Sammenligning af konventionel cytologipræpareringsmetode med andre tilgængelige metoder

Transkript

1 BIOANALYTIKKERUDDANNELSEN VIAUC, CAMPUS AARHUS N Sammenligning af konventionel cytologipræpareringsmetode med andre tilgængelige metoder - Udarbejdet af: Cecilia Stæcker (122021) I-vejleder: Vibe Alopaeus Jelsbak Laboratorie: Patologisk Institut Regionshospitalet Viborg K-vejleder: Birthe Søltoft Lundsgaard Antal tegn: Afleveret:

2 Indholdsfortegnelse Forord...3 Resumé...4 Indledning...5 Baggrund og formål...5 Problemformulering...6 Målformulering...6 Teoriafsnit...7 Blærecancer...7 Patientforløb...7 Cytologiske fund...8 Analytiske forhold...8 Matrialer og metode...9 Matrialer...9 Indsamling af prøvematriale Præpareringsmetoder Papanucolau (PAP) farvning Forsøgsopsætning Kvalitetsvurdering Kriterier for mikroskopi Økonomi Litteratursøgning Resultater Diskussion Forsøgsdesign Individul vurdering Metodevalg Økonomi Andre studier Sammenlignlighed

3 Teknik vs. diagnostik Implimentering Fejlkilder Konklusion Perspektivering Anbefaling Referenceliste Bilag

4 Forord Dette professionsbachelorprojekt er udarbejdet på modul 14 af de bioanalytikerstuderende Nikolai Møller, Susanne Hvidegaard, Tatiana Jensen og Cecilia Stæcker under Bioanalytikeruddannelsen, Aarhus. Indledningen i opgaven er lavet i fællesskab, resten af opgaven er udarbejdet individuelt. Projektet er udført som afslutning på uddannelsen, og produktet henvender sig til bioanalytikere eller andre faggrupper der håndterer cytologisk materiale. Der er i alt afsat 12 uger til projektet, over perioden 18 marts 2013 til 29 maj De første to uger gik med forberedelse samt prøvemateriale indsamling. Den praktiskske udførsel tog ca. to uger, og resten af perioden blev overladt til udarbejdelse af det skriftlige produkt. Der er vedlagt et USB stik med Mikroskopiresultater, billeder, en kopi af Thermo Scientific kataloget og rådata. Tak til Urologisk afdeling for deres hjælpsomhed. Tak til personalet på Patologisk Institut Viborg for hjælp med indsamling af prøvemateriale. Og et særligt tak til Birthe S. Lundsgaard, Patologisk Institut Viborg Maj 2013 Cecilia Stæcker 3

5 Resumé Baggrund På Patologisk Institut Viborg benytter man 1 ml urin til præparering, ved denne teknik centrifugeres pellet ned på glasset, og dette farves. Ved denne metode bruges kun en meget lille del af prøvematerialet, og ved cellefattige prøver vil præparatet ofte være tomt ved mikroskopering. Da dette kan så tvivl om, hvorvidt kvaliteten af præpareringen er tilfredsstillende, bør man derfor fremstille et nyt præparat. Da det tager tid og ressourcer at fremstille forsinker det svartiden med en dag at skulle fremstille et nyt præparat, derfor afgiver man ofte svar på den tomme prøve. Man har længe overvejet, om det er forsvarligt at stille en diagnose på et tomt præparat, derfor har dette bachelorprojekt til formål at undersøge om, alternative løsninger kan forbedre kvaliteten af cellebilledet. Metoder Til projektet er der samlet 47 fixerede urinprøver. De fire præpareringsmetoder blev valgt på baggrund af, hvilke materialer og apparater der var tilgængelige på afdelingen. 1 ml metoden, som allerede er i brug og 6 ml metoden, hvor der blot skulle købes nogle andre megafunnels og glas til præparering, men ellers kunne cytocentrifugen bruges. ThinPrep var oplagt, eftersom der var en ThinPrep 2000 til rådighed, og udstrygning, da denne ikke krævede mere end et ekstra glas. De blev fordelt, så alle prøver som minimum blev præpareret med to metoder, 1 ml og en anden metode til sammenligning. Ved prøver indeholdende store mængder prøvemateriale blev der tilføjet flere præpareringer, så der var mere at sammenligne med. Dette endte ud med i alt 111 præparater til mikroskopering, fordelt med 47 med 1 ml, 20 med 6 ml, 23 med ThinPrep og 21 med udstrygning. Resultater Kvaliteten af ThinPrep viste sig markant bedre end de sammenlignede metoder. Det generelle antal af celler pr synsfelt steg med op til 65,59%, hvor de andre metoder maks. opnåede en stigning på 40,00%. Konklusion ThinPrep gav en bedre kvalitet ved mikroskopering, men der er en stor udgift forbundet med indførselen af denne metode. Der vurderes, at det ikke betaler sig at skifte metode. 4

6 Indledning Baggrund og formål Blærecancer er en meget udbredt cancerform i Danmark. Årligt bliver omkring 1500 mennesker ramt af denne sygdom. Indtil 1988 har der været en jævn stigning i antallet af nye tilfælde af blærecancer. Efter 1988 sås der et lille fald af nydiagnosticerede blærecancer (Se Fig.1). Incidensen vurderes til at være omkring 25 tilfælde pr indbyggere. (1) Figur 1: I 1988 blev der registreret 1638 tilfælde af blærecancer, i 1996 var der 1380 nye tilfælde, i år 2000 observeres der igen en stigning af blærecancer, hvor der blev registreret 1616 nye tilfælde. I 2010 var incidensen oppe på Der registreres flere nydiagnosticerede mænd end kvinder. (1) Så stor prævalens af sygdommen gør, at det er nødvendigt at vurdere forskellige analysemetoder, med henblik på optimering af diagnosticering af blærecancer. Det hyppigste, og ofte det eneste symptom for blærecancer, er hæmaturi. Andre symptomer minder meget om symptomerne ved blærebetændelse, herunder små hyppige vandladninger og svie ved diurese. Ud fra disse symptomer kan lægen få mistanke om blærecancer, og derved sætte et blærecancer pakkeforløb i gang. Blærecancer pakkeforløbet inkluderer altid CT-scanning af blære/urinveje, flexcystoskopi og urincytologi. Hvor der ved CT-scanningen og flexcystoskopi giver et makroskopisk billede af en eventuel cancer. Ved urincytologi, der er en væskebaseret analyse af urothelceller, opnås et mikroskopisk billede, som kan 5

7 be- eller afkræfte mistanken om blærecancer. Dermed er urincytologien et meget vigtigt non-invasivt redskab til udredning af blærecancer, samt ved kontrol og monitorering. Der ses generelt en høj sensitivitet og specificitet på urincytologi ved diagnostik af high grade læsioner eller carcinoma in situ (CIS). Ved low grade læsioner er sensitiviteten på 25 %. (2) Rundt på landets sygehuse benyttes mange forskellige urincytologiske metoder. Herunder cytocentrifugering, udstrygning og tyndlagsmetode i form af ThinPrep. På Patologisk Institut, Regionshospitalet Viborg (PAI) benyttes cytocentrifugering med 1 ml fikseret prøvemateriale. Der er på afdelingen mistanke om, at dette ikke er repræsentativt for den samlede prøvemængde. Det ønskes derfor undersøgt, om det er muligt at optimere denne metode, med inspiration fra andre metoder, der benyttes på landets patologiske afdelinger. Problemformulering Hvilke konsekvenser vil erstatning af den nuværende urincytologiske metode have for implementeringen på PAI (Viborg), med henblik på primært undersøgelse af teknologien og sekundært et estimat af økonomien? Målformulering For at undersøge hvilken præpareringsmetode, der resulterer i det mest repræsentative præparat, sammenlignes metoderne: 1. Cytocentrifugering af 1 ml prøvemateriale. 2. Cytocentrifugering af 6 ml prøvemateriale. 3. ThinPrep metode. 4. Centrifugering af ca. 40 ml prøvemateriale med efterfølgende udstrygning af pellet. Disse farves med Papanucolau-farvning (PAP-farvning) og analyseres i mikroskop. Her sammenlignes kvaliteten af præparatet i forhold til de opstillede kriterier: 1. Repræsentativt antal celler. 2. Cellernes lejring. 3. Ikke-urothelceller i baggrunden. 6

8 Der undersøges også, om sensitiviteten vil kunne forøges ved at benytte en anden metode end cytocentrifugering af 1 ml prøvemateriale, der hidtil er benyttet på afdelingen, og en eventuel implementering af denne undersøges. Det er i forbindelse med forsøget relevant at undersøge implementeringsmulighederne for de valgte metoder, ved hjælp af relevant litteratur, herunder estimat af økonomi og ressourcer på afdelingen. Teoriafsnit Blærecancer Blærecancer er betegnelsen for tumordannelse i blærevæggens slimhinde og kaldes transitiocellulære tumorer. Der er kun få symptomer på blærecancer, derfor er mange patienter ofte langt i forløbet inden de diagnosticeres. Celle forandringerne begynder ofte i års alderen og er tre gange hyppigere blandt mænd end kvinder. Man har påvist en vis sammenhæng mellem rygning og øget risiko for udvikling af blærecancer. Ikke alle celleforandringer fører til malign cancer, godt halvdelen (45%) er benigne og betegnes transitionaltumor. Det er dog stadig vigtigt disse bliver fjernet, da op mod 10% uforstyrret vil vokse sig dybere ind i blærevæggen og med tiden blive malign. Indgrebet er hurtigt og foregår under fuld bedøvelse med en kikkertoperation, hvor man forsigtigt fjerner abnormale områder. Da ca. halvdelen af patienterne udvikler nye transitionaltumor, går patienterne efterfølgende til regelmæssig ambulant cystoskopi kontrol, hvor de ved samme lejlighed afleverer en frisk morgenurin. Årligt udføres der i Danmark omkring operationer af blærecancer og ambulante cystoskopi til rutinekontrol. 210 patienter får årligt bortopereret blæren som følge af blærecancer. (3) Patientforløb Ofte henvender patienten sig efter opdagelse af blod i urinen, hyppig vandladning eller ved symptomer på blærebetændelse. Patienten får taget blodprøve og sendes til røntgenundersøgelse, enten som urografi eller CT-urografi. Hvis resultatet af scanningen giver anledning til at tro, der er tale om cancer, bliver patienten indlagt to dage til cystoskopiundersøgelse. Under fuld bedøvelse bliver tumoren forsigtigt fjernet fra 7

9 blærevæggen, og der skylles efter med kemoterapi og Calmette. I tilfælde med aggressiv tumordannelse kan det være nødvendigt at fjerne hele blæren, og erstatte den med et stykke af patientens egen tarm. Derefter følger nogle måneder med stråling og kemoterapi. Efterfølgende kontrol, afhængigt af hvor fremskredent sygdommen er, består i ambulant cystoskopi hver 4-12 måned. (3) Cytologiske fund Den cytologiske prøve er en non-invasiv undersøgelse, og kan bruges til at opdage cancer på et tidligt stadie. Når man modtager prøverne, er patientens urin blandet med fixeringsvæske i forholdet 1:1. Efter præparering mikroskoperes prøverne ved hhv. 10x og 40x forstørrelse. Ved 10x får man overblik over et større udsnit af prøven, og man har derefter mulighed for at zoome ind. Når man kigger prøven igennem, ser man primært efter abnormale celler og inflammation. Analytiske forhold Præanalytiske forhold Figur 1 Normale celler ved 10x forstørrelse med ThinPrep Prøverne består af fixerede urinprøver. Patienter, som skal til cytologisk undersøgelse, medbringer selv en urinprøve, patienten bliver informeret enten mundligt eller skriftligt om hvordan prøven skal tages. Prøven må ikke være morgenurin, men tages efter morgenurinen er ladet, samme dag som undersøgelsen. (4) Ved særligt klare prøver kan der være tale om blæreskyllevæske, dette fremgår dog ikke altid af rekvireringen og er heller ikke altid tilfældet. Problemet med patienter der selv medbringer prøver, ligger i man ikke altid kan være sikker på, det er den rigtige person, som rent faktisk har lavet prøven. Man kan heller ikke altid være sikker på at prøven er taget korrekt, eller er fra samme dag, hvilket sommetider kom til udtryk i form af degenerere celler. 8

10 Analytiske forhold Ved undersøgelse af prøven er det bioanalytikerens opgave, at sikre kvaliteten af det færdige produkt, hvad end det er til egen undersøgelse eller går videre til andre. Det er altid vigtigt at præparatet indeholder prøvematriale, er farvet korrekt, samt der ikke er luftbobler mellem dæk- og objektglas. Lever præparatet ikke op til disse kriterier, kan man blive nødt til at lave præparatet om. Dette skyldes at man ikke kan afgive en forsvarlig diagnose på et uegnet præparat. Postanalytiske forhold Som standardprocedure gemmer afdelingen altid resten af prøven i 3 måneder. Dette er mest af hensyn til, hvis der pludselig dukker noget uforudset op, der sår tvivl omkring prøvesvaret, er der altid mulighed for at foretage nye analyser. Matrialer og metode Matrialer Metode 1 Thermo Scientific cytosin 4 ( ) Shannon filter cards 96% ethanol Metode 2 Shannon ez megafunnel (A ) Megafunnel slide coated Thermo Scientific cytosin 4 centrifuge (105044) 96% ethanol Metode 3 Rotofix 32 centrifuge ( ) 50 ml centrifugerør. ThinPrep 2000 (105846) ThinPrep preservcyt Solution (lot 2341AA) ThinPrep filter Coatede ThinPrep mikroskop slides. ( ) 96% ethanol Metode 4 Rotofix 32 centrifuge ( ) 50 ml centrifugerør Engangs pipette (3,5 ml) 96% ethanol 9

11 Fælles for alle metoder: 47 fixerede urinprøver eller blæreskyllevæske Mikroskop (105913, , og ) Farvelab til farvning af præparaterne ( ) Maskine til dækglas ( ) Indsamling af prøvematriale Indsamling af prøvematriale foregik i samarbejde med personalet, over en periode på ca. 14 dage. Efter den ansvarlige bioanalytiker havde udtaget det materiale de skulle bruge, blev bøtten med det resterende indhold sat til side, i en afmærket kasse, til dette projekt. Da afdelingen modtog 3-7 prøver om dagen i indsamlingsperioden, blev alle prøver lagt til side. Alle bøtter fik en label med et nummer, sat over personnummeret for at anonymisere prøverne. Prøverne blev delt ind efter, hvor meget prøvemateriale de indeholdt, og tildelt en præpareringsmetode, hvor der var nok. For at undgå for meget forvirring og sammenblanding af metoder, blev alle 1 ml præpareringerne udført først. Dernæst blev alle prøver til metode 2 taget fra, præpareret, farvet og lagt til side. Ligeledes med metode 3 og 4. Efterfølgende blev der suppleret op med flere præpareringer af andre metoder, af urinprøver med meget indhold. Præpareringsmetoder I dette projekt anvendes fire forskellige præpareringsmetoder, fremgangsmåden på disse vil blive beskrevet i dette afsnit. Alle præpareringsmetoder farves med Papanucolau. 1 ml metoden er den metode som anvendes på PAI Viborg. Denne metode vil blive brugt som kontrolmetode til sammenligning med alle øvrige metoder. 10

12 Oversigt for fordeling af prøvematriale mellem metoder: De orange cylindre er urinprøver. Cytocentrifugering Cytocentrifugering ThinPrep Cytocentrifugering 6 ml. 1 ml. Op til 50 ml. Op til 50 ml. Pellet udstryges PAP farvning Mikroskopering Metode 1 1 ml metoden Først samles enheden ved at lægge et Shannon filter cards hen over glasset og lukke metalspændet, som låser enheden. Bøtten med urin rystes forsigtigt og 1 ml. urin overføres til Thermo Scientific cytosin 4 og lukke denne med en prop. Denne centrifugeres i cytocentrifuge i 5 min ved 2000 rpm og Fikseres herefter i 10 min. i 96% alkohol. (5) Figur 2: Samlet 1ml. megafunnel, klar til brug 11

13 Metode 2 6 ml metoden Først samles Shannon ez megafunnel(megafunnel) ved at indsætte en slide coated megafunnel og bukke forsiden hen over glasset til låsen siger klik. Dernæst rystes bøtten med urin forsigtigt, og der overføres 6 ml til en megafunnel og denne lukkes med en prop. Megafunnelen har samme størrelse som megafunnelen til 1 ml og passer dermed i cytocentrifugen. Prøven centrifugeres ved 1500 rpm i 5 min og fixeres i 10 min. i 96% ethanol. Figur 3: 4 fyldte Shannon ez megafunnel, klar til centrifugering Metode 3 ThinPrep metoden ThinPrep 2000 er en væskebaseret tyndtlagsteknik med mange anvendelser, i dette tilfælde non-gynækologisk cytologi. Princippet ved ThinPrep er at fjerne forstyrrende elementer, som blod og slim, fra prøven. (6) Først overføres 40 ml urin til en cylindrisk beholder, som Figur 4: ThinPrep 2000 inklusiv tilbehør (6) centrifugeres i 10 minutter ved 1900 omdrejninger. Efter centrifugering hældes supernatant fra og pellet overføres til ThinPrep preservcyt Solution, dette giftige medie lyserer erytrocytter og degenerer slim. Her skal den stå 15 minutter inden den kommer på maskinen. Processen på maskinen deles ind i tre stadier. Første stadie: Maskinen roterer filtret i prøvebeholderen, denne proces har til formål at adskille slim og celler. Figur 5: De tre stadier maskinen foretager på Thinprep 2000 (6) 12

14 Andet stadie: Ved hjælp af vakuumdannelse opsamles celler mod filteret. Cellerne på filtret giver mere modstand til vakuumtrykket, maskinen er programmeret til at stoppe når modstanden mod filtret bliver større. Tredje stadie: Det opsamlede materiale overføres til objektglasset og dette stilles i 96% alkohol. Metode 4 Udstregnings metoden Til denne metode centrifugeres 40 ml urin ved 1900 rpm i 10 min. Supernatanten hældes fra, og pellet udstryges på et objektglas. Med et andet glas fordeles urinen ud over glasset med lette strygende bevægelser og stilles i alkohol for at undgå udtørring. Figur 6: udstrygnings metode Papanucolau (PAP) farvning PAP farvning er en oversigtsfarvning til at let kunne observere cellernes morfologi og metaboliske aktivitet i forskellige kropssekreter. Under farveprocessen bruges fire farver, i tre forskellige opløsninger, altså en trichromemetode. Første farvetrin involverer en kernefarvning med Hæmatoxylin. Dernæst bruges Orange G og EA (Eosin Y og Light Green) til farvning af cytoplasma(7), hele farveprocessen tager 32 minutter (se bilag 1 ). Figur 7: Almindeligt cellebillede ved 1 ml metode, indeholdende krystaller(lilla), pladeepilet (lys lilla) urotel celler (lilla til blålige) samt en inflammation 13

15 Resultat: Pladeepitel: Kan være lyserød, men ses ofte som lys lilla med mørk kerne Urotelceller: Turkis eller blålige med mørk til sort kerne Neutrofile granulocytter: Meget mørklilla Krystaller: Lilla eller klare Forsøgsopsætning Mikroskopering foregik i hold af to og to, i to forskellige lokaler, og med to forskellige metoder. Gruppe 1 bestod af studerende 1 og 2, forkortet til stu 1 og stu 2 i bilag, og gruppe 2 med studerende 3 og 4, forkortet til stu 3 og stu 4. Gruppe 1 skimmede hvert præparat igennem, og afgav selvstændigt svar inden for 10 minutter. Ved svær uoverensstemmelse blev enkelte præparater taget til revurdering. Gruppe 2 havde ubegrænset tid til hvert præparat, hvilket kunne betyde, der blev brugt op til en time på et præparat alene. Der blev der diskuteret om fundet mellem de to studerende, og nået til en fælles svarafgivelse. Da ingen i de to grupper er oplært med de nødvendige erfaringer, til at give en korrekt cellebeskrivelse, vil der blive fokuseret mere på cellebilledet generelt, så som antal og lejring. Der er anvendt procentberegninger for at undersøge forholdene mellem de forskellige metoder, og anvendt grafiske illustrationer for at give overblik over scorefordelingen. Kvalitetsvurdering Inden mikroskopering blev der opsat en række kriterier til, hvordan et givent præparat skulle scores. Der blev givet point efter, hvor mange celler der blev fundet, deres lejring, graden af inflammation og baggrundsstøj, samt en overordnet karakter for præparatets diagnostiske kvalitet. Til slut blev der givet karakter efter, hvilken præpareringsmetode, der havde den bedste score til givne prøve, og dermed var bedst at vurdere celler ud fra. 14

16 Kriterier for mikroskopi Hvert præparat blev givet 4 karakterer fra 0 til 3 inden for de forskellige kategorier. Første karakter går på antal urotelceller pr. synsfelt, hvor de forskellige karakterer dækker over følgende: Score Definition 0 Ingen urotelceller celler celler Sideløbende tages noter vedrørende andre fund, deriblandt mængden af pladeepitel m.m. dette tages med i den bedømmelsen af kvalitetskarakteren. Næste kategori beskriver cellelejring. Score Definition 0 Ingen celler 1 Cellerne ligger i syncytier og er svære eller umulige at vurdere 2 Urotelcellerne ligger i mindre grupper blandet med andre celler, men er stadigt vurderbare 3 Enkeltliggende afgrænsede urotelceller Tredje karakter bedømmer baggrunden. Denne er speciel, da der gives tre for en tom baggrund, hvor der ved de andre kategorier er givet 0. Score Definition 1 Kraftig inflammation, eller med meget krystal eller slim 2 Tegn på inflammation men ikke forstyrrende for diagnosticeringen 3 Ren baggrund 15

17 Tilslut gives en samlet karakter for det overordnede indtryk af præparatet, denne bedømmes ligeledes ud fra skalaen 0-3. Ved karakteren 0 vurderes præparatet som ikke egnet til diagnostik grundet mangle på celler, mens ved karakteren 3 vurderes præparater særdeles egnet til diagnosticering. Kriterier for vurdering 1 Cellerne kan ikke vurderes. Ingen eller få urotelceller. Kraftig inflammatorisk baggrund eller med krystaller, granulocytter, erytrocytter og pladeepitel. Celler lejret i flere lag/ sheets. Eksempel på cellebillede givet denne karakter alle ved 10x forstørrelse 10x forstørrelse af en prøve med stærk inflammation Karakteren 1 er givet, idet den kraftige inflammation gør det nærmest umuligt at vurdere på cellerne. 2 Cellerne ligger enkeltvis eller i mindre sheets, let inflammatorisk baggrund med få granulocytter og/eller erytrocytter. Figur 8: 1 ml 10x forstørrelse af normalt cellebillede med urotel- og pladeepitelceller samt lidt farve udfældning. Figur 9: 1 ml 16

18 Karakteren 2 gives, da cellerne ligger klumpet sammen, urotel cellerne har svag celleafgrænsning men de er stadig vurderbare. 3 Optimalt cellebillede. Cellerne kan nemt vurderes. Synlige, repræsentative og velbevarede urotelceller. Ingen inflammation. Celler lejret enkeltvis eller i mindre vurderbare sheets 10x forstørrelse af normalt cellebillede. Karakteren 3 er givet, idet cellerne er tydeligt afgrænset og baggrunden er ren. Figur 10: ThinPrep Økonomi Med hjælp fra bioanalytiker Anette Kim Nielsen fra PAI Viborg og kataloget fra Thermo Scientific er der lavet en estimeret udregning for materialeudgiften på analyseprisen. Der er ikke medregnet timelønninger, udgifter til vask og vedligehold af utensilier eller strømforbrug til maskinerne. Litteratursøgning Det var ikke muligt at finde relevante artikler nyere end fra Søgning på PubMed 6.maj 2013 kl. 16:48 med søgeordene: ((ThinPrep) AND Cytospin) AND nongynecologic 17

19 Dette gav 3 hits, artikel nummer 1(Comparison of ThinPrep and cytospin preparations in the evaluation of exfoliative cytology specimens) er fundet relevant. Da dette er en ældre artikel ligger denne frit tilgængelig. Søgning på PubMed 7.maj 2013 kl. 13:09 med søgeordene: (cytospin) AND ThinPrep Dette gav 22 hits, artikel nummer 7 (Analysis of urine cytology tests in 120 paired cases) blev fundet relevant. Artiklen er frit tilgængelig hvis man Googler hele artikel navnet. Resultater Rådata og beregninger er vedlagt som bilag 2. Procentmæssig overensstemmelse mellem resultaterne for kvaliteten af præparaterne. Gruppe 1 Gruppe 2 Metode 1 46,80 % 82,98 % Metode 2 52,38 % 90,48 % Metode 3 65,22 % 82,61 % Metode 4 52,38 % 95,24 % Mellem alle 4 studerende var der 61,70 % overensstemmelse med hensyn til, hvilket præparat de foretrak at bruge til diagnosticering. Sammenfatning af procentantal præparater med stigning i antal celler pr. synsfelt. Studerende 1 Studerende 2 Studerende 3 Studerende 4 Fra metode 1 til 2 25,00 % 40,00 % 10,00 % 10,00 % Fra metode 1 til 3 51,61 % 65,59 % 30,43 % 26,09 % Fra metode 1 til 4 4,76 % 19,05 % 19,05 % 14,29 % 18

20 Antal prøver i eksakt værdi Foretrunke i eksakt værdi Cecilia Stæcker Bachelorprojekt forår 2013 Sammenfatning af procentantal præparater med forbedret diagnostisk karakter Studerende 1 Studerende 2 Studerende 3 Studerende 4 Fra metode 1 til 2 40,00 % 40,00 % 20,00 % 15,00 % Fra metode 1 til 3 43,48 % 56,52 % 65,21 % 52,17 % Fra metode 1 til 4 19,05 % 28,57 % 14,29 % 19,05 % Valg af foretrukne præparat Histogram oversigt for foretrukne præparat Graf 1. Grafisk illustration over, hvilket præparat de studerende foretrak at kigge på stu 1 ved mikroskopering. Alle 47 prøver er medtaget stu 2 stu 3 stu 4 Metode Graf 2: Grafisk illustration over, hvilket præparat der bedst levede op til kvalitets kriterierne, når der altid var mulighed for at vælge metode 2. Præparat 2 er altid mulig andet præp 2 Præparat valgt stu 1 stu2 stu 3 stu 4 19

21 Antal prøver i eksakt værdi Antal prøver i eksakt værdi Cecilia Stæcker Bachelorprojekt forår 2013 Graf 3: Grafisk illustration over, hvilket præparat der bedst levede op til kvalitets kriterierne, når der altid var mulighed for at vælge metode 3. Præparat 3 er altid mulig andet præp 3 Præparart valgt stu 1 stu 2 stu 3 stu 4 Graf 4: Grafisk illustration over, hvilket præparat der bedst levede op til kvalitets kriterierne, når der altid var mulighed for at vælge metode 4. Præparat 4 er altid mulig andet præp 4 Præparart valgt stu 1 stu 2 stu 3 stu 4 Individuel scoring af en præparerings metode. De fire diagrammer viser, hvordan de fire studerende har scoret alle prøver til metode 1. Metode 1 studerende 1 4% Metode 1 studerende 2 21% 6% 49% 28% % % %

22 2% Metode 1 studerende 3 Metode 1 studerende 4 4% 11% 6% 21% % % 3 66% 3 Metode 3 studerende 1 Metode 3 studerende 2 4% 4% 5% 4% 18% % 1 74% % 2 3 Metode 3 studerende 3 Metode 3 studerende 4 39% 0% 9% % 4% 13% % 3 48% 3 Omkostninger Metode 1 Coated slides/glas til urincytologi x1 1,37 kr. 21

23 Shannon filter cards til 1ml urincentrifugering x1 2,09 kr. Materialeudgifter til en analyse 3,46 kr. Metode 2 Megafunnel Materialeudgifter til en analyse 45,00 kr. 45,00 kr. Metode 3 Coated ThinPrep slides x1 1,09 kr. 50 ml Centrifugerør x1 0,60kr. ThinPrep filter x1 47,15 kr. ThinPrep preservcyt Soulution x1 6,72 kr. Materialeudgifter til en analyse 55,56 kr. Metode 4 Coated slides/glas til urincytologi x1 1,37 kr. 50 ml Centrifugerør x1 0,60 kr. Objektglas x1 0,45 kr. Materialeudgifter til en analyse 2,42 kr. 22

24 Diskussion Idet de to grupper mikroskoperede på forskelligvis, har dette bevirket, at studerende 1 og 2 har større afvigelse ved svarafgivelse, både internt i gruppen og eksternt grupperne imellem, mens de studerende i gruppe 2 har meget enslydende resultater. Til trods for at mikroskoperingsmetoderne var forskellige, gav resultatet det samme billede. Præparerings metode 3, ThinPrep, var den mest foretrukne, hver gang man havde valget. Til sammenligning var der sjældent en forbedring ved metode 2 og 4, og disse blev ofte valgt fra. Forsøgsdesign Til forsøget blev der anvendt 47 urinprøver samt enkelte blæreskyllevæsker, alle taget inden for en periode på ca. to uger. Dette må antages at være et repræsentativt udsnit af patientprøver. Idet det anslås at der årligt bliver fundet 1500 nye tilfælde, fordelt over hele Danmark, var forventningerne til at finde en prøve, indeholdende celleforandringer, lav. Mange af de modtagne prøver hørte til screeninger af patienter med tideligere tilfælde af cancer. Forsøget havde mange observatører, dette kan både være en fordel og en ulempe. Fordelen ligger i de mange uafhængige observationer og svarafgivelser. Dette kan dog også være en ulempe, eftersom disse ikke var oplært, eller rutineret i at mikroskopere urinpræparater. Til trods for at være urutinerede, ses der dog en tydelig sammenhæng mellem scoring og præpareringsmetode. Det mest optimale ville være, hvis man havde sat to bioanalytikere, eller andet cytologisk fagpersonale, til at score præparaterne. Man kunne eventuelt have blindtestet prøverne, så observatøren ikke viste hvilken præpareringsmetode der blev mikroskoperet. Dette kan dog ikke lade sig gøre i praksis, da der er forskellige indikatorer på prøverne, så som afmærkede synsfelt eller anderledes morfologi, der afslører, hvilket præparat man kikker på. 23

25 Individul vurdering I resultatafsnittet er et par eksempler på, hvordan de studerende har fordelt scoren på de forskellige metoder. Ved at betragte cirkeldiagrammerne kommer det til udtryk, at der er stor intermediær vurderingsvariation. Dette bunder muligvis i, at alle 4 studerende har forskellige måder at mikroskopere på, og de vægter fundet på præparatet forskelligt. Da der kun er 3 karakterer, men flere kriterier der skal være opfyldt kan, det være en smagssag om disse opfyldes tilstrækkeligt, når der skal vægtes mellem to karakterer. Selv om der er tale om individuelle scoringer, ses der sjældent større uoverensstemmelser end en numerisk værdi, og alle 4 har ca. samme procentdel brugbare (2 og 3) som ikke brugbare (0 og 1). Ofte ligger uoverensstemmelserne mellem scoring 2 og 3, hvilket især ses ved sammenligning af gruppe 1 og 2. Gruppe 1 s scoring ligger overordnet højre og med større variation mellem de forskellige kategorier, mens gruppe 2 har været mere konsekvente med at give ensartede karakterer til alle kategorier. Eksempelvis ved vurdering af præparat 7, 1 ml: Studerende Urotelceller Lejring Baggrund Diagnostik Dette præparat var meget inflammatorisk, dette gjorde urotelcellerne svære at skelne. Ser man på det overordnede billede af alle præparaterne, er det tydeligt ved begge grupper, at der vægtes bedre karakterer til metode 3 frem for de øvrige metoder. Metodevalg Af resultaterne ses det tydeligt, at metode 4 ikke er vellidt blandt observatørerne. Denne metode er langt den billigste materialemæssigt, men viste den sig væsentligt dårligere kvalitetsmæssigt end de andre metoder. Præparaterne fremstod ofte enten tomme, eller med store mængder baggrundsstøj, så som trådlignende protein, erytrocytter, krystaller og farveudfældninger. Da prøvematrialet blev fordelt over en større overflade, betød dette at det tog længere tid at mikroskopere, og metoden ændrede på cellemorfologien. I stedet for pæne runde afgrænsede celler fremstod nogle af disse ofte næsten ovale eller D formede, efter at være trukket over objektglasset. 24

26 Metode 2 viste sig heller ikke at være væsentlig bedre, på trods af den større mængde prøvematriale, og selv om megafunnel til denne metode er dyrere i indkøb og tillige kun er til en gangs brug. På det mikroskopiske udseende mindede dette om 1 ml, dog havde denne metode en række ulemper. Hvis enheden ikke blev samlet 100 % korrekt, viste den sig hurtigt utæt, og måtte laves om. Selv ved korrekt udførsel, kunne der løbe prøvemateriale ved siden af, hvilket betød at mikroskopifeltet lå uden for det afgrænsede område, eller på den sorte linje, hvor cellerne ikke kunne identificeres. Ud fra scoringsresultaterne, vil det ikke kunne anbefales at bruge hverken metode 2 eller 4, det efterlader metode 1 og 3 til videre diskussion. Metode 1 gav et meget varieret billede. Ved stærkt cellerige prøver var antallet af syncytier massivt, mens ved cellefattige prøver var der risiko for, at man overså de få celler, der måtte være. Den største fordel ved denne metode går på den velbevarede cellemorfologi. Sammenligner man med metode 3, var cellebilledet kun svagt varierende fra prøve til prøve. Dog syntes urotelcellerne at være en anelse mindre, og mere klart farvet med metode 3 end med metode 1. Ved metode 1 var der ingen afmærkning på objektglasset, hvilket besværliggjorde mikroskopering ved cellefattige prøver. Dette var der midlertidigt taget højde for på ThinPrep, dennes objektglas var forsynet med en tydelig sort afgrænsning, og selv ved cellefattige prøver var præparatet hurtigt og let at mikroskopere. Metode 3 fik en bedre scoring end metode 1, hvor op imod 38 % af 47 (score 0 +1) var uegnede til diagnostigsering sammenlignet med metode 3 hvor dette maks. gjaldt 17 % af 23. Økonomi Ud fra et økonomisk aspekt vil det bedste alternativ være metode 4. Det viste sig dog at denne præpareringsmetode forringer kvaliteten. Ved at skifte fra 1 ml præpareringsmetoden til ThinPrep, vil det give en stigning i den årlige udgift på ca ,20kr (se bilag 2). Dette er en voldsom stigning på én analyse efter en periode med mange nedskæringer, eksempelvis som i 2009 hvor måtte lave besparelser på 0,499 mill.(8,8). Men det er også indtrykket at der kan spares meget tid, da udførelsesprocedurerne til begge metoder tager en del tid, men mikroskopering af ThinPrep går lettere end ved cytospin. Til dette forsøg er der dog ikke taget højde for, hvor lang tid der blev brugt på de forskellige præpareringsmetoder, eller tidsforbrug på mikroskopering, da dette sandsynligvis vil variere 25

27 væsentligt fra person til person. Der er heller ikke taget højde for ekstra udgifter til præparater at så ringe kvalitet at de skal laves om. Andre studier På Ball Memorial Hospital, Muncie, Indiana(9) har en gruppe patologer og cytologer lavet et lignende forsøg, hvor de sammenligner cytospinmetoden med ThinPrep. I dette forsøg inkluderede man en variation af otteogfirs forskellige non-gynækologisk prøver. Deres resultater peger ligeledes på, at til diagnosticering er ThinPrep at foretrække frem for den konventionelle cytospinmetode. I undersøgelsen blev det medtaget flere aspekter, så som cellemorfologi og flere typer prøvematriale. For at sammenligningen skal give mening, er man nødt til at se isoleret på resultaterne for urin alene. Sammenlignen af Muncies resultater med PAI er dog ikke så lige til, da der er opsat andre mikroskopikriterier, samt at dette forsøg er udført af fagpersonale med større erfaring inden for mikroskopering. Et af de konkrete resultater, der kan sammenlignes, er i forhold til hvilket præparat observatøren foretrækker at diagnosticere på. I 70,40 % af tilfældene eller 76,92 % (bilag 2) hvis man kun regner urin prøver, foretrak cytologerne ThinPrep. Til sammenligning foretrak de studerende ThinPrep i 90,91 % af tilfældene, hvor denne metode var mulig. Da de studerende ikke har vægtet morfologien på samme måde som cytologerne, har dette ligeledes givet en forskel i votering, da de forskellige præpareringsmetoder giver forskellige cellebilleder. ThinPrep gav et mere detaljeret billede af kromatinstrukturen, dog var cellerne skrumpet, i modsætningen til cytospin metoden, hvor cellerne til gengæld lå i hobe. I begge forsøg blev der observeret en stor variation ved brug af cytospin metoden, hvilket besværliggjorde en standardisering. ThinPrep ændrede cellemorfologien, men gav et mere detaljeret billede ved low grade cancer. Da forfatteren har læst andre artikler, hvor det konkluderes, at de to metoder har lignende sensitivitet(10), mener han derfor at det vil være en fordel at anvende ThinPrep som standard, men ved tvivl kan cytospin konfirmere det diagnostiske svar. Idet cytologerne i undersøgelsen både er rutinerede i at mikroskopere ThinPrep (5 år) og cytospin, har disse gode forudsætninger for en vurdering af begge metoder. Selvom der er medtaget mange prøver, nævnes det ikke hvor meget prøvematriale der bruges til de forskellige metoder. 26

28 I et andet studie, udført af en række patologer i Singapore, fra 2003(11), har man undersøgt sensiviteten og specificiteten på cytospin og ThinPrep. Artiklen blev først publiceret i 2006, da den har været gennemset af forskellige læger inden den blev godkendt. I denne undersøgelse indgik 120 ufixerede urinprøver, med minimum 20 ml urin. Prøvematrialet blev ligeligt fordelt mellem cytospin og ThinPrep. I 26 tilfælde var der mulighed for histologisk sammenligning, disse blev brugt som standard til beregning af sensitivitet og specificitet. Resultatet af undersøgelsen viste ikke nogen signifikant forskel mellem de to metoder, dog var cytologerne mere tilbøjelige til at vælge cytospin metoden af flere årsager. Et at de stærkeste argumenter var, at cytospin altid afspejler patientprøven, mens ThinPrep var mere standardiseret. En anden grund til, at cytospin var bedre, var dens evne til at bevare morfologien, og transitionaltumorer var bedre afspejlet. Der er i midlertidig et par ting i artiklen man bør forholde sig kritisk til. Ser må på mikroskopibillederne i rapporten, kan man undre sig hvad de har kunnet diagnosticere på, i de kaotiske mængde af celler på cytospin, samt at alle modtagne urinprøver var ufixerede, hvilket reducerer holdbarhed markant. Artiklen nævner ikke, hvilke erfaringer observatørerne har med de forskellige metoder. Idet det kræver oplæring at kunne mikroskopere ThinPrep korrekt, kan man forestille sig, at dette har givet indflydelse på scoringen. I forsøget blev der lavet to præparater til cytospinmetoden, samt der blev brugt voldsomt meget prøvematriale i forhold til andre cytospinmetoder, hvilket muligvis forklarer cellemængderne på billederne i artiklen. Fælles for begge undersøgelserne er, at der blev lavet dobbelt bestemmelse på alle cytospinprøver samt brugt mere prøvematriale. Eftersom der er en markant forskel i mængden af prøvemateriale med op til 5x mere materiale pr. prøve, kan man forestille sig, at sensiviteten på 1 ml metode måske ikke er helt identisk med 2x5ml. Da dette imidlertid er den mest identiske undersøgelse tilgængelig, vil den blive godtaget, men med forbehold. Der blev ligeledes brugt en anden cytocentrifuge, dette er også en ændring, som kan have haft indflydelse på resultatet, da artiklen ikke nævner hvilken centrifugalkraft, der er anvendt. Sammenlignlighed For at opsummerer fordele og ulemper mellem de to metoder. 27

29 Cytospin ThinPrep Fordele Ulemper Fordele Ulemper Afspejler patient Meget forskellige Ren baggrund Ændrer på prøven som den resultater Detaljeret cellemorfologien er Kan være cellekerne Billig analyse udiagnosticerbar Mange Dyr analyse Mindre og skal laves om enkeltliggende i materialer mikroskopi felt Syncytier celler Uden celler Tydeligt afgrænset mikroskopi felt De to artiklers cytologer har modstridende holdninger til, hvilken metode der er den bedste teknik. Begge kommer med gode argumenter for, hvorfor den ene er bedre frem for en anden. Teknik vs. diagnostik Dette forsøg har hovedsageligt vægtet de visuelle forskelle mellem forskellige præpareringsmetoder, hvor der viste sig en signifikant forskel mellem de to metoder. Da der foreligger en stor udgift ved erstatning af den konventionelle metode, er det vigtigt at undersøge, om der foreligger en diagnostisk forskel mellem de to metoder. Til at vurdere dette, må man antage at forsøget fra Singapore er validt. I artiklen konkluderes der ingen signifikant diagnostisk forskel mellem ThinPrep og cytospin. Dette giver også svar på, hvorfor der er så mange forskellige metoder i brug på landets forskellige afdelinger. Bl.a. benyttes ThinPrep metoden til blærecancerdiagnostik på Randers sygehus(12), mens patologisk Institut Aarhus lader til at bruge en cytospin metode der bruger en stor mængde urin (20 ml) (13) og hospitalsenheden vest benytter 6 ml. metoden(14). 28

30 Implimentering Idet afdelingen allerede ejer alt fornødent apparatur til indførsel, vil det kun være et spørgsmål om rutineomlægning, tilvænning til mikroskopering og den øgede materialeudgift. Da afdelingen gennemsnitligt modtager 4-5 prøver om dagen, vil apparaturets kapacitet ikke have nogen signifikant indflydelse på tidsforbruget. Når man tænker på materialeudgiften, er den ikke en særlig voldsom udgift, når vi snakker om offentlige udgifter, hvor man ofte regner i hele og halve millioner. Da godt og vel kr. årligt (8) ikke er en stor udgift, må andre faktorer spille ind for valget af metode. Fejlkilder Hvis prøverne er blevet centrifugeret ved forkert centrifugal kraft (g), ved for lav indstilling, ville ikke alt prøvematerialet blive slynget ned, og det vil betyde at præparatet bliver cellefattigt. Der er muligvis lavet fejl ved udstrygningsteknikken. Efter centrifugering var det svært at skælne supernatant fra pellet. Hvis der er blevet hældt for meget fra, kan dette være en forklaring på, hvorfor prøverne alle var cellefattige. Da den studerende som udførte udstrygningen ikke var rutineret i dette, kan man forestille sig, der er brugt for meget kraft til udstrygning, dette kan være en forklaring på cellernes anderledes morfologi. Eftersom der var mange præparater at holde styr på, kan man let forestille sig at, der kunne ske en forbytning, eksempelvis hvis en cellerig og en cellefattig prøve er blevet sammenlignet vil det give en større variation end der var meningen. Konklusion Ved indførsel af metode 2 og 4 ville det give en forringelse i kvaliteten. Dertil kommer at metode 2 ville give en større udgift. Ved sammenligning mellem ThinPrep og den konventionelle metode, viste der sig tydelig forbedring, både i mængden af urotelceller, i samt en mere standardiseret præparat. Implementering af ThinPrep vil 29

31 både betyde en stigning i materialeprisen på 63, kr. årligt, samt denne kræver tilvænning at mikroskopere. Da der rent diagnostisk ikke er signifikant forskel på positive præparater, ifølge studiet fra Singapore, er det ikke en nødvendighed at skifte metode. Til trods for at cytologer ofte foretrækker ThinPrep, er der intet der konkret beviser at der kan spares tid, penge eller ressourcer ved at benytte denne metode frem for den konventionelle. Perspektivering Da undersøgelsen kun foregik over en kort periode, resulterede dette i udelukkende negative prøver. Dette betyder alle scoringer er baseret på normale fund, men ved screening er man ofte mere interesseret i at finde de abnormale, frem for normale celler. Dette betyder også, at der kun er taget højde for den tekniske kvalitet, eftersom prøvematrialet viste sig negativt, samt at undersøgelse af den diagnostiske værdi tager længere tid, end der var afsat. Da der indtil nu kun er taget højde for materialer, ville være interessant at sammenligne prisen for fremstilling og analysering af præparater til cytospin og ThinPrep inklusiv arbejdstid. Det er de studerendes opfattelse, at der er tid at spare, bl.a. på mikroskopering af ThinPrep, samt at denne metode kræver mindre manuelt arbejde. Dette betyder at bioanalytikeren kan foretage sig andet imens præparaterne ordnes, hvilket i sidste ende kan betyde, at man får mere ud af bioanalytikerens tid. Dette er væsentligt da det dyreste på en afdeling ofte ligger i lønninger til personale frem for materialeudgifter. For definitivt at finde ud af, om det vil være en fordel for afdelingen at indføre ThinPrep metoden, kunne man lave et mindre projekt, hvor de ansatte fik en mindre mængde repræsentative prøver til scoring. Hvis afdelingens cytologer ligeledes finder signifikant forskel i diagnosticering, vil der være større belæg for overvejelser oms at erstatte den konventionelle metode. Anbefaling Efter denne undersøgelse står det klart, at den bedste kvalitet blev opnået med ThinPrep metoden, dog kræver denne metode at cytologen er opmærksom på den anderledes cellemorfologi ved 30

32 mikroskopering disse. Til trods for at denne metode er dyrere, og muligvis en smule mere tidskrævende, giver den et mere standardiseret cellebillede. Hvis afdelingen vælger at beholde den konventionelle metode, kan det anbefales at lave to præparater til hver prøve, som der gjorde sig gældende i andre studier. Dette vil kun give en merpris på 4228,12 kr. (bilag 2). pr. år, mens man samtidigt mindsker ricikoen for at få tomme præparater. Dette er dog definitivt mere arbejdskrævende. 31

33 Referenceliste (1) Nicolas Schnell, Blærecancer (Set 2013 marts).. (2) Region Midtjylland, Urincytologi.(Set 2013 marts).. (3) Omkring urinvejscancer. (4) vejledning til prøvetagning. (5) Viborgs præpareringsmetode. (6) ThinPrep trin. (7) Kompendium i klinisk cytologi: Normal Cervixcytologi. 2008:114 sider, ill. i farver. (8) /Aaben_dagsorden/Bilag/Punkt_5_Bilag_1.pdf. Buget. (9) Elsheikh TM, Kirkpatrick JL, Wu HH. Comparison of ThinPrep and cytospin preparations in the evaluation of exfoliative cytology specimens. Cancer 2006 Jun 25;108(3): (10) Sensiviteten. (11) Sng KK, Nga ME, Tan SY, Walker T. Analysis of urine cytology tests in 120 paired cases. Acta Cytol 2007 Sep-Oct;51(5): (12) Randers. (13) PAI Aarhus. (14) 8ESGJX/$FILE/Skema%20over%20cyt%20p%C3%A5%20langs.pdf. Hospitalsenheden vest. 32

34 Bilag Rådata i bilag (gerne elektronisk, CD, DVD el. lign.) Bilag 1 farve metode (PAP) Bilag 2 regneark Bilag 3 katalog med priser Bilag 4 indscannede skemaer (gruppe 1) Bilag 5 - indscannede skemaer (gruppe 2) 33