Præanalytisk håndtering af blodprøver En undersøgelse af lys- og tidsforhold for folat og cobalamin

Transkript

1 Præanalytisk håndtering af blodprøver En undersøgelse af lys- og tidsforhold for folat og cobalamin Udarbejdet af: Rikke Vissing Olesen Studienummer: K-vejleder: Gitte Hamann, Bioanalytikerunderviser, Klinisk Kemisk Afdeling, Sønderborg Sygehus I-vejleder: Jesper Volby, Cant.scient. Lektor, VIAUC Bioanalytikeruddannelsen

2 Forord Denne rapport er udarbejdet af bioanalytikerstuderende ved VIA University College Aarhus, Rikke Vissing Olesen, som en del af den afsluttende professionsbacheloreksamen, der finder sted i januar Rapportens målgruppe er personalet på Klinisk Kemisk Afdeling, Sygehus Sønderjylland samt interesserede bioanalytikerstuderende. Rapporten er udarbejdet på uddannelsens afsluttende modul 14 og forsøget er udført i perioden 10. oktober til 9. november Tak til Hanne Davidsen, specialist i immunkemi på Klinisk Kemisk Afdeling, Sygehus Sønderjylland, for altid at stå til rådighed og hjælpe med det praktiske arbejde ved ADVIA Centaur. 14. december 2011 Rikke Vissing Olesen Side 2 af 33

3 Resumé Baggrund: Dette forsøg undersøger, hvorledes en overskridelse af de præanalytiske retningslinjer for folat- og cobalaminanalyserne påvirker analyseresultaterne og om dette har klinisk relevans. Baggrunden for dette er Siemens analysemanualer, hvori det frarådes at analysere for folat- og cobalamin i serumprøver der har været opbevaret i stuetemperatur i mere end 8 timer. Det anbefales også, ikke at udsætte prøver til folat- og cobalaminanalyserne for direkte sollys. Klinisk Kemisk Afdeling på Sønderborg Sygehus overholder ikke Siemens anbefalinger. Metode: Vi sammenlignede koncentrationsændringerne i 72 serumprøver eksponeret for dagslys med serumprøver der var lysbeskyttede. Prøverne blev analyseret 4, 8, 28 og 52 timer efter blodprøvetagningen. Vi sammenlignede også koncentrationsændringerne i 38 serumprøver der blev opbevaret i stuetemperatur og analyseret 4, 8 og 28 timer efter blodprøvetagningen. Analyserne blev foretaget med et kompetitiv immunanalyseprincip på ADVIA Centaur. Resultater: Ved anvendelse af Wilcoxon-test fandt vi statistisk signifikant forskel i folatkoncentrationen mellem lysbeskyttede og lyseksponerede prøver analyseret 4 timer efter blodprøvetagningen, samt statistisk signifikant forskel i cobalaminkoncentrationen mellem lysbeskyttede og lyseksponerede prøver ved alle fire analysetidspunkter. Ved anvendelse af Anova to-sidet variansanalyse fandt vi statistisk signifikant forskel i folatkoncentrationen mellem serumprøver analyseret 4 timer efter blodprøvetagningen og serumprøver analyseret 8 og 28 timer efter blodprøvetagningen ved opbevaring i stuetemperatur. Ingen af de signifikante forskelle havde klinisk relevans. Konklusion: Dette forsøg viser, at det ikke er nødvendigt at lysbeskytte serumprøver til folat- og cobalaminanalyserne i op til 52 timer efter blodprøvetagningen. Yderligere viser forsøget, at opbevaring af serumprøver i stutemperatur i op til 28 timer ikke medfører klinisk relevante ændringer i folat- og cobalaminkoncentrationen. Side 3 af 33

4 Indholdsfortegnelse Forord... 2 Resumé Introduktion Baggrund Formål Problemformulering Målformulering Teori afsnit Folat Cobalamin Analyseprincip Metode Forsøgsdesign Præanalytisk Analytisk Postanalytisk Dataindsamling Deltagere Etik Databehandling Anvendt statistik Dataekskludering Kvalitetssikring Søgningsstrategi Materialer Utensilier Apparatur Reagens Kontroller Kalibratorer Resultater Folat Cobalamin Diskussion Konklusion Side 4 af 33

5 6. Perspektivering Bilagsoversigt Bibliografi Side 5 af 33

6 1. Introduktion 1.1 Baggrund Ifølge Siemens analysemanualer til folat- og cobalaminanalyserne, som begge udføres på ADVIA Centaur, skal prøverne analyseres indenfor 8 timer, hvis de opbevares ved stuetemperatur og sker dette ikke skal prøverne nedkøles ved 2 til 8 C (1,2). I rutinen på Klinisk Kemisk Afdeling (KKA), Sønderborg Sygehus overholdes disse anbefalinger ikke altid, idet prøver modtaget fra lægepraksis kan stå i stuetemperatur i op til 24 timer inden de analyseres på afdelingen. Desuden påpeges i analysemanualerne, at for stor lyspåvirkning kan påvirke cobalaminværdierne (2), mens der står at folat er lysfølsomt og man så vidt muligt skal undgå at udsætte prøven for direkte sollys (1). Dette tages der ikke hensyn til i den nuværende præanalytiske fase. 1.2 Formål Formålet er at undersøge, hvorledes en overskridelse af de anbefalede præanalytiske retningslinjer for folat- og cobalaminanalyserne påvirker analytkoncentrationerne og om dette har klinisk relevans. 1.3 Problemformulering Hvilke konsekvenser er der ved forskellig præanalytisk håndtering af prøvemateriale til folat- og cobalaminanalyserne og hvordan vil en eventuel forandring i den præanalytiske procedure påvirke den daglige rutine? 1.4 Målformulering Vi undersøger, om dagslys påvirker folat- og cobalaminkoncentrationen i serum. Der tages to blodprøver fra hver person, hvoraf den ene prøve lysbeskyttes mens den anden opbevares i dagslys. Blodprøverne analyseres inden 4 og 8 timer efter blodprøvetaningen og igen 27 til 28 timer samt 51 til 52 timer efter blodprøvetagningen. Prøverne opbevares ved stuetemperatur de første 8 timer, hvorefter de sættes på køl. Der anvendes t-test for parrede stikprøver til at vurdere, om data viser en signifikant forskel i koncentrationen mellem lysbeskyttede og lyseksponerede prøver. Der undersøges, hvorvidt en eventuel signifikant forskel har klinisk relevans. Vi undersøger også, om overskridelsen af Siemens anbefalede tidsinterval påvirker folat- og cobalaminkoncentrationerne i serum. Der tages en blodprøve fra hver person. Blodprøverne analyseres inden 4 og 8 timer efter blodprøvetagning og igen 27 til 28 timer efter blodprøvetagningen. Prøverne opbevares ved stuetemperatur alle 28 timer. Der anvendes to-sidet variansanalyse uden gentagelser til at vurdere om data viser en Side 6 af 33

7 signifinkant forskel i koncentrationen mellem de tre analyseringstidspunkter. Der undersøges, hvorvidt en eventuel signifikant forskel har klinisk relevans. Resultaterne fra tidsforsøget samt lys- og mørkeforsøget sammenlignes med resultater fra udvalgte videnskabelige artikler. 1.5 Teori afsnit Folat Folater er B-vitaminer, en gruppe stoffer med en fælles kemisk grundstruktur koblet til en eller flere glutaminsyre-enheder, og fungerer som coenzymer i stofskiftereaktioner. Folat er essentiel for DNA-syntesen, som er nødvendig for en normal modning af erytrocytter. Folatmangel medfører en forringelse af DNA-syntesen, der kan forårsage makrocytære anæmier, som blandt andet er karakteriseret ved en unormal modning af erytrocytter samt en forringet levetid af disse (1,3). Mennesket får folat gennem kosten via grøntsager, frugt, kød og mælkeprodukter. Før folat absorberes i tarmen spaltes det via enzymer og hverved methyleres og reduceres folat til 5-methyl-tetrahydrofolat (5-methyl-THF) og cirkulerer i plasma i denne form. Størstedelen af folat i plasma er løst bundet til albumin, mens en mindre del er bundet til specifikke transportproteiner. 5-methyl-THF optages fra plasma i vævscellerne, hvor det her afgiver sin methylgruppe til homocystein under dannelse af metionin, hvilket er nødvendigt for at tetrahydrofolat kan fungere i cellefunktioner som syntese af DNA. Mangel på folat kan ses ved blandt andet øget forbrug, malapsorption samt nedsat indtagelse (3,4). Referenceintervallet for voksne er 5,0-30,0 nmol/l (5) Cobalamin B12-vitamin eller cobalamin er en gruppe af komplekse kemiske forbindelser med et cobalt-atom i midten. Heraf er cyanocobalamin den mest stabile form og denne som ofte måles på i serum (4). Cobalamin er, ligesom folat, nødvendig for DNA-syntensen. Cobalaminmangel kan medfører anæmier og unormal modning af erytrocytter (2,3). Mennesket får cobalamin gennem kosten via animalske produkter som kød, æg og mælk. Intrinsic factor er et protein, som dannes i maveslimhindes celler og er nødvendig for absorption af cobalamin. I duodenum danner intrinsic factor og cobalamin et kompleks som fæstnes til receptorer og optages i tarmcellerne. Her frigøres cobalamin fra intrinsic factor og bindes i stedet i plasma, dels til et specifikt transportprotein, transcobalamin, hvilket udgør den biologisk aktive form af cobalamin i plasma og dels til et uspecifkt transportprotein, hvilket udgør cobalamin-depotet i blodet. Den biologisk aktive form af Side 7 af 33

8 cobalamin optages i leveren og i perifere væv, hvor cobalamin i vævscellerne fungerer som coenzym i processer nødvendige for DNA-syntensen (2,3,4). Symptomer på cobalaminmangel er ofte neurologiske symptomer som spasticitet, demens og desorientation og disse er ofte irreversible (4). Mangel på cobalamin kan ses ved blandt andet nedsat indtagelse, malabsorption, tyndtarmsygdomme samt ved mangel på intrinsic factor og transcobalamin (2). Referenceintervallet for voksne er pmol/l (6) Analyseprincip Både folat og cobalamin analyserne på ADVIA Centaur XP er kompetitive immunanalyser, der anvender direkte kemiluminiscens, en hurtig og spontan reaktion, der udsender energi i form af lys. Ved måling af folatkoncentrationen i serum, bliver folat i patientprøven først behandlet med DTT/slipmiddel, for at frigive folatet fra endogene bindingsproteiner i patientprøven. Solid Phase reagenset indeholder paramagnetiske partikler (PMP) hvortil der kovalent er bundet avidin og hertil bindes biotin-mærket folatbindende protein ved en avidinbiotinbinding. Biotin-mærket folatbindende protein fungerer som antistof. Folat fra patientprøven bindes til biotin-mærket folatbindende protein i konkurrence med acridiniumester-mærket (AE-mærket) folat, der findes i Lite Reagens og fungerer som antigen. AE-mærket folat bindes til de resterende biotin-mærket folatbindende proteiner, hvortil folat fra patientprøven ikke er bundet (1,5). Figur 1: Tegning af analyseprincip. 1: Avidinbiotin-binding. 2: PMP. 3: Folat i prøven. 4: AE-mærket antigen. Efter vask, hvor overskydende frit AE-mærket folat skylles væk, tilsættes sur og basisk reagens. Det tilbageværende acridiniumester oxideres af syrereagenset, hvorefter det basiske reagens danner et ustabilt molekyle og starter kemiluminiscensreaktionen (7). Side 8 af 33

9 Der er omvendt proportionalitet mellem lysudviklingen, målt i RLU (relative lysenheder), som systemet registrerer og folatkoncentrationen i patientprøven (1). Figur 2. Illustration af lysudviklingen (8). 1: Lysemission (RLU er). 2: Analytkoncentration Ved måling af cobalaminkoncentration i serum bliver cobalamin i patientprøven først behandlet med DTT/slipmiddel, for at frigive cobalamin fra endogene bindingsproteiner i prøven, samt med cobinamid for at forhindre senere genbinding efter tilføjelse af Solid Phase. I Solid Phase reagenset er der til PMP kovalent bundet en renset mængde intrinsic factor, der fungerer som antistof. Cobalamin i patientprøven konkurrerer med AE-mærket cobalamin, der findes i Lite Reagens og fungerer som antigen, om den begrænsede mængde renset intrinsic factor (2,6). Figur 3. Illustration af analyseprincip (8). 1: Intrinsic faktor. 2: PMP. 3: Cobalamin i prøven. 4: AE-mærket antigen. Side 9 af 33

10 Efter vask, hvor overskydende frit AE-mærket cobalamin skylles væk, tilsættes sur og basisk reagens og hverved sker den samme kemiluminiscentriske reaktion som beskrevet ved folatanalysen. Ved måling af cobalaminkoncentrationen i serum er der også omvendt proportionalitet mellem lysudviklingen og cobalaminkoncentrationen i patientprøven (2,6). Analyseusikkerheden for begge analyser på ADVIA Centaur er 15 % (9,10). 2. Metode 2.1 Forsøgsdesign Inden forsøgets start udarbejdede vi et tidsskema over forsøgsperioden, som ses i bilag 1. Dette fungerede som tidsplan og det er her muligt at se, hvilke tidspunkter der blev taget blodprøver på samt hvornår prøverne blev centrifugeret og analyseret Præanalytisk Der blev taget et 5,5mL serumglas og to 9,0mL serumglas, alle med clot activator. Inden blodprøvetagningen blev sammenhørende glas fra hver person mærket med et tal. Umiddelbart efter blodprøvetagningen blev 5,5mL glasset pakket ind i stanniol og 9,0mL glassene stod i dagslys. Blodprøverne blev mærket med prøvetagningenstidspunkt og koagulerede i mindst en time inden centrifugering ved 2061g i 10 minutter ved 20 C. Efter centrifugering af prøverne blev serum afpippeteret over i nye glas, mærket med specifikke barkoder. Prøver som skulle stå i mørke blev umiddelbart efter afpippetering pakket ind i stanniol og blev tilproppet. Prøver der skulle udsættes for lys blev stående fremme i dagslys. Prøver med hæmolyse samt prøver med for høje værdier af lipæmi og icterus blev ikke analyseret. Ved tilfælde af bobler i glasset blev disse fjernet inden analysering Analytisk Inden analysering af blodprøverne kontrollerede vi at dagens kontrolanalyseringer var godkendt. Desuden analyserede vi ekstra kontroller ved brug af ADVIA Centaur til analysering udenfor rutinen. Glassene blev sat på i hold på ADVIA Centaur til analysering, efter tidspunkterne angivet i tidsskemaet i bilag 1. Blodprøverne til lys- og mørkeforsøget blev analyseret inden 4 og 8 efter blodprøvetagningen og igen 27 til 28 timer samt 51 til 52 timer efter blodprøvetagningen. Blodprøverne til tidsforsøget blev analyseret inden 4 og 8 timer efter blodprøvetagningen og igen 27 til 28 timer efter blodprøvetagningen. Side 10 af 33

11 2.1.3 Postanalytisk Efter analysering på ADVIA Centaur blev prøverne sat tilbage i de dertil markerede stativer. Blodprøverne til tidsforsøget blev opbevaret ved stuetemperatur alle 28 timer efter blodprøvetagningen. Blodprøverne til lys- og mørkeforsøget blev opbevaret ved stuetemperatur de første 8 timer efter blodprøvetagningen, hvorefter alle prøver blev sat i køleskab og opbevaret ved 2 til 8 C mellem 2 og 3 analysering samt mellem 3 og 4 analysering. De prøver der skulle eksponeres for lys blev sat i et køleskab med glaslåge. 2.2 Dataindsamling Deltagere Der blev taget blodprøver på personalet fra Klinisk Kemisk Afdeling på Sønderborg Sygehus, samt på patienter, der kom til blodprøvetagning på Klinisk Kemisk Afdelings ambulatorium Etik Inden blodprøvetagningen blev der altid bedt om samtykke fra de frivillige til at tage ekstra prøver. Det sikredes at de frivillige personer var oplyst om at deltagelsen og den efterfølgende håndtering og analysering af prøverne var anonym. Vi var opmærsomme på at det kan virke voldsomt for den enkelte at få taget 3 ekstra glas, derfor vurderede vi også om det var forsvarligt at bede om lov til at tage 3 ekstra blodprøver i den aktuelle situation. 2.3 Databehandling Anvendt statistik I undersøgelsen af, hvorledes overskridelse af det anbefalede tidsinterval har nogen betydning for prøvematerialet, anvendes to-sidet varians analyse uden gentagelser til at vurdere om der er signifikant forskel på de indsamlede data fra de forskellige tidsintervaller (11). Udregningerne laves i Microsoft Office Excel 2007 ved brug af værktøjet dataanalyse Anava to-faktor uden gentagelser. I undersøgelsen af, hvorledes lys påvirker cobalamin og folat værdierne i blodprøverne, anvendes Wilcoxon-test for parrede stikprøver til at vurdere om der er signifikant forskel på data fra prøver opbevaret henholdsvis i lys og i mørke (11). Denne anvendes i stedet for en t-test for parrede stikprøver idet data ikke er normalfordelt. I bilag 2 og 3 ses histogrammer over data til lys- og mørkeforsøget for folat og cobalamin. Udregningerne laves i Excel. Det anvendte signifikansniveau er 0,05 (5 %). Side 11 af 33

12 Der anvendes følgende hypoteser til to-sidet variansanalyse uden gentagelser (11), Der er ikke påvist nogen signifikant forskel på stikprøverne. Der er påvist en signifikant forskel på stikprøverne. Der anvendes følgende hypoteser til Wilcoxon-testen (11), Der er ikke påvist nogen signifikant forskel på stikprøverne. Der er påvist en signifikant forskel på stikprøverne Dataekskludering Prøver med værdier > 54,4 nmol/l ved måling af folat ekskluderes fra den efterfølgende databehandling. Eventuelle tidligere eller efterfølgende målinger på denne prøve fratages også og ligeledes fratages de tilhørende cobalaminværdier for prøven. Prøver til tidsforsøget, hvor der ikke er tilstrækkelig med prøvemateriale til alle 3 analyseringer fratages fra databehandlingen. Prøver til lys eller mørkeforsøget, hvor der ikke er tilstrækkelig med prøvemateriale til alle 4 analyseringer fratages fra databehandlingen, og ligeledes fratages den tilhørende henholdsvis lys- eller mørkeprøve. Ved fejlmeldinger fra Centaur, f.eks. Clot Detected fjernes denne prøve fra databehandlingen og ligeledes gælder resultater fra tidligere analyseringer på prøven. 2.4 Kvalitetssikring Kvantitative analyser, som folat- og cobalaminanalyserne, er på KKA omfattet af en intern kvalitetskontrol. Kontrolområdet er angivet som middelværdien +/- 2 SD for den pågældende analyse (12). De interne kontroller på er Biorad 1 (40371) og Biorad 2 (40372). Disse vurderes og godkendes i ADVIA Centaur QC Programmet. Der analyseres dagligt kontroller først og sidst i rutinen for folat og cobalamin. Kontrollerne er fremstillet af frysetørret humanserum tilsat stabilisator og de opløses frisk hver dag med milli Q H 2 O (13). Til folat- og cobalaminanalyserne skal der som et minimunskrav udføres analyse af et lavt og et højt niveau af kvalitetskontrolmateriale hver dag der analyseres prøver. Side 12 af 33

13 Til folat- og cobalaminanalyserne tilhører en kalibrator i et lavt og i et højt niveau. Disse består af frysetørret analyt i buffer med human serum albumin, natriumazid og stabilisator (13). Kalibreringsintervallet for folat- og cobalaminanalyserne er henholdsvis 7 og 28 dage. Desuden kræver begge analyser en to-punktskalibrering når lotnumre på primærreagenspakker ændres, når systemkomponenter udskiftes og når resultaterne af kvalitetskontrollen gentagne gange befinder sig uden for det angivne område. Yderligere kræver folatanalysen en masterkurve-kalibrering når der bruges et nyt lotnummer af Lite Reagens, Solid Phase og folatbindende protein, mens cobalaminanalysen kræver en masterkurve-kalibrering når der bruges et nyt lotnummer af Lite Reagens og Solid Phase. Her skal stregkoden for masterkurve-værdierne indlæses på systemet, hvilket gøres ved brug af masterkurvekortet tilhørende den enkelte analyses lotnummer for primærreagenset (1,2). To-punktskalibreringerne minimerer variationer fra instrument til instrument, og ved udførelse af en sådan kalibrering på systemet laves flere bestemmelser på kalibratorerne til folat- og cobalaminanalyserne med kendte høje og lave værdier. Systemet sammenligner de gennemsnitlige RLU er for hver af de anvendte kalibratorer med masterkurven, justerer disse i forhold til og fastsætter herudfra en systemspecifik formel til både folat- og cobalaminanalysen. Når patientprøver eller kontrolprøver analyseres, matcher systemet den justerede RLU-værdi med dens tilsvarende analytkoncentration ved hjælp af masterkurven (8). Der analyseres også eksterne kontroller, som KKA modtager 6 til 7 gange om året fra forskellige firmaer, blandt andet Labquality og Referenzinstitut für Bioanalytik. De anvendte køleskabe er kvalitetssikret ved enten temperaturkontrol eller alarmering ved udsving af temperaturer udover de fastsatte grænser. 2.5 Søgningsstrategi Jeg har søgt videnskabelig litteratur gennem internet databaserne MEDLINE (PubMed) og DEFFnet, samt via søgemaskinen Google Scholar. Desuden også gennem databaser på internetadresserne og Søgningen har fundet sted løbende gennem perioden juli til december Der er eksempelvis anvendt søgeord som, Folate, Vitamin B12, Cobalamin, Stability, Storage of.., Serum, Light influence on.., Effect of.., time, temperature, preanalytical, photodegradation m.fl. Søgeordene er anvendt på dansk og engelsk. Der er primært fokuseret på peer-review artikler. Side 13 af 33

14 3. Materialer 3.1 Utensilier Kanyler: Sommerfugl (Terumo), Lotnr.: skiftende og Venoject needle (Terumo). Lotnr.: skiftende. Udløber: Serumglas 9,0mL (Venosafe) med clot activator, Lotnr.: Udløber: og Lotnr.: Udløber: Serumglas 5,5mL (Venosafe) med clot activator, Lotnr.: Udløber: Stanniol Prøvestativer Propper Køleskab med glaslåge Afpipetteringsglas (Terumo), plastic tube 5mL, Lotnr.: Engangspipetter 3,5mL (Sarstedt), Lotnr.: 0900/ Blodprøvetagningsudstyr 3.2 Apparatur ADVIA Centauer XP (Siemens) Eppendorf centrifuge ved 2061g 3.3 Reagens Folat: FOL DTT/ Releasing Reagens. Lotnr.: B, Udløber: og Lotnr.: B, Udløber: Folat Primær Reagens. Lotnr.: , Udløber og Lotnr.: , Udløber: B12: VB12 DTT/ Releasing Reagens. Lotnr.: K, Udløber: og Lotnr.: B, Udløber: T3/T4/VB12 Ancillery. Lotnr.: 74763, Udløber: og Lotnr.: 74763, Udløber: VB12 Primær Reagens. Lotnr.: , Udløber: og Lotnr.: , Udløber: Syre Reagens: Lotnr.: 1F053, Udløber: og Lotnr.: 1G078, Udløber: Base Reagens: Lotnr.: 1F054, Udløber: og Lotnr.: 1G079, Udløber: Side 14 af 33

15 3.4 Kontroller Biorad Lyphochek, Immunoassay Plus Control, Lotnummer: Biorad Lyphochek, Immunoassay Plus Control, Lotnummer: Tabel 1. Biorad 1 og Biorad 2 kontrolværdier for folat. Gennemsnitskoncentration 1 SD CV % 2 SD Biorad 1 3,7377 nmol/l 0, ,7635 4,7118 Biorad 2 14, 3438 nmol/l 1,389 9,7 11, ,1214 Tabel 1: Værdierne gælder i perioden for lys- og mørkeforsøget. I bilag 4 ses også targetværdierne, værdierne for hver enkelt kontrolanalysering samt en grafisk afbildning af disse. Tabel 2. Biorad 1 og Biorad 2 kontrolværdier for cobalamin. Gennemsnitskoncentration 1 SD CV % 2 SD Biorad 1 309,9276 pmol/l 19,292 6,2 271, ,5119 Biorad 2 575,1407 pmol/l 29,325 5,1 516, ,7905 Tabel 2: Værdierne gælder i perioden for lys- og mørkeforsøget. I bilag 4 ses også targetværdierne, værdierne for hver enkelt kontrolanalysering samt en grafisk afbildning af disse. Tabel 3. Biorad 1 og Biorad 2 kontrolværdier for folat. Gennemsnitskoncentration 1 SD CV % 2 SD Biorad 1 4,8533 nmol/l 0,669 13,8 3,5145 6,1922 Biorad 2 18,15 nmol/l 1,613 8,9 14, ,3758 Tabel 3: Værdierne gælder i perioden for tidsforsøget. I bilag 5 ses også targetværdierne, værdierne for hver enkelt kontrolanalysering samt en grafisk afbildning af disse. Tabel 4. Biorad 1 og Biorad 2 kontrolværdier for cobalamin. Gennemsnitskoncentration 1 SD CV % 2 SD Biorad 1 327,6125 pmol/l 20,444 6,2 286, ,5001 Biorad 2 595,175 pmol/l 22,686 3,8 549, ,5478 Tabel 4: Værdierne gælder i perioden for tidsforsøget. I bilag 5 ses også targetværdierne, værdierne for hver enkelt kontrolanalysering samt en grafisk afbildning af disse. Side 15 af 33

16 3.5 Kalibratorer Folat: CalT, Lotnummer: CT99L og CT99H. CalT, Lotnummer: CT01L og CT01H. CalT, Lotnummer: CT05L og CT05H. I bilag 6 og 7 ses udprint fra kalibratorer med tilhørende primærreagens, kalibreringsdato, kalibratorværdi og CV %. Cobalamin: CalC, Lotnummer: CC20L og CC20H. I bilag 6 og 7 ses udprint fra kalibratorer med tilhørende primærreagens, kalibreringsdato, kalibratorværdi og CV %. 4. Resultater 4.1. Folat I bilag 8 og 9 ses alle beregninger for folat til lys- og mørkeforsøget og til tidsforsøget. I bilag 12 ses rådata. Tabel 5. Resultater ved lys- og mørkeforsøget. Analyseringstidspunkt U- værdi H 0 - hypotesen Signifikant forskel mellem middelværdierne 4 timer 2,10 Forkastes Ja 8 timer 1,46 Accepteres Nej 28 timer 0,02 Accepteres Nej 52 timer 0,97 Accepters Nej Tabel 5: n = 70 ved 4 timer. n = 69 ved 8 timer. n = 69 ved 28 timer. n = 67 ved 52 timer. Tabel 6. Afvigelser i middelværdierne mellem lysprøver og mørkeprøver. Analyseringstidspunkt Afvigelse i procent 4 timer 1,32 % 8 timer 1,63 % 28 timer 1,52 % 52 timer 0,65 % Side 16 af 33

17 Tabel 7. Resultater ved tidsforsøget. F-værdi H 0 -hypotesen Signifikant forskel mellem middelværdierne 18,75 Forkastes Ja Tabel 7: n = 38 ved 4, 8 og 28 timer. Tabel 8. Afvigelser i middelværdierne mellem 4 og 8 timer og mellem 4 og 28 timer. Analyseringstidspunkt Afvigelse i procent 4 timer og 8 timer 4,04 % 4 timer og 28 timer 8,66 % 4.2. Cobalamin I bilag 10 og 11 ses alle beregninger for cobalamin til lys- og mørkeforsøget og til tidsforsøget. I bilag 12 ses rådata. Tabel 9. Resultater ved lys- og mørkeforsøget. Analyseringstidspunkt U- værdi H 0 - hypotesen Signifikant forskel mellem middelværdierne 4 timer 5,49 Forkastes Ja 8 timer 6,48 Forkastes Ja 28 timer 6,50 Forkastes Ja 52 timer 5,67 Forkastes Ja Tabel 9: n = 71 ved 4 timer. n = 71 ved 8 timer. n = 72 ved 28 timer. n = 71 ved 52 timer. Tabel 10. Afvigelser i middelværdierne mellem lysprøver og mørkeprøver. Analyseringstidspunkt Afvigelse i procent 4 timer 3,67 % 8 timer 6,04 % 28 timer 5,99 % 48 timer 4,90 % Side 17 af 33

18 Tabel 11. Resultater ved tidsforsøget. F-værdi H 0 -hypotesen Signifikant forskel mellem middelværdierne 2,80 Accepteres Nej Tabel 11: n = 38 ved 4, 8 og 28 timer. Tabel 12. Afvigelser i middelværdierne mellem 4 og 8 timer og mellem 4 og 28 timer. Analyseringstidspunkt Afvigelse i procent 4 timer og 8 timer 1,65 % 4 timer og 28 timer 1,45 % 5. Diskussion Lys- og mørkeforsøget: I tabel 5 ses, at der ved måling af folatkoncentrationen i serum på prøver opbevaret i henholdsvis lys og mørke og analyseret inden 4 timer er signifikant forskel mellem middelværdierne. Ved analysering inden 8 timer samt efter 28 og 52 timer er der ikke er signifikant forskel mellem middelværdierne. I tabel 9 ses, at der ved måling af cobalaminkoncentrationen i serumprøver er signifikant forskel i middelværdierne mellem prøver opbevaret i lys og prøver opbevaret i mørke ved alle fire analyseringstidspunkter. Til vurdering af, hvorledes de signifikante forskelle der ses har klinisk relevans anvendes analyseusikkerheden for ADVIA Centaur, som er 15 %. Afvigelsen mellem middelværdierne for henholdsvis folat og cobalamin kan ses i tabel 6 og tabel 10. Disse er mindre end 15 %, derfor har ingen af de signifikante forskelle klinisk relevans. Hermed viser vores forsøg, at lyseksponering i op til 52 timer ikke påvirker folat- og cobalaminkoncentrationen i serumprøver i en sådan grad der har klinisk relevans, hvorfor det ikke er nødvendigt at lysbeskytte prøverne. Desuden viser vores resultater, at afvigelserne der ses ved cobalamin er større end de tilsvarende afvigelser der ses ved folat, hvilket kan danne grundlag for at cobalamin er mere lysfølsom end folat er. At vores data viser dette er interessant i den sammenhæng, at sådan som det står skrevet i Siemens analysemanualer og ligeledes i analysevejledningerne fra KKA, Side 18 af 33

19 burde folat være mere lysfølsom end cobalamin er. Nedenfor sammenligner og diskuterer jeg vores resultater i forhold til resultater fra udvalgte artikler indenfor emnet lysfølsomhed for folat og cobalamin, samtidig med en vurdering af de enkelte artiklers relevante anvendelse. I Siemens analysemanual til folat står der, at folat er lysfølsomt og det anbefales så vidt muligt at undgå at prøven udsættes for lys under behandling og opbevaring (1). Her refererer Siemens til artiklen af Mastropaolo & Wilson (14), der har undersøgt effekten af lys på folat i serum, og konkluderer at måling af folat i serum er acceptabel, hvis serumprøven har været udsat for lys i mindre end 8 timer. Artiklen er fra 1993 og med tanke på, at Siemens analysemanual til folat er revideret i 2011, undrer jeg mig over, hvorfor Siemens ikke her har anvendt andet og nyere litteratur til at underbygge deres anbefalinger. I Siemens analysemanual til cobalamin står der, at for stor lyspåvirkning kan forandre cobalaminværdierne (2) men hertil opgives ingen reference og denne analysemanual er også revideret i I Mastropaolo & Wilson (14) er også effekten af lys på cobalamin i serum undersøgt, og her konkluderes ligeledes at måling af cobalamin i serum er acceptabel, hvis serumprøven har været udsat for lys i mindre end 8 timer. Dette er altså ikke tilsvarende med, hvad vores forsøg viser, da der på trods af signifikante forskelle i middelværdierne mellem lys- og mørkeprøver ikke forekommer en klinisk relevant forskel, hvilket forsvarer at man analyserer på folat og cobalamin i serum, selv hvis de har været eksponeret for lys i mere end 8 timer. Det skal også nævnes at der i Mastropaolo & Wilson (14) blot er en stikprøve på 9 personer, hvilket jeg mener, er en lille stikprøve at basere et forsøg på. I vores lys- og mørkeforsøg er der til sammenligning en stikprøve på 72 personer. Desuden anvendes i Mastropaolo & Wilson (14) en klinisk relevant grænse på 7 %, hvilket medfører at der accepteres mindre forskelle end tilfældet i vores forsøg, hvor en forskel på op til 15 % accepteres. Men ser man på vores afvigelser i tabel 6 og tabel 10, og forestiller sig vi også havde anvendt en klinisk relevant grænse på 7 %, ville stadig ingen af de signifikante forskelle i vores forsøg have klinisk relevans. Mastropaolo & Wilson (14) anvender som referenceværdi en serumprøve opbevaret i en mørk skuffe ved stuetemperatur i 24 timer. De påpeger, at tidligere studier viser der ikke sker et tab af hverken folat- eller cobalaminkoncentrationen når serumprøver opbevares på denne måde. Der angives dog ingen reference hertil og vores forsøg viser også at dette netop heller ikke er tilfældet. På trods af dette, mener jeg det er kritisk, at når Siemens selv i deres analysemanualer til folat og cobalamin, skriver at serumprøver ikke må anvendes, Side 19 af 33

20 hvis de har været opbevaret ved stuetemperatur i mere end 8 timer, netop i forhold til folat lysfølsomhed refererer til en Mastropaolo & Wilson (14), der som referenceværdi netop anvender en serumprøve opbevaret i direkte modstrid med hvad Siemens selv anbefaler. Yderligere er også alle de undersøgte prøver opbevaret ved stuetemperatur i 24 timer, hvilket strider imod Siemens egne anbefalinger. En nyere artikel fra 2009, Clement & Kendall (15), sammenligner koncentrationsændringer for folat og cobalamin i serumprøver der er lysbeskyttet med serumprøver der ikke er lysbeskyttet. Prøverne analyseres 1, 2 og 7 dage efter blodprøvetagningen og opbevares på køl ved 2-8 C. Der anvendes blodprøver fra 25 personer, hvilket er næsten 3 gange så mange som i Mastropaolo & Wilson (14). Ved anvendelse af Anova variansanalyse finder de ingen statistisk signifikant forskel mellem lys- og mørkeprøver. Dette stemmer med resultaterne fra vores forsøg, idet vi ved analysering efter 28 og 52 timer, der er tilnærmelses vis lig med deres analysering efter 1 og 2 dage, ej heller finder statistisk signifikant forskel i folatkoncentrationen i serum mellem lys- og mørkeprøver. For cobalamin finder vi dog at der er statistisk signifikant forskel ved analysering efter 28 og 52 timer, men denne er mindre end analyseusikkerheden på 15 % og derfor ikke klinisk relevant. Clement & Kendall (15) konkluderer, forskelligt fra Mastropaolo & Wilson (14) og fra Siemens anbefalinger, at lysbeskyttelse af serumprøver ved analysering af folat og cobalamin ikke er nødvendig. Denne artikel mener jeg virker mere troværdig end artiklen af W. Mastropaolo et al (14), hvorfor dennes data og resultater forekommer mere brugbare til en relevant sammenligning med resultater fra vores eget forsøg, blandt andet på baggrund af, at de opbevarer serumprøverne på køl ligesom vi gør ved 28 og 52 timer, og som anbefales fra Siemens samt den større anvendte stikprøve. Komaromy-Hiller et al. (16) undersøger lysfølsomheden for cobalamin og folat i serumprøver når disse opbevares ved 2-8 C. Her finder man at cobalamin er meget lysfølsomt, og det derfor er nødvendigt at lysbeskytte prøven, hvis denne ikke analyseres inden 4 timer, da ændringen i cobalaminkoncentrationen herefter er større end deres CV på 10 %. Cobalaminkoncentrationen i lysbeskyttede og lyseksponerede prøver følger næsten ens mønstre med stigning og fald i koncentrationen, men med en gennemsnitlig 6 % højere koncentration i lyseksponerede prøver end i lysbeskyttede prøver. Sammenligner man dette med resultaterne fra vores forsøg er der en klar forskel idet, vi på trods af vi finder Side 20 af 33

21 statistisk signifikante forskelle i cobalaminkoncentrationen mellem lysbeskyttede og lyseksponerede prøver, ikke finder klinisk relevante forskelle og derfor ikke mener det er nødvendigt at lysbeskytte serumprøver til cobalaminanalysen. Yderligere finder Komaromy-Hiller et al. (16), at folat er mere stabil ved lyseksponering end cobalamin er. Her gælder det også at folatkoncentrationen i lysbeskyttede og lyseksponerede prøver følger næsten ens mønstre med stigning og fald i koncentrationen, blot ser der ikke en forskel i koncentrationen mellem de lysbeskyttede prøver og de lyseksponerede prøver, som det var tilfældet med cobalamin. Koncentrationsændringerne der ses ved folat i løbet af de første 48 timer er også væsentlig mindre end de som ses ved cobalamin og de adskiller sig næsten ikke fra den opridenlige målte koncentration. Komaromy-Hiller et al. (16) konkluderer, at serumprøver til folatanalyse ikke skal lysbeskyttes, hvis de analyseres indenfor 3 dage, idet koncentrationsforskellene for lysbeskyttede og lyseksponerede prøver indtil da var +/- 7 % og dermed mindre end deres CV på 10 %. Dette stemmer meget godt med, at data i vores forsøg viser, at folat ikke er lysfolsøm i en sådan grad der har klinisk relevans. Der er nogle punkter ved denne artikel, der gør at jeg forholder mig kritisk til den. Artiklen er ikke peer-reviewet, hvilket er tilfældet med samtlige af de andre diskuterede artikler og det mener jeg, kan danne grundlag for at denne artikel, samt dens forsøgsdesign, ikke er nær så troværdig som de andre artikler. Desuden har de kun en stikprøve på 2 personer, hvilket jeg mener, er et snævert grundlag at drage konklusioner ud fra. Tidsforsøget: I tabel 7 ses, at der ved måling af folatkoncentrationen i serum er signifikant forskel i middelværdierne mellem prøver opbevaret i stuetemperatur og analyseret inden 4 og 8 timer samt 28 timer efter blodprøvetagningen. I tabel 11 ses, at der ved måling af cobalaminkoncentrationen i serum ikke er signifikant forskel i middelværdierne mellem prøver opbevaret i stuetemperatur og analyseret inden 4 og 8 timer samt 28 timer efter blodprøvetagningen. Til vurdering af, hvorledes de signifikante forskelle der ses har klinisk relevans anvendes også her ADVIA Centaurs analyseusikkerhed på 15 %. Afvigelsen i middelværdierne mellem prøverne analyseret 4 og 8 timer efter blodprøvetagningen samt mellem prøverne analyseret 4 og 28 timer efter blodprøvetagningen for folat og cobalamin kan ses i tabel 8 Side 21 af 33

22 og tabel 12. Disse er mindre end 15 %, derfor har ingen af de signifikante forskelle der ses klinisk relevans. Hermed viser vores forsøg, at der op til 28 timer ikke sker nogen klinisk relevant ændring i folat- og cobalaminkoncentrationen i serumprøver ved opbevaring i stuetemperatur, hvilket betyder at analysering på serumprøver godt kan tillades efter de har været opbevaret i stuetemperatur i mere end 8 timer, hvilket Siemens ellers fraråder i deres analysemanual. Desuden viser vores resultater, at afvigelserne der ses ved folat er større end de tilsvarende afvigelser der ses ved cobalamin, hvilket kan danne grundlag for at cobalamin er mere stabil end folat ved opbevaring i stuetemperatur i 28 timer. Nedenfor sammenligner og diskuterer jeg vores resultater i forhold til resultater fra udvalgte artikler indenfor emnet holdbarhed for folat og cobalamin, samtidig med en vurdering af de enkelte artiklers relevante anvendelse. Hannisdal et al. (17) undersøger holdbarheden og stabiliteten af folat i serumprøver opbevaret ved stuetemperatur ved at måle på 5-methyl-tetrahydrofolat (5-methyl-THF), der også anvendes til folatanalysen i ADVIA Centaur. Serumprøverne fra 16 personer opbevares i mørke og analyseres mellem 1 og 192 timer efter blodprøvetagningen. De sammenlignes med serumprøver opbevaret ved -80 C umiddelbart efter blodprøvetagningen. Hannisdal et al. (17) finder, at koncentrationen af 5-methyl-THF er stabil i serum i op til 48 timer, men ved analysering herefter sker et fald i koncentrationen på 50 %. Hannisdal et al. (17) understøtter vores data, der viser at folat er stabil i op til 28 timer når opbevaret ved stuetemperatur, og viser yderligere at folat er stabil også helt op til 48 timer efter blodprøvetagningen og modsiger dermed Siemens anbefaling om at opbevare serumprøver ved 2-8 C, hvis folatanalysen ikke sker inden 8 timer efter blodprøvetagningen. Drammeh et al. (18) undersøger ændringer i folat- og cobalaminkoncentrationen i serumprøver når de opbevares ved 11 C, analyseres efter 2, 7, 10 og 14 dage og sammenligner ændringerne med serumprøver opbevaret ved -70 C umiddelbart efter blodprøvetagningen. Deres stikprøve er på 34 personer, hvilket er meget lig vores stikprøve på 38 personer. Ved anvendelse af t-test for parrede stikprøver og et signifikansniveau på 0,05 finder Drammeh et al. (18) først efter 7 dage en statistisk signifikant forskel i folatkoncentrationen på 5 %. Efter 14 dage finder de en forskel på 22,4 % og først her overskrides den klinisk relavante grænse på 11,7 %. Drammeh et al. (18) Side 22 af 33

23 finder ingen klinisk relevante forskelle i cobalaminkoncentrationen efter opbevaring ved 11 C i 14 dage, hvor grænsen for klinisk relevans er på 5,3 %. Dette stemmer godt overens med hvad vores data viser. Sammenligning af afvigelserne for folat med afvigelserne for cobalamin tyder på, at cobalamin er mere stabil i serum end folat er, når prøverne opbevares ved stuetemperatur i op til 28 timer. Man skal selvfølgelig bemærke, at de forhold som serumprøverne her opbevares under er mere ekstreme end opbevaringsforholdene i vores forsøg. Her anvendes også en lavere klinisk relevant grænse, især for cobalamin hvor den her er tre gange mindre end vores på 15 %. Trods dette mener jeg en sammenligning stadig kan være relevant. Jeg tror, at netop forskelle i opbevaringstemperaturer, 11 C som i Drammeh et al. (18), mod stuetemperatur i vores forsøg, kan være forklaringen på, at der her først efter 7 dage findes en statistisk signifikant forskel i folatkoncentrationen, hvorimod der i vores forsøg findes en statistisk signifikant forskel efter 28 timer. Samtidig er der her først efter 14 dage en klinisk relevant forskel i folatkoncentrationen, mens dette ikke er tilfældet i vores forsøg efter 28 timer. Sammenlignet med Hannisdal et al. (17), der finder at folat er stabil i serum i op til 48 timer, stemmer det godt overens med, at Drammeh et al. (18) finder en forskel i folatkoncentrationen på blot 0,8 % efter opbevaring i 2 dage ved 11 C. Dette tyder på, at opbevaringstemperaturen kan have en betydning for holdbarheden og stabilitenten af folat og cobalamin i serumprøver. Til opsummering viser data fra vores forsøg, at lyseksponering i op til 52 timer ikke påvirker folat- og cobalaminkoncentrationen i serumprøver, i en sådan grad der har klinisk relevans, hvilket betyder at serumprøverne ikke skal lysbeskyttes. Desuden viser data fra vores forsøg at opbevaring af serumprøver i stuetemperatur i op til 28 timer ikke påvirker folat- og cobalaminkoncentrationen i en sådan grad der har klinisk relevans. Lignende resultater afspejler sig i de artikler som er inddraget i diskussionen ovenfor. Hermed danner vores forsøg grundlag for at KKA ikke behøver ændre på den daglige rutines præanalytiske håndtering af prøverne til folat- og cobalaminanalyserne. Nedenfor diskuteres blandt andet ADVIA Centaurs analyseusikkerhed, kontrollernes CV %, anvendt statistik, vores metodedesign samt kvalitetssikring. ADVIA Centaurs analyseusikkerhed: Den tilladte analyseusikkerhed for ADVIA Centaur er 15 % og det skal her bemærkes at Klinisk Kemisk Afdeling ikke selv har bestemt denne værdi. Analyseusikkerheden betyder Side 23 af 33

24 at resultater for folat- og cobalaminanalyserne må optræde med en usikkerhed på +/- 15 % uden at denne afvigelse betegnes som klinisk relevant. Jeg tror, at en analyseusikkerhed på 15 % kan tillades for folat- og cobalaminanalyserne på baggrund af, hvordan klinikerne kan anvende analyserne i forbindelse med diagnostisering af patienten og senere til kontrollering af patientens behandling. Ved monitorering af behandlingen, er klinikeren måske i højere grad interesseret i, hvorvidt koncentration stiger eller falder over en periode, og i mindre grad interesseret i at vide hvad den eksakte koncentrationsværdi er. Lyngbye (3), angiver en gråzone for cobalamin-mangel ved målte værdier mellem pmol/l, og jeg tror det er netop i denne lave ende af referenceintervallet, at en analyseusikkerhed på 15 % bliver problematisk og har klinisk betydning for patienten. I Lyngbye (3) står der, at hvis cobalamin muligvis kun er tvivlsomt nedsat i området pmol/l, kan forhøjet methylmalonat og/eller homocystein i serum eller plasma være med til at støtte diagnosen cobalaminmangel. Desuden oplyses det, at nogle eksperter betragter cobalaminanalysen som obsolet og mener den bør erstattes af methylmalonat. Dog kan cobalamin stadig bruges som en nem og billig screeningstest (3). I Lyngbye (3) står der, at folat i serum kun giver et øjebliksbillede af patientens folatstatus og således kan bruges som screening for folatmangel, mens erytrocytfolater er en mere definitiv test for folatdepoterne og derfor en mere sikker markør for folatmangel end folater i serum er. Ovenstående kan måske være forklaringen, hvorfor KKA tillader en analyseusikkerhed på 15 % ved folat- og cobalaminanalyserne, men dette er blot egen refleksion og jeg har således ingen direkte kilder til, hvorfor der tillades en analyseusikkerhed på 15 %. Kontrollers CV % til vurdering af data: På baggrund af ADVIA Centaurs analyseusikkerhed til bestemmelse af, hvorvidt de statistisk signifikante forskelle har klinisk relevans, synes jeg det kan være interessant at se, om anvendelsen af CV % for kontrollerne Biorad 1 og Biorad 2 som den klinisk relevante grænse, vil medføre andre resultater end hvis analyseusikkerheden anvendes. I tabel 1 og tabel 3 ses CV % for Biorad 1 og Biorad 2 opnået ved kontrolanalysering på folat og gældende for henholdsvis lys- og mørkeforsøget og tidsforsøget. Afvigelsen i folatkoncentrationen mellem lys- og mørkeprøverne og mellem tidsprøverne ses i tabel 6 og i tabel 8. Da ingen af afvigelserne er større end CV % for kontrollerne, har de signifikante forskelle der ses ikke klinisk relevans. Side 24 af 33

25 I tabel 2 og tabel 4 ses CV % for Biorad 1 og Biorad 2 opnået ved kontrolanalysering på cobalamin og gældende for henholdsvis lys- og mørkeforsøget og tidsforsøget. Afvigelsen i cobalaminkoncentrationen mellem lys- og mørkeprøverne og mellem tidsprøverne ses i tabel 10 og i tabel 12. Da ingen af afvigelserne er større end CV % for kontrollerne, har de signifikante forskelle der ses ikke klinisk relevans. Med undtagelse af afvigelsen mellem lys- og mørkeprøver ved 8 timer og 28 timer, da begge er større end CV % for Biorad 2, hvilket vil betyde at cobalamin i serum ved disse tidspunkter er lysfølsom i en sådan grad at koncentrationsændringen har klinisk relevans. Det skal bemærkes at det er kontrollen i det høje måleområde der overskrides. Cobalamin har kun klinisk betydning for patienten ved forekomsten af meget lave værdier under referenceintervallet og desuden er kontrollen kun overskredet med mindre end 1 %. Derfor mener jeg ikke det har nogen kritisk betydning at afvigelsen ved 8 timer og 28 timer overskrider CV % for Biorad 2, og man vil derfor i dette tilfælde kunne se bort fra at der er klinisk relevans. Anvendt statistik og datas fordeling: Vi havde oprindeligt planlagt at der til databehandling i lys- og mørkeforsøget skulle anvendes t-test for parrede stikprøver, men en forudsætning herfor er at data er normalfordelte, hvilket som tidligere nævnt ikke er tilfældet i vores forsøg. Dette er også en forudsætning ved anvendelse af to-sidet variansanalyse som anvendes til databehanling i tidsforsøget, dog er variansanalysen ikke så følsom overfor dette krav som det er tilfældet med t-testen (11). Til lys- og mørkeforsøget anvendte vi i stedet Wilcoxon-test, hvor der ikke stilles samme krav om normalfordelte data. Problemet ved at anvende Wilcoxon-test i stedet for t-test for parrede stikprøver er, at t-testen har den højeste teststyrke, hvilket vil sige en mindre type-2 fejl, og dermed er den stærkeste test af disse to. Wilcoxon-testen øger risikoen for type-2 fejl, hvilket betyder man fejlagtigt accepterer H 0 -hypotesen og denne risiko afhænger også af det anvendte signifikansniveau. I sundhedsvæsnet er det oftest anvendte signifikansniveau 0,05 (5 %) og denne angiver sandsynligheden for fejlagtig at forkaste H 0 -hypotesen, i tilfælde hvor der reelt ikke er nogen forskel, den såkaldte type-1 fejl. Problemet ved at anvende et lavt signifikansniveau og sikre en lille type-1 fejl er istedet en øget risiko for type-2 fejl, som tilfældet ved Wilcoxon-testen (11). Ovenstående kan måske forklare, hvorfor der ved folatkoncentrationen mellem lys- og mørkeprøver ses en signfikant forskel mellem middelværdierne ved 4 Side 25 af 33

26 timer, mens der ikke er signifikant forskel mellem middelværdierne ved de andre tidspunkter, og der trods dette ses den anden mindste afvigelse mellem lys- og mørkeprøverne netop ved 4 timer. Jeg tror, det er muligt, at vi på grund af anvendelsen af Wilxocon-testen fejlagtigt har accepteret H 0 -hypotesen både ved 8, 28 og 52 timer, således der også ved disse tidspunker faktisk er signifikant forskel på middelværdierne mellem lysog mørkeprøverne. Tabel 6 viser også, at der ikke er stor forskel mellem afvigelserne ved de fire tidspunkter, hvorfor forklaringen om at der er sket en fejlagtig accept af H 0 - hypotesen ved 8, 28 og 52 timer virker sandsynlig. Selvom dette er tilfældet, og der måske reelt set er statistisk signifikant forskel mellem middelværdierne, skal man huske på at der stadig ikke er klinisk relevant forskel. En forudsætning for både Wilcoxon-testen og variansanalysen er at der foreligger lige store stikprøver (11), hvilket vi sikrede os var tilfældet i vores forsøg i forbindelse med databehandlingen. Vi antog inden forsøgets start, at vores data ville være normalfordelte, hvilket viste sig ikke at være tilfældet. Jeg tror, det afspejler sig i, at vi anvendte blodprøver fra patienter, der kom til blodprøvetagning i ambulatoriet, samt blodprøver fra frivilligt personale på KKA. Personalet fra KKA blev betraget som raske individer, hvorfor vi forventede at folat- og cobalaminværdierne for denne gruppe ville være normalfordelt. På den anden side, kan jeg forestille mig, at personalet på KKA i kraft af at være sundhedsfaglige personer, er mere opmærksomme på nødvendigheden af vitaminer gennem kosten. De tager måske vitamintilskud og får dermed en gennemsnitligt højere koncentration af vitaminer i forhold til den almindelige raske dansker, hvilket kan have medført at vores data ikke er normalfordelt. Patientene i ambulatoriet deltog i blodprøvetagningen uanset deres medicinske tilstand og da det ikke kun var patienter med folat- og cobalaminmangel der deltog, forventede vi at folat- og cobalaminværdierne for denne gruppe også ville være normaltfordelt. Man må huske på at patienterne netop ikke betragtes som raske individer, som det er tilfældet med personalet fra KKA, og der af den grund kan være en usikkerhed i hvordan denne gruppes folat- og cobalaminværdier fordeler sig over referenceintervallet. Der er måder, hvorpå vi kunne have sikret os normalfordelte data. En mulighed er, at analysere på kontroller og analysere på den samme kontrol flere gange i løbet af forsøgsperioden. En anden mulighed er, at analysere på blodprøver kun fra raske personer, hvilket burde give normalfordelte data. En trejde mulighed er, at anvende pools f.eks. i et lavt, middel og højt måleniveau og måle på disse flere gange i løbet af forsøgsperioden. Jeg tror dog, at denne sidste mulighed vil være svær at udføre i praksis, Side 26 af 33

27 på baggrund af de tidsintervaller fastlagt i vores forsøg. Var det tilfældet, skulle vi tage et tilstrækkeligt antal blodprøver, centrifugere og analysere disse for at kende hver enkelt prøves folat- og cobalaminkoncentration. Herefter udvælge hvilke prøver der skal anvendes i hver af de tre pools og fremstille pools til hvert enkelt måleområde. Jeg tror ikke, dette ville være muligt for os at nå og samtidig nå at analysere de tre pools inden 4 timer efter blodprøvetagningen, der jo netop betragtes som vores referenceværdi. Anvendte refereceneprøver: Hannisdal et al. (17) og Drammeh et al. (18) anvender serumprøver, der umiddelbart efter prøvetagningen er frosset ned ved -80 C og ved -70 C, som referenceprøver. Vores reference til tidsforsøget er serumprøverne opbevaret ved stuetemperatur og analyseret inden 4 timer efter blodprøvetagningen og det er muligt at der er sket en ændring i folat- og cobalaminkoncentrationen i løbet af dette tidsrum. Dette må forekomme i mindre grad i serumprøverne der er frosset ned umiddelbart efter blodprøvetagningen. Jeg mener stadig, vi kan betragte vores referenceprøve som det bedste bud på prøvens sande værdi netop på baggrund af, at der i Siemens analysemanualer til folat- og cobalaminanalyserne står, at prøver må opbevares ved stuetemperatur i op til 8 timer inden analysering (1), (2). Den eventuelle koncentrationsændring der forekommer de første 4 timer efter blodprøvetagningen må derfor forventes at være uden klinisk relevant betydning. Tidsintervaller og opbevaringforhold: Vi opbevarede serumprøverne til folat- og cobalaminanalyserne ved stuetemperatur og analyserede dem lige inden 4 og 8 timer efter blodprøvetagningen fordi disse tidspunkter overholder anbefalingerne fra Siemens. Desuden passer disse to tidsintervaller med den tid serumprøver til folat- og cobalaminanalyserne kan stå i stuetemperatur inden de analyseres i den daglige rutine på laboratoriet. Prøverne til tidsforsøget blev opbevaret i stuetemperatur og analyseret igen 28 timer efter blodprøvetagningen, for at teste om prøver opbevaret i stutemperatur i op til 24 timer, som kan forekomme for prøver taget i lægepraksis, viser statistisk signifikante koncentrationsændringer i forhold til referenceprøven. Ligeledes analysede vi prøverne til lys- og mørkeforsøget efter 28 timer, for at teste om prøver ekponeret for lys i op til 24 timer, som kan forekomme for prøver taget i lægepraksis, viser statistisk signifikante koncentrationsændringer i forhold til referenceprøven der blev lysbeskyttet gennem hele forsøget. Prøverne til lys- og mørke forsøget analyserede vi igen 52 timer efter blodprøvetagningen, fordi vi havde muligheden Side 27 af 33