Kalibrering af glukose i Danmark. Sporbarhed og stabilitet

1. september 2015 Kalibrering af glukose i Danmark. Sporbarhed og stabilitet Indhold Indledning... 1 Resume... 1 Baggrund... 2 Om SRM... 3 Om kalibratorer til glukose og om deres sporbarhed... 4 Metode... 5 Resultater... 5 Diskussion og kommentar... 6 Konklusion... 6 Reference... 7 Appendiks... 8 Undersøgelse af årsagen til den systematiske afvigelse for glukose... 8 Indledning Denne rapport sendes til dig fordi du enten har svaret på det udsendte spørgeskema i foråret 2015, se appendix, eller fordi du deltager i det eksterne kvalitetssikringsprogram (EQA-program) for Almen Klinisk Biokemi, Serum B og C. Resume Metodegruppen Fotometri har gennem adskillige år vist en systematisk positiv forskel på ca. 3 % fra referenceværdien i det eksterne kvalitetssikringsprogram (EQA-program) for Almen Klinisk Biokemi, Serum B og C. Referenceværdierne i EQA-materialerne er overført fra NFKK Reference Serum X. For at finde årsagen til denne forskel blevder udsendt et spørgeskema til de danske deltagere i EQA-programmet som belyste hvilke kalibratorer, som blev benyttet på laboratorierne samt deres håndtering af samme. Referencematerialerne fra NIST bliver opsummeret. Årsagen til den systematiske, analyserede bias på glukose viser sig med stor sandsynlighed at ligge i værditillæggelsen af de kalibratorer, som opbevares ved 2-8 C, da der er et kendt tab i koncentrationen af glukose i frysetørret serum ved 2-8 C. For at et laboratorium skal kunne kalibrere til det korrekte niveau under hensyntagen til at det er kendt at glukosekoncentrationen falder i frysetørrede prøver i serum ved 2-8 C, må det anbefales at benytte kalibratorer hvis værdi, opbevaring og formulering tager højde for det forhold. DEKS tillader ingen gengivelse af dette materiale (rapport), eller udpluk af materialet, til kommercielle formål som er underlagt denne copyright. DEKS forbyder enhver anvendelse af vores navn eller enhver henvisning til DEKS, DEKS kvalitetssikringsprogram eller materialet i denne rapport, i annoncer, brochurer, eller i andre kommercielle publikationer. DEKS databearbejdning angiver nødvendigvis ikke det bedste af instrumenter, reagenser, eller materialer, som bliver anvendt af deltagende laboratorier. Brug af DEKS databearbejdning til at anbefale instrumenter, reagenser eller materialer kan være vildledende eller kan misopfattes. DEKS, Rigshospitalet Glostrup, Indgang 8, 1. sal, 2600 Glostrup Side 1 af 9 Tlf.:3863 4400 Fax: 4453 5369 deks@deks.dk www.deks.dk

Baggrund Glukose er en vigtig komponent at kunne analysere korrekt idet den fortsat benyttes til diagnose af diabetes for patienter hvor hæmoglobin A1c ikke kan anvendes fx for patienter med hæmoglobinopatier, fordi den benyttes på akutmodtagelser på sygehusene samt til monitorering af glukoseniveauet hos diabetespatienter. Indirekte benyttes laboratoriernes glukoseniveau også til at kvalitetssikre patientnært udstyr ved parallelanalyse med Almen Praksis. Et korrekt analyseniveau for glukose er derfor fortsat vigtigt også selv om hæmoglobin A1c er blevet den nye generelle markør for diagnose af diabetes. Gennem flere år har analyseresultaterne for glukose i det eksterne kvalitetssikringsprogram, EQA-program, Almen Klinisk Biokemi, Serum B og C, ligget højere end referenceværdien. Formålet med denne rapport er at prøve at finde frem til årsagen til den observerede forskel. For at finde frem til om den fx kan skyldes de anvendte kalibratorer, blev der sendt et spørgeskema ud til laboratorierne. Figur 1 giver et typisk billede af hvordan metodegruppen Fotometri gennem adskillige år har vist en systematisk positiv forskel på ca. 3 % fra referenceværdien, i figur 1 kaldet Assigned value, som er overført fra NFKK Reference Serum X. Den observerede systematiske forskel kan skyldes, at overførslen af referenceværdien til det udsendte eksterne kvalitetskontrolmateriale ikke er korrekt, eller at kalibreringen af nogle af analysemetoderne i metodegruppen Fotometri ikke er korrekt. Tre gange har referenceværdien været direkte bestemt med IDMS-referencemetoden og samtidig været indirekte bestemt med den overførte værdi fra NFKK Reference Serum X. De to metoder har stemt overens. Forskellen skyldes derfor ikke den tillagte referenceværdi til EQAmaterialerne. Kalibreringen af analysemetoderne i fotometrigruppen må derfor være årsag den observerede systematiske forskel. Kalibratorerne er sporbare til referencematerialer fra NIST, hvis værdier anses for at være korrekt i 2015. Værditillæggelsen af kalibratorerne fra NISTs referencemateriale kan være behæftet med fejl, opbevaringen af kalibratorerne kan være forkert ligesom håndteringen af dem kan være det. Figur 1 chemistry Figur 1. Den lodrette streg er referenceværdien. Det ses at hovedparten af alle laboratorier måler for højt i forhold til referenceværdien. Kalibrering af glukose 2015 Side 2 af 9

Om SRM NIST har 3 standardiserede referencematerialer, SRM, som indeholder certificerede værdier på glukose, SRM 909, SRM 917 og SRM 965. Ingen andre end NIST tilbyder referencematerialer med certificerede glukoseværdier. Tabel 1 SRM nr. Matrice Fysisk form Fremstillingsår Opbevaring 909 1 humant serum frysetørret 1980 2-8 C 909a 2 humant serum frysetørret 1993 2-8 C 909b 3 humant serum frysetørret 2010 2-8 C 909c humant serum frossent 2015 <-60 C 917 rent pulver 1970 stuetemperatur 917a rent pulver 1989 917b rent pulver 2006 917c rent pulver 2009 og 2013 20-25 C 965 4 humant serum frossent 1996-80 C 965a 4 humant serum frossent 2008-80 C 965b 5 humant serum frossent 2014-80 C Kommentar 1) NIST oplyser et tidsafhængigt tab: Fra 7,811 mmol/l til 7,74 mmol/l over 2 år. Det svarer til 0,45 % tab/år. Tabet over 4½ år er ligeledes anført: Fra 7,81 mmol/l til 7,56 mmol/l over 4½ år. Det svarer til 3,2 % tab over 4½ år og 0,71 % tab/år. 2) "The Glucose values degrade with time, and NIST will recertify every two years." 3) Ingen referenceværdi for glucose. 4) Tilsat gentamicinsulfat, et antibiotikum. 5) Fremstillingsmetode eller tilsætninger er ikke specificeret. Af NIST certifikater fremgår således at koncentrationen af glukose ikke er stabil i frysetørret serum ved 2-8 C. NIST anfører årlige tab på 0,45 % - 0,71 % tab/år i certifikaterne. I reference 1 anføres et årligt tab i værdien af glukosekoncentrationen på 1%. Derfor tilbyder NIST i dag kun frosne referencematerialer i en human serummatrice, jf. reference 1. Siemens beskriver (personlig information) hvorfor glukose i frysetørret serum nedbrydes selv ved køleskabstemperatur: Glukose som sådant er et lille og stabilt molekyle, men i en proteinmatrice sker der en gradvis glykosylering af de tilstedeværende proteiner, selv i frysetørret tilstand og selv om det opbevares afkølet. Derfor bliver der med tiden relativt mindre frit glukose både i det certificerede referencemateriale med serummatrice så vel som i alle kalibratorer når de er frysetørrede og serumbaserede. Kalibrering af glukose 2015 Side 3 af 9

Om kalibratorer til glukose og om deres sporbarhed Tabel 2 Producent Fysisk form Opbevaring, C Sporbarhed Kalibrator Multiconstituent Calibrator 1 flydende 2-8 SRM965 Abbott Beckman Coulter, DxC 5 Synchron Multicalibrator 2 flydende -15 - -20 SRM917a Beckman Coulter, AU System Calibrator frysetørret 2-8 SRM965b Roche Calibrator f.a.s. frysetørret 2-8 917 og 965 Siemens, Advia Chemistry Calibrator 3 og 4 frysetørret 2-8 SRM965a Siemens, Vista Chemistry 1 Calibrator 3 og 4 frossent -15 - -20 SRM917 Thermo Fischer scal 4 frysetørret 2-8 SRM965b Vitros, Johnson & Johnson Calibrator Kit 1 frysetørret -18 SRM917 Kommentar 1) Tilsat NaN 3 som konservering 2) Tilsat ethylenglycol 30-40 % som konservering og stabilisator 3) Tilsat konserveringsmiddel, methyl-isothiazolon 4) Tidsafhængig kalibratorværdi, som er anført at falde i værdi med 2,2 % per år for Siemens Chemistry Calibrator til Advia og med 1,7 % for Thermo Fischers scal. 5) Synchron Systems AQUA Cal 1, 2 & 3 fra Beckman Coulter er en kalibrator til UniCel DxC, men den bruges ikke i Danmark i 2015. Den er flydende, stabiliseret med benzosyre og opbevares ved 2-8 C. Frysetørrede kalibratorer opbevaret ved 2-8 C må ligesom NISTs frysetørrede referencemateriale i serum også have et fald i koncentrationen af glukose med tiden. Med tiden må man derfor formode at koncentrationen af følgende kalibratorer taber i værdi: - Beckman Coulters System Calibrator, - Roches Calirator f.a.s. Abbotts Multiconstituent Calibrator er flydende, men opbevares ved 2-8 C hvorfor det kan formodes at den kalibrator også vil have et tab i glukosekoncentrationen, hvis den opbevares over længere tid. Siemens og Thermo Fischer er i overensstemmelse med erfaringerne fra NIST og angiver derfor et tidsafhængigt tab i koncentrationen af glukose i frysetørret, humant serum ved 2 8 C. Når kalibratorerne taber i koncentration i forhold til den oplyste værdi, vil patientprøver og EQA-prøver blive analyseret højere end den faktiske glukosekoncentration. Frysetørrede interne kontrolprøver vil tabe i glukosekoncentration ligesom kalibratoren, hvorfor de ikke nødvendigvis kan afsløre et tab i kalibratorens koncentration af frit glukose. Sporbarheden er for visse producenter opgivet til uddaterede referencematerialer. Beckman Coulter og Thermo Fischer anfører sporbarhed til de nyeste referencematerialer. Roche anfører sporbarhed til en massespektrometrisk metode, men den kan også føres tilbage til NISTs referencematerialer, hvilket er oplyst af Roche i Danmark. Kalibrering af glukose 2015 Side 4 af 9

Metode Et spørgeskema (se appendix) blev sendt ud til de danske deltagere i EQA-programmet i Almen Klinisk Biokemi, Serum B og C, for at finde frem til hvilke kalibratorer der bliver anvendt i laboratorierne, og hvordan de aktuelt bliver håndteret. Endvidere benyttes resultatet af den stadige overførsel af referenceværdier til de udsendte EQAmaterialer i Serum B og C. De overførte referenceværdier stammer fra den værdi som glukosekoncentrationen i NFKK Reference Serum X er blevet bestemt til med referencemetoder. Resultater Resultatet af spørgeskemaet er følgende: 27 laboratorier har svaret på spørgeskemaet, som var sendt ud til alle 54 danske deltagere i EQAprogrammet i Almen Klinisk Biokemi, Serum B og C, hvilket er en svarprocent på 50 %. Alle laboratorier benytter den kalibrator som udstyrsproducenten tilbyder. Tabel 3 Producent Kalibratornavn Gennemsnitlig antal måneder for anvendelse af samme lot Frysning af alikvoter efter rekonstitution Antal af total Roche Calibrator f.a.s. 10,3 Ja, 12 af 12 Siemens, Vista Chem 1 Cal <0,5 Nej, 3 af 3 Siemens, Advia Chemistry <0,5 Ja, 1 af 1 Calibrator Beckman Coulter, DxC 800 Multicalibrator <0,5 Nej, 1af 1 Beckman Coulter, AU 680 Abbott Thermo Fischer Scientific Ortho Clinical Diagnostics System Calibrator 12 Ja, 1af 1 Multiconstituent <0,5 Nej, 4 af 4 Calibrator scal <0,5 Nej, 2 af 2 Vitros Chemistry Products Kalibratorkit 1 <0,5 7,5 Nej, 3 af 3 Resultatet af spørgeskemaundersøgelsen, se tabel 3, viste at der inden for 1½ år forekommer skifte af kalibratorernes lotnummer på de danske laboratorier for alle producenterne. Endvidere er der anført niveauskifte for to, Siemens Advia Chemistry Calibrator samt Thermo Fischer Scientifics scal, hvilket er i overensstemmelse med pakningsvedlæggene for de to kalibratorer, som indeholder et skema med tidsafhængig kalibratorværdi for glukose. Hvert halve år sænkes koncentrationen af glukose. Af de frysetørrede kalibratorer, som opbevares ved køleskabstemperatur, benyttes samme lotnummer i mere end ½ år, hvilket gælder følgende kalibratorer fra to producenter, Roches Calibrator f.a.s. og Beckman Coulters System Calbrator. Typisk vil der forløbe et par år eller mere fra en kalibrator bliver produceret til dens udløbsdato (personlig information fra producenter), selv om laboratorierne har den i kortere tid. Kalibrering af glukose 2015 Side 5 af 9

Ifølge spørgeskemaet vil brugere af Roches Calibrator f.a.s., af Siemens Advia Chemistry calibrator samt af Beckman Coulters System Calibrator opløse de frysetørrede kalibratorer, alikvotere dem og genfryse dem, selv om det ikke anbefales i pakningsvedlægget. Hvis alikvoterne af kalibratorerne opbevares ved -80 C, er tabet i koncentrationen af glukose derved blevet mindre end hvis kalibratorerne havde været opbevaret forskriftsmæssigt! Men som nævnt ovenfor kan kalibratorerne allerede have haft et tab i koncentrationen af glukose inden laboratorierne modtager dem og inden rekonstitution, alikvotering og frysning. Overordnet er resultatet af spørgeskemaet at der i Danmark benyttes 5 forskellige frysetørrede kalibratorer, en flydende og to frosne kalibratorer. Af de 5 forskellige frysetørrede kalibratorer anføres tidsafhængige koncentrationer af glukose for to af kalibratorerne, men ikke for to af dem, og den sidste opbevares frosset. Der anføres heller ikke en tidsafhængig koncentration af glukose for den flydende kalibrator opbevaret ved 2-8 C. Diskussion og kommentar Hvorfor har NIST konstateret et tab i glukosekoncentrationen i frysetørret humant serum opbevaret i køleskab? Glukose er som molekyle stabilt, jævnfør NISTs referencemateriale af ren glukose, SRM 917-serien. En hypotese er at tabet skyldes en glykosylering af de proteiner som er til stede i humant serum (personlig kommunikation fra Siemens). Samme glykosylering vil formodes at finde sted af proteinerne i bovint serum, som mange af kalibratorerne har som matrice. Konklusion Konklusionen af udviklingen af de forskellige referencematerialer fra NIST er at de frysetørrede kalibratorer med glukose i humant serum, 909, og 909a, ikke har en stabil glukosekoncentration. Derimod er glukosekoncentrationen i frossent serum stabil ved 80 C (Ref. 1), hvorfor NIST er gået over til kun at have referencemateriale for glukose i serum på den form og temperatur, jævnfør SRM 909c og SRM 965-serien. Tilbage står to producenter med frysetørrede kalibratorer, som skal opbevares ved køleskabstemperatur og er erklæret holdbare i mere end ½ år, Roches Calibrator f.a.s. og Beckman Coulters System Calbrator. Disse to producenter har altså valgt at vurdere tabet af glukose i frysetørret humant serum opbevaret ved køleskabstemperatur som negligerbart for laboratorieanvendelse. Dette er i modsætning til Siemens og Thermo Fischers tidsafhængige kalibreringsværdier for glukose samt af NISTs påvisning af tab af glukose i frysetørret serummatrice opbevaret ved ved 2-8 C. Om Abbotts kalibrator, Multiconstituent Calibrator, også har et tab i glukosekoncentration vides ikke, men det kan formodes at der også sker en glykosylering af proteiner i den og dermed et tab i koncentrationen af glukose, hvis den opbevares i mere end ½ år. Variationen i sporbarheden for kalibratorerne kan give anledning til variation, men ikke en systematisk afvigelse. Fire af producenterne anfører referencematerialet af ren glukose SRM 917 og 917a som sporbarhed for værdifastsættelsen. Ved værdifastlæggelsen af producenternes interne kalibratorer må der derfor kompenseres for den forkerte matrice i referencematerialet i forhold til patientprøver. Resten anfører sporbarhed til SRM 965-serien og ingen til SRM 909-serien. Kun Thermo Fischers scal og Beckman Coulters (AU) System Calibrator har sporbarhed til et eksisterende referencemateriale, SRM 965b. Kalibrering af glukose 2015 Side 6 af 9

Niveauet af kalibratorer med sporbarhed til udgåede referencematerialer kan ikke direkte efterprøves. Over en årrække er glukosekoncentrationen i gennemsnit blevet bestemt ca. 3% højere end den overførte referenceværdi fra NFKK reference Serum X til de udsendte EQA-materialer. Overordnet set tyder det på at der er tab af glukose i kæden af kalibratorer fra interne kalibratorer hos producenterne til de kalibratorer som laboratorierne benytter, især hos de producenter som dominerer i metodegruppen Fotometri i Almen Klinisk Biokemi, Serum B og C. For at et laboratorium skal kunne kalibrere til det korrekte niveau under hensyntagen til at det er kendt at glukosekoncentrationen falder i frysetørrede prøver i serum ved 2-8 C, må det anbefales at benytte kalibratorer hvis værdi, opbevaring og formulering tager højde for det forhold. Reference Reference 1. NIST s Role in Measurement Accuracy for Diagnosis and Monitoring of Diabetes. M.J. Welch. Diabetes Technology & Therapeutics, vol 4(1), 2002, pp 77-79. Med venlig hilsen Inger Plum DEKS Kalibrering af glukose 2015 Side 7 af 9

Appendiks Det udsendte spørgeskema med besvarelse senest den 30.4.2015. Undersøgelse af årsagen til den systematiske afvigelse for glukose Til Laboratorium nr. XXX Kære deltager Mange tak for din deltagelse i denne undersøgelse af glukose. Dette spørgeskema kan også hentes på www.deks.dk Baggrund Gennem flere års resultater i Almen Klinisk Biokemi, Serum B og C, har DEKS fået mistanke om at der kan være problemer med analyseniveauet for glukose. Metodegruppen Fotometri har gennem adskillige år vist en systematisk positiv forskel på ca. 3 % fra targetværdien, se figuren herunder. Targetværdien har både været en direkte bestemt værdi med IDMS-referencemetoden og været indirekte bestemt med den overførte targetværdi fra NFKK Reference Serum X. Den systematiske forskel på ca. 3 % kan stamme fra referencematerialet fra NIST, som jeres kalibratorer er sporbare til, eller fra jeres kalibratorer. For at prøve at finde frem til om den observerede forskel kan skyldes de anvendte kalibratorer, kan I hjælpe ved at svare på nedenstående spørgsmål. chemistry Figur. Den lodrette streg er værdien bestemt med en referencemetode. Det ses at hovedparten af alle laboratorier måler for højt. Det er denne forskel som fremgår af figuren, som DEKS hermed ønsker at finde en mulig forklaring på. Spørgsmål Herunder ønskes fakta om analysemetoden for glukose på din afdelings instrument(er)? Noter venligst følgende: Producent af apparaturet Model/type af apparaturet Producent af reagenser Kalibrering af glukose 2015 Side 8 af 9

Metode, hexokinase eller glukoseoxidase/peroxidase Hexokinase Glukoseoxidase/peroxidase Producenten af kalibratoren Kalibratorens navn Er kalibratoren Frysetørret Flydende Efter evt. rekonstitution af kalibratoren fryser du da en alikvot til senere anvendelse? ja Nej Somme tider Data om kalibrering. Nogle benytter en, andre benytter to og tre kalibratorer. Præcis dato for kalibreringen Lotnummer for kalibrator Kalibreringsværdien, mmol/l [dd.mm.åååå] Kalibr. 1 Kalibr. 2 Nyeste Før den 13.11.2014 Før den 28.5.2014 Før den 13.11.2013 Bemærkning: Spørgsmål kan rettes til Inger Plum, inger.plum@deks.dk eller tlf.: 38634402 Returner skemaet senest den 30.4.2015 på mail eller på papirform til Inger Plum DEKS Glostrup Hospital, Indgang 8, 1-ste sal Nordre Ringvej 29-57 2600 Glostrup Kalibrering af glukose 2015 Side 9 af 9