Flowcytometri - Princip og praksis DHS kursus for yngre læger 2017
Flowcytometri - princip celle Antigenet = Markøren som cellen undersøges for, påvises ved hjælp af fluorescens fra det konjugerede Fluorokrom
Markør undersøgelse KM PB CerebroSpinalVæske Pleuravæske Ascites PSH Biopsimateriale
Markør undersøgelse +/neg Kvantitet Mønster
Markør undersøgelse Differentiering Diagnose? Myeloid/lymfoid? CR/MRD Proliferation Blaster/aplasi
Flowcytometer (BD Facs Canto II)
FLOWCYTOMETRETS OPBYGNING Dual laser flowcytometre kan excitere fluorokromer med 2 bølgelængder og opnå (mindst) 4-farve-fluorescens. Moderne flowcytometre har flere lasere og kan derved opnå mindst 10 parametre. (FACSCalibur)
FLOWCYTOMETRETS OPBYGNING (8 farver 10 parametre)
LYSSPREDNING FSC ~ størrelse Laserlys SSC ~ Granulering Spredningen af laserlyset giver oplysning om cellens størrelse og kompleksitet incl. granula i cytoplasmaet. (NB: Dette er ikke fluorescens)
LYSSPREDNING Ved hjælp af lysspredningen kan cellerne i prøven adskilles i hhv lymfocytter og monocytter = mononucleære celler (MNC) samt granulocytter. Hver prik = en event = en celle : FSC-H FSC Normal knoglemarv Series Mean % 95% conf. limits Neutrophil 57 39-79 Eosinophil 3 1-5 Lymphocyte 18 12-28 Monocyte 0,3 0-0,8 Erythrocyte 21 11-30 (Winthrobe tabel 2.6)
Lysspredning og fluorescens Med lysspredningen kan man vurdere forholdet mellem de forskellige populationer og indkredse (gate) en population Med fluorescensen kan man undersøge den gatede populations linie-tilhørsforhold og Differentieringsgrad Fluorescensintensitet korrelerer til epitop-tæthed (CD20, osv.) Med et panel af relevante monoklonale antistoffer kan man identificere de enkelte celler i prøven
Linie-Ag vs differentierings-ag Differentieringsantigener identificerer cellens modningsgrad Linie-antigener Linieantigener: identificerer f.eks myeloide, T- eller B- cellelinier
GRANULOCYTOID Myelo- Blast differentiering Promyel. Myeloc. Metamyel. PMN s. From: Loken & Wells: Imunophenotyping, Ch. 6, 2000
Flowcytometri - linieag Specifikke linieantigener: Myeloid: cympo T-celle: CD3 B-celle: CD19 + cycd79a, CD10, og/eller cycd22
Forward/side scatter vs SSC/CD45-gating Forward/side-scatter Side-scatter/CD45 Neutrofile MNC Lymphocytter R1 Blastvindue R5 R2 Monocytter Neutrofile R3 R4 Plasmaceller
Flowcytometrisk markørundersøgelse: Immunfænotypning af malign hæmatologisk sygdom Diagnostik af hæmatologiske sygdomme følger så vidt muligt: WHO-klassifikationen: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW (Eds) IARC Press, Washington 2008
Markør undersøgelse - analysen Mønster genkendelse! Referencebillede af det normale kende de normale andele af cellepopulationer og disses markørudtryk = fænotype. Identifikation af abnorme/maligne celler aberrant ekspression! Eks.: raske T-celler har altid CD2+, CD5+ og CD7+ udover CD3. Identifikation af få syge celler blandt mange normale. Identifikation af linie og differentiering. Undgå faldgruber!
Flowcytometri aberrans Aberrante (= afvigende) markører: Ekspression af antigener der ikke normalt findes på denne celletype. Eller manglende ekspression. Evt ekspression af antigener fra andre linier (ses hyppigst ved akutte leukæmier).
Præ-B ALL R2 R1 R5 R3 No gate G1=R1 R6 R4 Precursor _B- og T-neoplasierne - her vist som precursor B-ALL (CD19+,CD10+) - er blastære (ligger i blast-vinduet) og udtrykker blastære differentierings- Antigener (CD34, TdT).
Immunfænotypning af moden B- lymfoproliferativ sygdom CD-nr./ SmIg 5 22 23 25 FMC-7 103 11c 10 20 Diagnose CL/SLL (+) + -/+ + +/- -/+ - -/+ - + B-PLL ++ - + -/+ - + - - -/+ + Follikulært NHL ++ - +/- -/+ - + - - + + Waldenström IgM ++ - + - -/+ + - -/+ - + MCL ++ + +/- - + +/- - - + + HCL ++ - ++ - ++ + + ++ - + Splenic marg.zone NHL ++ - + - -/+ + - +/- - +
MALIGNE B-CELLE SYGDOMME VEJLEDENDE DIAGNOSTISK HIERAKI CD19-POSITIV: B-LYMFOCYT LETKÆDE RESTRIKTION: LYMFOM CD5-POSITIV CD5-NEGATIV CD23-POSITIV CD23-NEGATIV CD10-POSITIV CD10-NEGATIV SMÅ STORE MCL SMÅ STORE SMÅ CLL PLL? Richter? FL DLBCL MALTOM? SMZL? LPL? FORKORTELSER: CLL: KRONISK LYMFATISK LEUKÆMI; PLL: PRO-LYMFOCYT LEUKÆMI; MCL: MANTLE CELLE LYMFOM; FL: FOLLIKULÆRT LYMFOM: DLBCL: DIFFUST STORCELLET B-CELLE LYMFOM MALTOM: MUCOSA ASSOCIERET LYMFOM; SMZL: SPLENISK MARGINALZONE LYMFOM: LPL: LYMFOPLASMACYTÆRT LYMFOM (WALDENSTRÖM).
Lymfocyt analyse https://youtu.be/gu1yzvywph8 Rigshospitalet 2017
Flowcytometri med Euroflow/Infinicyte Adskillelse af clusters med 2 hhv 10 parametre
Euroflow Diagnose/Problemstilling PANEL 1 Tubes PANEL 2 Profil AIHA/Coombs pos. LST B-CLPD LST-Lim Akut Erythrocyt Leukæmi AML/MDS 1-7 AML Merge Akut Leukæmi ALOT Afhængig af fund. ALOT AML AML/MDS 1-4 AML Merge Amyloidose PCD + LST B-CLPD PCD-M + LST-Lim Anæmi AML/MDS 1-4 LST AML Merge APL (Akut promyelocyt Leukæmi) AML/MDS 1-4 AML Merge Aplastisk Anæmi (AA+SAA) AML/MDS 1-4 LST/PNH AML Merge Ascites SST Specifik for Diag SST B-ALL BCP-ALL B-ALL Merge Blastisk Plasmacytoid dendritcelle neoplasi AML/MDS 1-6 specielt glas 6 AML Merge Burkitt lymfom LST B-CLPD B-CLPD Merge CLL LST-Limited 3-5 B-CLPD LST Lim Merge CML AML/MDS 1-4 AML Merge CMML AML/MDS 1-4 AML Merge CSV ALL (B) BCP-ALL 1 Afh af evt Fænotype B-ALL CSV ALL (T) T-ALL 1 Afh af evt Fænotype T -ALL CSV NHL SST SST CSV Lymfoblast Lymfom BCP-ALL 1 Afh af evt Fænotype B-ALL Dendritceller/Plasmacytoide AML/MDS 1 + 6 AML Merge DLBCL (Difust storcellet B-celle Lymfom) B-CLPD B-CLPD Merge Duncan Syndrom B-CLPD B-CLPD Merge Ny Paneloversigt
Flowcytometri med Euroflow/Infinicyte Single files Cluster analyse Merge files
Eksempel på panel (AML/MDS Euroflow Tube PacB PacO FITC PE PerCPCy5.5 PECy7 APC APCH7 Aim 1 HLADR CD45 CD16 CD13 CD34 CD117 CD11b CD10 Diagnosis and classification, neutrophilic maturation, PNH 2 HLADR CD45 CD35 CD64 CD34 CD117 CD300e (IREM2) CD14 Diagnosis and classification, monocytic maturation, PNH 3 HLADR CD45 CD36 CD105 CD34 CD117 CD33 CD71 Diagnosis and classification, erythroid maturation 4 HLADR CD45 NuTdT CD56 CD34 CD117 CD7 CD19 Aberrant expression of lymphoid markers, abnormal B lymphoid maturation 5 HLADR CD45 CD15 NG2 CD34 CD117 CD22 CD38 Aberrant marker expression, stem cells 6 HLADR CD45 CD42a and CD61 CD203c CD34 CD117 CD123 CD4 Diagnosis and classification of AML Megakaryocytic, basophilic, and plasmacytoid dendritic cell lineages 7 HLADR CD45 CD41 CD25 CD34 CD117 CD42b CD9 Characterization of megakaryoblastic leukemia, and systemic mastocytosis
Euroflow B-celle analyse med reference-images (MRD). Flere markører i samme glas Mere sofistikeret matematisk analyse Sammenligning med referencepopulation PCA = Principal Component Analysis Kalkulerede data
SVARAFGIVELSE: Svar består af en beskrivende del og en konklusion. Størrelse af populationer opgives som andel i procent af alle kerneholdige celler, med mindre andet er oplyst. Der svares i princippet kun på det, der er spurgt om. Eller - hvis velbegrundet - med et forslag til differentialdiagnose(-r). Eksempel: Fænotype: Knoglemarv med ca. 47% CD45neg., CD38++, delvis CD56+ atypiske plasmaceller med kappa letkæderestriktion. Konklusion: Plasmacelledyskrasi, foreneligt med Myelomatose. Svarer og evt supervisor anfører initialer og dato + evt. tlf.svar.
Markør analyse - god fornøjelse!
Infinicyt AML/MDS
Infinicyt Lymfom
Infinicyt Plasmacelledyskrasi
Case 1: Normal KM LST Cases Case 2: Normal PB LST (samme som ovenfor) Case 3: 43622 CLL Case 4: Nomal KM AML1-4 Case 5: 38881 AML (M0) Case 6: 37298 Præ B-ALL