Sammenligning af PrepStain, CytoSpin og konventionelle metoder på nongynækologiske prøver

Sammenligning af PrepStain, CytoSpin og konventionelle metoder på nongynækologiske prøver Professionsbachelorprojekt af Bonnie Svendsen, 26.07.1979 Udført februar-juni 2010 Afleveret d. 11.06.2010 Hovedvejleder: Susanne Wahl Bioanalytikeruddannelsen København Bivejledere: Camilla Qvist og Heidi Johansen Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital Tegn uden mellemrum: 72.729

Forord: I forbindelse med udførelsen af mit bachelorprojekt gerne have lov til at takke Patologiafdelingen på Bispebjerg Hospital for at tilbyde projektet. Tak til overlæge Dr. Med Henrik Winther Nielsen og overlæge, Ph.D Klaus Richter Larsen for at støtte op om projektet. Jeg vil også gerne takke studerende Thomasine Ignatiussen for godt samarbejde under den praktiske del af projektet og sparring i forbindelse med den efterfølgende projektskrivning. En stor tak til mine vejledere Susanne Wahl, Camilla Qvist og Heidi Johansen for fremragende vejledning og en fantastisk støtte under hele projektet. Bonnie Svendsen

Indholdsfortegnelse Abstract... 3 Indledning... 5 Problembaggrund... 5 Formål... 6 Problemformulering... 6 Problemuddybning... 6 Teori... 8 Fiksering... 8 Konventionelle metoder... 9 PrepStain... 10 CytoSpin... 10 Papanicolaoufavning... 10 Giemsafarvningen... 11 May-Grünwald Giemsa farvning... 12 Uriner/blæreskyllevand... 12 Finnålsaspirater fra lungerne... 13 Bronkieskyllevæsker... 13 Børstebiopsier... 14 Cancerdiagnosik for lungecytologi... 14 Pleuravæsker... 14 Materialer og metoder... 15 Forsøgsmaterialer... 15 Prøvemateriale... 15 Maskiner... 15 Metode... 15 Prøveindsamling... 15 Konventionel præparering... 16 PrepStain... 17 CytoSpin... 17 Resultatvurdering... 19 Morfologi... 19 Lejring... 19 Baggrund... 20 Farvning... 20 Resultater... 20 Diskussion... 27 Uriner og blæreskyllevæsker... 27 Morfologi... 27 Lejring... 28 Baggrund... 30 Farvning... 31 Diagnoser for uriner og blæreskyllevæsker... 31 Delkonklusion på uriner og blæreskyllevæsker... 32 Lungecytologi og serøse væsker... 33 Morfologi... 33 Lejring... 35 Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 1

Baggrund... 37 Farvning... 38 Diagnoser på lungecytologi... 40 Delkonklusion på lungecytologiske... 44 Diagnoser på serøse væsker... 44 Del konklusion på serøse væsker... 45 Forsøget som helhed... 45 Konklusion... 47 Perspektivering... 47 Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 2

Abstract Liquid-based cytology (LBC) has been recommended for cervical cytology for years and is starting to find it s way into non-gynaecologic cytology as well. The aim of this study was to determine if the diagnostic quality could be improved if Patologiafdelingen, BBH started preparing it s non-gynaecologic samples on PrepStain Slide Processor from TriPath Imaging, Inc. or with CytoSpin in cytofunnels. In a split sample test conventional smears of FNA, bronchial secretions and serous fluids as well as conventional cytospin slides for urines were compared with the slides produced on the PrepStain Slide Processor and using CytoSpin in cytofulnnels. I found that the diagnostic quality of PrepStain was equal to conventional methods and CytoSpin was slightly inferior. I believe that with the right training and of staff PrepStain and perhaps CytoSpin in cytofunnels could improve the diagnostic quality of non-gynaecologic samples. Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 3

Begrebsdefinitioner og forkortelser CRB/CRR: CytoRich Blue/CytoRich Red CS: CytoSpin Diagnostisk kvalitet: Begrebet dækker over en metodes evne til at stille samme diagnose som den der stillet på det konvntionelle præparat da denne antages at være den korrekte. FNA: Finnåla aspriat Konventionelle udstrygnings teknikker/konventionel metode: Her menes den metode der pt. bruges på afdelingen. Det drejer sig om: Blodudstrygningsteknik, som bruges til finnålsaspirater. Drejeteknik, som bruges til bronkieskyl og serøsevæsker. Cytocentrifugering ved brug af Megafunnels, som benyttes til uriner. MS: Malignitets Suspekte MGG: May Grünwald-Giemsa PAP: PapanicolaouPS: PrepStain RG: Romanowski-Giemsa Serøse væsker: Dækker over pleura-, acites- og perikardievæsker. I denne opgave vil kun pleuravæsker indgå. Split sample: Prøven deles og bruges til forskellige metoder. VBT: Væskebaseret tyndtlagsteknik. Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 4

Indledning Problembaggrund På Patologiafdelingen på Bispebjerg Hospital(BBH) modtages en række forskellige nongynækologiske cytologiske prøver. Disse er ofte led i en cancerudredning og derfor underlagt krav om svartider. Med lukningen af Patologiafdelingen afdeling på Gentofte Hospital, som har betydet at deres prøver nu sendes til BBH, vil antallet af prøver stige markant i fremtiden A. Pt. modtages en del af prøverne udstrøget, mens afdelingen selv laver udstrygninger på andre. Ofte ligger materialet i et tykt lag og indeholder så meget blod og slim, at det kan vanskeliggøre screeningen og diagnosticeringen B. Jeg synes det kunne være interessant, at undersøge andre metoder til præparering af cytologisk materiale for at se om disse problemer kan løses og om Patologiafdelingen med fordel kan overveje at ændre den nuværende procedure. Væskebaseret tyndtlagsteknik(vbt) har i flere år været brugt på cervix cytologi og opnået stor succes. Antallet af uegnede prøver er faldet drastisk, fordi cellerne ligger i et mere jævnt lag og blod og slim er fjernet fra præparatet. Tiden brugt på screening er også reduceret, fordi et mindre område skal screenes 1. Man er også begyndt at bruge teknikken til nongynækologiske prøver og har fundet, at den giver et velbevaret cellebillede med en renere baggrund og det kunne derfor være interessant at undersøge om den kunne bruges her på afdelingen til uriner, lungecytologi og serøse væsker 2,3. Jeg har valgt at se nærmere på to forskellige tyndlagsteknikker og sammenligne dem med de konventionelle metoder. PrepStain(PS) fra Tripath Imaging Inc. er et delvist automatiseret system til præparering af cytologisk materiale der skal sikre et tyndt lag celler, der er repræsentativt for hele prøven, fordelt på et lille område 4. Da denne metode kræver at man anskaffer udstyr til mange tusinde kroner har jeg også valgt at undersøge et billigere alternativ, nemlig CytoSpin(CS) med cytofunnels hvor cellerne vha. centrifugalkraften slynges op på et objektglas i et tyndt lag og på et lille område 5. CS er ikke kun billigere, afdelingen har allerede alt udstyret til denne metode. A Ifølge Ulla Thomsen, ledende bioanalytiker, Patologiafdelingen Bispebjerg Hospital. B Ifølge Camilla Qvist, cytobioanalytiker, Patologiafdelingen Bispebjerg Hospital. Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 5

Jeg valgte at medtage uriner i forsøget dels for at få en større mængde prøver og dels fordi det vil være en fordel at behandle alle cytologiske prøver som afdelingen modtager, på samme måde. Uriner er ifølge producenten også velegnede til præparering på PS og undersøgelser har vist at den ligesom CS giver et jævnt lag af celler hvor morfologien er velbevaret og en ren baggrund 4,6. Formål Formålet med mit forsøg er, at undersøge om man kan opnå den samme eller en bedre diagnostiske kvalitet ved at indføre VBT på lungecytologisk materiale samt uriner. Det vil jeg gøre ved at sammenligne to forskellige VBT med de konventionelle metoder der benyttes i dag. Jeg vil vurdere fordele og ulemper ved alle tre metoder og give et bud på hvilken af dem der giver den bedste diagnostiske kvalitet. Problemformulering Hvilken betydning vil det have for den diagnostiske kvalitet, hvis Patologiafdelingen på Bispebjerg Hospital, indfører en væskebaseret tyndtlagsteknik til præparering at nongynækologisk cytologisk materiale frem for de konventionelle metoder? Problemuddybning Jeg vil for hver prøve fremstille to præparater på PS. Et af dem vil jeg lade maskinenfave Papanicolaou(PAP), mens det andet Giemsafraves i hånden. Jeg vil herefter lave et CS præparat på restmaterialet fra PS og PAPfarve dette på afdelingens rutine farvemaskine. Herefter vil jeg mikroskopere alle præparater og score dem mht. morfologi, lejring baggrund og farvning og i samarbejde med afdelingens cytobioanalytiker stille diagnoser. Jeg vil til slut vurdere om VBT lever op til de konventionelle metoder. Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 6

Metodevalg og afgrænsning Jeg har valgt at sammenligne de konventionelle udstrygningsteknikker, der i dag benyttes på Patologiafdelingen på BBH, med to forskellige VBT, nemlig PrepStain fra TriPath Imaging Inc., Burlington, NC, som stilles til rådighed af Axlab, Vedbæk, DK samt CytoSpin, som er et noget billigere alternativ, der kun kræver en cytocentrifuge samt cytofunnels 5. At valget er faldet på PS skyldes til dels det samarbejde der allerede eksisterer mellem Patologiafdelingen på BBH og Axlab og at der i litteraturen er findes flere artikler der behandler brugen af denne i forbindelse med nongynækologisk materiale 7,8. Også CS teknikken er afprøvet og sammenlignet med konventionelle metoder og andre VBT. Her viser resultaterne at CS kan måle sig med de automatiserede VBT, som til gængæld er op til 150% dyrere end CS. Da afdelingen også allerede har både en cytocentrifuge og cytofunnels var det oplagt at afprøve metoden 5,6. Flere studier har vist at VBT er fuldt på højde med og i flere tilfælde bedre end de konventionelle metoder i forbindelse med diagnosticeringen af cancer 9,10. Jeg har valgt at lave et spilt-sample forsøg, hvor prøven ved modtagelsen deles og bruges til hhv. konventionel metode og VBT. Det giver den fordel, at resultaterne kan sammenlignes direkte, da det antages at cellesammensætningen er ens i begge dele af prøven. Idet de konventioneller metode pt. er den der skal svares ud fra, er det vigtigt at der er prøvemateriale nok til at få et diagnostisk anvendeligt svar med denne. Ved små volumener eller i tvivlstilfælde, vælger jeg at ekskludrer prøven fra forsøget. Da det vil være en fordel at man behandler alle cytologiske prøver på afdelingen på samme måde og det også er muligt at præparere uriner på PS, har jeg valgt også at medtage disse. Det betyder også, at jeg vil kunne indsamle en større mængde prøver. Uriner præpareres i dag ved cytocentrifugering i megafunnels. Jeg vælger at lave to præparater for hver prøve på PS. Et som maskinen PAPfarver og et som er ufarvet. Det gør jeg fordi maskinen er i stand til at PAPfarve og jeg gerne vil sammenligne denne PAPfarvning med afdelingens egen. Som et pilotforsøg farvede jeg en del ufarvede præparater med den MGG farveforskrift der findes på afdelingen. Resultaterne heraf var af så ringe karakter at det blev besluttet at kassere dem. Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 7

Jeg søgte i litteraturen efter andre MGG farvninger til farvning af VBT materiale og fandt en artikel hvori man i stedet benytter Giemsafarvning 11. Det ufarvede præparat for lungecytologiske prøver og serøsevæsker bliver Giemsa farvet efter en af de foreslåede forskrifter i Horobin et al., se bilag 1. Man laver ikke Giemsafarvninger på uriner så de ufarvede præparater fra urinprøverne bliver kasseret. CS præparaterne er lavet på restmaterialet fra PS frem for at udtage materiale inden prøven præpareres på PS. Det har jeg valgt at gøre fordi cellerne under PS proceduren opkoncentreres og da jeg gerne vil sammenligne PS og CS mener jeg, at det er hensigtsmæssigt at de væsker der bruges til at fremstille de to præparater, er af samme koncentration. Da der ikke er ret meget prøvemateriale tilbage når prøven er blevet præpareret på PS har det kun været muligt at fremstille èt præparat til hver prøve vha. CS metoden. Her har jeg valgt at differentiere farvningen, så uriner er blevet farvet PAP på afdelingens rutine farvemaskine, mens lungecytologi og serøse væsker er farvet Giemsa. Jeg vil sammenligne teknikkerne med hensyn til morfologi, lejring af celler, baggrund og farvning ligesom jeg vil fastslå om man ved en eller begge VBT er i stand til at opnå samme diagnose som ved de konventionelle metoder. Teori Jeg vil her gennemgå teorien bag de tre metoder jeg sammenligner i mit forsøg. Jeg vil ligeledes gennemgå de fikseringer og farvninger jeg har brugt, samt kort beskrive de prøvetyper der er indsamlet og brugt i forsøget, samt det forventede cellebillede i disse. Fiksering Uriner fikseres umiddelbart efter de er opsamlet i 70% ethanol. Ethanol er et koagulerende fiksativ der åbner proteinernes tertiære struktur og medvirker til dannelsen af intermolekylære bindinger proteinerne imellem. Idet det er 70% og ikke 100% ethanol vil koaguleringen være mindre udtalt og cellerne vil skrumpe mindre. Efter udstrygning må cellerne ikke udtørre og fikseres derfor med et Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 8

spray fiksativ der indeholder et voksligende stof opløst i alkohol. Dette danner en beskyttende hinde og forhindre udtørring 12 s. 30-31 Konventionelt fremstillede udstrygninger af lungecytologi og serøse væsker fikseres ved lufttørring og efterfølgende med 100% methanol. Ved lufttørringen fordamper vandet og cellens deformeres. Cellen ender med at kollapse og cytoplasmaens tæthed øges. Methanol er et koagulerende fikseringsmiddel som åbner proteinernes tertiære struktur og medvirker til at der dannes intermolekylære bindinger mellem proteinerne.. Koaguleringen er mindre udtalt end 100% ethanol og 100% isopropanol og skrumpningen af cellerne derfor også mindre 12 s. 15-21 og 30-31. I forbindelse med præparering på PS skal uriner fikseres i et kommercielt fiksativ, CytoRich Blue(CRB) fra Tripath Imaging. Den præcise sammensætning kendes ikke, men de aktive ingredienser er bl.a. isopropylalkohol, methanol og polyethylenglycol. Fiksativet bevarer erytrocytter., se bilag 2. Polyethylen glycol (PEG) er en vokslignende substans der er lægger sig som et beskyttende lag omkring cellerne og er med til at bevare det osmotiske tryk i cellerne og på den måde minimere dehydrering af cellerne som får dem til at skrumpe 13. Lungecytologisk materiale og serøse væsker der skal præpareres på PS fikseres i et andet kommercielt fiksativ, CytoRich Red(CRR) også fra TriPath Imaging. Den præcise sammensætning kendes heller ikke her, men er næsten den samme som CRB Dog indeholder CRR også et reagens der lyserer erytrocytter. CRR indeholder også formaldehyd der fikserer de globulinprotiener der frigøres inden alkoholerne kommer til. Dette forhindrer at der dannes store proteinudfældninger. Andre celler har membraner der er mere permable for alkohol end formaldehyd og disse vil blive alkoholfikseret, se bilag 2. Konventionelle metoder Hvilken konventionel metode der benyttes på afdelingen i dag er afgjort af prøvetypen. Finnålsaspirater(FNA) og børste biopsier modtages udstrøget på objektglas fra afdelingen hvor prøvetagningen er foregået, mens Patologiafdelingen selv præparerer bronkieskyl, serøse væsker og uriner. Urinerne centrifugeres ved modtagelsen hvorefter pellet opslemmes i en smule alkohol og cytocentrifugeres i megafunnels hvorved cellerne slynges op på et felt med et areal på 294mm 2 5. Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 9

Bronkieskyl og serøse væsker centrifugeres ned og cellepellet udstryges med en vatpind på objektglas vha. drejeteknik. PrepStain PS er en delvis automatiseret præpareringsmaskine der er designet til fremstiller et tyndt lag af celler i en cirkel på 13 mm 2 på et objektglas. Maskinen kan fremstille 4 præparater til hver prøve og kan indstilles til at PAP farve et eller flere af disse. Cellebilledet skulle ifølge fabrikanten være det samme på alle 4 præparater og repræsentativt for prøvens sammensætning idet prøven blandes grundigt før hvert præparat fremstilles. Ufarvede præparater kan benyttes til immuncytologiske farvninger 4. Der bruges objektglas coatet med poly-l-lysin på maskinen som sikrer at cellerne adherer til glasset under sedimentationen C. CytoSpin I dette forsøg laves CS delen på restmaterialet fra PS. Prøverne centrifugeres i cytocentrifugen i 5 min. ved 1500 rpm. Når prøverne centrifugeres vil prøvematerialet vha. centrifugalkraften blive slynget gennem et lille hul i kammeret op på objektglasset i en cirkel målende 6 mm i diameter 5. Hvis prøven er meget cellerig kan det resulterer i at cellerne kommer til at ligge i et tykt lag, det er derfor vigtigt at vurdere suspensionen inden den overføres til funnels og centrifugeres. Papanicolaoufavning PAP er en oversigtsfarving til cytologisk materiale som fx uriner. Det er en konkurrencefarvning mellem tre anionfarvestoffer i alkoholisk solvent med en forudgående kernefarvning med hæmatoxylin. C Iflg. sælger fra Tripath Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 10

Hæmatoxylin er et metalkompleks farvestof som ved oxidation bliver til Hæmatein. Hæmatein farver DNA i kernerne ved ionbytning og upolære bindinger, hvorved der sker en interkaleirng af farvestoffet i DNA s dobbelthelix. Farvningen efterfølges af blåning under rindende vand. Her hæves ph og der sker en fraspaltning af H + fra Hæmateinen. Den dannede metal kompleksion er uopløselig i vand og modstår derfor den følgende dehydrering i alkohol som gør cellerne klar til cytoplasmafarvningen 14 s. 34-35 Cytoplasma farves af de tre anion farvestoffer, Organge G, Eosin Y og Light Green. Orange G er det mindste af de tre og vil trænge ind i de tætteste proteinstrukturer. Det lidt større Eosin Y vil trænge ind i de lidt løsere proteinstrukturer, mens Light Green farver de løseste. Alle tre farvestoffer bindes vha. ionbytning. Da solventet er alkohol vil der ikke forekomme hydrofobstabilisering. Over tid vil de større farvestoffer kunne fortrænge de mindre da de en stærkere bindingsevne. For at forhindre dette bruger man phosphorwolframsyre(pws) i farveopløsningen. PWS er en stor polyanion der virker som en slags spærring for de store farvestofmolekyler 14 s. 38-39. Resultatet er at cytoplasma i keratiniserede celler bliver orange, mens det i superficielle celler antager en mere rødlig/pink farve. Endelig bliver cytoplasma i de basale og intermediere celler farvet blåt 15 s.113-114, 179-180 og 231-233. En komplet farve forskrift fra PS foreligger ikke, men afdelingens egen findes i bilag 3. Det bemærkes at afdelingen bruger EA-65 til cytoplasmafarvningen. Denne indeholder ikke Orange G. Giemsafarvningen Giemsa er en oversigtsfarvning til cytologisk materiale især blod og lungecytologi. Den består af to farvestoffer i opløsning. Azur II og Eosin Y som er hhv. kat- og anion farvestof vil farve alle celle komponenter og man kan nemt differentiere de hvide blodlegmer 14 s. 54-55. Under farve processen vil Azur II, som er positivt ladet, binde sig til negativt ladede strukturer i cellerne som fx DNA i cellekernen og RNA i cellekerne og cytoplasma ved at danne upolære bindinger og hydrofob stabilisering til fosfatgrupperne i disse strukturer. Det negativt ladede Eosin Y binder sig til positivt ladede strukturer som fx histonerne i cellens kerne og erytrocytter ved ionbytning og hydrofob stabilisering 15 s. 231-233 og 296-298. Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 11

Efter at være blevet farvet føres præparaterne hurtigt gennem eddikesyre for at differentiere Azur II så en passende kontrast til eosinfarvningen 14. Præparaterne dehydreres i tre hold isopropanol og ikke ethanol da Azur II som nævnt er et kation farvestof og ekstraheres i ethanol. Efter et kort dyp i xylen monteres dækglas med Pertex, mens præparaterne stadig er våde 14 s. 19. Et specielt træk ved Giemsa farvningen på cytologisk materiale er den så kandte Romanowsky- Giemsa(RG) effekt som fremkommer når Azur II binder sig til en polyanion og Eosin Y binder sig til en polykation lige ved siden af. Dette resulterer i hydrofob stabilisering mellem de to farvestoffer og de vil antage en purpurrød farve. Dette fænomen ses i DNA og i neutrofile granula 14 s. 54-55conn 303-310 En komplet farveforskrift for Giemsafarvningen brugt i dette forsøg ses på bilag 1. May-Grünwald Giemsa farvning Bruges som oversigtsfarvning af cytologisk materiale bl.a. lunge- og pleuracytologi. Cellerne er udstrøget på glassene og fikseret idet de er lufttørret efter udstrygningen. Cellerne fikseres yderligere i methanol før de farves i en May-Grünwald opløsning bestående af Methylenblåt og Eosin Y. Eosin Y vil som anionfarvestof binde sig til de positivt ladede grupper i cellerne som fx poteiner, eosinofile granula og erytrocytter ved ionbytning og hydrofob stabilisering, mens kationfavestoffet Methylenblåt binder sig til de negativt ladede grupper som fx DNA ved ionbytning og upolære bindinger 14 s. 54-55 og 15 s. 303-310 Præparaterne farves nu med Giemsa. De samme principper som forklaret i Giemsafarvningen herover gør sig gældende for denne del af May-Grünwald Giemsa farvningen. Romanowsky- Giemsa effekten opnås også i denne farveopløsning. Præparaterne skylles i tre hold buffer for at fjerne overskydende farve, hvor efter de lufttørrer og der monteres dækglas. En komplet farveforskrift for denne farvning ses på bilag 4. Uriner/blæreskyllevand Der skelnes på afdelingen mellem uriner og blæreskyllevæsker. Uriner dækker over prøver som er opsamlet når patienten tisser på normal vis hvorefter der tilsættes fiksativ. Blæreskyllevæsker er Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 12

fysiologisk saltvand der bruges til at skylle/spule blæren efter den er tømt. Skyllevandet udtømmes med det samme og tilsættes fiksativ. Uriner og blæreskylle vand er principielt altid egnede. En rask blære vil ikke afstøde ret mange celler, så selv en prøve med kun få eller uden celler vil kunne bruges. Man vil ofte se urothel og i nogle tilfælde pladeepithel i prøverne. Cylinderepithel findes også, men sjældnere end de to førnævnte 16 s. 144. Pladeepithel ses hyppigere i urin end i blæreskyllevæsker. Dette skyldes den tilblanding der sker når urinen lades. En prøve kan erklæres uegnet hvis cellerne er svært nedbrudte 16 s.144-145 En urinprøve eller et blæreskyl kan fx bruges til at detektere hæmaturi, inflammation eller cancer i blæren. De cytologiske forandringer der ses ved en cancer graderes efter Bergkvist som enten grad 0, I, II, III eller IV, hvoraf grad IV er den mest alvorlige 16 s. 152. En prøve erklæres altid egnet hvis der forekommer tumorceller D. Finnålsaspirater fra lungerne Finnålsaspirater bruges især til diagnostik af cancer der befinder sig perifært i lungen. En tynd nål guides vha. enten ultralyd eller røngten direkte ind i tumor og celler herfra suges op i nålen. Hvis prøven er udført præcist vil der være mange tumorceller, samt alveolemakrofager og respirationsepithel. FNA med respirationsceller er principielt altid egnede 16 s. 100-101. Prøven erklæres altid egnet ved forekomst af tumorceller D. Bronkieskyllevæsker De større bronkier skylles med saltvand som opsamles. Prøverne er ikke altid særligt rige på celler, men de mest almindelige er makrofager, bronkieepithel og granulocytter. Prøven er egnet hvis der ses bronkieepithel og makrofager 16 s 99. Prøven erklæres altid egnet ved forekomst af tumorceller D. D Ifølge Camilla Qvist, cytobioanalyitker, Patologiafdeligen BBH Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 13

Børstebiopsier Med en lille børste børstes områder i lungen hvor man har mistanke om tumorer. Man vil typisk se makrofager, erythrocytter, granulocytter og, fordi man har børstet direkte på bronkieepithelet, velbevarede cylinderepithelceller. En prøve vurderes at være egnet når der findes bronkieepithelceller 16 s. 99-100.. Prøven erklæres altid egnet ved forekomst af tumorceller E Cancerdiagnosik for lungecytologi Ved cytologiske undersøgelser alene klassificeres de maligne tilstande i småcellet carcinom og nonsmåcellet carcinom. Non-småcellet opdeles i yderligere planocellulært- eller adenocarcinom. Den endelige udredning i samarbejde med bl.a. radiografer og kiruger resulterer i en TNMkode som fortæller hvor tumoren sidder og om den har spredt sig 16 s. 108. Pleuravæsker En pleuravæske er som udgangspunkt også altid egnet. Man vil ikke få tappet pleuravæske med mindre der er øgede mængder og prøven vil altid få diagnosen reaktiv også uden forekomst af cancerceller. Ofte ses mesothelceller og ved ophobning af væske i pleurahulen ses også makrofager, leukocytter og lymfocytter i varierende mængde. En pleuravæske er egnet hvis der ses mesothelceller og makrofager 16 s. 122-123. Prøven erklæres altid egnet ved forekomst af tumorceller E. I pleuravæsker skelnes mellem primært opståede tumorer i mesothelet, kaldet malignt mesotheliom, og metastaser udgået fra andre organer. De hyppigste metastaser ses fra mamma- og lungecarcinomer 16 s.128-33. E Ifølge Camilla Qvist, cytobioanalytiker, Patolgiafdelingen BBH Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 14

Materialer og metoder Forsøgsmaterialer Prøvemateriale 24 urinprøver/blæreskyllevæsker 17 bronkieskyl 12 finnålsaspirater 8 pleuravæsker 1 børstebiopsi Til kontrol er der i Giemsafarvningerne brugt blodudstrygninger Til kontrol er der i PAPfarvningerne brugt kindskrab Maskiner PrepStain slide processor fra TriPath Imaging Inc ref. nr. 799-13000-00 Robostainer fra Microm HMS 760 X ref. nr. 93955 Cytocentrifuge Cytospin 3 fra ref. nr. 29645 Hettic Rotanta fra Hettic Labinstrument APS? Minishaker MS2 fra Bie & Berntsen AS ref. nr. 409782 Seven Easy fra Mettle Toledo ref. nr. 409723 Mikroskop fra Olympus BX50 ref. nr. 67389 Reagens og materialeliste Se bilag 5 Metode Prøveindsamling Prøverne er indsamlet over en periode på 4 uger på BBH. Uriner modtages fikseret i 70% ethanol. Efter der var udtaget materiale til den konventionelle metode blev rest materialet brugt til forsøget. Prøven blev vendt flere gange for at opnå en ensartet Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 15

opløsning og ca. 45 ml blev centrifugeret i 10 min ved 15 rpm og supernatanten hældt fra. Et volumen CRB minimum svarende til pellets volumen blev tilsat. Finnålsaspiraterne og børstebiopsierne er indsamlet i samarbejde med Lungemedicinsk ambulatorium(lma). Her laves FNA og materialet udstryges på objekt glas. Efter hver FNA blev nålen skyllet i en beholder med ca. 5 ml. CCR. Børstebiopsier blev ligeledes udstrøget på objektglas til konventionel præparering, hvorefter børstehovedet blev skyllet i en lille beholder med ca. 5 ml. CCR. Prøverne blev herefter sendt til Patologiafdelingen. Pleuravæsker og bronkieskyllevæsker blev modtaget frisk på Patologiafdelingen i spidsrør. Hvis volumenet var over 2 ml blev prøven inkluderet i forsøget. Prøven blev vendt flere gange for at sikre at cellerne var forholdsvis jævnt fordelt. Med en engangspipette blev ca. halvdelen af prøven afpipetteret over i et nyt spidsglas og centrifugeret i 10 min ved 1500 rpm. Supernatanten blev hældt fra og et volumen CRR der minimum svarede til pellets volumen blev tilsat. Den resterende del af prøven blev sat til side til konventionel præparering. Fælles for alle prøver er at de har stået i deres respektive fiksativ i minimum 30 min. inden præpareringen kunne fortsætte. Konventionel præparering Uriner vendes flere gange hvorefter der udtage et volumen på ca. 45 ml. dette centrifugere i 5 min ved 1500 rpm. Supernatanten hældes fra og cellepellet suspenderes i ca. 2 ml 70% alkohol. Hvis prøven er meget cellerig tilsættes der så meget alkohol at man kan se gennem prøven. To objektglas fastgøres med klips til megafunnels og der overføres 500 l til hver funnel. Disse centrifugeres i cytocentrifugen i 5 min ved 1500 rpm. Objektglassene afmonteres og fixeres med cytofix. Præparaterne farves på rutinefarvemaskinen den følgende dag. Glas med udstryg af FNA og børstebiopsier modtages luftørret og farves MGG. Pleuravæsker og bronkieskyllevæsker centrifugeres i 5 min ved 1500 rpm. Supernatanten hældes fra og cellepellet stryges ud på 4 objektglas med en vat pind. Der benyttes drejeteknik hvor vatpinden Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 16

føres rundt i cirkler på objektglasset mens den drejes rundt. Objektglassene lufttørrer og 2 farves MGG mens de andre 2 gemmes i en kasse i køleskabet i 4 uger. Herefter kasseres de. Eventuelt oversydende materiale i spidsglasset bruges til at fremstille et koagel til indstøbning i paraffin. PrepStain Efter fiksering i minimum 30 min. i enten CRR eller CRB blev prøverne igen centrifugeret i 10 min ved 1500 rpm. Supernatanten blev hældt fra og volumen af pellet vurderet. Var dette over 0,5 ml blev det opslemmet i lidt fiksativ og delt. Efter endnu en 10 min. centrifugering ved 1500 rpm blev pellets volumen igen vurderet. Såfremt pellet var under 0,5 ml kunne præpareringen fortsætte ellers blev fortyndingen gentaget. Alle prøver blev rystet på vortexmaskinen for at løsne pellet, synlige klumper af slim eller celler der ikke kan opslemmes, blev fjernet med en træpind. Prøverne blev herefter præpareret på PS maskinen ifølge producentens retningslinier. En mere detaljeret forsøgsvejledning ses på bilag 6 For hver prøve blev der på PS fremstillet to præparater. Et blev farvet PAP på maskinen, mens det andet forblev ufarvet. Hver gang der blev præpareret prøver på maskinen medtog jeg en kontrol i form af kindskrab der var fikseret i CRR for at kunne vurdere PAPfarvningen. Når maskinen var færdig blev der med Pertex monteret dækglas på de stadig våde præparater der var blevet farvet. De ufarvede glas blev overført til en vugge og opbevaret i 99,9% alkohol til CS præparaterne var klar. Dette skyldes at producenten under demonstration af PS maskinen havde understreget at de ikke måtte tørre ud når de var lavet, da dette kunne påvirke morfologien F. Når CS præparaterne var klar blev de alle Giemsafarvet. CytoSpin Restmaterialet fra prøverne præpareret på PS, brugte jeg til forsøget med CS. Cytofunnels blev med klips monteret til et objektglas og jeg overførte 10 dråber prøvemateriale til kammeret. Efter centrifugering i 5 min ved 1500 rpm fikserede jeg glassene med urinprøver med Cytofix. De blev F Ifølge sælger fra TriPath Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 17

den efterfølgende dag PAPfarvet på rutinefarvemaskinen. Kontrollen med kindskrab blev farvet sammen med urinerne og fungerede som kontrol. Prøverne med lungemateriale blev inden de tørrede, overført til en vugge og Geimsafarvet sammen med de ufarvede præparater fra PS. Efter farvningen fik alle præparaterne monteret dækglas mens de stadig var våde. Som kontrol i Giemsafarvningen benyttede jeg blodudstrygninger. For en mere detaljeret forsøgsvejledning se bilag 6. Efter farvning og montering af dækglas blev kontrollerne vurderet og hvis disse blev godkendt kunne farvningerne, og således også resultaterne, anvendes. De konventionelt fremstillede præparater blev fremstillet sideløbende af en anden bioanlytiker efter gældende procedure og blev til slut indsamlet. Alle præparater mikroskoperet, scoret og en diagnose fastslået. Metoderne blev herefter vurderet ud fra den diagnostiske kvalitet i samarbejde med cytobioanalytiker Camilla Qvist, Patologiafdelingen BBH. Patologiafdelingen, Bispebjerg Hospital 18