10 / 64

12 Fravalg Statistik Da vores forsøg er et nyt forsøg, og ikke en dataindsamling, og da statistik det ikke er relevant for scoring af farveintensitet, fravælges denne form for databehandling. ZAC Vi vælger ikke at undersøge hvorvidt ZAC scanneren kan anvendes til automatisering af diagnosen SS da vores fokus ligger i hvorvidt selve IHC/SPEC og SPEC/IHC farvningerne kan lade sig gøre. Dog vil patolog Katalin Kiss i sin vurdering af forsøgets egnethed til diagnosticering af SS, lægge vægt på om hvorvidt farvningerne vil kunne automatiseres vha. ZAC scanneren. Valg af resultatvurdering Til vurdering af resultater gennem forsøgets 5 delforsøg, anvendes scorings skemaer som tager udgangspunkt i RHPA's måder at score SPEC farvet vævs snit på, samt NordiQC's måder at score deres Assessment runs på deres forskellige IHC farvninger. [17] Skemaerne er delt op således at alle SPEC farver farves ud fra "SPEC farvnings scoringsskema" mens IHC farvninger scores ud fra SPEC farvnings scorings skema" og farvninger som både indeholder SPEC og IHC farvninger scores efter "IHC/SPEC farvnings scorings skema". Den lavest givne score for IHC/SPEC angiver den maksimale score som farvningen kan få. Hvis IHC farvningen får score 3, men SPEC får score 2, så er den samlede score for de to farvninger score 2, altså acceptabel. Det fælles scorings skema ses nedenunder mens de individuelle SPEC og IHC scorings skemaer findes under Samlet score for IHC/Special farvninger, side 34. IHC/SPEC farvnings scorings skema Score 1 Score 2 Score 3 Uacceptabel til diagnostisk brug Uacceptabel immunfarvning med en uacceptabel, acceptabel eller optimal special farvning eller en uacceptabel special farvning med en uacceptabel, acceptabel eller optimal immunfarvning. Acceptabel til diagnostisk brug Acceptabel immun farvning med acceptabel eller optimal special farvning eller acceptabel special farvning med en acceptabel eller optimal immun farvning. Optimal til diagnostisk brug Optimal immunfarvning med optimal special farvning. 11 / 64

13 Katalin Kiss s vurdering af IHC/SPEC Score 1 Score 2 Score 3 Uacceptabel til diagnostisk brug Farvningen kan ikke bruges til diagnose af Sjögrens Syndrom. Acceptabel til diagnostisk brug Farvningen kan bruges til diagnose af Sjögrens Syndrom men bør optimeres Optimal til diagnostisk brug Farvningen er optimal kan anvendes til diagnose af Sjögrens Syndrom. For at det kan vurderes hvorvidt vores farvninger kan anvendes af Katalin Kiss til diagnosticering af Sjögrens Syndrom, skal de farvede vævs snit i delforsøg 5 have en score. Denne score kalder jeg Katalin Kiss's vurdering af IHC/SPEC. Scoren deles op i om farvningen er 1: uacceptabel, 2: acceptabel eller 3:optimal til diagnose på det pågældende vævs snit. Scoringsskemaet har tre scorings trin for at det er lettere at sammenligne resultaterne af KK's vurdering af IHC/SPEC med de andre anvendte scorings skemaer. Dette er en fordel hvis man f.eks. ønsker at se om der er en sammenhæng mellem hvad en IHC/SPEC farvning har fået i score og om vævs snittet ifølge KK kan anvendes til diagnose af SS. 12 / 64

14 Valg af delforsøg 1 Forsøget ønskes udført af Katalin Kiss, og hun vurderer at de SPEC farver som er vigtigst for vores forsøg er Alcian Blue, PAS og DPAS samt at CD3. Delforsøg 1 går ud på at vurdere om det er muligt at kombinere CD3 sammen med Alcian Blue, PAS og DPAS således at der på et objekt glas er en IHC og en SPEC farvning til stede samtidig. For at vurdere om de bedste resultater vil fås ved at påføre IHC eller SPEC farvningen først, har jeg set på et par artikler som anvender SPEC kombineret med IHC farvninger. Et studie, udført af Corbellini et al. udførte et forsøg på humant mama væv med resultater der viste at man fik den mest optimale farvning ved at tilføre IHC, og derefter påføre SPEC farvning. [6] Et andet forsøg er udført Tacha et al, som har en Alcian Blue/PAS farvning kombineret med Napsin A og TTF-1 på humant lunge væv. Deres forsøg var sat op således at de SPEC farvninger var påført vævet først hvorefter IHC tilføres hvilket gav gode resultater. [7] Da disse studier viser to forskellige resultater vil begge metoder afprøves, for at finde det bedste egnede resultat. De to artikler anvender forskellige typer af væv, og det er for os interessant at undersøge om enten IHC/SPEC eller SPEC/IHC kan anvendes forbindelse med Sjögrens syndrom. Det materiale vi anvender til at udføre forsøget på er indstøbte tunge- og mundbunds resektater. Vi fik udleveret 16 blokke som er fra den samme patient. Disse 16 blokke har hver fået farvet et HE snit som Katalin Kiss har brugt til at vurdere hvilke blokke der ville være bedst at udføre vores forsøg på (altså hvilke blokke som er bedst til indkørings materiale). KK vurderer at blok 16 er bedst, efterfulgt af blok 8 og 2. Forsøgsopstilling delforsøg 1 side 24. Valg af delforsøg 2 Efter mikroskopering af delforsøg 1 vurderer de studerende og Camilla Christine Qvist at de vævs snit som er farvet med IHC efterfulgt af SPEC giver de bedste resultater. Delforsøg 2 går ud på at prøve at optimere farvningerne således at vores resultater bliver endnu bedre. I delforsøg 1 så vi at kernefarvningen med Mayers hæmatoxylin gav et meget mørkt resultat, og vi vurderer derfor i samråd med Camilla Christine Qvist at vi sagtens kan anvende Mayers sure hæmatoxylin til alle SPEC kernefarvninger. Herudover vælger vi at sænke tiden i Mayers sure hæmatoxylin fra 5 til 2 min da de i immun lab kernefarver deres IHC farvninger med 2 min i Mayers sure hæmatoxylin. Herudover vurderer de studerende at efter som RHPA har to procedure vejledninger for PAS, en hvor snittene farves i 20 min i Schiff's reagens og en hvor PAS får 40 min i Schiff's reagens, at afprøve hvor stor en forskel de 20 min ekstra i Schiff's reagens giver. Forsøgsopstilling delforsøg 2, side / 64

15 Valg af delforsøg 3 Da vi i delforsøg 2 ser at CD3 kombineret med Alcian Blue fungerer optimalt vurderer vi at der i dette forsøg ikke er behov for optimering af denne farvning. I stedet vurderer vi at det er nødvendigt at optimere DPAS da denne farvning ikke er optimal. Da det virker som at nogle steder i vævet ikke bliver farvet optimalt, vurderer vi at i dette delforsøg vil vi forsøge at ændre farve tiderne i amylase for DPAS. Vi forsøger med farve tiderne 20 og 40 min i amylase for hver indkøringsblok (2,8,16) hvor vi ellers følger resten af farveforskriften som normal vis. Da vi mistænker HIER for at være en af de faktorer der spiller ind i DPAS's forkerte udseende, vælger vi at forbehandle vores kontroller for SPEC farvningen i HIER. Herudover vælger vi også efter en samtale med Katalin Kiss og vores kliniske vejleder Camilla Christine Qvist at det er en god ide at afprøve hvorvidt spyt vil give de samme resultater. Dette vælges blandt andet fordi spyt tidligere har været anvendt på afdelingen. Forsøgsopstilling delforsøg 3, side 26. Valg af delforsøg 4 Dette delforsøg går ud på at se om vi kan overføre vores manuelle farvninger til at kunne fungere optimalt rutinemæssigt. Farvningerne udføres på henholdsvis Tissue-Tek Prisma og Dako Autostainer Link 48. DPAS i dette forsøg foregår dog manuelt da der skal spyt på disse snit. Der spyttes på snittene inden de sættes på Tissue-Tek Prisma. Forsøgsopstilling delforsøg 4, side 27. Det anvendte prøve materiale er indkørings materiale blok 16. Valg af delforsøg 5 Da vi i samråd med Camilla Christine Qvist har vurderet at resultaterne fra delforsøg 4 er optimale, vælger vi at afprøve om vores farvninger vil fungere optimalt på læbebiopsier fra forskellige patienter når forsøget udføres rutinemæssigt. Det væv vi anvender, har Katalin Kiss har vurderet vil være optimale til at udføre forsøget på. Prøve materiale 20 læbebiopsier fra patienter. Forsøgsopstilling delforsøg 5, side / 64

16 Sjögrens Syndrom Teori Sjögrens Syndrom er en kronisk inflammatorisk og autoimmun sygdom. Sygdommen ses som en infiltration af B og T- lymfocytter som gradvist ødelægger spyt og tåre kirtler som fører til at patienter oplever symptomer som tør mund og øjne. CD3 molekylerne sidder i cellemembranen i T-celler. T-celler er en del af det specifikke immunforsvar som bekæmper fremmedlegemer som fx virus. Ved SS ses færre udtrykte CD3 antigener samt svækket funktion af CD3 i positive T lymfocytter. Herimod ses en B-lymforcyt hyperaktivitet hos patienter med SS. B-lymfocytter er den del af immunforsvaret som producerer antistoffer rettet mod fremmede antigener. [19][10] Der er opstået en autoimmunitet, med et immunrespons som er redigeret imod forskellige antigener som er til stede over alt i epitel væv. De autoantistoffer som dannes mod disse antigener menes at forhindre stimulering af sekretionen af tårer og spyt og man mener hermed at disse er skyld i sygdommens karakteristika. Ydermere er eksokrint væv infiltreret med aktiverede cytotoksike lymfocytter, som medfører død af eksokrine kanaler og deres acinar (små sækkelignede hulrum) epitel, med tab af funktionel spytkirtel væv. [4] HIER (heat induced epitope retrival) HIER er en forbehandling som anvendes på formalin fikseret væv. Ved formalin fiksering af væv nedsættes sensitiviteten af Immunhistokemiske farvninger. Dette skyldes de methen broer som dannes i vævet ved formalin fikseringen. Disse methen broer "blokerer" eller "maskerer" de epitoper som ønskes at påvises, og derved hindrer bindingen af antistoffer. Vandbad er alle almindeligt brugt til HIER demaskering. På Rigshospitalet anvendes Dako Link som har et vandbad hvori der tilføres en ph buffer afhængig af det antistof der senere skal farve vævet. Dako Target Retrieval Solution Tris-EDTA, ph 9 eller Dako Target Retrieval Solution Citratbuffer ph 6. Temperaturen i dette varmebad er 85 C når maskinen starter, og 97 C under selve forbehandlingen. HIER demaskerer antigenerne i vævet ved at fjerne de calcium ioner som er bundet til methen broerne. I den buffer som anvendes ved HIER forbehandling, forefindes blandt andet citrat og EDTA(afhængig af den valgte buffer) som begge binder calcium ioner. Herudover kan de methen broer som dannes under formalin fiksering fjernes ved varmebehandling, da de er reversible. Ved anvendelse af antistoffer som CD3 er det derfor nødvendigt at anvende HIER for at demaskere disse maskerede epitoper. [8] 15 / 64

17 Mayers sure hæmatoxylin Al-hæmatein er et metal kompleks farvestof og tiltrækkes af de negativt ladede vævskomponenter, dvs.carboxylsyre grupper i protein og kulhydrater, sulfat grupper i kulhydrater samt fosfat rygraden i nucleinsyrer. Ved ph 2,4(sur Mayer) og et Al3+ :hæmatein forhold på 33 : 1 vil Al-hæmateinen fortrinsvis op koncentreres nær DNA og RNA s ioniserede fosfat rygrad og herved farve kernerne. Dette skyldes at den store mængde af Al 3+ vil blokere nogle af de carboxylsyre grupper i protein og kulhydrat hvorved Mayers sure hæmatoxylin bliver mere selektiv for kerner end Mayers [3] [9] [2] hæmatoxylin. ph hæves i rindende vand og Al-hæmatein farven skifter fra rød til blå. I vores anvendte væv farves kerner blå. Alcian Blue Alcian Blue er et kationfarvestof med 8 positive ladninger. Farvestoffet har svært ved at danne Londonbindinger med positivt ladede vævskomponenter som f.eks. proteiner og vil herved frastøde disse grundet de mange positive ladninger. Derimod vil Alcian Blue have en stærk iontiltrækning til sure muciner. [2] Farvestoffet består af et stort upolært aromatisk ring-system, som gør at molekylerne i vand kan danne dimer ved hjælp af Londonbindinger. Ved ph 3 er Alcian Blue selektiv for alle (både sulfaterede og carboxylerede) sure kulhydrater i slim, i brusk og i mastceller. DNA og RNA farves kun svagt fordi molekylerne blokeres af positivt ladede proteiner og protein farves stort set ikke da de fleste proteiner har et ph iso på >5. Alcian Blue ph 3 er derfor næsten selektiv for sure kulhydrater. [3] I forsøgets anvendte væv farver Alcian Blue sure muciner og kulhydrater er farvet klar turkis farve. PAS Period-Acid-Schiff er en anvendt kulhydrat farvning, hvor et farvestoffet Schiff s reagens bindes kovalent til vævskomponenter hvis reaktive grupper er kunstigt fremkaldt ved oxidation. [2] Perjod syre Med 0,5% w/v periodsyre fremoxideres aldehydgrupper i kulhydrater som ellers kun sjældent forekommer naturligt i vævet. Det selektive trin i en PAS farvning er oxidationstrinnet, og det er derfor vigtigt hverken at overoxidere(aldehydgrupperne bliver til Carboxylsyregrupper) eller at underoxidere (for få aldehydgrupper), hvilket begge kan føre til at Schiff's reagens har for få steder at binde sig. Schiff's reagens Schiff's reagens fremstilles ved at kationfarvestoffet Pararosanilin opløses i demineraliseret vand og tilsættes svovldioxid (SO 2 ). En af sulfonsyregrupperne binder sig herved til det centrale C i Pararosanilinens triphenylmethan-struktur og farvestoffet bliver farveløst. Når SO 2 binder sig til det centrale C i Pararosanilin, bliver det røde farvestofs tre aromatiske konjugerede dobbeltbinder ophævet, og farvestoffet mister sin farve. 16 / 64

18 Pararosanalin (rød) Figur 2 Pararosanalin-leucosulfonsyre(farveløs) De fremoxiderede aldehydgrupper binder sig kovalent til de sulfinsyregrupper som findes i Pararosanalin. For at de sidestillede -NH 2 /- OH grupper får farve, er det dog nødvendigt at fjerne den Sulfonsyregruppe(SO 2) som tidligere blev bundet til det centrale C-atom i Schiff's reagens. For at fjerne denne SO 2 gruppe er det nødvendigt at hæve ph'en i præparatet, hvilket kan gøres ved at skylle vævs snittet i vand hvorved ph'en hæves fra ph 2 til 7. Derved fraspaltes den SO 2 gruppe som var bundet til Pararosanalin's centrale C-atom og de tre aromatiske ringe får igen tre konjugerede dobbeltbindinger, hvilket resulterer i at farvestoffet får sin Magenta farve. [3][9] I forsøgets anvendte væv farver PAS sure og neutrale kulhydrater, eks. muciner. glycoprotein, er farvet nuancer af lyserød /magenta. DPAS Har samme forskrift som PAS, men har dog den forskel at vævet gennemgår en behandling med diasatase før vævet gennemgår resten af PAS proceduren. DIASTASE Diastase spalter α-1,4 glykosidbindinger. Grunden til dette er at vi ved behandling med DPAS er interesseret i at teste hvorvidt der findes glukose i vævet som kan fraspaltes. α-amylase spalter α- 1,4 glykosidbindinger hvorved der fraspaltes alle forgreninger siddende længere ude på glukosemolekylet end α-1,4. De fraspaltede glukose enheder forsvinder når vævs snittet efter behandling i diastase skylles i vand. [3] I vores anvendte væv ses at glykogen er fjernet via α-amylase, Sure og neutrale kulhydrater, eks. muciner, glycoprotein, er farvet nuancer af lyserød / Magenta. 17 / 64

19 CD3 Polyklonalt kanin antistof som er rettet mod CD3 antigener. CD3 antigenerne udtrykkes af T-celler. CD3 antistoffet binder sig primært på cellemembranen af T-celler hvor CD3 antigenet er præcenteret. I umodne thymocytter vil bindingen til cellen være cytoplasmisk, mens bindingen til CD3 antigenet i cellemembranen forekommer ved modning af thymocytterne. Udfældning af DAB i ved CD3 antigenet ses som en brun farve. Cellerne betragtes som positive hvis deres membran er farvet brun samt at cellerne er lokaliseret et forventet sted. Lymfocytterne i spytkirtler og læbebiopsier forventes fundne i inflammatoriske områder (fokus områder) [11] Grundet at CD3 er et polyklonalt antistof, vil der være større risiko for at få uspecifikke bindinger end hvis man havde anvendt et antistof af monoklonal karakter. Dette skyldes at CD3 er lavet ud fra flere kloner rettet mod det samme antigen hvorved det er mindre specifikt end antistoffer lavet ud fra en klon (monoklonalt). Fordelen ved at anvende CD3(polyklonal) er dog at den CD3 variant som afdelingen i forvejen bruger, så den ved vi virker. Samtidig er CD3 polyklonalt antistof lavet af Dako, som også er producenten af Dako Autostainer Link 48 hvorved de giver garanti for at det virker. I forsøgets anvendte væv farvers CD3 antigener i lymfocytternes membraner brune. Immunfarvnings teori 1. Peroxidase blockering dryppes på vævet for at blokere endogen enzym aktivitet som kan give falsk positive reaktioner når DAB tilsættes. Herefter skylles vævet i skyllebuffer for at fjerne overskydende peroxidase blocker. Det primære antistof tilsættes herefter og binder sig til de korresponderende antigener i vævet. Herefter skylles vævet i skyllebufferen for at fjerne ubundne antistoffer væk. 2. EnVision indeholdende Horse Radish Peroidase dryppes på. Disse er lange polymer kæder hvorpå der sidder sekundære antistoffer og enzymer(hrp). Disse polymer kæder binder sig til de primære antistof. 3. DAB tilføres til vævet. Der hvor HRP forefindes vil der ske en brun udfældning af DAB da H2O2 oxideres hvorved der fraspaltes kobber. Herved vil man vide at der hvor der er sket en brun udfældning af DAB, må der have været antigener til stede i vævet. 4. Kernefarvning/oversigtsfarvning med Mayers sure hæmatoxylin for lettere at kunne orientere sig i vævet. [12] 18 / 64

20 Reagenser med Lot nummer Reagens Materialer Lot nummer. Natriumcarbonat A Eddikesyre 1% Alcian Blue ph 2, Mayers sure hæmatoxylin Mayers hæmatoxylin Periodsyre Amylase Schiff's reagens 061M1629V Hx CD3(polyklonalt) Alkohol 99.9% Alkohol 96% Alkohol 70% Note: Som udgangspunkt anvender vi samme Lot nummer til alle farvninger, men forekommer der et andet Lot nummer, vil dette blive noteret med dato. Reagenser til farvninger Farvning PAS Farvestoffer 0,5% perjodsyre, Schiff's reagens, Mayers hæmatoxylin* D-PAS α-amylase pulver, 0,5%perjodsyre, Schiff's reagens, Mayers hæmatoxylin *, ** Alcian Blue Alcian Blue pyridin variant ph 2,8, Kernechrot *** CD3 Polyklonalt ready-to-use antistof fra Dako *Mayers sure hæmatoxylin erstatter Mayers hæmatoxylin efter delforsøg 1. **Spyt anvendes også udover α-amylase pulver efter delforsøg 2. ***Mayers sure hæmatoxylin erstatter Kernechrot efter delforsøg / 64

21 Anvendt væv Indkørings materiale: Patient materiale Kontroller (Multi-1) Paraffin indstøbte tunge- og mundbunds biopsier. Paraffin indstøbte læbebiopsier. Paraffin indstøbte lever, tonsil, pancreas og appendix biopsier. Anvendt apparatur Type af farvning Special- og immunfarvninger Maskine anvendt Dako Autostainer Link 48 PT moduler. Immunfarvninger Dako Autostainer Link 48 Special farvninger Tissue-Tek Prisma 20 / 64

22 Forsøgsopstilling Metode Figur 3 Håndtering af væv fra modtagelse på RHPA til det indstøbes 21 / 64

23 Forsøgsopstilling for enkeltfarvninger Figur 4 Flowdiagram som viser generel behandling af væv som skal have SPEC farvning. indstøbes Figur 5 Flowdiagram som viser generel behandling af væv som skal have SPEC farvning. indstøbes 22 / 64

24 Forsøgsopstilling for dobbeltfarvninger Figur 6 Flowdiagram som viser hvordan vævet behandles når det skal IHC farves efterfulgt af SPEC farvning. Figur 7 Flowdiagram som viser hvordan vævet behandles når det skal SPEC farves efterfulgt af IHC farvning. 23 / 64

25 Forsøgsopstilling delforsøg 1 Forsøget er udført på indkørings væv og går ud på at vurdere hvorvidt vi får det bedste farve resultat ved at anvende SPEC + IHC eller IHC + SPEC farvninger først. Snittene er delt op i hvilken forbehandling de har fået, samt om de er enkeltfarvninger eller indkørings materiale. Vævssnittene også delt op i hvilken en farvning de har fået påført først. Alle SPEC farver er udført manuelt, IHC er udført maskinelt. Ved DPAS anvendes α-amylase pulver. Schiff s reagens anvendes i 40 min efter procedurevejledning fra RHPA team Bispebjerg. Procedurevejledninger anvendt: Bilag 3 - Alcian Blue, side 61. Bilag 1 - DIASTASE- PAS (DPAS), side 60. Bilag 2 - PAS, side 61. Anvendte farveprocedurer for CD3, side 29. Figur 8 Forsøgsopstilling af delforsøg / 64

26 Forsøgsopstilling delforsøg 2 Delforsøg 2 går ud på at optimere farvningerne. Dette forsøg er udført på indkørings materiale. Alle SPEC farver er udført i hånden, IHC er udført maskinelt. Ved DPAS anvendes α-amylase pulver. Indkørings væv er anvendt. Procedurevejledninger anvendt: Bilag 3 - Alcian Blue, side 61. Bilag 1 - DIASTASE- PAS (DPAS), side 60. Bilag 2 - PAS, side 61. Anvendte farveprocedurer for CD3, side 29. Figur 9 Forsøgsopstilling for delforsøg / 64

27 Forsøgsopstilling delforsøg 3 Figur 3 viser opstillingen af delforsøg 3. Delforsøg 3 er et forsøg på at optimere DPAS ved at variere tiden i amylase, samt at prøve hvorvidt det fungerer hvis vi anvender spyt i stedet for amylase. Dette forsøg er udført på indkørings materiale. Alle SPEC farver er udført i manuelt, IHC er udført maskinelt. Ved DPAS anvendes α-amylase pulver. Procedurevejledninger anvendt: Farveprocedure for PAS & DPAS- Modificeret, side 30.Anvendte farveprocedurer for CD3, side 29. Figur 10 Forsøgsopstilling for delforsøg / 64

28 Forsøgsopstilling delforsøg 4 Figur 4 viser opstillingen af delforsøg 4. Forsøget går ud på at teste om vores manuelle farvninger kan fungere i rutinen. Dette forsøg er udført på indkørings materiale og farvningerne er udført maskinelt. Ved DPAS anvendes α-amylase pulver eller spyt som påføres vævet før det sættes på Tissue-tek Prisma. Procedurevejledninger anvendt: Farveprocedure for Alcian Blue - Modificeret, side 29. Farveprocedure for PAS & DPAS- Modificeret, side 30. Anvendte farveprocedurer for CD3, side 29. Figur 11 Forsøgsopstilling for delforsøg / 64

29 Forsøgsopstilling delforsøg 5 Figur 5 viser opstilling af delforsøg 5. Forsøget går ud på at anvende patient materiale med vores optimerede farvninger i rutinen. Farvningerne er udført maskinelt. Ved DPAS anvendes spyt som påføres vævet inden vævet sættes på Tissue-tek Prisma. Ved inkubation med spyt placeres vævet i et fugtkammer. Procedurevejledninger anvendt: Farveprocedure for Alcian Blue - Modificeret, side 29. Farveprocedure for PAS & DPAS- Modificeret, side 30. Anvendte farveprocedurer for CD3, side 29. Figur 12 Forsøgsopstilling for delforsøg / 64

30 Anvendte farveprocedurer for CD3 1. Afparaffinering/forbehandling i PT link, se procedure 20min. 2. Skyl i skyllebuffer. 5 min. 3. Dryp Peroxidaseblockering på. 5 min. 4. Skyl i skyllebuffer, 2 hold i alt. 5 min. 5. Dryp primært antistof på. 20 min. 6. Skyl i skyllebuffer, 2 hold i alt. 5min. 7. Dryp HRP på. 20 min. 8. Skyl i skyllebuffer. 5 min. 9. Fremkald DAB Working substrate solution 10 min. 10. Skyl i rendende vand. 5 min. 11. Mayers sure hæmatoxylin. 2 min. 12. Skyl i rindende vand. 5 min. 13. Dehydrering til 99% alkohol Montering med Pertex - Farveprocedure for Alcian Blue - Modificeret 1. Alcian Blue ph 2,6-2,8 10 min 2. Kort skyl i 1 % eddikesyre 5 sek 3. Skyl i rindende vand 2 min 4. 0,3 % natriumkarbonat 10 min 5. Skyl i rindende vand 5 min. 6. Mayers Sure Hæmatoxylin 2 min. 7. Skyl i rindende vand 5 min % alkohol 5 sek % alkohol 5 sek % alkohol 2 min % alkohol 2 min % alkohol 2 min. 13. Tørring i stinkskab min. 14. Montering med Pertex - Se original farveprocedure for Alcian Blue. Bilag 3 - Alcian Blue side / 64

31 Farveprocedure for PAS & DPAS- Modificeret 1. Spyt* 20 min 2. 0,5 % periodsyre* 5 min. 3. Skyl i rindende vand* 5 min. 4. Schiff s reagens stuetemperatur 20 min. 5. Skyl i rindende vand 5 min. 6. Mayers Sure Hæmatoxylin 2 min. 7. Skyl i rindende vand 5 min % alkohol 5 sek % alkohol 5 sek % alkohol 2 min % alkohol 2 min % alkohol 2 min 13. Tørring i stinkskab min 14. Montering med Pertex - * Kun DPAS skal igennem denne del af farveforskriften. Se original farveprocedure for PAS og DPAS. Henholdsvis Bilag 2 - PAS, side 61 og Bilag 1 - DIASTASE- PAS (DPAS), side / 64

32 Kriterier for datavurdering (resultatvurdering) Immunfarvnings scorings skema Score 1 Score 2 Score 3 Uacceptabel til diagnostisk brug Kraftig overfarvning og/eller svag samt falsk negativ farvning af komponenterne i vævet. Mange uspecifikke bindinger kan forekomme hvilket gør det svært at skelne de celler fra de resterende vævs komponenter. Acceptabel til diagnostisk brug Acceptabel immunreaktion i alle inkluderede snit. Overfarvning eller svag farvning af de forventede celler i vævet, dog uden betydelig indvirkning på vurdering af immunreaktionen. Få uspecifikke bindinger(baggrundsfavning) kan forekomme. Optimal til diagnostisk brug Optimal - eller næsten optimal immunreaktion i de forventede celler i alle de inkluderede snit. Specificering af optimale immunfarvninger CD3 Figur 13 Optimal CD3 reaktion. [18] Vævskomponenter Kerner (DNA & RNA) T-lymfocytters cellemembran Farve Blå/lilla af Mayers sure hæmatoxylin Brune 31 / 64

33 Special farve scorings skema Score 1 Score 2 Score 3 Uacceptabel til diagnostisk brug De ønskede vævs komponenter er ikke påvist i tilstrækkelig grad. For brug til diagnostisk skal farvningen optimeres. Acceptabel til diagnostisk brug Overfarvning og/eller svag farvning af komponenterne i vævet, dog kan der skelnes i mellem oversigtsfarvningen og farvningen. Små områder af vævet kan fremstå ufarvet men dog stadig med mulighed for at se de ønskede vævs komponenter. Få uspecifikke bindinger kan forekomme. Optimal til diagnostisk brug Kun de ønskede komponenter er farvet. Her forekommer ingen svag farvning, overfarvning eller uspecifikke bindinger. Specificering af optimale SPEC farvninger. PAS Figur 14 PAS x 50 forstørrelse. blok delforsøg Vævskomponenter Kerner (DNA & RNA) Visse lipider Glykogen, neutrale proteoglycaner/glycoproteiner Farve Blå/lilla af Mayers sure hæmatoxylin Magenta/lyserød Magenta/lyserød 32 / 64

34 DPAS Vævskomponenter Kerner (DNA & RNA) Visse lipider Neutrale proteoglycaner/glycoproteiner Glykogen, fjernet via alfa-amylase Figur 15 PDAS 50x forstørrelse. Blok 16 1.delforsøg Farve Blå/lilla af Mayers sure hæmatoxylin Magenta/lyserød Magenta/lyserød Ikke til stede Alcian Blue Figur 16 Alcian Blue 50x forstørrelse. Blok 16. Delforsøg 1. Vævskomponenter Kerner (DNA & RNA) Sialinsyre- og sulfatsyreholdige epitiale muciner Bindevævs og brusksubstanser og mastcellegranula Farve Blå/lilla af Mayers sure hæmatoxylin Kraftig turkis af Alcian Blue Turkis af Alcian Blue 33 / 64

35 Samlet score for IHC/Special farvninger Score 1 Score 2 Score 3 Uacceptabel til diagnostisk brug Uacceptabel immunfarvning med en uacceptabel, acceptabel eller optimal special farvning eller en uacceptabel special farvning med en uacceptabel, acceptabel eller optimal immunfarvning. Acceptabel til diagnostisk brug Acceptabel immun farvning med acceptabel eller optimal special farvning eller acceptabel special farvning med en acceptabel eller optimal immun farvning. Optimal til diagnostisk brug Optimal immunfarvning med optimal special farvning. 34 / 64

36 Delforsøg 1 Resultater Farvning/ blok nr. Kontrol Score Indkørings materiale Kommentar Blok 16 CD3 3 2 Uspecifik CD3 i indkørings materiale i kirtel epitel. Glemt Mayers kernefarvning. Alcian Blue 3 3 CD3 + Alcian Blue 3 3 Alcian Blue + CD3 3 3 PAS 3 3 CD3 + PAS 2 3 Kontrol: CD3 uspecifik i pladeepitel i tonsil. Mørk mayer kernefarvning hvilket gør det svært at skelne mellem kernefarvning og CD3 i tonsil. Kontrol: uspecifik CD3 i pladeepitel i tonsil. Schiff s farver muciner og glykogen svagt. PAS + CD3 2 2 Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt i muciner/kulhydrater. Der er en brunlig nuance i vævet hvilket kunne skyldes uspecifik CD3. D-PAS 3 3 CD3 + D-PAS 2 2 D-PAS + CD3 1 1 Kontrol: CD3 uspecifik i pladeepitel i tonsil. Schiff s farver kulhydrater svagt i tarmen. Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt i mucinerne/kulhydraterne. Mucinerne fremstår ufarvet Kontrol: CD3 uspecifik i lever væv og pladeepitel i tarm og glat muskelvæv. Schiff s farver kulhydrater svagt. Mørk Mayers kernefarvning Indkøringsvæv: Schiff s svagt i mucinerne/kulhydraterne. Mucinerne fremstår ufarvet 35 / 64

37 Delforsøg 2 Farvning/ blok nr. Kontrol Score Indkørings materiale Kommentar Blok 2 CD3 + Alcian Blue 3 3 CD3 + PAS 20 min 3 3 CD3 + PAS 40 min 3 3 CD3 + D-PAS 20 min 2 2 CD3 + D-PAS 40 min 2 2 I Kontrol: CD3 uspecifik i pladeepitel i tonsil samt leveren. Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt muciner/kulhydrater fremstår ufarvet Kontrol: CD3 uspecifik i pladeepitel i tonsil samt leveren. Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt muciner/kulhydrater fremstår ufarvet Blok 8 CD3 + Alcian Blue 3 3 CD3 + PAS 20 min 3 3 CD3 + PAS 40 min 3 3 CD3 + D-PAS 20 min 3 2 CD3 + D-PAS 40 min 2 2 Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt muciner/kulhydrater fremstår ufarvet Kontrol: CD3 uspecifik i pladeepitel i tonsil samt leveren. Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt muciner/kulhydrater fremstår ufarvet Blok 16 CD3 + Alcian Blue 3 3 CD3 + PAS 20 min 3 3 CD3 + PAS 40 min 3 3 CD3 + D-PAS 20 min 3 2 CD3 + D-PAS 40 min 3 2 Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt muciner/kulhydrater fremstår ufarvet Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt muciner/kulhydrater fremstår ufarvet 36 / 64

38 Delforsøg 3 Farvning/ blok nr. Kontrol score Indkørings materiale Kommentar Blok 2 CD3 + D-PAS, Amylase i 20 min CD3 + D-PAS, Amylase, 40 min CD3 + D-PAS, Spyt, 20 min Blok 8 CD3 + D-PAS, Amylase i 20 min CD3 + D-PAS, Amylase, 40 min Kontrol: CD3 uspecifik i pladeepitel i tonsil samt leveren. Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt muciner/kulhydrater fremstår ufarvet Kontrol: CD3 uspecifik i pladeepitel i tonsil samt leveren. Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt muciner/kulhydrater fremstår ufarvet Kontrol: CD3 uspecifik i pladeepitel i tonsil samt leveren. Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt muciner/kulhydrater fremstår ufarvet Kontrol: CD3 uspecifik i pladeepitel i tonsil samt leveren. Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt muciner/kulhydrater fremstår ufarvet CD3 + D-PAS, Spyt, 20 min 2 3 Kontrol: CD3 uspecifik i pladeepitel i tonsil samt leveren. Blok 16 CD3 3 3 PAS 3 3 D-PAS(40 min) 2 2 Kontrol: schiff s farver svagt bægercellerne i tarmen. Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt kulhydrater/ muciner, fremstår ufarvet CD3 + D-PAS, Amylase i 20 min CD3 + D-PAS Amylase 40 min Kontrol: CD3 uspecifik i pladeepitel i tonsil samt leveren. Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt muciner/kulhydrater fremstår ufarvet Kontrol: CD3 uspecifik i pladeepitel i tonsil samt leveren. Indkøringsvæv: Schiff s reagens farver svagt muciner/kulhydrater fremstår ufarvet CD3 + D-PAS, Spyt, 20 min 2 3 Kontrol: CD3 uspecifik i pladeepitel i tonsil samt leveren. 37 / 64

39 Delforsøg 4 Farvning/ Kontrol Indkørings blok nr. score materiale PAS 3 3 Kommentarer DPAS + spyt i 20 min. 3 3 Rester af indtørret spyt på objekt glasset efter endt inkubation og skyld i vand. Alcian Blue 3 3 CD3 3 3 CD3+ PAS 3 3 CD3+ DPAS + spyt i 20 min 3 3 Delforsøg 5 Nedenunder ses figur nr Diagrammerne er lavet ud fra rådata som ses i Bilag 4 - Rådata for 5. delforsøg, side 62. Figurerne på venstre side viser de resultater vi har fået ved mikroskopering af delforsøg 5 for henholdsvis CD3+Alcian Blue, CD3+ DPAS og CD3+PAS. Figurerne til højre viser den score Katalin Kiss har givet snittene for CD3+Alcian Blue, CD3+ DPAS og CD3+PAS. Scorerne er fordelt på Uacceptabel, Acceptabel og Optimal antallet af prøver er n= / 64

40 Score fordeling for Alcian Blue Score fordeling for Alcian Blue Uacceptabel Acceptabel Uacceptabel Acceptabel 17 Optimal 20 Optimal Figur 17 Scorefordeling for CD3+ Alcian Blue udført på læbebiopsier fra de 20 patienter i delforsøg 5. De bachelorer studerendes vurdering. Figur 18 Scorefordeling for CD3+ Alcian Blue udført på læbebiopsier fra de 20 patienter i delforsøg 5. Katalin Kiss vurdering. Scorefordeling for CD3 + PAS Scorefordeling for CD3 + PAS 0 2 Uacceptabl Acceptabel 6 Uacceptabel Acceptabel 18 Optimal 14 Optimal Figur 19 Scorefordeling for CD3+ PAS udført på læbebiopsier fra de 20 patienter i delforsøg 5. De bachelorstuderendes vurdering. Figur 20 Scorefordeling for CD3+PAS udført op læbebiopsier fra de 20 patienter i delforsøg 5. Katalin Kiss vurdering. Scorefordeling for CD3 + DPAS Scorefordeling for CD3 + DPAS 0 Uacceptabel 3 Uacceptabel 12 8 Acceptabel Optimal 17 Acceptabel Optimal Figur 21 Scorefordeling for CD3+DPAS udført på læbebiopsier fra de 20 patienter i delforsøg 5. De bachelorstuerenes vurdering Figur 22 Scorefordeling for CD3+DPAS udført på læbebiopsier fra de 20 patienter i delforsøg 5. Katalin Kiss vurdering. 39 / 64

41 Diskussion I nedenstående afsnit vil jeg gennemgå de væsentligste problematikker som er dukket op i løbet af forløbet. Herudover vil jeg diskutere og vurderer de opnåede resultater og sammenligne projektets resultater med andre studier samt undervejs inddrage relevant litteratur. Dog er der kun sparsomt med artikler til rådighed inden for de IHC/SPEC og SPEC/IHC kombinationer vi anvender, hvorved jeg i stedet, ved mangel på artikler til at bakke mine resultater op, vil give min egen vurdering af hvorfor vores resultater ser ud som de gør. Nedenstående afsnit vil omhandle: Resultater af delforsøg 1-5 Katalin Kiss vurdering af IHC/SPEC. Diskussion Spyt vs. Amylase. Reliabilitering. Validering. Generaliserbarhed. Delforsøg 1 Delforsøg 1 gik ud på at afprøve hvorvidt IHC/SPEC eller SPEC/IHC gav de bedste resultater. Enkeltfarvninger Vores enkeltfarvninger for PAS,DPAS, Alcian Blue og CD3 er alle optimalt farvet med undtagelse for CD3. Grunden til at CD3 enkeltfarvning har fået scoren acceptabel, er fordi vi har glemt Mayers kernefarvning hvilket gør det svært at orientere sig i vævet. Herudover ses der uspecifikke udfældninger i vævet som set på Figur 23. Dette skyldes kunne skyldes at CD3 er et polyklonalt antistof hvorved det lettere laver uspecifikke bindinger end hvis vi havde anvendt et monoklonalt antistof. Dog ser det ud som tilfældige udfældninger, som kunne skyldes at Dako maskinen ikke har skyllet vævet grundigt nok efter endt inkubation med CD3. PAS, DPAS og Alcian Blue enkeltfarvningerne er optimalt farvet, hvilket vi havde regnet med da vi har fulgt procedurevejledningerne fra RHPA team Bispebjerg. Figur 23 CD3 50x forstørrelse. Blok 16. Delforsøg 1. Manglende Mayers kernefarvning. 40 / 64

42 PAS I farvningerne med CD3+PAS og PAS+CD3 ser vi at kun CD3+PAS er optimal. I PAS+ CD3 har vævet et mat, gammel rosa udseende hvor slim og kulhydrater er til stede (se Figur 25). Dette kunne skyldes forbehandlingen i HIER. Da HIER er en forbehandling som går ind og denaturerer vævet kunne det tænkes at vævet ændrer sin originale struktur. Når vævs snittet efterfølgende sættes i perjodsyre, det selektive trin for PAS som fremoxiderer aldehydgrupper, så kunne det tænkes at perjodsyre ikke fremoxiderer nok aldehydgrupper som Schiff's reagens kan binde sig til hvorved man får en svagt udseende PAS farvning. Samtidig tænker jeg at en kombination af denatureringen i HIER og perjodsyre kunne ændre vævet til at CD3 kunne binde sig uspecifikt til kulhydraterne hvorved vævet får en let brunlig/gammelrosa baggrundsfarvning i indkøringsmaterialet. Det kunne være at ved påføring af CD3, at vævs snittet ikke bliver afskyllet grundigt nok af maskinen efter endt inkubation med CD3, således at brune udfældninger fra DAB forekommer som ligner uspecifikke bindinger hvorved vævet får et svagt brunligt/gammelrosa udseende. I CD3 + DPAS ser vi som set på Figur 24 har vævet i dette snit ikke et mat, gammel rosa udseende. Dette kunne skyldes at efter som CD3 påføres før perjodsyre, så vil denne ikke påvirke CD3 til at udfælde sig uspecifikt. Ved CD3+PAS ser vi en optimal farvning i indkøringsmaterialet men den tilhørende kontrol er kun acceptabel hvilket skyldes i kontrollen ses uspecifikke bindinger fra CD3 i pladeepitel i tonsil, hvilket kan skyldes at pladeepitel er ret tæt væv hvorved det polyklonale CD3 let kan binde sig. Mayers kernefarvning er også meget er meget mørk i kontrollen, hvilket gør det svært at differentiere mellem CD3 og Mayer kernefarvning, da kernerne bliver næsten sorte. Se afsnit om CD3 for uddybning af CD3 og uspecifikke bindinger. Figur 24 CD3+PAS 50x forstørrelse. Blok 16. Delforsøg 1. Figur 25 PAS +CD3 50x forstørrelse. Blok 16. Delforsøg / 64

43 DPAS I resultaterne fra både DPAS+CD3 og CD3+ DPAS ser vi ingen af farvningerne er optimale. Dette skyldes at kulhydrater fremstår ufarvet i indkøringsmaterialet samt at der forekommer uspecifikke bindinger i epitel i tonsil i kontrol og uspecifik baggrundsfarvning i indkøringsmaterialet fra CD3. Der ses i CD3 enkeltfarvning på Figur 23, at der både forekommer uspecifikke bindinger i kontrol og indkøringsmaterialet, hvilket kan skyldes at CD3 er et polyklonalt antistof, hvilket vil sige at det har større risiko for at lave uspecifikke bindinger end ved brug af et monoklonalt antistof. Man kan derfor forvente at der i indkøringsmaterialet vil forekomme uspecifikke bindinger fra CD3. Vores enkelt farvning med DPAS og PAS viser en optimal farvning af indkørings materialet og en optimal farvning af kontrollen, og da begge disse fungerer optimalt, må grunden til vores manglende kulhydrat og slimfarvning må findes et andet sted end i DPAS's procedure. Mistanken falder på at der må være noget i HIER forbehandlingen eller farvningen på Dako maskinen som påvirker α- Amylase. Se afsnittene om Spyt vs. Amylase for uddybning af HIERs påvirkning af amylase. Dette vides dog ikke med sikkerhed, og der forefindes ingen artikler som bakker op om teorien. Figur 27 DPAS med CD3 x50. Blok 16. Delforsøg 1 Figur 26 CD3+DPAS 50x forstørrelse. Blok 16. Delforsøg 1. Schiff's reagens I de farvninger som indeholder Schiff's reagens ser vi at resultaterne bliver bedst hvis IHC farvningen er påført først. I et forsøg udført af Corbellini LG et al så fås de bedste resultater også når IHC farvninger påføres før Schiff's reagens. Ifølge Corbellini LG et al. skyldes det at farvninger indeholdende Schiff's reagens, har en ekstremt lav ph pga. saltsyre og herved påvirker antigenerne i vævet samt paratoperne på antistofferne. Dette støtter min tidligere teori om at perjodsyre kunne påvirke farvningen negativt. Dog skal man være opmærksom på at Cobellinis studie ikke har anvendt den samme maskine, antistoffer eller væv som vi har, hvorved det er svært konkludere om det i virkeligheden er ph'en som gør en forskel. Ydermere anvendte Corbellini LG et al et monoklonalt antistof i sit forsøg, hvilket kunne forhindre nogle af de uspecifikke bindinger som vi ser i vores forsøg grundet at monoklonale antistoffer binder sig mere specifikt end polyklonale antistoffer. 42 / 64

44 Alcian Blue Modsat PAS og DPAS, så er farvningerne indeholdende Alcian Blue optimal ved både IHC/SPEC og SPEC/IHC som set på Figur 28 og Figur 29. Dog kan man se at der på Figur 29 er en mørkere Alcian Blue farvning end på Figur 28. Dette mistænker vi dog skyldes at vævssnittet er en smule tykt. I sin artikel Staining of macromolecules: possible mechanisms and examples [22] siger Poul Prentø at Alcian Blue er et stort farvestof med 8 positive ladninger som gør at farvestoffet er meget svært at fjerne fra vævet igen. Dette kunne man tænkte er grunden til at Alcian Blue fungerer optimalt, uanset om den er påført før eller efter immunfarvningen samtidig med at HIER som denaturerer vævet ikke ser ud til at påvirke Alcian Blues mulighed for at binde sig i vævet. Teorien om at Alcian Blue er et meget stabilt farvestof bakkes op af artiklen "Alcian Blue Blue pyridine variant" som skriver at i de forsøg de har lavet hvor de har anvendt Alcian Blue pyridine variant, har der ikke været en eneste af deres farvninger som har været utilfredsstillende. Figur 29 CD3+Alcian Blue 50x forstørrelse. Delforsøg 1. Figur 28 Alcian Blue+ CD3 50x forstørrelse. Blok 16. Delforsøg 1. Når man ser på CD3 s brune udfældnings farve i forhold til Alcian Blues blå farve(figur 29 og Figur 28) kan man tydeligt skelne mellem slimfarvningen og CD3 udfældningerne. Dog kan man argumentere for, at der hvor man i PAS og DPAS kunne se uspecifikke bindinger fra CD3, så er Alcian Blue så mørk at man ikke kan se om der eventuelt oveni slimfarvningen forekommer uspecifik CD3. 43 / 64

45 Mayer/Mayers sure hæmatoxylin Fire glas i PAS og DPAS samt PAS+ CD3 og DPAS+ CD3 blev sat i Mayers hæmatoxylin i 20 min i stedet for i Schiff s reagens i delforsøg 1. Herefter blev de sat i Schiff's reagens i 40 min. I følge vores anvendte forskrifter, så skulle vores vævs snit have været i Schiff's reagens i 40 min før det senere blev kerne farvet i Mayers hæmatoxylin. Vi blev opmærksomme på at vi havde sat vævet i Mayer i stedet for Schiff efter 20 min. I følge vores teori skulle det ikke gøre nogen forskel i hvilken rækkefølge vores snit blev farvet i. Da Schiff's reagens farver sure og neutrale kulhydrater, eks. muciner, glykoprotein og Mayers hæmatoxylin farver kerner, skulle det uf fra teorien ikke gøre en forskel om vævet kernefarves før eller efter Schiff's reagens. Dog kan det tænkes at den lange tid i Mayers hæmatoxylin kan være skyld i at vores kerner blev så mørke. Vi valgte at skifte til sur Mayer i stedet for Mayer efter delforsøg 1, da det er den metode de anvender i immunlab. Vi vurderede at det ville være optimal at anvende Sur Mayer da vi også anvender antistoffet CD3 som i immunlab kernefarves med Mayers sure hæmatoxylin. Da PAS, DPAS og Alcian Blue i forvejen giver vores væv den histokemiske farvning har vi kun brug for en kernefarvning som både Mayer og sur Mayer giver. Forskellen er at sur Mayer er mere selektiv for kerner end Mayer er, dette skyldes at den store mængde af Al 3+ vil blokere nogle af de carboxylsyre grupper i protein og kulhydrat hvorved Mayers sure hæmatoxylin bliver mere selektiv for kerner end Mayers hæmatoxylin. Dette er en fordel da farvning med Mayers hæmatoxylin gjorde at det var svært at differentiere mellem Mayers blålige kernefarvning og CD3 som farves brunt i membranen, da kernerne blev sorte. Dog skal det tilføjes, at der hvor vores kernefarvning med Mayer har været meget mørk blev vi senere opmærksom på, at alle snittene i delforsøg 1 er skåret uden en µm tæller. En µm tæller er en funktion på mikrotomer som gør det muligt at vælge hvor tykt vævet skal skæres. Herved har det været svært i nogle tilfælde, at vurdere om farvningen har været optimal/acceptabel, eller om det skyldtes at snittet i virkeligheden har været for tykke. På Figur 29 ses en let overfarvning af Alcian Blue, som vi havde svært ved at vurdere om skyldes farvningen eller at snittets tykkelse. Snittene i delforsøg 2-5 er alle skåret med fungerende µm tæller for mest valide resultater. Delkonklusion fra delforsøg 1 IHC efterfulgt af SPEC farvninger giver det bedste resultat i de farvninger som indeholder en kombination af Schiff's reagens og CD3. I IHC farvninger kombineret med Alcian Blue er resultaterne lige gode uanset om CD3 eller Alcian Blue er påført først. Selvom vi får de bedste resultater med IHC/SPEC i stedet for SPEC/IHC har det været nødvendigt at optimere farvningerne fra delforsøg 1 for at få optimale resultater. 44 / 64

46 Delforsøg 2 Delforsøg 2 går ud på at forsøge at optimere farvningerne fra delforsøg 1. Vi valgte ud fra vores resultater og delkonklusion fra delforsøg 1, at arbejde videre med vores IHC/SPEC farvninger da disse gav de flotteste resultater. I delforsøg 2 og fremefter, koncentrerer vi os ikke længere om SPEC/IHC farvninger. Mayers sure hæmatoxylin anvendes i stedet for Mayers hæmatoxylin under de resterende forsøg for at gøre det lettere at skelne mellem det brune CD3 og den blå kernefarvning fra Mayer. Kernechrot er også er skiftet ud med Mayers sure hæmatoxylin for at gøre det lettere for os selv, samtidig med at Kernechrot ikke er en farvning som de anvender rutinemæssigt på RHPA team Bispebjerg hvor vi primært udfører vores forsøg. I delforsøg 1 anvendte vi Schiff s reagens i 40 min ved PAS og DPAS farvningerne. Dog fandt vi ud af der var en forskel på RHPA og RHPA team Bispebjerg i forhold deres PAS og DPAS forskrifter. RHPA farver deres Schiff s i 20 min modsat de 40 min vi i delforsøg 1 forsøgte os med, og herved synes vi det kunne være relevant at afprøve om det gjorde en forskel for vores resultater. Vi valgte i delforsøg 2 at ændre tiden i Schiff s reagens samt at skifte til sur Mayer, og anvende indkøringsblok 2, 8 og 16 for at se om vi ville få de samme resultater hvis vi udførte vores forsøg på flere prøver. Som set ud fra resultaterne for delforsøg 2, så har vi ingen enkeltfarvninger som vi kan anvende som kontroller af vores farvninger. Dette skyldes at vi tænkte vi sagtens kunne anvende vores enkeltfarvninger fra forsøg 1, men blev opmærksom på at det ville være bedst at have enkeltfarvninger med ved hvert forsøg, da vi på den måde kunne kontrollere om vi har håndteret farvningerne korrekt ved hvert delforsøg. Alle forsøg undtagen delforsøg 2 har enkeltfarvninger med. CD3+PAS Vores resultater for CD3 + PAS, viser at for blok 2,8 og 16 så er både 20 og 40 minutter i Schiff s reagens med til at give en optimal farvning. Det havde jeg også forventet efter som at RHPA kun farver med Schiff s reagens i 20 min. En artikel Corbellini, LG et al "Immunohistochemistry combined with periodic acid-schiff for bovine mammary glands with protothecal mastitis anvender også en immune farvning kombineret med en PAS farvning. Deres resultat bliver optimalt til trods for at deres væv kun farves i Schiff s reagens i 2 min efter at være blevet immunfarvet. [6] Man kan ud fra teorien om PAS farvningen argumentere for at det selektive trin(perjodsyre) i PAS farvningen bestemmer hvor meget Schiff s reagens kan binde sig til vævet. Jeg tror at den minimale forskel i resultatet mellem farvning i 20 min og 40min i Schiff s reagens skyldes at det selektive trin (perjodsyre) for begge farvninger har været lige lang, hvorved der i begge farvninger har været samme antal aldehydgrupper som Schiff s reagens kunne binde sig til. 45 / 64

47 CD3+DPAS I kontrollerne for CD3+DPAS for blok 2, ses at ved både 20 og 40 minutter i Schiff s reagens ses uspecifik CD3 i pladeepitel. Det samme er gældende for blok 8 ved 40 minutter i Schiff s reagens. Se Teori, CD3, side 18. for uddybning af hvorfor CD3 kan være uspecifik. Vores resultater for CD3+DPAS udført på indkøringsblok 16, viser at vævet har et ufarvet udseende der hvor kulhydraterne i slim burde være blevet farvet. Dette gælder for både blok 2,8 og 16 uanset om været har været farvet i 20 eller 40 min i Schiff s reagens. Herved kan vi se at ændring i Schiff s reagens ikke kan gøre at vores ufarvede udseende af kulhydrater udbedres. Grundet at vores DPAS enkeltfarvning ikke har et ufarvet udseende i hverken delforsøg 1 eller 2 falder mistanken herved stadig på at der må være noget i HIER forbehandlingen eller farvningen på Dako maskinen som påvirker α-amylase. Dette vides dog ikke med sikkerhed, og der forefindes ingen artikler som bakker op om teorien. Se afsnittene om Spyt vs. Amylase for uddybning af HIER's påvirkning af amylase. Figur 30 CD3+DPAS 20 min Schiff.50x forstørrelse. Blok 16. Delforsøg 2. Figur 31 Figur 0-4: CD3+ DPAS 40 min Schiff. 50x forstørrelse. Blok 16. Delforsøg 2. CD3+Alcian Blue Vores resultater viser at CD3+ Alcian Blue bliver optimal for både blok 2,8 og 16. Det havde vi også forventet da vi i delforsøg 1 så at Alcian Blue var optimal. Den eneste forskel mellem vores Alcian Blue i delforsøg 1 og delforsøg 2 er kernefarvningen som vi anvendte. I delforsøg 1 anvendte vi Kernechrot (farvning som farver kernerne røde), hvor vi i delforsøg 2 vurderede at man godt kunne anvende sur Mayer. Se afsnit om sur Mayer for uddybning af fordele ved anvendelse af Mayers sure hæmatoxylin. Delkonklusion Vores forsøg på optimering af DPAS har vist os, at der ikke er nogen grund til at lade vores væv være i Schiff's reagens i 40 min, da 20 min giver et næsten lige så flot resultat(figur 30og Figur 31). Ydermere har DPAS stadig kulhydrater i vævet som fremstår ufarvet uanset om vi farver vævet i 20 eller 40 min hvorved vi kan konkludere at tiden i Schiff s reagens ikke er skyld i kulhydraternes ufarvede udseende. Kernefarvning med Mayers sure hæmatoxylin fungerer optimalt i alle vævs snit. 46 / 64

48 Delforsøg 3 Da vores CD3+ Alcian Blue blev optimal i både delforsøg 1 og 2, vælger vi ikke at optimere denne farvning i delforsøg 3. CD3 + PAS farvningen i delforsøg 2 er optimal, hvorved vi kun vælger at optimere DPAS. Vi anvender i dette forsøg indkørings blok 2,8 og 16 hvor vi undersøger om det er muligt at få et optimalt resultat af vores farvninger når vi efter HIER og CD3 farvning, enten bruger amylase i 20 minutter, 40 minutter eller spyt i 20 min. I et forsøg på at bekræfte eller afkræfte vores teori om at der må være noget i HIER forbehandlingen eller farvningen på Dako maskinen som påvirker α-amylase i DPAS, vælger vi i delforsøg 3 at forbehandle vores enkeltfarvninger i HIER. Herved vil vi såfremt at vores væv stadig fremstår ufarvet i kulhydrater, kunne bekræfte at HIER påvirker α-amylase. Hvis vores enkeltfarvninger ser ud som de skal efter behandling i HIER, må konklusionen være at det er behandlingen af vævet på DAKO maskinen som giver vævet sit ufarvede udseende i kulhydrater. Kontroller I blok 2,8 og 16 ses for alle kontroller for alle farvninger, med undtagelse af blok 2 med CD3 + D-PAS med Spyt i 20 min, at der i epitelet og lever væv forefindes uspecifikke bindinger af CD3. Dette kan skyldes at epitelet er meget tæt væv, hvorved der let udfældes brune udfældninger fra CD3. Se Teori, CD3, side 18, for uddybning af CD3 og uspecifikke bindinger. Enkeltfarvninger Ud fra vores resultater kan vi se at vores enkeltfarvninger i delforsøg 3 med CD3 og PAS farvninger er optimale efter forbehandling med HIER. Herimod kan vi se at vores enkeltfarvning med DPAS har samme ufarvede udseende hvor kulhydraterne i slim burde være farvet. Herved formoder jeg at den reaktion som sker i DPAS skyldes HIER kombineret med amylase. Se afsnit Spyt vs. amylase for uddybning for hvad dette kan skyldes. DPAS Vores resultater for DPAS med amylase med 20 min fra blok 2,8 og 16 viser alle samme resultat, nemlig at vævet har et ufarvet udseende hvor kulhydrater burde være farvet. Det samme er gældende for blok 2,8 og 16 hvor snittene har været i amylase i 40 minutter i stedet for 20 minutter. Vævet fremstår ufarvet i kulhydrater uanset tiden i amylase. Dog ser vi for både blok 2,8 og 16 at DPAS med spyt i 20 min virker optimalt sammen med HIER(se Figur 32). Dette undrer os da der både forefindes amylase i spyt og i α- Amylase pulver. Se afsnit Spyt vs. Amylase for uddybning af hvorfor spyt virker men amylase ikke gør. Figur 32 CD3+DPAS med spyt i 20 min. 50x forstørrelse. Blok 16. Delforsøg / 64

49 Delkonklusion I DPAS vil behandling af vævet med amylase efter at vævet har været HIER forbehandlet, gøre at kulhydrater og muciner fremstår ufarvede efter farvning med Schiff's reagens. Ved brug af spyt i 20 min i stedet for amylase i DPAS, fremstår kulhydrater i vævet ikke længere ufarvet. Delforsøg 4 Da vi i delforsøg 2 opnåede en optimal CD3+Alcian Blue samt CD3+PAS farvning, og i delforsøg 3 fandt frem til at vi får optimale resultater ved brug af spyt i stedet for amylase i vores DPAS, besluttede vi os for at forsøge at standardisere vores manuelle farvninger ved at udføre forsøgets SPEC farvninger på Tissue-Tek Prisma, efter at vævet blev farvet med IHC farvninger på Dako Autostainer Link 48. Programmering af Tissue-Tek Prisma Da vi i dette forsøg skulle anvende Tissue-Tek Prisma, blev vi nødt til at lave nogle ændringer i forskrifterne for vores SPEC farvninger. Til Både PAS,DPAS og Alcian Blue anvendte vi efter delforsøg 2 konsekvent Mayers sure hæmatoxylin i stedet for Mayers hæmatoxylin(i DPAS og PAS) og Kernechrot(I Alcian Blue). Der anvendes ikke Mayers sure hæmatoxylin på Tissue-Tek Prisma, hvilket gav os nogle udfordringer igennem forsøget. Tissue-Tek Prisma har kun begrænset mængde med plads til farve kar, hvorved vi blev nødt til at skifte farvekaret med Mayers hæmatoxylin ud med Mayers sure hæmatoxylin mens maskinen udførte andre farvninger end vores. Når vores snit var færdige med at farves med Mayers sure hæmatoxylin var det vigtigt at huske at skifte farve karrene tilbage igen for ikke at risikere at de andre farvninger på maskinen blev farvet med Mayers sure hæmatoxylin. Samtidig var det nødvendigt at programmere maskinen til at farve Mayers sure hæmatoxylin i 2 min i stedet for de 5 min i Mayers hæmatoxylin som maskinen er programmeret til. Til hjælp til at programmere maskinen til at anvende vores modificerede procedurevejledninger, måtte vi have hjælp fra Ilker Ceylan, hvilket gjorde at vi følte os meget afhængige af andre for at få udført delforsøg 4. Alcian Blue Det man skal være opmærksom på her, er at vi i dette delforsøg har anvendt en anden metode ved Alcian Blue end i delforsøg 1 og 2. Dette skyldes at efter som vi skulle afprøve vores forsøg rutinemæssigt blev vi nødt til at udelade nogle trin i Alcian Blue farveproceduren som vi havde med da vi farvede manuelt. Vi har udeladt eddikesyre og natriumcarbonat, da disse to trin ikke rutinemæssigt anvendes på RHPA team Bispebjerg. Denne metode anvendes dog på RHPA til trods for at de også anvender Alcian Blue pyridin variant. Dette skyldes at man ikke ved hvorfor pyridin varianten er stabil, så derfor behandler man den som Alcian Blue 8G for at være på den sikre side. Vi blev nødt til at få hjælp af Ilker til at programmere Tissue-Tek Prisma, og han sagde det er umuligt at programmere maskinen til 5 sek. i eddikesyre som vores forskrift påbød. Da der udføres andre farvninger på Tissue-Tek Prisma samtidig med at vi anvender maskinen til vores forsøg, bliver vi opmærksomme på, at vi ikke kan flytte rundt på farvevæsker da det kan resultere i at de andre farvninger ødelægges. Ydermere har maskinen kun ringe mænge med plads til nye farve kar, 48 / 64

50 og vi valgte derfor at undlade disse trin. Udover at RHPA team Bispebjerg anvender Alcian Blue uden eddikesyre og Natriumcarbonat, så findes der flere artikler og farveforskrifter som anvender samme metode. Eksempelvis har IHCWORLD lavet "Alcian Blue Staining Protocol" hvori de foreslår at man farver Alcian Blue i 15 min hvorefter vævet skylles i vand og herefter kernefarves, som minder meget om den metode vi anvender [21]. Derudover anvender de i artiklen Tacha; David et al"an Alcian Blue/PAS combined with TTF-1 and Napsin A staining Procedure" samme metode med deres Alcian Blue hvorved de får gode resultater selv når Alcian Blue kombineres med PAS farvningen og med forskellige antistoffer [5]. CD3+PAS Da vi i delforsøg 4 anvendte samme procedure for vores CD3+PAS farvning som i delforsøg 2, hvor vi opnåede en optimal CD3+PAS farvning, forventede vi også i dette forsøg at få en optimal IHC+SPEC farvning. Vores resultater viser også at dette er tilfældet. Vores resultater viser at CD3+PAS får scoren 3, som er optimal. CD3+DPAS Vi var til at begynde med bekymrede for hvordan det ville gå med at skulle spytte på de snit som skulle farves CD3+DPAS hvorefter de skulle farves på Tissue-TekPrisma. Denne del af forsøget viste sig dog ikke at være et problem. Dog havde vi problemer med, efter endt inkubation med spyt at få vasket al spyttet af snittet igen, da spyttet var tørret ind. Dette krævede lang tids skyld i vand hvorefter der alligevel sad aflejringer af spyt på snittet som blev tydelige da vævet blev farvet. Da vi mikroskoperede snittet med CD3+DPAS kunne vi stadig se at der sad rester af spyt og lidt epitel væv fra Lars Hvidtfeldts kind på snittet. For at undgå dette fremover, blev vi enige om at det ville være en god ide, at ligge de snit som skal have spyt, i et fugtkammer, så spyttet ikke tørrer ud under inkubationen. Til trods for at der var indtørret spyt på glasset, var både CD3 og DPAS i farvningen optimal, og der kunne let differentieres mellem disse. Dette havde vi også forventet da vi i delforsøg 4 har anvendt samme farveprocedure for CD3+DPAS som vi anvendte i delforsøg 3 hvor vi også opnåede optimale resultater. Delkonklusion Vores forsøg fungerer optimalt når det overføres til rutinen. Dog burde der anvendes et fugtkammer ved anvendelse af spyt i DPAS, således at spyttet er lettere at vaske af igen efter endt inkubationstid med spyt, således at der ikke forekommer aflejringer af spyt og epitelceller fra personen som spytter på vævet. 49 / 64

51 Delforsøg 5 CD3+ Alcian Blue Resultaterne af delforsøg 5 viser, at ved Alcian Blue, så er 17 ud af 20 prøver optimale. Dem som kun er acceptabelt farvet er prøve nr. 3,4 og 11. Grunden til at disse tre farvninger ikke er optimalt farvet skyldes ikke Alcian Blue, men herimod CD3 som har uspecifikke bindinger i epitelet i patientmaterialet som det set på Figur 33. Det undrer os dog hvorfor alle tre prøver har uspecifikke bindinger i pladeepitelet i patientmaterialet, da der her ikke forefindes nogen celler som CD3 skulle udfælde sig brunt på. Da det er patienter med autoimmune sygdomme der anvendes til forsøget, kunne man eventuelt mistænke disse patienter for at have antigener i vævet som CD3 udfælder ved. Se evt. teori afsnit om CD3 for uddybning af uspecifik CD3. Figur 33 CD3+Alcian Blue. 50x forstørrelse. Patient prøve 3. Delforsøg 5. Uspecifik CD3 i epitel. CD3+ PAS Resultaterne fra CD3+PAS i delforsøg 5 viser, at 18 ud af 20 prøver er farvet optimalt ifølge de studerende. De to prøver, henholdsvis prøve 3 og 13 er vurderet til kun at kunne få scoren acceptabel da der forekommer uspecifikke bindinger fra CD3 i pladeepitel i patient prøverne som set på Figur 35. Dette er det samme som skete i farvningerne med CD3+ Alcian Blue hvilket får os til at tænke om der i disse patienter eventuelt kunne være noget til stede i epitelet som får CD3 til at udfælde lige præcist der. Se evt. Teori, CD3, side 18. Figur 34 CD3+DPAS 50x forstørrelse. Patient prøve 3. Delforsøg 5. Uspecifik CD3 i epitel. Figur 35 CD3+PAS 50x forstørrelse. Patient prøve 3. Delforsøg 5. Uspecifik CD3 i epitel. 50 / 64

52 CD3+ DPAS Resultaterne fra CD3+DPAS i delforsøg viser at i følge de bachelorstuderende så er kun 12 ud af de 20 patient prøver farvet optimalt, mens de resterende 8 får scoren acceptabel. Dette skyldes at prøverne 5,6,11,12,18,19,20 ikke har fået nok spyt til at hele vævet er dækket, hvorved ikke alt glykogen er blevet fjernet som det burde(figur 36) Prøve nr.18 og 3 har uspecifik CD3 i pladeepitel(figur 34). Se afsnit om spyt vs. amylase i diskussionen for uddybning. Katalin Kiss s vurdering af IHC/SPEC. Da vi selv havde scoret vores snit i delforsøg 5 bad vi Katalin Kiss om at give snittene en samlet score for IHC og SPEC farvningerne. Hun skulle vurdere hvorvidt farvningerne ville være uacceptable, acceptabel eller Figur 36 CD3+DPAS 50x forstørrelse. Patient prøve 5. Delforsøg 5. Ikke nok spyt på væv/glykogen ikke fjernet helt. optimale til diagnosticering af SS. Forskellen mellem vores og KK's vurdering af snittene skyldes til dels at vi har to forskellige uddannelser, hvor at vi som bioanalytiker skal kunne vurdere hvorvidt farvningerne fungerer optimalt sammen, om de korrekte vævs komponenter er farvet, hvorimod KK ligger vægt på om hun kan bruge farvningerne til diagnosticering af SS som hun er specialiseret i. Herudover ønsker KK også at få en automatiseret diagnosticering af SS vha. ZAC scanneren. Dette gøres ved at scanne vævssnittene og lade et computerprogram tælle antallet af lymfocytter i fokusområderne. Det er nødvendigt at scanneren kan differentiere de forskellige farvninger fra hinanden. Hvis der er en masse uspecifikke bindinger kan det være svært for maskinen at kende forskel på hvad der er positive celler og hvad som uspecifikke bindinger. Dette skyldes at scanneren aflæser forskellen mellem farver. Så hvis noget er brunt vil den ikke kunne kende forskel på om det er en uspecifik binding eller en positiv lymfocyt. Hvis man ser på Katalin Kiss vurdering af CD3+PAS farvningerne, så ser man at 6 ud af 20 prøver (prøve 10,11,12,14,16,18) som har fået scoren acceptabel i stedet for optimal. Ifølge Katalin Kiss skyldes dette at CD3 bliver for svagt farvet eller at der forekommer uspecifikke bindinger i cytoplasmaet fra CD3. Som set i afsnit CD3+ PASide 50 så er KK og jeg ikke enige om hvilke prøver som har uspecifik CD3. Dette vides ikke hvorfor. Katalin vurderer ud fra vores CD3+DPAS med spyt at 3 ud af 20 prøver er optimalt farvet. Dog er der ved prøve 4,5 og 18 en for svag CD3 immunfarvning til at farvningen kan kaldes optimal. De kan dog stadig anvendes hvorved de får scoren acceptabel. Som set i afsnittet CD3+ DPASide 51 så er KK og jeg enige i at prøve 18 har uspecifik CD3, mens vi er uenige om de resterende prøver hvilket undrer os. Samtidig synes vi det er mærkeligt at KK ikke har kommenteret på at prøverne 5,6,11,12,18,19,20 ikke har fået nok spyt på. Hvis man herimod ser på de scoringer som Katalin Kiss har givet CD3 + Alcian Blue, så vurderer hun at alle 20 snit er farvet optimalt. De uspecifikke bindinger fra CD3 som vi studerende vurderer der gør at farvningerne kun er acceptabel, dem har Katalin Kiss ikke vurderet til at påvirke 51 / 64

53 farvningerne negativt. Dette undrer os da de uspecifikke bindinger fra CD3 som set på Figur 33 side 50 kan påvirke ZAC scannerens resultat af tælling af lymfocytter. Det vides dog ikke hvorfor KK ikke har taget højde for disse uspecifikke bindinger da vi vurderer de er meget tydelige. Ud fra dette kan man se at der er en tildens til at Katalin Kiss lægger mere vægt på hvordan CD3 er farvet i forhold til vores SPEC farvninger. Dette skyldes at Katalin Kiss er interesseret i at tælle antallet af lymfocytter i fokusområderne. I Alcian Blue vurderer KK ikke at de uspecifikke bindinger ville blive et problem ved automatiseret tælling af lymfocytterne til diagnosticering af Sjögrens Syndrom på ZAC scanneren. Dog ved både DPAS og PAS kommenterer hun både på uspecifikke bindinger samt at hun ikke synes at CD3 farves kraftigt nok til at man tydeligt kan skelne mellem CD3 positive kerner og PAS og DPAS farvningen. Dette kunne skyldes at der i CD3 +Alcian Blue er en stor kontrast forskel mellem den blå Alcian Blue og den brune CD3, hvorimod ved både CD3+ DPAS og CD3+ PAS ikke er en stor forskel mellem de lyserøde/magenta farver fra Schiff og den brune farve fra CD3. Ved anvendelse af ZAC scanneren vil det være optimalt at anvende et andet kromogen(fx sort) til CD3 således at der i DPAS og PAS vil fremkomme en større kontrast mellem den brune farve fra IHC og de lyserøde/magenta nuancer fra PAS og DPAS farvningerne. Dette ville gøre at ZAC scanneren lettere vil kunne differentiere mellem IHC positive lymfocytter og SPEC farvningen således at der fås et korrekt resultat af tælling af lymfocytterne. Katalin Kiss vurderer at vores forsøg godt kan anvendes til diagnosticering af SS grundet at ingen af vores farvninger i delforsøg 5 har fået en score som er under acceptabel. Delkonklusion Vores forsøg kan anvendes til diagnostik af Sjögrens Syndrom, men ved automatisering af diagnostikken vha. ZAC scanneren, er det nødvendigt at optimere farvningerne så det bliver lettere for maskinen at se forskel på de anvendte farvninger. Spyt vs. Amylase I delforsøg 1,2 og 3 har vi anvendt α-amylase pulver til de fleste af vores DPAS farvninger. Men som det kan ses ud fra vores resultater så giver dette uventede resultater hvor kulhydrater og slim fremstår ufarvet i indkøringsmaterialet. Derfor valgte vi at forsøge at optimere vores farvninger på forskellige måder, da vi på dette tidspunkt i forsøget ikke havde et kvalificeret bud på hvorfor DPAS giver kulhydraterne i vævet et ufarvet udseende. Vi valgte derfor i delforsøg 3 at afprøve om ændring af amylase faktorer ville gøre en forskel. Vi farvede DPAS snit i 20 min i amylase i stedet for de originale 40 min som forskriften lister. Dette gjorde vi fordi de på RHPA ifølge deres forskrift kun anvender amylase i 20 min i stedet for 40 min som de gør på RHPA team Bispebjerg. Som set på Figur 30 og Figur 31 side 46 gør det dog ingen stor forskel for vores resultater, selvom der i teorien kun burde være fraspaltet halvt så meget ved brug af amylase i 20 min i stedet for 40 min. Dog kan vi ikke være helt sikre på at kulhydraterne i virkeligheden er blevet fjernet, de kunne lige så godt være ufarvede. 52 / 64

54 Vi valgte i delforsøg 3 at lade vores enkeltfarvninger gennemgå forbehandlingen HIER ligesom vores indkøringsmateriale, for at teste om dette kunne have indflydelse på de ufarvede kulhydrater i DPAS. Da vi sammenligner vores enkeltfarvninger fra DPAS delforsøg 1 med enkeltfarvningerne fra delforsøg 3, ser vi at DPAS enkeltfarvningen i delforsøg 1 optimal, hvorved vi ved at α-amylase pulver virker. Dog vil man se at i kulhydraterne i DPAS enkeltfarvningen i delforsøg 3 har samme ufarvede udseende som vores indkøringsmateriale i delforsøg 1,2 og 3. Herved er vi ret sikre på at HIER ændrer vævet strukturer når methen broerne efter formalinfiksering brydes, og i sammenspil med amylase kunne forudsagde kulhydraternes ufarvede udseende. Grundet vores uventede resultater har jeg forsøgt at finde videnskabelige artikler som skriver om HIERs påvirkning af α-amylase. Desværre er det et emne hvor der ikke findes nogle artikler endnu, og derfor kontaktede vi overlægen Morgens Vyberg for et bud på hvad vores resultater kan skyldes. Jeg citeter Mogens Vyberg Jeg kender ikke det fænomen, men kunne heller næppe finde på at kombinere immunfarvninger med slimfarvninger.. Han havde desværre ingen forklaring på vores resultater men gav også det bud at problemet kunne ligge i HIER forbehandlingen. Da HIER er en varmebehandling som går ind og denaturerer vævet hvorved methen broer og calcium ioner fjernes, kan det tænkes at der sker en ændring i vævets struktur. Ifølge vores teori spalter Amylase normalt α-1,4 glucosidbindinger midt i glycogenkæderne [9], men jeg tænker, at ved væv som er forbehandlet med HIER, kan der ske det at α-amylase fra pancreas spalter andre bindinger end α-1,4 glucosidbindinger hvorved de skylles væk når vævet skylles i vand. Når vævet senere mikroskoperes vil de steder hvor der har været gulcosidbindinger til stede i vævet fremstå ufarvet da Schiff's reagens ikke har kunnet binde sig til de fjernede kulhydrater. Da vi ikke formåede at opnå tilfredsstillende resultater ved brug af α-amylase pulver foreslog Camilla Qvist og Katalin Kiss at vi kunne anvende spyt i 20 min i stedet for α-amylase pulver. Spyt indeholder amylase og denne metode har tidligere været anvendt på RHPA og RHPA team Bispebjerg. Da vi fra delforsøg 3 begynder at anvende spyt i stedet for amylase, ser vi at både fra blok 2,8 og 16 at CD3 + D-PAS med spyt 20 min giver optimale resultater. Her er glykogenet fjernet som den skal, uden at kulhydrater i vævet fremstår ufarvet. Det undrer os hvorfor spyt virker optimalt når amylase pulveret som anvendes på afdelingen ikke gør. α-amylase som anvendes på RHPA er lavet ud fra enzymer fra pancreas fra grise. De gener som koder for enzymerne henholdsvis fra pancreas og spytkirtler er forskellige, men til trods for dette de er 97% ens i deres aminosyre sammensætning. [1] Forskellen i hvorfor spyt virker optimalt og α- Amylase pulver ikke gør, kunne ligge i den aminosyre sammensætning som er forskellig mellem de to enzymer, samtidig med at der i spyt findes andre komponenter såsom muciner som kunne tænkes at hindre amylase fra spyt i at nedbryde spytkirtler. Herudover siger Steve Mack i " How much amylase alpha and amylase beta are in human saliva what other enzymes" at det er svært at svare på hvor meget amylase der er i menneskespyt, da der er forskellige gener som koder for Amylase, og disse er ikke ens fra person til person. Så hvis to forskellige personer giver en spyt prøve, vil deres spyt ikke nødvendigvis være lige godt til at nedbryde stivelse til monosaccharider. Ifølge 53 / 64

55 Olav Sand et al så indeholder bugspyt meget amylase i forhold til spyt, så da det ifølge Steve Mack er svært at vurderer hvor meget amylase der i virkeligheden er i menneskespyt, kunne det være at den koncentration af amylase fra pancreas som vi anvender, i virkeligheden er i en meget høj koncentration hvorved det lettere påvirker vævet til at fraspalte kulhydrater end spyt fra mennesker. En anden teori kunne være at da vi anvender amylase som er fra pancreas fra grise, så tænker jeg at vores α-amylase pulver kunne være kontamineret med andre enzymer fra pancreas som kan spalte fedtstof, kulhydrater eller proteiner efter at vores væv har været forbehandlet med HIER. Der findes dog ingen videnskabelige belæg for denne teori, ej heller kunne jeg finde noget på Sigmas hjemmeside omkring indhold i α-amylase pulver. Der er nogle ting man skal overveje på når man vælger menneske spyt frem for et kontrolleret α- Amylase pulver som er købt fra et firma. Firmaet giver en garanti for at deres produkt er standardiseret samtidig og virker optimalt ved korrekt anvendelse samtidig med at produktet er let at anvende. På RHPA og RHPA team Bispebjerg anvendes α-amylase pulver som har 10U/ml [24] fra selskabet sigma. Vores resultater viser(dpas med spyt i 20 min fra delforsøg 3-5), at man kan anvende spyt hvorved man får en optimal farvning. Dog siger Steve Mack et al, at de gener som koder for produktionen af spyt forskellig fra person til person, hvilket også giver en usikkerhed i hvorvidt resultaterne af en DPAS med spyt vil være optimal uanset hvilken en bioanalytiker som udfører farvningen. Dette hænger godt sammen med at Ifølge Mandel et al i Individual Differences in AMY1 Gene Copy Number, Salivary α-amylase Levels, and the Perception of Oral Starch vil der kunne være meget store variationer I den biologiske variation af aktiviteten af α-amylase hos mennesker. Han siger at i gennemsnit har en rask person omkring 93U/ml men at der er målt variationer fra 1U/ml til 371U/ml. [23] Herudover så vi også i vores resultater at der er en risiko for at pladeepitel fra munden fra personen som leverer spyttet kan ligge sig hen over vævet hvis man ikke får skyllet vævet grundigt nok, hvilket gør at det er svært at se det underliggende væv. Udover at det vil være svært for en patolog at se det underliggende væv, vil det også ved automatisering vha. ZAC scanneren kunne skabe problemer hvis pladeepitel dækker over de lymfocytter i vævet som maskinen skal tælle. Det kan også være et problem som vi så i delforsøg 5, at nogle af vævs snittene ikke har fået nok spyt på til glykogen blev fjernet hvor det skulle. Dette kan skyldes den store mængde snit som en enkelt person har skulle levere spyt til samtidig med at Lars Hvidtfeldt måske har følt en form for pres over at skulle spytte på vævet når hans medstuderende synes det er ret ulækkert. Ifølge Nater Makus et al I artiklen "Stress-induced changes in human salivary alpha-amylase" ses en betydelig ændring i hvor stor aktiviteten af amylase er, mens forsøgspersonerne er stresset. Lars gav udtryk for at han følte sig ret stresset over at han skulle spytte på al vævet, hvilket i følge artiklen fører til at hans amylase aktivitet er væsentlig højere end normal. Hvis Lars nu ikke havde været stresset mens han skulle spytte på snittene, kan det teoretisk set være at vi ikke havde fået nær så gode resultater som vi gjorde, samtidig med at det er svært at vurdere hvor reproducerbart det er at anvende spyt i stedet for amylase. Vi valgte dog kun at anvende Lars til at spytte på snittene for at 54 / 64

56 opnå så ensartet resultater som muligt gennem vores forsøg. Ydermere kan man argumentere for at det ikke er særligt hygiejnisk at anvende spyt da det indeholder bakterier og er en potentiel smittekilde til forskellige sygdomme. Reliabilitet Projektets reliabilitet kan diskuteres af flere årsager. En af disse årsager ligger i vores anvendte væv. Da væv fra patienter kan der forekomme biologiske variationer i vævet udsende, hvorved det svært at få væv som er identisk med de tunge og mundbundsbiopsier samt læbebiopsier som vi anvender i vores forsøg. Vi har ved skæring af snit anvendt vores kliniske vejleder og bioanalytiker underviser Camilla Qvist, som har flere års erfaring som bioanalytiker, hvorved vi har forsøgt at få vores væv skåret lige tykt i alle sit. Dog havde vi i delforsøg 1 ikke en µm tæller hvorved der kan forekomme variation i, hvor tykt de forskellige snit er skåret, som gør at det er svært at udføre forsøget helt magen til igen. Dog er der i vores forsøg anvendt spyt fra Lars Hvidtfeldt i delforsøg 3-5, hvor man, som gennemgået i diskussionen i afsnittet Spyt vs. Amylase på side 57, ikke nødvendigvis vil få de samme resultater hvis en anden person anvendes til at spytte på snittene. Herved kan der sættes spørgsmålstegn ved kvaliteten af resultaterne ved gentagelse af forsøget, såfremt andre personer end Lars Hvidtfeldt skulle spytte på snittene til DPAS. Til mikroskopering og vurdering af vores farvninger har vi anvendt scoringsskemaer samt at vi har anvendt ekspertise fra bioanalytikere som er specialiseret inden for immunhistokemi, Jane Andersen og Ilker Ceylan, ved eventuelle tvivl om immunfarvninger. Vejleder og bioanalytiker underviser Camilla Qvist og lektor og vejleder fra Metropol, Annette Stenlov, er anvendt til generel hjælp til vurdering af farvningerne, hvilket giver en høj reliabilitet da de har ekspertise inden for patologi. Det skal dog nævnes, at selvom vi i vores forsøg har anvendte scorings skemaer til scoring af vævs snittene, så kan det alligevel ske at de forskellige snit bliver scoret ud fra en subjektiv vurdering af fx hvilken en nuance der er den mest optimale for en farvning. Validitet Validiteten af vores resultater er høj da vi da vi igennem hele forsøget har samarbejdet med Patolog og specialist i SS, Katlin Kiss, ved vurdering af vores resultater. Ydermere har vi anvendt fag specialister Ilker Ceylan og Jane Andersen til generel hjælp til udførsel af IHC farvningerne samt mikroskopering af disse ved tvivl om resultater, hvilket ydermere øger validiteten af vores resultater da de har stor ekspertise inden for IHC farvninger. Validiteten bliver også høj af at vi har anvendt mange patient prøver (20 stk.) til delforsøg 5, som er flere end RHPA har fået på årsbasis normalt i de foranliggende år. Samtidig har vi til delforsøg 1-4 anvendt tunge- og mundbunds resektater som alle er fra blok 2,8 og 16 som er udtaget fra den samme patient, hvilket gør vores farvninger lette at sammenligne. Dog kan man argumentere for at hvis validiteten for projektet skulle øges yderligere, så burde vi have anvendt enkeltfarvninger til alle delforsøg, og ikke kun delforsøg 1,3,4 og 5. Herved ville man 55 / 64

57 ved alle farvninger kunne kontrollere om farvningerne fungerede optimalt før de blev kombineret med hinanden, hvorved det ville være lettere at vurdere hvor eventuelle fejl kunne være opstået. Samtidig skulle man i stedet for spyt have afprøvet forskellige typer α-amylase pulver, indtil man fandt en variant som ikke forudsagde det ufarvede udseende hvor kulhydrater/slim forekom i vævet i DPAS farvningerne. Herved ville man opnå et mere standardiseret resultat hver gang der blev udført farvninger med DPAS. Vi har i delforsøg 3,4 og 5 kun anvendt en person til at spytte på vores snit, hvilket gør at der ikke burde forekomme de store variationer i vores resultater. Dog mindskes validiteten da der i nogle tilfælde ved anvendelse af spyt forekom at ikke al vævet var blevet dækket af spyt. Dette mener vi dog skyldes de mange snit (20 snit) som skulle spyttes på, hvilket gjorde det svært for Lars Hvidtfeldt at producere nok spyt til alle snittene. Da man på års basis de foreliggende år ikke har modtaget 20 prøver over et helt år, vurderer vi dog at risikoen for at en person på afdeling blev nødt til at levere spyt til så mange prøver på en gang er usandsynlig, hvorved vi ville forvente en bedre dække evne fra personen som skulle levere spyttet. Generaliserbarhed Da vi ud fra RHPA Cyres Patobank fandt at der i gennemsnit er modtaget 15 blokke med diagnosen Sjögrens Syndrom om året, og vi i vores forsøg har anvendt 20 blokke fra 20 forskellige patienter, vurderer vi at generaliserbarheden på vores forsøg er god. 56 / 64

58 Konklusion Ved at anvende formalin fikseret, paraffin indstøbte læbebiopsier fra patienter med Sjögrens syndrom, som forbehandles med HIER og efterfølgende immunfarves med CD3 på Dako Autostainer Link 48 efterfulgt af en special farvning (DPAS med spyt, PAS eller Alcian Blue) udført på Tissue-Tek Prisma opnås de bedst egnede dobbeltfarvninger. Da vores forsøg viser at det er muligt at opnå egnede dobbeltfarvninger med CD3+PAS, CD3+DPAS med spyt og CD3+Alcian Blue konkluderer jeg i samråd med overlæge Katalin Kiss at disse dobbeltfarvninger vil kunne anvendes til diagnosticering af Sjögrens syndrom. Dog tages der forbehold for, at hvis forsøgets farvninger skal kunne anvendes på ZAC scanneren, så er det nødvendigt at anvende et andet kromogen for CD3, som giver en bedre kontrast til SPEC farvningerne end den brune farve vi har anvendt i dette forsøg. Herved bliver det lettere for scanneren at differentiere mellem IHC og SPEC farvningerne. Samtidig anbefales det også at der ved anvendelse af spyt til DPAS farvninger anvendes fugtkammer ved inkubation med spyt, så dette ikke tørrer ud hvorved epitel celler fra bioanalytikerens mund ikke sætter sig i aflejringer på vævssnittet og herved hindrer ZAC scanneren i at differentiere mellem IHC og SPEC farvningerne. Den bedste løsning ville dog være at undersøge hvorvidt andre typer af α-amylase pulver kunne anvendes i stedet for spyt, for at få et mere standardiseret resultat ved hver farvning. 57 / 64

59 Perspektivering 1. Hvis Rigshospitalet beslutter sig for at implementere vores forsøg som en del af SS, ville det i den sammenhæng være relevant at afprøve hvorvidt andre typer af Amylase kan anvendes/giver et bedre resultat til diagnostisk af SS end den Amylase afdelingen bruger lige pt. 2. Det kunne videre være interessant at afprøve hvorvidt det er muligt at kombinere andre Immunhistokemiske farvninger med PAS, DPAS og Alcian Blue. 3. Det kunne være interessant at teste hvor reproducerbart det er at anvende spyt fra flere personer da der forekommer en biologisk variation i sammensætningen af spyt. 4. Da det virker til at forbehandlingen i HIER påvirker hvorvidt DPAS får et hullet udseende pga. manglende farvning, kunne det være interessant at teste for andre former for forbehandling, inklusiv at teste for om forbehandling i en buffer med lav ph kunne gøre en forskel. 5. Det kunne være relevant at teste hvorvidt de andre antistoffer CD 20(klon L26), MUM5, CD79a (klon JCB117), Ki67 (klon MIB-1) som også anvendes til diagnostisk af Sjögrens Syndrom, kunne anvendes i stedet for CD3, om man ved brug af disse ville opnå brugbare resultater. 6. Man kunne lave et forsøg hvor man forsøget at få ZAC scanneren til at tælle antallet af T- lymfocytter lige så præcist som en specialiseret patolog kan, samt hvor følsom ZAC scanneren er overfor uspecifikke bindinger fra CD3. 7. Ved automatisering af tælling af lymfocytter med ZAC scanneren kan man overveje at bruge en anden farve kromogen for at maskinen lettere kan differentiere mellem lymfocytterne og det resterende væv. 58 / 64

60 Referenceliste/literatur [1]Steve Mack; How much amylase alpha and amylase beta are in human saliva what other enzymes" juni 3; 2006 [2] IngerLindebo Holm "Histokemi vævspræparation og vævsfarvning"; s 68; 2013; [3] IngerLindebo Holm "Histokemi Bindevævs- og kulhydratfarvninger"; s 130,131; 2013; [4] "Pathophysiology of Disease" Stephen J. McPhee. 2010; s [5] David Tacha Ph.D et al. Poster# P-25 An Alcian Blue/PAS combined with TTF-1 and NapsinA Staining Procedure". [6] Corbellini, LG et al "Immunohistochemistry combined with periodic acid-schiff for bovine mammary glands with protothecal mastitis"; 7/ [7] Tacha; David et al"an Alcian Blue/PAS combined with TTF-1 and Napsin A staining Procedure"; [8] Shan-Rong et al. DAKO; Part I: The Staining Process; Chapter 3 Antigen Retrieval [9] R.W Horobin et al. "CONN'S Biological Stains"; 10th edition. [10] Daniels, Troy et al "Associations between salivary gland histopathologic diagnoses and phenotypic features of SjögrensSyndrom(SS) among 1726 participants". juli 2011; 63(7): [11] Dako; FLEX; Polyclonal Rabbit; Anti-Human CD3; ready to use; kode IR503; 2012 [12] Mogens Vyberg Anvendt histokemi ; 6. udgave 2005 [13] Rigshospitalets procedurevejledning I indstøbning af væv. [14] D.02/ [15] Rigshospitalets procedurevejledning I skæring af væv. [16] Rigshospitalets procedurevejledning i fiksering af væv. [17] d 15/ [18] d 21/5/ [19] Olav Sand et al "Menneskets anatomi og fysiologi" 2. Udgave; 2006; s , 403 [20] Urs M. Nater et al., Human salivary alpha-amylase reactivity in a psychosocial stress paradigm, International Journal of Psychophysiology 55 (2005) [21]Ellis Roy; IHCWORLD "Alcian Blue Staining Protocol" 28/4/2015. [22] Prentø, Poul Staning of macromolecules: possible mechanisms and examples ; School of Medical Kaborytory Science; [23]Abigal L, Mandel et al Individual Differences in AMY1 Gene Copy Number, Salivary α-amylase Levels, and the Perception of Oral Starch [24] Rigshospitalets procedurevejledning D-PAS. 59 / 64

61 Bilag Bilag 1 - DIASTASE- PAS (DPAS) Den ikke modificerede forskrift som RHPA/RHPA team Bispebjerg anvender til DPAS farvning. 1. Afparaffinering af snit til vand 2. Amylase, FRISK FREMSTILLET 20min.*/40min** 3. Skyl i rindende vand 5 min. 4. 0,5 % periodsyre 5 min. 5. Rindende vand 5 min. 6. Schiff s reagens stuetemperatur 20 min.*/40min** 7. Rindende vand 5 min 8. Mayers hæmatoxylin. 5 min 9. Rindende vand 5 min % alkohol 5 sek % alkohol 5 sek % alkohol 2 min % alkohol 2 min % alkohol 2 min. 15. Tørring i stinkskab min 16. Montering med Pertex *Anvendes på RHPA. **Anvendes på RHPA team Bispebjerg 60 / 64

62 Bilag 2 - PAS Den ikke modificerede forskrift som RHPA anvender til PAS farvning. 1.Afparaffinering af snit til vand. 2. Schiff s reagens stuetemperatur 20 min*./40min** 3. Rindende vand 5 min 4. Mayers hæmatoxylin. 5min 5. Skyl i vand. 5min. 6. Tørring i stinkskab min 7. Montering med Pertex *RHPA anvender denne farvetid. ** RHPA team Bispebjerg anvender denne farvetid. Bilag 3 - Alcian Blue Den ikke modificerede forskrift som RHPA anvender til Alcian Blue farvning. 1. Afparaffinering af snit til vand 2 Alcian Blue pyridin variant ph 2,8 10 min 3. Skyl i rindende vand 5min. 4. Kernechtrot 10min 5. Skyl i rindende vand 5 min. 6. Dehydrering 5min. 7. Montering med Pertex Tørring i stinkskab min 61 / 64

63 Bilag 4 - Rådata for 5. delforsøg Farve+prøve nr. Kontrol score Prøve score Katalin Kiss s vurdering af IHC/SPEC. Kommentarer CD3+ PAS Uspecifik CD3 i pladeepitel i patient prøve Uspecifik CD3 i pladeepitel i patient prøve CD3+DPAS med spyt i 20 min Uspecifik CD3 i pladeepitel i patient prøve Væv har ikke fået nok spyt. Glykogen ikke fjernet i DPAS i patient og kontrol væv Væv har ikke fået nok spyt. Glykogen ikke fjernet i DPAS i kontrol væv Små områder i kontrol- og patient væv har ikke været dækket af spyt Små områder i kontrol- og patient væv har ikke været dækket af spyt / 64

64 Små områder i kontrollen har ikke været dækket af spyt. Uspecifik CD3 over alt i kontrol (lever) Små områder i kontrollen har ikke været dækket af spyt Små områder i kontrollen har ikke været dækket af spyt. CD3+Alcian Blue Uspecifik CD3 i pladeepitel i patient prøve Uspecifik CD3 i pladeepitel i patient prøve Uspecifik CD3 i pladeepitel i patient prøve Kontroller Blok 16 Multi-1 PAS 3 3 DPAS 3 3 Alcian Blue 3 3 CD / 64

65 Bilag 5 - Katalin Kiss s vurdering af IHC/SPEC Patient nummer Katalin Kiss s Kommentar vurdering af IHC/SPEC Svag CD3 i spyt/pas 5 2 Spyt/PAS+CD3 giver en utydelig immunfarvning PAS med uspecifik cytoplasmatisk CD3 farvning 11 2 Svag CD3 i PAS 12 2 PAS med uspecifik cytoplasmatisk CD3 farvning Svag CD3 i PAS + lidt uspecifik farvning Svag cytoplasmatisk CD3 farvning i PAS Svag cytoplasmatisk CD3 farvning i PAS, CD3 svag i spyt/d-pas Note : Såfremt der ingen kommentar forekommer om en farvning, har den fået scoren, 3 (optimal). 64 / 64