P-Homocystein, total. Anatomi af et kvalitetssikringsprogram

Transkript

1 P-Homocystein, total og Anatomi af et kvalitetssikringsprogram Lene Damm Christensen Niels Tørring og Jan Møller

2 Folate Cycle DIET Methionine e 5,10-Methyl- Tetrahydrofolate MTHFR Tetrahydrofolate B12 5-Methyl- Tetrahydrofolate MS DMG BHMT Betaine S-Adenosyl-Methionine (SAM) CH 3 S-Adenosyl-Homocysteine (SAH) Homocysteine B6 CBS Cystathionine Transsulfuration Pathway Cysteine

3 Plasma Homocystein, total. Hvad er det? Homocysteine: HS-CH 2 -CH 2 -CH-COO - NH 3 + Frit thiol: Mindre end 2% Disulfider: Homocystine ocys eller e homocysteine-cysteine: ocys e e e 10-15% Protein bundet: Mere end 80% P-Homocystein, total er summen af disse fraktioner eller koncentrationen af homocystein efter reduktion af fraktionerne.

4

5 P-Homocystein, total. Hvem? I de Nordiske lande er der mindst 76 kliniske laboratorier der rutinemæssigt måler total homocystein in plasma. 20 i Danmark 31 i Sverige 21 i Norge 3 i Finland 1iIsland

6 P-Homocystein, total. Hvordan? Reduktion Analytiske metoder GC-MS LC-MS HPLC Immunoassays Enzymatic cycling

7 Reduktion Sulfhydryl reagenser: Dithiothreitol (DTT), dithioerythritol (DTE), mercaptoethanol Natrium eller kalium borohydride tri-n-butylphosphine (TBP) tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)

8 GC-MS Sally Stabbler et al 1993 Intern standard: d Deutereret t homocystin Reduktion med DTT Fast fase ekstraktion på en anion- exchange søjle Silylering med MTBSTFA Kvantitering på kapillær GC med masse spektrometer i SIM mode. Ratio mellem deutereret og ikke-deutereret homocysteine måles

9 LC-MS-MS Intern standard: Deutereret homocystin Reduktion med DTT Protein fældning Separation på en kort analytisk LC-CN søjle Detektion på tandem MS system.

10 HPLC Amino syre analysatorer Ninhydrin post-column derivatisering Fotometric detektion Post-column derivatisering Fluorometric detektion Derivatisatisering with SBD-F or monobromobimane Electrochemical detektion Ingen derivatisering

11 Immunoassays Reduktion Enzymatisk omdannelse til S-adenosyl- homocysteine (SAH) Detektion med et monoklonalt antistof mod SAH og konkurrerende binding med mærket SAH Platforme: EIA, FPIA, LIA, Nephelometri

12 Enzymatic Cycling Catch method Reduktion Enzymatisk omdannelse af Hcy og serine til L- Cystathionine thi i med CBS (Cystathionine-β- thi i β synthase). Enzymatisk omdannelse af L-Cystathionine thi i til Hcy, pyruvat og ammoniak Pyruvate reduceres af LD med oxidation af NADH til NAD + Hastigheden af NAD + dannelsen måles som ændringen i absorption ved 340 nm

13 Folate Cycle DIET Methionine 5,10-Methyl- Tetrahydrofolate MTHFR Tetrahydrofolate B12 5-Methyl- Tetrahydrofolate MS DMG BHMT Betaine S-Adenosyl-Methionine (SAM) CH 3 S-Adenosyl-Homocysteine (SAH) Homocysteine B6 CBS Cystathionine Transsulfuration Pathway Cysteine

14 Enzymatic Cycling Diazyme method Reduktion Enzymatisk omdannelse af Hcy til Methionin med SAM som methyldonor. Den resulterende SAH spaltes til Adenosyl og Hcy. Hcy indgår igen i den enzymatiske cycling og den dannede adenosyl måles enzymatisk med en resulterende NAD/NADH cyclus.

15 Ekstern Kvalitetssikring Pilotforsøg i 1996 med 7 deltagere fra Danmark (1), Norge (1) og Sverige (5) Siden 1997 fast DEKS-program i samarbejde med NKK, Labquality og EQUALIS 2009: 91 deltagende laboratorier, heraf 17 ikke-nordiske

16 Fra starten et lidt anderledes program med få deltagere Databehandling efter ISO13528 Dokumentation af prøvematerialet efter ISO13528 Møller J, Rasmussen K, Christensen L. External quality assessment of methylmalonic acid and total homocysteine. Clin Chem 1999; 45; Rykkere (purringer) ved for sent indkomne svar Forespørgsler ved ombyttede resultater eller andre oplagte grove fejl Aktiv udlevering af erstatningsprøver Rådgivning og levering af referenceprøver

17 Ingredienser til programmet Organisation Prøver Forsendelse og svar Vurderinger Fremtid

18 Organisation Et nordisk program! Programmet er et DEKS-program Udføres af og på Århus Universitetshospital,Skejby Administration af DEKS, Herlev Samarbejde mellem DEKS, NKK, EQUALIS, Labquality

19 Prøver Prøvematerialer fremstillet t til dette program Donorblod fra Blodbank stabiliseret med EDTA, der køles og centrifugeres umiddelbart. Modifikationer: Blandinger, fortyndinger med 0,9% saltvand og tilsætninger t i med L- Homocystin Opbevares ved -20 o Holdbarheden undersøges løbende ved udsendelse d af samme materiale flere gange I løbet af et år

20 Forsendelser og svar Forsendelse af prøver: Norden: Prøverne sendes med almindelig post direkte fra fryser. Andre lande: Det er en udfordring at sende prøver til USA, Polen og Tyrkiet. Prøverne for hele året sendes samlet uden temperaturkontrol med kurer. Resultater: Med post, fax eller . Rapporter: Med post. Enkeltvist som med rapport som pdf-fil.

21 Nogle resultater fra sæt resultater t (Nogle laboratorier indsender resultater fra mere end en metode.) Det samme umodificerede plasma har været sendt ud 4 gange g med forskellige koder. 82 laboratorier har indsendt resultater til alle 4 gange. Det samme plasma men tilsat L-Homocystin svarende til 20 µmol/l har været sendt ud 2 gange. 81 laboratorier har indsendt alle 6 resultater.

22 Kvalitetsmål Beregnet efter biologisk variation Bias: 8% Upræcision: 4% TE (P:0.01): 2.33*4%+8% = 17% Referencer: Møller J, Rasmussen K, Christensen L. External Quality Assessment of Methylmalonic Acid and Total Homocysteine. Clin Chem 1999;45: Ricos C et al. Current databases on biological i l variation: pros, cons and progress. Scand J Clin Lab Invest 1999;59:

23 Præcision 2009 Metode Antal lab Median CV% LC/GC-MS 10 5,2 HPLC 5 15,6 Axis Shields/Catch 12 3,5 Advia Centaur ,7 Abbott Methods 17 4,4 Siemens Immulite methods 11 8,5 Ortho-Clinical Diagnostics 2 4,1 Nephelometry 2 7,8 Diazyme 9 4,0 Others 1 6,5 Alle 82 5,1

24 Præcision CV% LC/GC-MS HPLC Axis Shields/Catch Advia Centaur Abbott Methods 13 Siemens Immulite methods 11 Ortho-Clinical Diagnostics 9 Nephelometry 7 Diazyme 5 Others

25 Bias 2009 Metode Antal lab Median Recovery% LC/GC-MS ,0 HPLC 5 112,3 Axis Shields/Catch ,8 Advia Centaur ,3 Abbott Methods 17 99,3 Siemens Immulite methods ,3 Ortho-Clinical Diagnostics 2 92,9 Nephelometry 2 98,0 Diazyme 9 99,1 Others 1 91,4 Alle ,5 Minimum 85,2 Maksimum 124,6

26 Er det godt nok? Meget få laboratorier opfylder kravet om en ønskværdig upræcision bedre end 4% Minimumskravet er 6%. Mere end halvdelen af alle laboratorier opfylder dette krav. Usikkerheden på den målte bias skal tages i betragtning. For et gennemsnitligt laboratorium med en upræcision på 5%, vil usikkerheden på den enkelte laboratoriums beregnede genfinding være ca 4.5%. Kravet er således en genfinding på %. Husk: Matrixeffekter! Ikke alle kommercielle metoder benytter endnu NIST SRM 1955 sporbare kalibreringer.

27 Fremtiden Programmet er I de bedste hænder: Lene Damm Christensen, der hele tiden har været medansvarlig og Niels Tørring, der kommer med nye ideer.

28 Tak for opmærksomheden! Kommentarer og spørgsmål?