Påvisning af collagen colitis ved lymfocytær colitis diagnosticeret væv

Påvisning af collagen colitis ved lymfocytær colitis diagnosticeret væv - udført med masson trichrom, picrosiriusrød og optimering af anti-tenascin Detection of collagenous colitis in lymphocytic colitis diagnosed tissue - using masson s trichrome, picrosirius red and optimization of anti-tenascin Mikrofoto af special- og immunfarvning med masson trichrom, picrosiriusrød og anti-tenascin på colonvæv. Forstørrelse x80. Udarbejdet af: Lina Jensen Torp (studienummer: Ba10s136) Uddannelsesinstitution: University College Syddanmark Klinisk uddannelsessted: Klinisk Patologi Sygehus Lillebælt Vejle Vejleder: Inge-Marie Bayer Vejleder: Judith L. Jensen Periode: Medio oktober 2015 medio december 2015 Anslag: 61.084

Forord Dette projekt er udført på Klinisk Patologi på Sygehus Lillebælt Vejle og der skal derfor gives en stor tak til personalet på afdelingen, for at være behjælpelige med indsamling af prøvematerialer og for altid at have tid til at svare på spørgsmål og guide os i laboratoriet. Derudover skal der også gives en kæmpe tak for løbende hjælp og rådgivning i optimeringsprocessen og for at sætte tid af til indhentning af priser og oplæring i datasystemet og Nano Zoomer. Også en stor tak skal gives til vejledere Judith L. Jensen og Inge-Marie Bayer for deres uvurderlige hjælp og støtte og for deres råd og vejledning. 1

Abstrakt Baggrund: På Klinisk Patologi på Sygehus Lillebælt Vejle anvendes HE-farvning på colonbiopsier mistænkt for mikroskopisk colitis, for at diagnosticere patienten med en af undergrupperne af sygdommen, kollagen colitis (CC) eller lymfocytær colitis (LC). Da disse histologisk minder meget om hinanden og HE-farvning ikke altid er pålidelig til korrekt estimering af tykkelsen på subepitial kollagen i basalmembranen, som er en indikator ved CC, anvendes der ofte også specialfarvning med masson trichrom som en yderligere metode til diagnosticering. Formål: At undersøge om masson trichrom kan erstattes af andre farvemetoder bl.a. ved optimering af anti-tenascin og om der kan påvises CC ved LC diagnosticeret væv. Metode: Optimering af antistoffet foretaget med Optiview DAB på Ventana Benchmark Ultra. Specialfarvninger udført med masson trichrom på Artisan Link og håndfarvning med picrosiriusrød. Resultater: Vurderet ud fra scoreskemaer for farveintensitet, tydelighed af basalmembranen og måling af basalmembranen. Opnået protokol for anti-tenascin med fortyndingsforhold 1:40, demaskeringsmiddel CC1 HIER, demaskeringstid 40 min. og inkubationstid 52 min. Picrosiriusrød vurderes til bedste metode til visualisering af basalmembranen. Konklusion: Yderligere optimering af anti-tenascin skal foretages og den kan derfor ikke inkluderes i metodesammenligningen med specialfarvningerne. Picrosiriusrød er et bedre alternativ til nuværende farvemetode masson trichrom, til påvisning af CC. 2

Indholdsfortegnelse Ordliste... 5 Introduktion... 6 Baggrund... 6 Problemformulering... 7 Teori... 8 Colon... 8 Kollagen... 9 Kollagen colitis og lymfocytær colitis... 10 Tenascin... 10 Fiksering... 10 Histokemisk analyseprincip ved farvning af kollagen... 11 Masson trichrom... 11 Picrosiriusrød... 11 Immunhistokemisk analyseprincip... 12 Benchmark Ultra... 12 Demaskering... 12 Blokering af endogen aktivitet... 13 Primært antistof... 13 Metodevalg og afgrænsning... 14 Projektopbygning... 15 Valg af primært antistof... 15 Valg af patient- og kontrolvæv... 15 Etiske overvejelser... 16 Valg af forsøgsopstilling... 16 Valg af resultatvurdering... 16 Fravalg... 17 Materialer og Metode... 17 Materialer... 17 Priser for special- og immunfarvning... 18 Sundhedsfarer ved special- og immunfarvning... 18 Metode... 19 Delprojekt 1: Fremstilling af multiblokke... 19 3

Delprojekt 2: Optimering af anti-tenascin... 19 Delprojekt 3: Farvning af patientprøver med anti-tenascin... 22 Delprojekt 4: Farvning af patientprøver med masson trichrom... 22 Delprojekt 5: Farvning af patientprøver med picrosiriusrød... 22 Delprojekt 6: Måling af basalmembranen... 23 Litteratursøgning... 23 Resultatvurdering... 24 Resultater... 27 Delprojekt 2: Optimering af anti-tenascin... 27 Delprojekt 6: Måling af basalmembranen... 30 Diskussion... 35 Delprojekt 1: Fremstilling af multiblok... 35 Delprojekt 2: Optimering af anti-tenascin... 36 Delprojekt 3-5: Farvning af patientmateriale... 38 Delprojekt 6: Måling af basalmembranen... 39 Konklusion... 40 Refleksion... 41 Referenceliste... 42 Bilagsliste... 44 Bilag 1:... 45 Bilag 2:... 47 Bilag 3:... 49 Bilag 4:... 52 Bilag 5:... 53 Bilag 6:... 54 Bilag 7:... 58 Bilag 8:... 59 Bilag 9:... 62 Bilag 10:... 65 4

Ordliste MC: Mikroskopisk Colitis MCi: Inkomplet form af mikroskopisk colitis LC: Lymfocytær Colitis LCi: Inkomplet form af lymfocytær colitis CC: Kollagen Colitis CCi: Inkomplet form af kollagen colitis KPA: Klinisk Patologi Afdeling/en: Klinisk Patologi Sygehus Lillebælt Vejle SLB Vejle: Sygehus Lillebælt Vejle IEL: Intraepitelial Lymfocytter SEC: Subepitelial kollagen NBF: 4 % Neutral Buffet Formaldehyd Artisan Link: Artisan TM Link for Special Stains, Dako Benchmark Ultra: Ventana Benchmark Ultra, Roche 5

Introduktion Baggrund På Klinisk Patologi (KPA) på Sygehus Lillebælt Vejle (SLB Vejle) anvendes HE-farvning på colonbiopsier mistænkt for mikroskopisk colitis (MC), for at diagnosticere patienten med en af undergrupperne af sygdommen, kollagen colitis (CC) eller lymfocytær colitis (LC). Da disse histologisk minder meget om hinanden og HE-farvning ikke altid er pålidelig til korrekt estimering af tykkelsen på subepitial kollagen (SEC) i basalmembranen, som er en indikator ved CC, anvendes der ofte også specialfarvning med Masson trichrom som en yderligere metode til diagnosticering. Denne metode er dog både dyr at anvende i rutinen og samtidig viser den heller ikke en lige så veldefineret og tydelig afgrænsning af SEC, som gør det nemt at differentiere mellem denne og de underliggende vævskomponenter i lamina propria. Dette projekt har til formål at undersøge om det er muligt ved hjælp af andre farvemetoder at opnå en større distinktion mellem disse vævskomponenter. Til dette inddrages yderligere farvemetoder til påvisning af basalmembranen, blandt andet immunhistokemisk farvning med anti-tenascin som optimeres til brug i dette projekt og specialfarvning med Picrosiriusrød, som et billigere alternativ til de to farvemetoder. Derudover vil det undersøges om disse farvemetoder kan anvendes til fund af CC ved LC diagnosticeret væv, da de som nævnt histologisk minder meget om hinanden og nyere forskning tyder på at CC og LC måske er to sider af samme sag, hvor der kan være tale om en progression fra CC til LC og omvendt, alt efter hvor fremskreden sygdommen er. Andre studier fokuserer på at der måske er yderligere en kategori af MC som går under betegnelsen Incomplete Microscopic Colitis (MCi), hvor der herunder ligeledes forefindes to undergrupper; Borderline Lymphocytic Colitis (LCi) og Borderline Collagenous Colitis (CCi). Disse betegneler anvendes når der er klare kliniske symptomer på MC, men som ikke opfylder kriterierne for at den til fulde kan betegnes enten som CC eller LC. Der vil derfor i forsøget også undersøges om der udover CC kan påvises undergruppen CCi. I Danmark er incidensen af MC, baseret på nationale patologidatabase, har været jævnt stigende de seneste 10 år og er nu på 25 pr. 100.000 indbyggere pr. år (CC 15 og LC 10 pr. 100.000 indbyggere pr. år.). Det er svarende til at der årligt diagnosticeres ca. 1.200 nye tilfælde af MC i Danmark. Stigningen i tilfælde kan blandt andet skyldes at der er kommet en øget fokus på diagnosen. CC blev første gang beskrevet i 1976 og LC i 1989. 6

Både CC og LC udtrykker sig som betændelse i slimhinden i colon, som forårsager ublodig, grødet til vandig diarré hos patienten. Derudover kan patienten opleve intermitterende mavesmerter og der kan forekomme vægttab. Som regel er almentilstanden god, men sygdommen kan være invaliderende for patienten, idet at det ikke er unormalt med vandige diarréer imellem 5-10 gange om dagen, ind imellem også natlige afføringer. Makroskopisk ses der ved begge sygdomme en normal colonslimhinden, mens der mikroskopisk ses karakteristiske histologiske forandringer. Det er derfor nødvendigt at udtage biopsier fra colonslimhinden for at give en korrekt diagnose. Incidensen af begge sygdomme stiger med alderen hvor hovedparten fremstår, ved begge køn, i 60-70 års alderen. Der ses dog en forskydning imellem kønnene, hvor 75% af de CC- og 65% af de LC diagnosticerede tilfælde forekommer hos den kvindelige del af befolkningen. Der er dog stadig uvis hvad denne kønsforskel skyldes. Det samme med ætiologien som også stadig er ukendt, men undersøgelser peger på at sygdommene måske er associeret med blandt andet miljømæssige påvirkninger som for eksempel rygning, kost og brugen af non-steoride antiinflammatorisk medicin (NSAID s). Derudover undersøges der om autoimmune sygdomme spiller en rolle når det kommer til udvikling af CC og LC. Det vil måske være muligt, hvis man fik præciseret den specifikke sygdom ved hver enkel patient, at konkludere noget om ætiologien og dermed kunne forbehandle sygdommene. (1,2,3,4,5,6). Problemformulering Hvorledes kan immunhistokemisk farvning på Benchmark Ultra med anti-tenascin på paraffinindstøbt væv optimeres? Hvordan vil farvningen på baggrund af denne protokol påvise fortykkelsen af basalmembranen, der er en indikator ved kollagen colitis, sammenlignet med picrosiriusrød og masson trichrom? Hvilken en af disse farvninger vil være bedst til påvisning af kollagen colitis tilfælde ved lymfocytær colitis diagnosticeret væv og hvorfor er denne at foretrække? 7

Ordforklaring: bedst Betyder i denne sammenhæng den farvning som påviser SEC på en så specifik og veldefineret måde, enten kvalitativ eller kvantitativt, at differentieringen mellem denne og øvrige vævskomponenter i lamina propria, muliggøre en korrekt diagnose af CC. Teori I dette afsnit vil der beskrives opbygningen af colon, herunder basalmembranen, lamina propria, lamina musularis og tela submucosa. Derudover beskrives også kollagens opbygning og funktion. Der vil også beskrives hvordan CC og LC manifesterer sig i basalmembranen og hvorledes disse to sygdomme minder om hinanden. Endvidere vil emnerne tenascin og fiksering blive behandlet. Til sidst i dette afsnit vil analyseprincipperne for special- og immunfarvning anvendt i forsøget fremstilles. Colon Colon udgør den sidste del af fordøjelsessystemet. Colons primære funktion er at reabsorbere vand og uorganiske salte og være et depot for fæces. I colon forefindes der et stort antal af bakterier, som blandet andet syntetiserer vitaminer og fordøjer cellulose. Den er opbygget af en tyktarmsslimhinde, tunica mucosa hvor der forefindes tubulære kirtler i form af lieberkühnsje krypter og epitel hvor der forefindes bægerceller. Epitelet adskilles fra det underliggende bindevæv i lamina propria, af en ekstracellulært matrix også kaldet basalmembranen. Øverst i dette lag nær epitellet er basallamina, som blandt andet virker som et passivt molekylært filter, hvor der både tilbageholdes og videresendes celler. Nederst finder man de kollagene fibre. Under her finder man lamina propria som er et cellerigt, retikulært bindevæv og som spiller en stor rolle immunforsvaret idet mange immunceller er lokaliseret her og dermed gør den til et centralt sted for immunrespons at forekomme. Den fungerer yderligere som en barriere som beskytter de indre vævsdele mod udefrakommende mikroorganismer. Lamina muscularis er et tyndt lag under lamina propria som består af glat muskulatur. Under denne forefindes tela submucosa som består af løst bindevæv (fig. 1) (6,7). 8

Kollagen Kollagene fibre er de hyppigst forekommende bindevævsfibre. De er opbygget af lineære, parallelt forløbende proteinfilamenter. Disse er sammensat af tynde fibriller, der yderligere er sammensat af parallelle mikrofibriller, der er opbygget af mindre enheder som er betegnet tropokollagen. Tropokollagen er stive, aflange molekyler som er ca. 300 nm lange og 1,5 nm tykke. Hvert enkelt tropokollagen består af 3 polypeptidkæder, betegnet alfa-kæder, der er snoet omkring hinanden i en trippelspiral, hvorved tropokollagenmolekylet får et reblignende udseende. De kollagene fibre er stabiliseret ved upolære-, hydrogen- og kovalente bindinger, samt positiv/negativ tiltrækning mellem tropokollagen molekylerne. Kollagen har ikke en særlig stærk farvebindingsevne, da dette protein ikke kan indgå i hydrofob stabilisering. Så en farvebinding til kollagen skal først og fremmest skyldes hydrogen- og upolære bindinger (6,8). 9

Kollagen colitis og lymfocytær colitis Ved CC ses der i epitelet øget antal immunceller, herunder T-lymfocytter som forefindes i stor mænge i lamina propria, hvor de så migrerer ud i epitelet. Immunfarvning med anti-cd3 går ind og påviser T-lymfocytterne som en histologisk indikator for LC, hvor der normalt forekommer <10 intraepiteliale lymfocytter (IEL) pr. 100 overfladeepitel celler, ses der ved LC IEL på >20 IEL pr. 100 overfladeepitelceller. Der ses ingen fortykkelse af basalmembranen. Ved CC ses der derimod en fortykkelse af SEC på >10µm som kan overlappe kapillærer, erytrocytter og inflammatoriske celler. Fortykkelsen ses tydeligst mellem de lieberkühnske krypter i vævet. Normalt ses kollagen >5µm tykt. Der kan forekomme skader på overfladeepitelet og også her kan der forekomme forøgelse af EIL, <20 EIL pr. 100 overfladeepitelceller (1,5,10,11). Tenascin Tenascin er disulfibundet ekstracellulære matrix proteiner der er opbygget af to trimere segmenter og produceres i blandet myofibroblaser. Ekspressionen af tenascin er associeret med udvikling og vækst, både normale og patologiske, hvorimod mængden hos raske voksne personer er begrænset. Den udtrykkes kortvarig, specielt i embryonale fibroblaster og ekstracellulær matrix, men forsvinder derefter, undtagen i visse epiteliale grænseflader, samt glat muskulatur og sener. Den visualiseres blandt andet med T2H5 og TN2 (12). Fiksering Når væv er udtaget fra patienten, skal det fikseres. Dette gøres for at forhindre nedbrydningsprocessen som ellers ville påvirke morfologien. Fikseringen standser de enzymatiske processer således af vævsstrukturen bibeholdes. Der er i forsøget anvendt et gelerende fiksativ, 4 % neutral buffer formaldehyd (NBF), da dette giver nær optimal morfologisk bevarelse, samtidig med at det bibeholder vævsbestanddelenes reaktive egenskaber. NFB fiksere proteinsidegrupper, ved at aldehyd bindes til to frie aminosyregrupper og danner methenbroer. Disse methenbroer medfører en ændring eller blokering for bindingen mellem antistof og epitop. Methebroerne er dog reversible og det er muligt at hydrolysere dem ved skylning i vand eller buffer. Dog kan der ved immunhistokemiske farvninger vise sig at påvirke antigener negativt ved blandt andet at ekstrahere antigener under fikseringen eller den efterfølgende præparation med klaring og indstøbning. Der anbefales derfor en standardiseret fikseringstid på mellem 24-48 timer. På den måde undgår man en for kort fikseringstid hvor vævet ikke er færdigfikseret og hvor der er en risiko for at epitoperne bliver alkoholfikserede i stedet for, 10

hvilket kan ændre på betingelserne for den immunhistokemiske påvisning. Ved for lang fiksering ses en tiltagende demaskering af epitoperne (12). Histokemisk analyseprincip ved farvning af kollagen Kollagen farvning sker altid ved lav ph, hvor kollagen kun har positive ladninger. Bindingsevnen af et farvestof til kollagen forøges jo flere negativt ladede grupper, upolære grupper og hydrogenbindende grupper denne besidder. Bindingen til kollagen består at svage bindingstyper. (13). Masson trichrom Denne farvning anvendes til at identificere og påvise bindevæv og muskler i vævsprøver ved hjælp af lysmikroskopi (14). Når der proteinsidegrupperne fikseres af NFB, vil forskellige proteiner danne netværk med de forskellige komponenter i vævet. Erytrocytternes protein vil producere et fintmasket net med små porer mellem proteinelementerne. Muskelcellerne vil danne en mere åben strutur med store porer, mens kollagen har en tættere struktur med flere porer. De mindre farvemolekyler, vil trænge ind i muskelceller og kollagen, men vil ikke reagere med erytrocytterne, da de ikke kan trænge igennem her. Når et større molekyle kan trænge igennem vævskomponenterne, vil det mindre farvemolekyle blive erstattet. Der anvendes anionfarvestoffer til farvning med Massons Trichrom, som skelner mellem kollagen og cytoplasma i vævet. De anionfarvestoffer som her anvendes er Bierbrich Scarlet-syrefuchsin. For at kunne opnå en ensformig og korrekt farvning af kollagen, anbefales det at man farver ved en ph på mellem 1,5-3,0 (8,14). I tabel 1 ses oversigten over farveresultat ved brug af massons trichrom, ud fra producentens anbefalinger (14). Resultat: Kerner Brunsort Cytoplasma Rødt Muskelfibre Røde Kollagen Blåt Tabel 1: Oversigt over vævskomponer og deres farvning med Massons Trichrom. Picrosiriusrød Siriusrød er et stærkt og stort anionfarvestof som farver kollagen ved at reagere via dets sulfonsyregrupper med de basiske grupper i kollagen molekylet. Picrinsyre farvestoffet er derimod 11

lille og let hydrofob. Samspillet mellem disse, kombineret med et metalkompleks er den grundlæggende mekaniske bag picrosiriusrød farvningen. Primært farves kerner og cytoplasma af metalkomplekset Weigert-Lillie s jernhæmatein, som er stabilt nok til at modstå farvestofferne i den sekundære farvning, som farver kollagen rødt og proteiner i muskulatur og erytrocytter gule. Farvningen forudsætter at farvemolekylet kan trænge igennem de kollagene fibre og hastigheden af dette afhænger af farvemolekylets størrelse, som bevirker at den er langsommer om at diffundere igennem vævet. I tabel 2 ses oversigt over farveresultatet af picrosiriusrød, ud fra afdelingens instruks (bilag 1). Hvis dette resultat ikke opnås kan det skyldes en række forskellige faktorer så som tid, temperatur, fiksering, tykkelsen af vævssnittene og ph (8,15). Resultat: Kerner Brune Retikulin Rødt Erytrocytter Gule Muskulatur Gul Kollagen Rødt Tabel 2: Oversigt over vævskomponenter og deres farvning med Picrosiriusrød (bilag 1) Immunhistokemisk analyseprincip Detektionssystemet anvendt i dette projekt er Optiview DAB fra Ventana, som er et indirekte biotin-fri system til detektering af blandt andet mus IgG. Denne metode anvendes på omkring 90 % af alle immunfarvningerne på KPA. Benchmark Ultra Udførelsen af den immunhistokemiske farvning foregår i dette projekt på Benchmark Ultra. Dette apparatur er fuldautomatisk og har plads til 30 glas, hvor der kan udføres flere forskellige farvninger på en gang. Apparaturet opvarmer og mikser reagenserne under et lag af olie for at forhindre udtørring af været, således at der opnås en ensartet farvning (16). Demaskering Heat-induced epitop retrieval (Hier) er en forbehandling som anvendes på formalinfikseret væv for at bryde de methenbroer der dannes ved fikseringen med NBF. Varmebehandlingen går også ind og fjerner de kompleksbundne og epitopmaskerende Ca 2+, så epitoperne demaskeres og gøres immunreaktive igen. HIER teknikken består af opvarmning af afparaffinerede og rehydrerede paraffinsnit i en passende buffer. I projektet anvendes Tris/EDTA buffer (CC1) (12). 12

Blokering af endogen aktivitet Enzymet endogen perioxidase forekommer i nogle celler i kroppen, derfor er det nødvendigt at blokere for disse, så der ikke skabes en uspecifik baggrundfarvning, hvilket kan resultere i et falskpositivt svar. Det gøres ved at præinkubere med hydrogenperoxid (H 2 O 2 ) inden tilsætningen af det primære antistof, som forhindrer svage uspecifikke bindinger mellem immunglobuliner og vævsproteiner via elektrostatisk og hydrofob interaktion, uden at påvirke de stærke antigen-antistof bindinger (12). Primært antistof Efter demaskering og forbehandling kan vævet inkuberes med det primære antistof, som i projektet er anti-tenascin. Antistoffet er monoklonalt og reagerer derfor kun med en epitop på antigenet. Inkubationen foregår ved en indirekte teknik med detektionssystemet Optiview DAB (figur 2). Antallet af Optiview HRP multimer molekylerne som binder til HQ haptenerne fordobles i denne proces, hvilket resulterer i øget farvnings intensitet uden samtidig at øge baggrundsfarvningen. Til sidst generer DAB kromogenet et klart signal, i form af udfældning af en brun farve i vævet, i samspil med HRP og H 2 O 2. For at forstærke den brune farve anvendes Optiview copper. For lettere at kunne iagtage reaktionen i vævet, i forhold til vævs- og cellemorfologien, farves der til sidst med en kernefarvning med hæmatoxylin (12,17). 13

Metodevalg og afgrænsning Dette projekt er baseret på både et kvantitativt og et kvalitativt grundlag. Der er anvendt måling af basalmembranen ud fra en opstillet afgrænsning (tabel 8), på baggrund af Cord, L.et.al. (1). Derudover en der opsat en score for farveintensiteten ved optimeringen af anti-tenascin og en score for hvorledes basalmembranen fremstår ved de tre målinger således en måling af denne er mulig. Alle tre farvninger sammenlignes med hinanden ved hver enkel patient og til sidst samlet, for at kunne vurdere hvilken en af dem, der er bedst til påvisning af basalmembranen og hvilken der vil være bedst til påvisning af CC ved LC diagnosticeret væv. I afsnittet her vil der beskrives de forskellige valg og fravalg der er projektets opbygning, herunder valg af antistof, valg af forsøgsopstilling, etiske overvejelser og valg af resultatvurdering. 14

Projektopbygning Projektet er opdelt i fem delprojekter. Delprojekt 1: Fokuseres der på fremstillingen af multiblokken anvendt til optimering af antitenascin og til farvning af patientmateriale. Der fremstilles tre ens multiblokke i alt til kontrolmateriale. Delprojekt 2: Her undersøges muligheden for at optimere anti-tenascin farvningen på Benchmark Ultra på kontrolmateriale og på CC diagnosticeret væv og hermed udarbejdelsen af en protokol for denne. Der opstilles et flowdiagram for udarbejdelsen af delprojektet, ud fra en opstillet score. Delprojekt 3: Der anvendes den endelig protokol for anti-tenascin farvning, opnået i delprojekt 2, på 30 patientprøver diagnosticeret med LC, fordelt på 15 objektglas. Delprojekt 4: Der foretages her det samme som foregående delprojekt 3, her farves dog i stedet med massons trichrom på Artisan Link. Delprojekt 5: Der farves ligeledes som i delprojekt 3, dog her håndfarvning med picrosiriusrød. Delprojekt 6: Her måles der på basalmembranen på alle vævsprøver og der afgives en score for hver enkel, for hvor tydelig basalmembranen fremstår. Valg af primært antistof Der er taget kontakt til forskellige producenter, for at forhøre sig om muligheden for at indkøbe antistoffet. Ved de fleste af producenterne der blev taget kontakt til, viste det sig at antistoffet ikke længere var i produktion. Der blev derfor taget kontakt til andre sygehuse i landet for at undersøge om antistoffet var en del af rutinen hos dem og hvis ja, hvilken producent der så her blev benyttet. Der kom tilbagemelding fra patologiafdelingen på Herlev Hospital og ud fra en korrespondance med afdelingen (bilag 2), blev det bestemt at benytte sig af samme producent Novusbio og samme antistof og lot. nummer (bilag 3). Valg af patient- og kontrolvæv Der blev udvalgt tonsil og appendix som kontrolmateriale til påvisning af tenascin på baggrund af NordiQC s anbefalinger (bilag 4) og på baggrund af K1 kontrol anvendt på afdelingen til immunfarvninger, som indeholder appendix, lever, nyre og tonsil. picrosiriusrød. Derudover blev der også medtaget colon som en kontrol, da den anvendes til masson trichrom. 15

Til optimering af anti-tenascin blev der anvendt patientmateriale som var diagnosticeret med CC for at sikre sig påvisning ved denne farvemetode. Til immunhistokemisk farvning og specialfarvning af patientmateriale til fund af CC, blev der anvendt LC diagnosticeret væv. Etiske overvejelser Der er anvendt vævmateriale i projektet fra patienter som er diagnosticeret med LC og CC og som dermed er i udredning for sygdommen. Dette projekt har dermed ingen betydning for patientens allerede fastlagte diagnose og projektet skal ses som en kvalitetssikring af den nuværende farvemetode med massons trichrom, derfor er det ikke nødvendigt at tage etiske hensyn. Der er valgt at blænde patienternes CPR-nummer og rekvisitionsnummer så de i stedet for fået et bogstav. De eneste patientdata der bibeholdes, udover diagnosen, er patienternes alder, køn og udtagelsessted for biopsierne. Der er ikke foretaget andre analyser af vævsprøverne udover undersøgelsen af tilstedeværelsen af CC ved LC diagnosticerede patienter. Valg af forsøgsopstilling Der vælges at der først skal optimeres på anti-tenascin farvningen. Dette gøres ud fra afdelingens standardprotokol for optimering af nye antistoffer (bilag 5). Der ændres på én parameter af gangen. Når der er opnået en tilfredsstillende farveintensitet, der muliggør en differentiering af bindevæv med det omkringliggende væv ud fra den opstillede score, anvendes denne protokol til videre brug i projektet. Efterfølgende farves patientprøverne med de tre farvemetoder. Valg af resultatvurdering Resultatvurdering af optimering af anti-tenascin foretages mikroskopisk og vurderes ud fra et scoreskema (tabel 7), som tager udgangspunkt i NordiQC s anbefalinger (bilag 4). Til resultatvurdering af CC fund ved LC væv, vurderes der ud fra måling af basalmembranen, på baggrund af en fastlagt grænse (tabel 8) om der kan påvises CC eller CCi, ved LC præparaterne. Ved resultatvurderingen mellem de tre farvninger anvendes der, udover måling af basalmembranen, også en score (tabel 9) for hvor tydelig basalmembranen fremstår i hver enkel patientprøve ved hver af de tre farvninger. Derudover tages pris og arbejdsmiljø i betragtning i den endelige vurdering af den optimale farvemetode til påvisning af CC ved LC præparater. 16

Fravalg Der er valgt ikke at lave en metodesammenligning mellem picrosiriusrød, massons trichrom og antitenascin på CC diagnosticeret væv, da der vælges at holde fokus på, om der kan findes fund af CC eller CCi ved LC diagnosticerede patienter, da det er lettere histologisk at skelne LC fra CC end omvendt. Materialer og Metode Materialer Kontrolvæv: Afdelingens K1 kontrol til immunfarvninger, indeholdende tonsil, nyre, lever, appendix og colon. Multiblok 1-3, indeholdende colon, appendix og tonsil. Vævssnit: Colonvæv indeholdende CC Colonvæv indeholdende LC Objektglas Anti-tenascin: Dako IHC glas Masson trichrom og picrosiriusrød: Superfrost+ glas Apparaturer Anti-tenascin: Benchmark Ultra Masson trichrom: Artisan Link Antistof Tenascin C antibody (T2H5) NBP1-42547 lot. nr. 3170252 Detektionskit på Benchmark Ultra Optiview DAB 17

Specialfarvning Masson trichrom Picrosiriusrød Se bilag 6 for komplet oversigt over materialer anvendt. Priser for special- og immunfarvning Sammendrag af priser for hver enkel farvning, baseret på priser fra producenterne på objektglas, kemikalier, reagenser mm. Se bilag 7 for komplet oversigt over priser og udregning. Farvning Anti-tenascin Masson trichrom Picrosiriusrød Pris i kr. pr. farvning 55,37 71,24 13,57 Tabel 3: Udregning af pris i kr. pr. farvning pr. objektglas ved hver af de tre farvemetoder. Sundhedsfarer ved special- og immunfarvning Der ses et uddrag af de forskellige sundhedsfarer der kan opstå ved håndtering af de enkelte farvemetoder i laboratoriet (tabel 4). Se bilag 6 for komplet oversigt over sundhedsfarer ved de tre farvemetoder. Anti-tenascin Massons Trichrom Picrosiriusrød Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. Ætsende irriterer luftvejene. Farlig ved indånding, hudkontakt og ved indtagelse. Irriterer øjne, åndedræt, hud. Mulighed for varig skade på helbred. Kan give allergi ved hudkontakt Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. Farlig ved indtagelse. Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. Ætsende irriterer luftvejene. Tabel 4: Uddrag af sundhedsfarer ved brug af anti-tenascin, massons trichrom og picrosiriusrød farvemetoderne Ætsende irriterer luftvejene. 18

Metode Herunder vil der beskrives de forskellige delprojekters opbygning og udførelse. Til dette inddrages både tabeller og illustrationer over blandt andet optimeringsprocessen, hvor der opstilles et flowdiagram hvor der ses de forskellige kørsler og hvilke parametre som blev udvalgt til videre anvendelse. Delprojekt 1: Fremstilling af multiblokke Prøvematerialet der anvendes i projektet, colon og appendix, er restmaterialer fra rutinepræparater. Vævene blev fikseret i minimum 24 timer til dagen efter, hvorefter de blev håndindstøbt i paraffin. Efterfølgende blev der mikrotomeret et snit af hvert vævsstykke, som blev farvet med en HEfarvning til mikroskopering, for at undersøge hvor i vævet der kunne udtages tre repræsentative udsnit til multiblokkende. De blev udtaget med en biopsinål. Vævsmaterialet fra tonsil blev udtaget, fra en allerede indstøbt blok forsynet af afdelingen, på samme fremgangsmåde, Da dette væv allerede er indstøbt, er det ikke muligt at vide hvor lang fikseringstid her har været. Alle tre udsnit fra colon, appendix og tonsil blev håndindstøbt på samme måde i multiblok 1-3, således at hver vævstype var repræsenteret i hver enkel kapsel. Delprojekt 2: Optimering af anti-tenascin Til optimering af anti-tenascin blev der anvendt i alt 30 objektglas, fordelt på kørsel 1-10, til udformning af den endelig protokol. Til repetitionsforsøget, kørsel 11, blev der anvendt tre objektglas. Ved kørslerne 1-10 blev anti-tenascin titreret i hånden, mens der ved repetitionen i kørsel 11 blev anvendt en dispenser for at standardisere denne kørsel, da samme fremgangsmåde skulle anvendes ved farvning af patientprøver. Alle glassene anvendt, bestod af ét kontrolsnit og ét vævssnit med CC (figur 3). Derudover blev der på nogle af glassene anvendt afdelingens rutinekontrol K1 til immunhistokemiske farvninger. 19

Der blev taget udgangspunkt i afdelingens standardprotokol for optimering af et nyt antistof (bilag 5). Der blev fokuseret på parametrene; fortynding, demaskeringstid, demaskeringsmiddel, amplifikation og inkubationstid, hvor der blev ændret én parameter af gangen. Efter hver kørsel blev farveintensiteten vurderet for hvert kontrolsnit, ud fra en til projektet opstillet scoreskema (tabel 7). Den parameter, i den givne kørsel, med den højeste score blev udvalgt til næste kørsel. Når der blev afgivet en ens score i den samme kørsel, blev der udvalgt den som var tidsmæssig mindst eller den hvor fortyndingsforholdet var størst. Til sidst mundede hele forsøget ud i en protokol (bilag 8), der blev vurderet egnet til sammenligning med specialfarvningerne. For bedre visualisering af forsøgsprocessen opstilles et flowdiagram (figur 4). 20

1:50 48 min. HIER CC1 32 min. Inkubation 1:200 48 min. HIER CC1 32 min. Inkubation 1:400 48 min. HIER CC1 32 min. Inkubation 1:50 40 min. HIER CC1 32 min. Inkubation 1:50 48 min. HIER CC1 32 min. Inkubation 1:50 56 min. HIER CC1 32 min.inkubation 1:50 Protease 1 32 min. inkubation 1:50 Protease3 + HIER CC1 32 min. inkubation 1:50 48 min. HIER CC1 32 min. inkubation 1:50 32 min. HIER CC2 32 min. inkubation 1:50 48 min. HIER CC1 32 min. inkubation 1:50 48 min. HIER CC1 32 min. inkubation Amplifikation 1:50 40 min. Hier CC1 32 min. inkubation Amplifikation 1:50 48 min. HIER CC1 32 min. inkubation Amplifikation 1:50 56 min. HIER CC1 32 min. inkubation Amplifikation 1:50 32 min. HIER CC! 32 min. inkubation Amplifikation 1:50 40 min. HIER CC1 32 min. inkubation Amplifikation 1:50 48 min. HIER CC1 32 min. inkubation Amplifikation 1:50 40 min. HIER CC1 28 min. inkubation Amplifikation 1:50 40 min. HIER CC1 32 min. inkubation Amplifikation 1:50 40 min. HIER CC1 36 min. inkubation Amplifikation 1:50 40 min. HIER CC1 32 min. inkubation Amplifikation 1:50 40 min. HIER CC1 32 min. inkubation 1:30 40 min. HIER CC1 32 min. inkubation 1:50 40 min. HIER CC1 32 min. inkubation 1:40 40 min. HIER CC! 32 min. inkubation 1:40 40 min. HIER CC1 52 min. inkubation 1:40 40 min. HIER CC1 72 min. inkubation 1:40 40 min. HIER CC1 92 min. inkubation 1:40 40 min. HIER CC1 52 min. inkubation 1:40 40 min. HIER CC1 52 min. inkubation 1:40 40 min. HIER CC1 52 min. inkubation Figur 4: Flowdiagram over optimeringsprocessen af anti-tenascin fra kørsel 1-11. De kasser som er markeret med orange repræsentere den protokol som er udvalgt til videre kørsel på baggrund af scoreskema tabel 7. 21

Delprojekt 3: Farvning af patientprøver med anti-tenascin Der anvendes protokollen til farvning af anti-tenascin opnået i delprojekt 2 (bilag 8). Inden kørsel på Benchmark Ultra blev alle anti-tenascin glassene med LC pos. vævsmateriale anbragt i varmeskab på 60 o C i 45 minutter, for at sikre sig en større adhæsion til glasset. Kontrol- og patientmateriale blev mikrotomeret ved 3µm efter afdelingens instruks for mikrotomering af specialfarvning (bilag 9). Delprojekt 4: Farvning af patientprøver med masson trichrom Farvning med masson trichrom, som ses i tabel 5, blev foretaget på Artisan Link efter producentens anbefalinger (14). Kontrol- og patientmateriale blev mikrotomeret ved 4µm efter afdelingens instruks for mikrotomering af specialfarvning (bilag 9). Inden farvningen blev vævssnittene anbragt i varmeskab på 60 o C i 30 minutter for at sikre sig større adhæsion til glasset. Trin Reagens Tid i minutter 1 Bouin s solution 12:00 2 Wash solution 0 3 Wash solution 6:00 4 Wash solution 6:00 5 Weigert s A 0 6 Weigert s B 6:00 7 Wash solution 6:00 8 Biebrich scarlet acid fuchsin 0 9 Wash 5:25 10 Phos/phos acid 12:50 11 Wash 0 12 Aniline Blue 14:00 13 Wash 0 14 Acetic Acid 2:60 Tabel 5: Protokol for massons trichrom farvning på Artisan Link Efter endt farvning, blev vævssnittene dehydreret i 96% - 99% ethanol og dækglas blev påsat i hånden med pertex. Til sidst blev kontrollerne mikroskoperet for at sikre sig et korrekt farveresultat. Delprojekt 5: Farvning af patientprøver med picrosiriusrød Til farvning med picrosiriusrød, blev der først fremstillet Weigert-Lillie jernhæmatoxylin og picrosiriusrød reagenset. Herefter blev patientprøverne håndfarvet på én gang, alt sammen efter afdelingens instruks (bilag 1). Selve udførelsen fremgår i tabel 6. Kontrol- og patientmateriale blev mikrotomeret ved 5µm efter afdelingens instruks for mikrotomering af specialfarvninger (bilag 9). 22

Trin Udførelse Bemærkninger/tid i min. 1 Afparaffinering dem vand Foregår på Tissue-Tek film og farvemaskine 2 Weigert-Lillie jernhæmatein 5:00 3 Rindende vand 5:00 4 Picrosiriusrød 5:00 5 Rindende vand 2 dyp 6 Dehydrering fra 96% - 99% ethanol 7 Montering af dækglas med pertex Tabel 6: Instruks for farvning med picrosiriusrød på KPA. Der er kun anvendt ét kontrolglas ved picrosiriusrød, da hele farvningen forgår på en gang i det samme coplingsglas. Delprojekt 6: Måling af basalmembranen Der blev forsøgt at finde et punkt i basalmembranen hvor den fremstod fortykket. Omkring dette punkt blev der målt tre steder, hvor gennemsnittet af disse målinger anvendes som udtryk for basalmembranens tykkelse dette sted. Der blev forsøgt så vidt muligt at måle basalmembranen ved hver patientprøve samme sted, i hver af de tre farvninger, for at give en mere præcis sammenligning. Det var dog kun muligt ved få af patientprøverne, da vævet ikke fremstod ensartet ved alle farvningerne og der var elementer som var forsvundet i processen. Hvilket kunne være sket under mikrotomeringen, hvor der blev mikrotomeret ved forskellige µm afhængig af hvilken farvning det givne vævsstykke skulle have, eller under farveprocessen. Der blev taget mikroskopiske billeder, ved hjælp af apparaturet Nano Zoomer, af hver enkel kontrol- og patientprøve, hvor man ved hjælp af måleværktøjet kunne måle i µm på basalmembranen. Der blev målt ved forstørrelse x80 ved alle patientprøver. Derudover blev der anvendt et scoreskema, opstillet til dette projekt (tabel 9), for at sige noget hvor tydelig basalmembranen fremstod ved hver enkel patientprøve, således at det var muligt at måle den, for at sammenligne de tre farvninger og deres anvendelighed. Litteratursøgning Der blev anvendt systematisk review, hvor videnskabelige artikler var med til at belyse emnerne og fungere som evidens. Det blev foretaget med blandt andet University College Syddanmarks biblioteks database, samt databaserne PubMed.US og PubMed.EU. Derudover blev der anvendt producenternes hjemmesider og datasheets og sekundær litteratur i form af faglitteratur. 23

De primære søgeord har bestået af; Collagenous Colitis, Lymphocytic Colitis, Microscopic Colitis, Tenascin antibody, T2H5, measuring, colon og subepitelial collagen. Litteratursøgningen blev påbegyndt medio september 2015 og afsluttede medio december 2015. Der er søgt på og anvendt artikler til beskrivelsen af CC og LC og deres sammenhæng tilbage til år 2003, for at medtage den nyeste information og forskning. Derudover er der anvendt litteratur som beskriver farveteorierne, som der går længere tilbage i tiden, men som medtages da det teoretiske grundlag stadig er gyldig. Resultatvurdering For optimeringen af anti-tenascin blev der efter hver kørsel afgivet en score for kontrollerne, ud fra et til projektet opstillet scoreskema (tabel 7) på baggrund af anbefalinger fra NordiQC. Der ses eksempler af score 0-2 i figur 5-10. Score 0 Poor 1 Borderline 2 Good 3 Optimal Definition Ingen reaktion. Svag/delvis reaktion i relevant bindevæv omkring muskelceller, bindevæv i karvæggen og bindevæv der indgår i opbygning af basalmembran, uspecifik farvning i materiale der ikke forventes positiv for tenascin. Kan ikke anvendes til diagnosticering. Acceptabel reaktion, Distinkt farvning i relevant bindevæv omkring muskelceller, bindevæv i karvæggen og bindevæv der indgår i opbygning af basalmembran. Evt. uspecifik farvning. Ingen uspecifik farvning i materiale der ikke forventes positiv for tenascin. Farvning er brugbar til diagnosticering. Yderligere optimering er mulig for bedre farvekvalitet. Perfekt eller næsten perfekt reaktion. Distinkt farvning i relevant bindevæv omkring muskelceller, bindevæv i karvæggen og bindevæv der indgår i opbygning af basalmembran. Ingen uspecifik farvning i materiale der ikke forventes positiv for tenascin. Betragtes som velegnet til diagnosticering. Tabel 7: Scoreskema til bedømmelse af kontrolsnit til optimering af anti-tenascin, udarbejdet på baggrund af NordiQC s anbefalinger. 24

25

Til vurdering af om der kan påvises CC eller CCi ved LC præparaterne, anvendes kriterier for påvisning af disse ved måling af basalmembranen (tabel 8). CCi Tilstedeværelsen af subepitelial kollagen 5-10µm CC Tilstedeværelsen af subepitelial kollagen >10µm Tabel 8: Kriterier for påvisning af CCi og CC ved måling af basalmembranen. Til vurdering af hvor tydelig basalmembranen fremstår, når det kommer til at kunne måle denne, opstilles der et scoreskema (tabel 9), hvor der ved hver patientprøve afgives en score fra 0 til 3. Score Definition 0 Ikke muligt at måle på basalmembranen. 1 Basalmembranen fremstår meget utydeligt og diffus. Det er svært at differentiere mellem denne og det omkringliggende væv i epitelet og lamina propria. 2 Basalmembranen fremstår utydelig og diffus. Der kan nogenlunde skelnes mellem denne og det omkringliggende væv i epitelet og lamina propria 3 Basalmembranen fremstår skarp og det er let at skelne mellem denne og det omkringliggende væv i epitelet og lamina propria. Tabel 9: Scoreskema for hvor tydelig basalmembranen fremstår mikroskopisk efter billedtagning med Nano Zoomer, således der kan foretages en måling. 26

Resultater Resultatafsnittet opdeles i delprojekterne 2 og 6, hvor der vil indgå begrundelsen af valg for optimering af anti-tenascin og score som blev afgivet ved hver kørsel, samt angivelse af middelværdien for måling af basalmembranen ved hver enkel patientprøve og herunder også en score for hvor tydelig den fremstår. Der vil anvendes beskrivende statistik til at anskueliggøre resultaterne opnået i dette projekt. Delprojekt 2: Optimering af anti-tenascin I tabel 10 ses optimeringsprocessen af anti-tenascin på Benchmark Ultra. Kørsel 1-10 indeholder de parametre der blev ændret på undervejs i processen, som inkluderede fortynding, demaskeringstid, demaskeringsmiddel, amplifikation og inkubationstid. Kørsel 11 bestod af repetition af den protokol som blev vurderet til at være bedst i kørsel 10. Ved hver kørsel ses begrundelsen for de valg som blev taget og som udgør delprojektets opbygning, samt den score der blev afgivet for kontrollerne ud fra scoreskema tabel 8. Der blev yderligere anvendt afdelingens kontrol ved immunfarvning ved nogle af kørslerne. I tabellen fremgår deres score med rødt. Kørsel Parameter Begrundelse af valg Score nr. 1 Fortynding Der vælges tre fortyndinger med en fordobling 1:50 1:200 1:400 hver gang. Dette for at give et stort spænd at afprøve på og for at spare på antistof. Der vil prøves at opnås over-/underfarvning til 1 0 0 indsnævring af hvilken fortynding der skal arbejdes videre med. Dette opnås ikke, der vælges alene den med bedste score til videre kørsel. 2 Demaskeringstid (dem.tid) Protokollen ændres med ét trin over/ ét trin under ved dem.tid. for at se om det fremkalder over-/underfarvning Det gør der ikke. Farveintensiteten fremstår ringere ved 40 min. og der ses ingen kraftigere farveintensitet ved 56 40 0 48 1 56 1 3 Demaskeringsmiddel (dem.mid.) min. så der fastholdes en dem.tid på 48 min. Vil se om ændring af dem.mid. kan producere en kraftigere farvereaktion, da denne stadig er meget svag. CC1 er den bedste af dem.mid. Den vælges til næste kørsel. P1 P3 CC1 CC2 1 0 2 1 0 2 27

4 Amplifikation (amp.) Der anvendes amp. for at se om det kan give en kraftigere farvereaktion, da den stadig er svag. Den kan den, dog i en lille grad. Den vælges til næste kørsel. 5 Dem.tid forsøg nr. 2 Der afprøves med samme dem.tid som ved kørsel 2, for at sammenligne de to kørsler med- /uden amp. Der ses ingen en lille smule kraftigere reaktion med amp. så den vælges til videre forsøg. 6 Dem.tid forsøg nr.3 Der undersøges om der efter tilføjelse af amp. kan spares tid ved demaskering. Tiden ændres med ét trin over/ét trin under. Der ses en lidt bedre farveintensitet ved 40 min. så den vælges til videre forsøg 7 Inkubationstid (ink.tid.) Der ændres på ink.tid med ét trin over/ét trin under. Der ses en ringere farveintensitet ved 28 min. og ingen kraftigere farveintensitet ved 36 min. så der fastholdes at bruge ink.tid på 32 min. til videre forsøg. 8 Amp. forsøg nr.2 Der er prøvet ændring af dem.tid, dem.mid. og ink.tid, og der fastslås at kørsel 7 er den mest optimale protokol indtil nu. Den er dog stadig svag, så der afprøves om tilførslen af amp. kan give en kraftigere farveintensitet. Der ses ingen forskel i farveintensiteten, så der vælges uden amp. til videre forsøg, for at spare penge. 9 Fortynding forsøg nr.2 Farveintensiteten vurderes til stadig at være for svag til at bruges som en endelig protokol og da der er ved at være en sparsom mængde antistof tilbage vælges der, efter konsultation med specialisterne i immunfarvning på afdelingen, at der skal afprøves en mindre fortynding. Der vælges fortyndinger som ligger tættere på producentens anbefalede minimums fortynding på 1:10. Det er ikke muligt at lave en fortynding på mindre end 1:30, da det der så vil mangle antistof til repetitionskørslen og til patientprøverne. Det vurderes at 1:30 og 1:50 har en ringere farveintensitet end 1:40, så den vælges til videre forsøg. 10 Ink.tid. forsøg nr.2 Farveintensiteten er stadig ikke helt optimal og da der kun er antistof tilbage til ét forsøg, vælges der, efter konsultation med specialisterne endnu en gang, at der ved sidste forsøg skal afprøves om en stor ændring på +20 min. ved hver trin, i ink.tiden kan skabe en kraftig nok farveintensitet så den kan anvendes som endelig protokol. Der ses ingen dog ingen betydelig ændring i farveintensitet mellem tiden 52 min., 72 min. og 92 min. Derfor vælges den mindste ink.tid på 52 min. Den sammenlignes med kørsel 9, hvor - amp + amp 1 2 40 48 56 2 2 2 32 40 48 1 2 2 28 32 36 1 2 2 - amp + amp 2 1 1:30 1:40 * 1:50 1 2 1 2 3 3 52 72 92 2 0 1 3 0 3 28

ink.tid var på 32 min. og det ses her at der opnås en kraftigere farveintensitet når man anvender ink.tid på 52 min. i stedet for, så den vælges til den endelig protokol. 11 Repetition Her køres der tre glas med den endelige protokol udvalgt ved kørsel 10, som ser således ud: Demaskeringsmiddel: HIER CC1 Demaskeringstid: 40 min. Inkubationstid: 52 min. Fortynding: 1:40 2 3 2 3 2 3 Det vurderes efter denne kørsel af de tre repetitionsglas er ensformig farvet, og at farveintensiteten også er ens, så denne protokol kan godkendes til brug til anti-tenascin farvning på patientprøver. Tabel 10: Opstilling af optimering af anti-tenascin med kørsel 1-11, forklaring og begrundelse af valg og score af hver enkel glas. * På grund af den sparsomme mængde antistof tilbage, var det her ikke muligt at gentage kørslen med fortyndingen 1:40. Tabel 11 viser protokollen opnået for anti-tenascin farvningen på Benchmark Ultra, ud fra optimeringsprocessen i delprojekt 2. Der er trin i processen som ikke fremgår i tabellen, disse inkludere afparaffinering og vaske/skylletrin, de er udeladt her for at give et bedre overblik. Den komplette protokol kan forefindes i (bilag 8). Trin Reagens Inkubationstid i minutter 20 CC1 40:00 43 Peroxidase inhibit -* 51 Primært antistof 52:00 62 HQ Linker 8:00 71 HRP Multimer 8:00 80 H2O2 + DAB 8:00 83 Copper 4:00 86-97 Kernefarvning 8:00 Tabel 11: Protokol for anti-tenascin på Benchmark Ultra med detektionskit Optiview DAB, hvor der er udeladt afparaffinering og vaske/skylletrin. *Der fremgår ingen tider her i protokollen. 29

Delprojekt 6: Måling af basalmembranen Tabel 12 viser hver enkel patient stillet op over for hver farvemetode, for middelværdien af måling af basalmembranen og score for basalmembranens fremtræden (tabel 9). Der er foretaget tre målinger af basalmembranen ved hver patientprøve og heraf er der fundet middelværdien som udtryk for tykkelsen på basalmembranen af den givne prøve (tabel 12). Oversigt over alle målingerne kan forefindes i bilag 10. Ved patient A var der i vævet ingen basalmembran, dermed har det heller ikke været muligt at måle på denne eller afgive en score. Ved 12 af patienterne (B,C,H,I,L,M,N,O,R,X og AA), har det ikke været muligt at måle basalmembranen ved anti-tenascin farvningen. Der har enten ikke været en fortykkelse af basalmembranen som bliver påvist, eller også er der gået noget galt under immunreaktionen. Dermed har det heller ikke været muligt at afgive en score for basalmembranens fremtræden. I tabellen er patienter, hvor der ikke har været muligt at måle, angivet med 0 under middelværdien og score. Patient Middelværdi af måling på basalmembran Score af måling af basalmembran (µm) Anti-tenascin Massons Picrosiriusrød Anti-tenascin Massons Picrosiriusrød Trichrom Trichrom A 0 0 0 0 0 0 B 0 2,1 2,9 0 3 3 C 0 2,5 6,0 0 2 3 D 3,6 5,4 6,0 3 3 3 E 2,8 4,0 4,5 1 2 2 F 1,7 1,6 2,7 2 2 2 G 2,1 3,6 1,3 1 1 2 H 0 2,6 1,9 0 1 1 I 0 3,0 2,1 0 2 2 J 3,4 4,3 3,9 1 1 2 K 2,2 4,2 1,9 1 1 2 L 0 3,0 3,5 0 2 2 M 0 1,7 2,0 0 1 1 N 0 1,7 3,0 0 1 2 O 0 2,5 5,2 0 1 2 P 6,3 3,6 4,8 1 2 2 Q 3,6 3,2 2,8 1 1 2 R 0 5,0 4,7 0 1 2 S 2 3,5 4,6 1 1 2 T 3,6 3,4 3,2 1 2 1 30

U 0 2,0 1,8 0 1 1 V 7,8 4,2 2,6 3 1 1 W 6,6 3,2 2,4 1 3 1 X 0 3,1 9,1 0 2 1 Y 7,3 5,2 4,6 1 1 2 Z 8,3 5,0 6,7 1 1 1 Æ 4,1 5,9 3,6 1 1 1 Ø 1,9 4,7 3,7 1 1 2 Å 6,2 4,8 3,8 2 1 2 AA 0 3,1 2,1 0 1 1 Tabel 12: Oversigt over hver patient ved hver farvning, hvor der ses middelværdien af tre målinger på basalmembranen og score af basalmembranens fremtræden. For at sammenfatte scoren ved hver farvemetode opstilles en tabel med samlet antal af score for hver farvemetode. Score Anti-tenascin Masson trichrom Picrosiriusrød 0 13 1 1 1 13 18 10 2 2 8 16 3 2 3 3 Tabel 13: Oversigt over samlet antal af hver score ved farvemetoderne. I tabel 12 ser man at målingerne varierer, når man måler den samme patientprøve ved hver sin farvemetode. Sammenligner man de enkelt farvninger overfor hinanden for hver patient, så ses det for eksempel at, ved patient X kan er der en forskel i målingen på 0 µm ved den laveste værdi ved anti-tenascin og 9,1 µm ved den højeste værdi ved picrosiriusrød. Ved patient V ses der en forskydning den anden vej, hvor anti-tenascin måler 7,8 µm og picrosiriusrød 2,6 µm. For lettere at synliggøre sammenligningen af måling ved de tre metoder, opstilles et søjlediagram med patienterne A-O (figur 11) og et med patienterne P-AA (figur 12). Den sorte streg er skæringspunktet, >5µm, for hvornår målingen påviser CCi. 31

32

Ligeledes ses der i søjlediagrammerne en forskel på målingerne mellem farvemetoderne, når man måler på væv fra den samme patient. Sammenlagt har vævsprøverne farvet med picrosiriusrød 12 gange været målt, til at være tykkere end ved de andre farvninger. Masson trichrom har 10 gange været målt tykkere og anti-tenascin syv gange. Ud fra søjlediagrammerne kan der også aflæses hvor mange af patientprøverne som blev målt til at være >5-9µm og dermed kan kategoriseres som værende CCi, udover også at være LC. Ved antitenascin var det seks gange og ved picrosiriusrød og masson trichrom var det fem gange. Der er ikke blevet påvist CC ved nogen af farvemetoderne.. For at undersøge hvor pålidelige disse målinger er, vurderes det hvilken en af farvemetoderne der er bedste til at påvise SEC på en så specifik og veldefineret måde, at differentieringen mellem denne og øvrige vævskomponenter i lamina propria muliggøre en korrekt måling. Dette gøres kun på de patientprøver hvor der er påvist en fortykkelse, idet der ikke kan laves en sammenligning ved de patientprøver hvor basalmembranen ikke har været visualiseret. I tabel 14 opstilles antallet af score for hver farvemetode hvor der påvises CCi. Score Anti-tenascin Masson trichrom Picrosiriusrød 1 4 4 2 2 1 0 1 3 1 1 3 Tabel 14: Oversigt over antal af score afgivet ved hver farvemetode hvor der er påvist CCi. Ud fra tabellen ser man at picrosiriusrød var den af farvemetoderne, som blev bedst bedømt, når det kom til hvor tydelig basalmembranen fremstod ved måling. Herefter kommer anti-tenascin og til sidst masson trichrom, som er en lille smule dårligere. Ved figur 13-15 kan man se på hvilken baggrund scoren blev afgivet. 33

Figur 13: Vurdering af måling af basalmembran ved picrosiriusrød. Score 3. Forstørrelse x40 Figur 14: Vurdering af måling på basalmembranen ved masson trichrom. Score 2. Forstørrelse x40. Figur 15: Vurdering af måling på basalmembran ved anti-tenascin farvning af colon. Score 1. Forstørrelse x40. 34

Diskussion I følgende afsnit vil der diskuteres de refleksioner som opstod i skabelsen af dette projekt. Der vil lægges vægt på de forskellige delprojekters begrænsninger og heraf hvilken indvirkning det har haft på resultaterne. Der vil diskuteres fremgangsmåderne og hvad der kunne have været gjort anderledes. Der vil inddrages illustrationer i fortolkningen af resultaterne. Delprojekt 1: Fremstilling af multiblok Det var vanskeligt at opnå en kraftig reaktion, for lettere visualisering, i kontrolmaterialet fremstillet til projektet, hvilket måske kan skyldes det faktum at der i kroppen ikke er store mængder af tenascin til stede (12). Det forklarer måske også hvorfor det var svært at anvende det forskellige kontrolmateriale, til at pejle sig ind på hvornår optimering af anti-tenascin var optimal. Derfor blev afdelingens kontroller taget i brug, for at holde op imod multiblokken, for at se om de viste samme resultat, for så var det måske ikke her fejlen skulle findes. Det var tydeligt, at der forekom en kraftigere reaktion ved afdelingens kontroller, især ved muskelvævet i appendix kunne man se en klar forskel mellem de to (figur 16 og 17). Det kan måske tilskrives biologiske forandringer, idet der er tale om andet vævsmateriale anvendt her. Der kunne derfor med fordel anvendes mere kontrolmateriale i multiblokken, for eksempel i form af colonvæv fra forskellige patientprøver, da visualiseringen mellem antistoffet og tenascin her var sværeste at se mikroskopisk. Derved kunne der også tages højde for de biologiske forskelle der måtte være. 35

Delprojekt 2 tog udgangspunkt i et estimat over hvor mange glas der ville blive anvendt i optimeringsprocessen, derfor blev det besluttet ikke at anvende afdelingens kontroller på alle indkørselsglassene, da man ellers ville tage en for stor mængde af de kontroller der anvendes i rutinen. Men de kunne måske have været en hjælp, hvis de havde været anvendt hele vejen igennem, da det var kontrollernes fremtræden som bestemte hvilke parametre der var anvendelige og hvilke der ikke var. Måske man så kunne have opnået et mere specifikt farveresultat, som ville resultere i en protokol som kunne kvalitetssikres til anvendelse. Delprojekt 2: Optimering af anti-tenascin Det var oplyst fra producenten side, at koncentrationen af antistoffet var ukendt, hvilket også gav nogle problemer, da den rette fortynding skulle opnås (bilag 3). Det var ikke muligt at skabe en over- eller underfarvning på præparaterne, hvilket kunne have været med til at indsnævre rationen for, hvornår man opnåede den fortynding som ville producere det bedste resultat til påvisning af basalmembranen. Producentens anbefalinger lå mellem 1:10-1:500, men det var ikke muligt med den mængde antistof der blev udleveret, at komme ned i så lav en fortynding, så det er ikke til at sige, om man der ville have kunnet opnå den optimale fortynding. Der blev anvendt fortynding 1:30 som det laveste i projektet, men mod alt forventning, som sagde at en lavere fortynding ville give en kraftigere reaktion, så var den dårligere visuelt end 1:40 og 1:50. Det kan måske skyldes at titreringen, som blev udført i hånden, ikke have været helt god nok og at man måske ikke var kommet helt ned under olien, som beskytter vævet fra udtørring. Eller også var der måske gået noget galt under fremstillingen af fortyndingerne. På grund af den mængde antistof som var tilgængelig i sidste del af delprojektet, så var det ikke muligt at gentage forsøget med fortyndingerne, hvilket havde været hensigtsmæssig ikke kun her, men også i forsøget med at øge inkubationstiden. Her blev der observeret at tiden 52 min. var bedre end tiden 92 min. i kontrollerne fra multiblokken. Der havde man forventet at farvningen ville blive kraftigere, når antistoffet fik længere tid til at binde sig til antigenet. Ved tiden 72 min. var der slet ikke sket en reaktion. Ved K1 kontrollerne, var der heller ikke her opnået en reaktion i tiden 72 min, hvilket må tale for en fejl i fremstillingen af fortyndingen, hvorimod de to andre tider begge var optimale og blev vurderet til en score 3.. 36

På trods af optimeringsprocessen fejl og mangler, blev det valgt at protokollen med fortynding 1:40, demaskeringstiden 40 min. og inkubationstiden 52 min. kunne godkendes til brug ved patientprøverne. Denne protokol er dog langt fra optimal og kunne også kun opnå en score på 2. På grund af faktoren med hensyn til den antistofmængde som var til rådighed, var det ikke muligt at arbejde videre med optimeringen og afprøve flere parametre igen. De fejl som opstod under processen taler også for, at der skal optimeres yderligere på anti-tenascin, for at kunne anvende den i rutinen. En yderligere fejl i optimeringsprocessen var vurderingen af kontroller for hver kørsel, for at vurdere hvilke en af de ændrede parametre der skulle anvendes videre i optimeringsprocessen. Disse kontroller blev vurderet som en helhed og ikke som hvert væv for sig. Så i stedet for at sammenligne tonsil i den nuværende kørsel, med tonsil i den foregående kørsel, så valgte man at vurdere dem samlet, så hvis der blev observeret en svag reaktion for eksempel i colon, så kunne den stadigvæk godt få en god score, hvis den samtidig havde en kraftig reaktion i tonsil. Det kan måske også forklare hvorfor der ikke blev opnået et optimalt resultat i optimeringen. Hvis man måske havde sammenlignet hvert væv i hver kørsel med sig, så havde man måske opdaget hvis farven for eksempel ved tonsil pludseligt ændrede sig fra den ene kørsel til den anden, hvilket måske kunne have tydet på en fejl i farveprocessen. Det ville der ikke blive taget notits af her, for kontrollernes helhedsvurdering ville måske påvise at farvningen i colon var blevet kraftigere, så selvom farvningen i tonsil ikke fremstod så klart længere, så ville den protokol blive anvendt til næste kørsel. Så man havde måske allerede et dårligt udgangspunkt tidlig i optimeringsprocessen og det ville måske forklare hvorfor der aldrig blev opnået en optimal reaktion i de tre kontrolvæv. Andre ting som der kunne have påvirket farveresultatet kunne være at objektglassene ikke lå korrekt på varmepladen, eller der sad en boble i dispenseren, eller vævenes placering på objektglassene lå forkert. Oven i det skal der også tages højde for daglige variationer. Alle disse faktorer ville give en forkert antistofmængde på vævssnittene, hvilket vanskeliggør en korrekt vurdering af farveintensiteten. Idet at man ved, at dette anti-stof har været optimeret til anvendelse på en anden patologisk afdeling (bilag 3), taler det for at en optimering er mulig og at det ikke er antistoffet i sig selv der er noget galt med. Videnskabelige studier beretter også om, hvordan antistoffer rettet mod tenascin, udtrykker en tykkere basalmembran, end ved specialfarvninger. Salas, A. et al. (18) anvendte specialfarvninger, heriblandt masson trichrom, og holdte dem op imod anti-tenascin klon TN2, med 37

en fortynding 1:50 og visualisering med Envision+ system fra Dako. Her blev det også bemærket at ekspressionen af basalmembranen var højere ved anvendelse af anti-tenascin end ved masson trichrom. Ligeledes anbefaler Münch, A.et.al. at der anvendes immunfarvning rettet mod tenascin, når der opstår usikkerhed om der påvises fortykkelse eller ej (19). Delprojekt 3-5: Farvning af patientmateriale Et af de fravalg der blev foretaget i projektet, var at lave en metodesammenligning af alle farvemetoderne på CC væv. Der kunne det måske have været en fordel først at gøre dette og så derefter anvende farvemetoderne på LC væv. På den måde ville man kunne opstille et forsøg, hvor man for eksempel havde 15 patientprøver som var diagnosticeret med CC og 15 som ikke var og så undersøge hvor mange de hver især påviste som værende CC. Herudfra ville man så kunne sige noget om deres anvendelighed, samtidig med at man ville kunne se om der var en korrelation mellem farvemetoderne. En fejl der opstod under de her tre delprojekter og som først rigtig viste sig sidst i projektet, var håndteringen af dækglas ved hver af farvningerne. De blev alle foretaget i hånden og dermed skulle menneskelige fejl også tages i betragtning. Der skal også tages forbehold for fejl ved Tissue-Tek film og farvemaskine, som anvendes på afdelingen til montering af film ved nogle af farvningerne, men her er proceduren mere systematisk i det at det foregår på et apparatur. Monteringen af dækglas ved masson trichrom, picrosiriusrød og anti-tenascin blev udført under forskellige forhold blandt af forskellige personer i gruppen og under tidspres. Alle vævssnittene blev godkendt mikroskopisk efter farvning, men der blev ikke observeret hvordan pertex og pålægning af dækglasset påvirkede vævet visuelt, det blev først bemærket da der skulle foretages målinger af basalmembranen og den ved flere af vævene fremstod utydelig og diffus. Der var anvendt for meget pertex ved nogle af glassene og dermed havde det både lagt sig som et tykt lag på vævet, men også på selve glasset. Det var muligt ved nogle af glassene, at fjerne lidt af pertexen som sad på selve glasset. Fordi fejlen blev opdaget så sent i forløbet, så var der ikke tid til at lægge nye dækglas på, hvilket måske ville have forbedret nogle af de vævssnit hvor vævet fremstod utydeligt. En anden ting som måske kunne forklare hvorfor vævene fremstod udtydeligt, kunne måske havde noget at gøre med mikrotomeringen af vævene. Hvis man er kommet til at mikrotomere ved en forkert µm i forhold til forskrifterne, for eksempel ved et højere niveau, kunne det måske resultere i at vævene fremstod utydelige, da farvningstiden så havde været for kort, da den er udstukket til en bestemt µm. 38

Til vurderingen af hvilken farvemetode der er bedst, tages arbejdsmiljø og pris også med i betragtningen. Ved udførelsen af de tre farvemetoder er personalet i kontakt med sundhedsskadelige kemikalier og reagenser. Dog kan man ved anti-tenascin helt undgå dette, hvis man vælger at foretage dehydreringen og pålægning af film på Tissue-Tek film og farvemaskinen, i stedet for at udføre de ting i hånden. Ved masson trichrom og picrosiriusrød undgår man ikke at skulle håndtere arbejdet i et kemisk arbejdsmiljø. Kigger man på hvor meget én farvning koster af udføre, så er masson trichrom fem gange så dyr at anvende i forhold til picrosiriusrød. Delprojekt 6: Måling af basalmembranen Det har kun været muligt at påvise basalmembranen med anti-tenascin, ved 17 af patientprøverne, enten fordi der ingen fortykkelse er, eller fordi noget er gået galt under immunreaktionen. Der er ingen af farvemetoderne som har været i stand til at påvise CC når man anvender gennemsnittet for tre målinger ved hver patientprøve. Det har i stedet været muligt at påvise undergruppen CCi. Anti-tenascin var her i stand til at måle CCi ved seks patienter og picrosiriusrød og masson trichrom ved fem patienter. Der er kun én af patienterne, patient Z (figur 12), hvor der blev målt en fortykkelse >5-9µm ved alle tre farvninger. Ellers havde anti-tenascin og masson trichrom én patient tilfælles og det samme med masson trichrom og picrosiriusrød. Denne forskel i hvilken patienter hvis måling påviser CCi eller ej, kan have en betydning for patientens diagnose, alt efter hvilke farvemetode der anvendes til påvisning af basalmembranen. Når der undersøges på præparater der er diagnosticeret med LC, forventer man ikke at nogen af dem også er positive for CC, med mindre man som i projektet arbejder ud fra den antagelse at LC og CC kan være to sider af samme sag og at der findes undergrupper af sygdommene. Derfor er det også vanskeligt at medtage anti-tenascin ved en metodesammenligning, ved måling af basalmembranen på LC væv. Her vil den altid fremstå som en ringere metode, da anti-tenascin binder sig til tenascin i bindevævet og udtrykkes størst ved vækst i vævet ved ikke raske personer. Så hvis der ikke er tenascin tilstede, vil man ikke kunne påvise basalmembranen. Hvorimod basalmembranen ved masson trichrom og picrosiriusrød altid vil blive visualiseret ved farvning, da de går ind og farver de kollagene fibre. Så selvom man i tabel 12 kan se at anti-tenascin ikke har været i stand til at påvise basalmembranen ved næsten halvdelen af patienterne og at der derfor heller ikke er nogen målinger, så kan man ikke nødvendigvis derudfra konkludere, at den er en ringere farvemetode til påvisning af CC end specialfarvningerne. Det betyder egentlig bare at 39

specialfarvningerne altid kan påvise basalmembranen uanset forandringer i vævet og at det derfor er muligt at anvende dem til påvisning og måling på LC væv. Hvis man endelig skal konkludere noget om anti-tenascins anvendelighed bliver man nødt til, i dette projekt at tage højde for det faktum, at immunreaktionen aldrig blev optimal og at de fejl som blev udført undervejs i processen kan have en indvirkning på dette. Derfor skal sammenligning mellem farvemetoderne måske også kun undersøgelse mellem picrosiriusrød og masson trichrom, da deres farvning blev vurderet til at være udført korrekt, ud fra resultatet af farvning af de forskellige vævskomponenter. For at undgå menneskelig fejl og spare tid ved måling af basalmembranen, kunne der måske i stedet for undersøges om anvendelsen af et computerstyret program, kunne give en mere præcis vurdering af basalmembranens tykkelse og dermed kunne sikre en korrekt diagnose af CC eller CCi (11). Omvendt kan der også diskuteres om måling af basalmembranen er en anvendelig metode, da det kan være svært at definere en nedre grænse for hvornår man kan sige der påvises CC. I dette projekt er der anvendt en nedre grænse på 5µm hvor der herefter kan påvises CCi, men i andre undersøgelser er den nedre grænse sat til 3µm og 7µm (5 + 20). Der er dog enighed om at for at påvise CC, så skal der ses tykkelse af basalmembranen på >10µm og den skal fremstå irregulær og dermed også kunne overlappe kapillærer, erytrocytter og inflammatoriske celler (19 + 20). Konklusion Anti-tenascin kan optimeres til immunhistokemisk farvning på Benchmark Ultra, når udgangspunktet er producentens anbefalinger for fortynding og afdelingens instruks for optimering af et nyt antistof. Protokollen for anti-tenascin opnået i dette projekt, som siger fortynding 1:40, demaskering med CC1 HIER, demaskeringstid 40 min. og inkubationstid 52 min., gav en kraftigere immunreaktion end udgangspunktet, som sagde fortynding 1:50, demaskering CC1 HIER, demaskeringstid 48 min. og inkubationstid 32 min. Resultatet af optimeringsprocessen kan dog ikke anvendes i en analysesammenhæng, til korrekt angivelse af tenascin niveauet i patientprøver, da en fejlfri optimering aldrig blev opnået og dermed kan protokollen ikke kvalitetssikres til brug. Alle tre farvemetoder var i stand til at påvise en fortykkelse af basalmembranen, når kriteriet for hvordan basalmembranen fremstår i normalt væv var <5µm. Alle tre farvemetoder kunne påvise CCi, undergruppen af CC, hvor der ses en fortykkelse på basalmembranen på mellem 5-9µm. Ingen af farvemetoderne kunne påvise CC som kræver en fortykkelse af basalmembranen på >10µm. 40

Picrosiriusrød var den farvemetode som tydeligst påviste basalmembranen, så der kunne differentieres mellem denne og de omkringliggende vævskomponenter for en korrekt måling. Idet at protokollen for anti-tenascin ikke kunne opnå en score på mere end 2, samtidig med at der sås tvivl om dens anvendelighed, idet at den ikke kan kvalitetssikres, foretages sammenligning mellem farvemetoder kun mellem specialfarvningerne. På baggrund af dette projekt udvælges picrosiriusrød til at være den farvemetode som er bedst til påvisning af CC ved LC diagnosticeret væv. Det var den af farvemetoderne som tydeligst påviste basalmembranen, så der kunne differentieres mellem SEC og vævskomponenterne i lamina propria, til en korrekt vurdering af basalmembranens tykkelse. Derudover er den også den billigste metode til anvendelse, den er cirka fem gange så billig som masson trichrom. Samtidig er farvemetoden i brug i rutinen på afdelingen og det vil dermed ikke medføre en ændring i arbejdsgangen, da der ikke skal implementeres en ny metode. I forhold til arbejdsmiljøet, så er picrosiriusrød ikke mere sundhedsskadeligt, end den nuværende metode masson trichrom. Der anbefales at der foretages yderligere optimering af anti-tenascin, hvis den skal anvendes til påvisning af CC og til metodesammenligning med specialfarvningerne. Refleksion Hvis man havde haft muligheden for at have arbejdet videre med optimeringen, hvis der havde været en større mængde antistof til rådighed, så ville man måske have opnået en anvendelig protokol til anvendelse på KPA SLB Vejle til påvisning af CC. Det kunne være spændende at afprøve nogle af parametre på ny, for at se om ikke en lavere fortynding og højere inkubationstid, kunne fremtvinge en kraftigere immunreaktion. Ellers kunne det have været interessant at afprøve en hel anden klon af anti-tenascin, da dette præcise antistof i projektet ikke længere kan købes ved producenten (bilag 3). Det ville også have været interessant, at have afprøvet picrosiriusrød og anti-tenascin på forskellige patientprøver der var diagnosticeret med CC, for at se hvordan de ville påvise fortykkelse af basalmembranen i forhold til masson trichrom. 41

Referenceliste 1. Langner, Cord.et al. (2015) Histology of microscopic colitis review with a practical approach for pathologists, Histopathology Vol.66, Issue 5, 613-626. Lokaliseret: oktober 2015. Tilgængelig på: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/his.12592/abstract;jsessionid=9ec9b3fa02be0 C9B2AF11824643173B4.f02t02?userIsAuthenticated=false&deniedAccessCustomisedMess age= 2. Koskela, R.M.et.al. (2004) Clinical characteristics of collagenous and lymphocytic colitis, Scandinavian Journal of Gastroenterology Vol.39, Issue 9. Lokaliseret: oktober 2015. Tilgængelig på: http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00365520410006468 3. Sonneberg, Amnon.et.al. (2013) Lymphocytic and Collegenous Colitis: Epidemiologic Differences and Similarities, Digestive Diseases and Sciences Vol.58, Issue 10, 2970-2975. Lokaliseret: Oktober 2015. Tilgængelig på: http://link.springer.com.ezson.statsbiblioteket.dk:2048/article/10.1007%2fs10620-013-2718-6 4. Vigren, L.et al. (2012) Are collegenous and lymphocytic colitis different aspects of the same disease?, Scandinavian Journal of Gastroenterology Vol. 47, Issue 12, 1448-1453. Lokaliseret: Oktober 2015. Tilgængelig på: http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.3109/00365521.2012.729085 5. Münch, Andreas.et.al. (2015) Perspectives in clinical gastroenterology and hepatology, Clinical Gastroenterology and Hepatology, 2015;13:228-236. Lokaliseret: oktober 2015. 6. Munck, L. (2015) Mikroskopisk kolitis er en hyppig årsag til diarré, Ugeskrift for læger, Vol.4, 366-370. Lokaliseret september 2015. 7. Geneser, F. (2010) Histologi på molekylærbiologisk grundlag. Munksgaard Danmark, 1.udg. 9.oplag. 8. Sand, O. et al. (2004) Fysiologi - en grundbog, Munksgaard Danmark, 1. udg. 1. oplag, København. 9. Prentø, H. (1998) Vævsfarvning og farvemekanismer, Kompendium I kemiske og biokemiske analyseprincipper, bioanalytikeruddannelsen, København. 10. Sands, E.B.et al. (2004) From symptom to diagnosis: Clinical distinctions among various forms of intestinal inflammation, Gastroenterology (2004) 126:1518-1532. Lokaliseret november 2015 på: http://www.gastrojournal.org/article/s0016-5085(04)00461-5/abstract 11. Malekian, V.et.al. (2012) Computer aided measurement of sub-epithelial collagen band in colon biopsies for collagenous colitis diagnosis, Micron (2013), Vol.42, 59-67. 42

Lokaliseret: November 2015. Tilgængelig på: http://www.sciencedirect.com.ezson.statsbiblioteket.dk:2048/science/article/pii/s096843281200248x 12. Vyberg, M. (2007) Anvendt immunhistokemi, 7.udg. PH Metropol, København. 13. Prentø, P. (2004) Biologisk farvning. 14. Dako Massons trichrom staining kit, Artisan, Lokaliseret: November 2015. Tilgængelig på: http://www.dako.com/dk/ar54/p235642/prod_products.htm 15. Polysciences, Inc Technical datasheet 837: Picrosirius red stain kit, Lokaliseret: December 2015. Tilgængelig på: http://medicine.emory.edu/documents/mimcore/polysciences-picrosirius-red-kit.pdf 16. Roche Ventana Benchmark Ultra Lokaliseret: oktober 2015. Tilgængelig på: http://www.ventana.com/benchmarkultra 17. Ventana Medical Systems, Inc. Optiview Detection Chemistry, Lokaliseret: November 2015. Tilgængelig på: http://www.ventana.com/documents/optiview_f&b_brochure.pdf 18. Salas, A.et.al (2003) Subepithelial myofibroblasts and tenascin expression in microscopic colitis, Histopathology Vol 43, Issue 1. Lokaliseret: December 2015. Tilgængelig på: http://onlinelibrary.wiley.com.ez-son.statsbiblioteket.dk:2048/doi/10.1046/j.1365-2559.2003.01650.x/full 19. Münch, A.et.al. (2012) Microscopic colitis: Current status, present and future challenges statements of the European Microscopic Colitis Group, Journal of Crohn s and Colitis (2012) 6, 932-945. 20. Magro, F.et.al (2013) European consensus on the histopathology of inflammatory bowel disease, Journal of Crohn s and Colitis (2013) 7, 827-851 43

Bilagsliste 1) Instruks for specialfarvning med picrosiriusrød på KPA SLB Vejle 2) Mailkorrespondance med patologiafdelingen på Herlev Hospital mht. anti-tenascin T2H5 3) Datasheet over Tenascin C Antibody (T2H5) NBP1-42547 anvendt i projektet 4) NordiQC s anbefalinger for kontrolvæv ved tenascin påvisning 5) KPA SLB Vejles standardprotokol for optimering af nye antistoffer 6) Materialer anvendt i projektet 7) Oversigt over priser for picrosiriusrød, masson trichrom og anti-tenascin. 8) Protokol for immunhistokemisk farvning med anti-tenascin på Benchmark Ultra opnået i delprojekt 2. 9) Instruks for mikrotomering af kontrolvæv til special- og immunfarvning på KPA SLB Vejle. 10) Oversigt over målinger af basalmembranen for anti-tenascin, masson trichrom og picrosiriusrød. 44

Bilag 1: Instruks for specialfarvning med picrosiriusrød på KPA SLB Vejle PIKROSIRIUSRØD (SI) Dokument id 411333 Senest udskrevet den 09-10-2015 Udskrevet af Side 1/2 Vejle Klin.patologi Affald Bemærkninger 1 Afparaffinering dem.vand 2 Weigert-Lillie s jernhæmatein (F) 5 min. H-sug Brug DYMOmærket glas. Smides ud fredag. 3 Rindende vand 5 min. 4 Pikrosiriusrød 5 min. Pikro I skab under farvemaskinen Brug DYMOmærket glas 5 Rindende vand 2 dyp 6 96%-99% ethanol alk 7 Pertex Weigert-Lillie s jernhæmatein: Stamopløsning A.. 60 ml (står i skab under farvemaskinen) Stamopløsning B.. 20 ml blandes og filtreres ned i dymo-mærket Hellendahl glas skriv dato på glasset Resultat: Kerner Brune Kollagen Rødt Retikulin Rødt Erytrocytter gule Muskulatur gul Anvendelse: Differntialfarvning af bindevæv især skelnen mellem muskulatur og kollagen. Klassifikation af mesenkymale tumorer. 45

Til bedømmelse af fibrosegraden (fibrose = bindevævsnydannelse) f.eks. ved levercirrose eller opheling efter bindevævssygdomme i hud. Til forskel fra pikrofuchsin farver pikrosirius også retikulære fibre. Øvrige opløsninger: Weigert-Lillie s jernhæmatein: Bland: 3 dele A + 1 del B. Blandingen skal blive dybsort. Filtreres A: FeCl 3,6 H 2 O 7,5 g FeSO 4, 7 H 2 O. 13,5 g Dem.vand.. 894 ml Konc.saltsyre.. 6 ml B: Hæmatoxylin.. 10 g etiket nr.3 99% ethanol. 1000 ml Opløses tildækket på omrører ved lav temparatur Pikrosiriusrød: Direct Red 80 (Siriusrød). 0,8g Siriusrød hældes via en pulvertragt direkte i flasken. Oveni hældes: Mættet vandig pikrinsyre. 1 flaske (1 liter) Husk omrystning! Må IKKE filtreres. 46

Bilag 2: Mailkorrespondance med patologiafdelingen Herlev Hospital mht. anti-tenascin T2H2 - Er vores henvendelse til patologiafdelingen på Herlev Hospital Er tilbagemelding fra patologiafdelingen Herlev Hospital - Hej Christina. Tusinde tak for dit respons, som sagt er vi en gruppe der ønsker at undersøge om det er muligt at benytte anti-tenascin i forbindelse med udredningen af Collagen Colitis. Mere præcist ønsker vi at undersøge om der findes uopdagede til fælde af Collagen Colitis i i præparater der eller var blevet diagnosticeret som lymfocytær Colitis. Vi er dog på bar bund i forhold til hvilken antistof klon vi skal indkøbe. De eneste to cloner vi i litteraturen har set omtalt i forbindelse med CC er clone 49 og clone T2H5 begge meget dyre og svære for de danske distributører at skaffe, derfor opslaget på facebook. Så hvis du kan finde ud af hvilken klon i benytter i Herlev, evt en leverandør, og måske endag en brugsprotokol ville det hjælpe vores projekt lidt på vej. Mvh Emil Hej Emil, Jeg håber mailen er kommet frem og ikke er fanget i spam mail? Antistoffet fra Abcam vi gerne vil have fingerne i koster mange penge - absurd! Men har ikke lige hørt mere, hvad vi ender med Christina G. Thomsen Bioanalytiker Patologiafdelingen Herlev Hospital - Den er kommet frem og tusind tak for det. Jeg har samlet nogle tilbud sammen på t2h5 klonen fra diverse distributører og der efter har den speciale ansvarlige bioanalytiker på afdelingen fået lov til at se det igennem og hun forhandler så forhåbentligt nogle gode tilbud hjem. så vi er på vej afsted. Og igen tusind tak for hjælpen Det lyder super godt! Hvis i har brug for sparring af nogen art skriver i bare Mvh Christina G. Thomsen Bioanalytiker Patologiafdelingen 47

Herlev Hospital Hej Emil Se lige nedenstående! Vi har nu problemer med antistoffet. Christina Hej Christina. Her er hvad jeg har sendt til Bio-Techne omkring Tenascin. Du kan videre sende det til den studerende, hvis han er interesseret. Hilsen Dorte. Dear Jameson As agreed by phone here is a little about our use of Tenascin (T2H5) from Novus NBP1-42547. In early October, I ordered 2 x tenascin. Our former antibody was discontinued. I got a message saying there was a backorder on Tenascin. I called to hear more about the delivery and got one sent on Oct. 20, the next one came on October 26. The first one had lot. number 3170252, maybe Z in the end? The next one had lot. number 427025C. With the first one we were able to get a good result with DAKO EnVision Flex K8002 using 1:20 and a Mouse Linker. We use a Dako Link machine and HIER in PT-Link using High ph buffer (9). (see attached pictures) When we switch to lot 427025C we got a totally negative result. I already ordered 4 more Tenasin, and they have the same Lot. number 427025C and we have open one of them and still got a negative result. I hope you can use the information Best regards Dorte Skriver-Jensen Områdeleder, Bioanalytiker Department Technician - Tak for beskeden Christina. Vi har til vores projekt brugt samme lot som jeres første lot, vi har brugt opitiview visualisering og hier demaskering samt fortynding 1:40, det giver et brugbart men ikke optimalt resultat. Men tak fordi du skrev. Vi afslutter vores sidste laboratorier dag i dag 48

Bilag 3: Datasheet for Tenascin C Antibody (T2H5) NBP1-42547 anvendt i projektet 49

50

51

Bilag 4: NordiQC s anbefalinger for kontrolvæv ved tenascin påvisning Oversigt over NordiQC s anbefaling for kontrolvæv til anvendelse ved påvisning af tenascin (markeret med gult). De anbefaler appendix og tonsil. 52

Bilag 5: KPA SLB Vejles standardprotokol ved optimering af nye antistoffer på afdelingen. Protokollen er uden vaske/skylletrin Protocol summary Procedure: U Optiview DAB IHC v4 (v1.00.0108) Benchmark ULTRA IHC/ISH Staining Module Patologisk afdeling Vejle Sygehus, immunlaboratoriet Protocol No Protocol Name 135 AE1AE3 1. Paraffin [Selected] 2. Deparaffinization [Selected] 3. Warmup Slide to [72 Deg C] from Medium Temperature (Deparaffinization) 4. Cell Conditioning [Selected] 5. Ultra CC1 [Selected] 6. Warmup Slide to [100 Deg C] and Incubate for 4 Minutes (Cell Conditioner #1) 7. CC1 8 Min [Selected] 8. CC1 16 Min [Selected] 9. CC1 24 Min [Selected] 10. CC1 48 Min [Selected] 11. Pre Primary Perioxidase Inhibit. [Selected] 12. Primary Antibody [Selected] 13. Apply Coverslip. One Drop og [PREP KIT12] (Antibody), and Incubate for [0 Hr 32 Min] 14. Optiview HQ Linker [Selected] 15. Optiview HQ Universal Linker [Selected] 16. Apply Coverslip, One Drop of OV HRP MULTIMER, and Incubate for [8 Minutes] 17. Optiview HRP Multimer [Selected] 18. HRP Multimer Incubation Time [Selected] 19. Apply Coverslip, One Drop of OV HRP Multimer, and Incubate for [8 Minutes] 20. Counterstain [Selected] 21. Apply One Drop of [HEMATOXYLIN II] (Counterstain), Apply Coverslip, and Incubate for [4 Minutes] 22. Post Counterstain [Selected] 23. Apply One Drop of [BLUING REAGENT] (Post Counterstain), Apply Coverslip, and Incubate for [4 Minutes] 53

Bilag 6: Materialer anvendt i projektet Øverst er en samlet tabel med kemikalier og reagenser anvendt ved special- og immunfarvning, plus lot nr./batch nr., producent og faremærkning ved hver enkel farvemetode. Nedenunder forefindes tabeller med information over utensilier og apparaturer anvendt, samt producent. Kemikalier/reagenser anvendt i forsøget: Kemikalie / reagens Producent Lot nr. /batch nr. Faremærkning Weigert-Lillie s jernhæmatein Iron(II)sulfat heptahydrate (FeSO 4, 7 H2O) Merck 7762-93-0 Farlig ved indtagelse. Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig Iron(III)chloride hexahydrate (FeCI 3, 6 H2O) Hydrochlorid Acid 37-38 % (HCl) hudirritation. Merck 10025-77-1 Farlig ved indtagelse. Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. J.T. Baker 1015-108029 Ætsende irriterer luftvejene. 99 % ethanol Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. Demineraliseret vand Picrosiriusrød Picric acid 1,2 % VWR Chemicals 13H230009 96 % ethanol Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. 99 % ethanol Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. Siriusrød Struers 27703 Pertex Tissue-Tek 1305701002 Ætsende irriterer 54

luftvejene. Masson trichrom Bouin s solution Dako 10101725 Farlig ved indånding, hudkontakt og ved indtagelse. Irriterer øjne, åndedræt, hud. Mulighed for varig skade på helbred. Kan give allergi ved hudkontakt. Weigerts Hematoxylin A Dako 10101725 Farlig ved indånding, hudkontakt og ved indtagelse. Irriterer øjne, åndedræt, hud. Mulighed for varig skade på helbred. Kan give allergi ved hudkontakt. Weigerts Hematoxylin B Dako 10101725 Biebrich Scarlet Acid Dako 10101725 Fushsin Prosphotungstic Dako 10101725 phrosphomolybdic Acid Aniline Blue Dako 10101725 Acetic Acid 3 % Dako 10101725 Clearing Solution Dako 10100855 Pertex Tissue-Tek 1305701002 Ætsende irriterer luftvejene. 100 % Reagent Alcohol Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. 95 % Reagent solution Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. Wash Solution Dako Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. Anti-Tenascin Tenascin Novusbio 3170252 Optiview Copper (5,0 Ventana F03513-F03505 g/l) Optiview H 2 O 2 (0,04 %) Ventana F03513-F03504 Optiview DAB (0,2 %) Ventana F03513-F03503 Optiview HRP multimer Ventana F03513-F03502 55

(<40µl/mg) Optiview HQ Universal Ventana F03513-F03501) Linker (<50 µg/ml) Optiview Peroxidase Ventana F03513-F03500 Inhibator Optiview Amplification Ventana F02834-F03583 (<10 µg/ml) Optiview Amplification Ventana F02834-F03584 (0,04 %) Optiview Amplifier (<40 Ventana F02834-F03582 µg/ml) Hematoxylin II (< 60 %) Ventana F03828 Bluing Reagent Ventana F03841 Protease 3 (~0,02µg/mL) Ventana F02231 Protease 1 Ventana D10420 (~0,38mg/mL) Sulfo 70 % ethanol Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. 96 % ethanol Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. 99 % ethanol Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. Pertex Tissue-Tek 1305701002 Ætsende irriterer luftvejene. EZ prep Ventana 619010-01 Ultra LCS Ventana F04624 2X SSC Ventana 614 686-01 Reactions Buffer Ventana 621738-01 Ultra CC1 Ventana F13712 Ultra CC2 Ventana F04619 Antibody Diluent Dako 20017946 Vævspræparering 70 % ethanol Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. 96 % ethanol Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig 56

øjenskade. 99 % ethanol Forårsager hudirritation. Forårsager alvorlig øjenskade. Estisol Estichem DE 14-11 4 % Neutral buffet formaldehyd Demineraliseret vand Paraffin Tissue-Tek 7052 Utensilier Utensiler Nitril handsker Dækglas (24x50 mm) Dækglas (24x60 mm) Coplingglas Trimming blade IHC Microscope Slides Superfrost glas Superfrost Plus glas Kapsler Kassetter Producent TouchNTuff Hounisen Hounisen Feather Dako Hounisen Thermo Scientific Tissue-Tek Tissue-Tek Apparaturer Apparatur/farvning Ventana Benchmark Ultra Tissue-Tek film og farve maskine Artisan Link Microm HM 355S Mikroskop Nano Zoomer XR Producent Roche Sakura Dako Thermo Scientific Leica DMLB Hamamatsu 57

Bilag 7: Oversigt over priser for picrosiriusrød, masson trichrom og anti-tenascin. Tabellerne er opstillet med priser for hver af de tre farvemetoder. Priserne pr. glas, ved én farvning, er markeret med fed. Picrosiriusrød: Væske * Kemikalie Mængde Pris i kr. A hæmatoxilin 0,96 g 44,57 Ethanol 60 ml 0,3 B Ferrisulfat 0,3 g 0,68 Ferrichlorid 0,83 g 1,66 Demineraliseret vand 19,86ml 0 Salsyre 32 % 0,133 ml 0,01 Sirius rød opløsning Picrinsyre 80 ml 18,59 Sirius rød 0,08 g 0,8 I alt pr. coplinglas 66,61 Objektglas 0,44 I alt Pr. snit 13,57 * ved fremstilling af væsker til farvning af fem glas i Coplinglas Masson trichrom: Enhed Pris i kr. Antal test Pr. kit 6980,35 100 Objektglas 1,44 1 Pr glas 71,24 1 Anti-tenascin: Reagens Enhed Pris kr. Antal test Anti-tenascin 0,2 ml / et rør 2350 80 Anti-tenascin 2,5µl/ 29,37 1 Optiwiev visualisering Kit 6500 250 Optiwiev visualisering Pr test 26 1 Objektglas 1 8,57 1 I alt pr snit 63,95 58

Bilag 8: Protokol for immunhistokemisk farvning med anti-tenascin på Benchmark Ultra, opnået i delprojekt 2. Protocol # 1026: Bachelor Tenascin kort de+ 52 inku aut (02-11-2015) Procedure: U Optiview DAB IHC v5 (v1.00.0117) Benchmark ULTRA IHC/ISH Staining Module Patologisk afdeling Vejle Sygehus, immunlaboratoriet Protocol No Protocol Name Creation Date 02-11-2015 1. Enable Mixers 2. Disable Mixers 3. [72 o C is the standard temperature] 4. Warmup Slide to [72 Deg C] from Medium Temperature (Deparaffinization) 5. Incubate for 4 Minutes 6. Apply EZPrep Volume Adjust 7. Rinse Slide With EZ Prep 8. Apply EZPrep Volume Adjust 9. Apply Coverslip 10. Rinse Slide With EZ Prep 11. Apply EZPrep Volume Adjust 12. Apply Coverslip 13. Enable Mixers 14. Disable Mixers 15. Pause Point (Landing Zone) 16. Rinse Slide With EZ Prep 17. Apply Cell Conditioner #1 18. Apply CC Coverslip Long 19. [100 o C is the standard temperature] 20. Warmup Slide to [100 Deg C] and Incubate for 4 Minutes (Cell Conditioner #1) 21. Incubate for 4 Minutes 22. Incubate for 8 Minutes 23. Apply Cell Conditioner #1 24. Apply CC Medium Coverslip No BB 25. Incubate for 8 Minutes 26. Incubate for 8 Minutes 27. Apply Cell Conditioner #1 59

28. Apply CC Medium Coverslip No BB 29. Apply Cell Conditioner #1 30. Apply CC Medium Coverslip No BB 31. Apply Cell Conditioner #1 32. Apply CC Medium Coverslip No BB 33. Disable Slide Heater 34. Apply Cell Conditioner #1 35. Apply CC Medium Coverslip No BB 36. Rinse Slide With Reaction Buffer 37. Adjust Slide With Reaction Buffer 38. Apply Coverslip 39. Pause Point (Landing Zone) 40. Warmup Slide to 36 Deg C 41. Rinse Slide With Reaction Buffer 42. Adjust Slide With Reaction Buffer 43. Apply One Drop of OV PEROX IHBTR, Apply Coverslip, and Incubate for 4 Minutes 44. Rinse Slide With Reaction Buffer 45. Adjust Slide With Reaction Buffer 46. Apply Coverslip 47. [If not selected, temperature will default to 36 o C] 48. Warmup Slide to 36 Deg C 49. Rinse Slide With Reaction Buffer 50. Adjust Slide With Reaction Buffer With Label Blow Off 51. Apply Coverslip, One Drop of [PREP KIT 30] (Antibody), and Incubate for [0 Hr 52 Min] 52. [Titration will only happen if selected] 53. Warmup Slide to 36 Deg C 54. Rinse Slide With Reaction Buffer 55. Apply 230ul + VA Reaction Buffer 56. Apply Coverslip 57. Rinse Slide With Reaction Buffer 58. Apply 230ul + VA Reaction Buffer 59. Apply Coverslip 60. Rinse Slide With Reaction Buffer 61. Adjust Slide Volume With Reaction Buffer With Label Blow Off 62. Apply Coverslip, One Drop of OV HQ UNIV LINKR, and Incubate for [8 Minutes] 63. Rinse Slide With Reaction Buffer 64. Apply 230ul + VA Reaction Buffer 65. Apply Coverslip 66. Rinse Slide With Reaction Buffer 67. Apply 230ul + VA Reaction Buffer 68. Apply Coverslip 69. Rinse Slide With Reaction Buffer 60

70. Adjust Slide Volume With Reaction Buffer With Label Blow Off 71. Apply Coverslip, One Drop of OV HRP MULTIMER, and Incubate for [8 Minutes] 72. Rinse Slide With Reaction Buffer 73. Apply 230ul + VA Reaction Buffer 74. Apply Coverslip 75. Rinse Slide With Reaction Buffer 76. Apply 230ul + VA Reaction Buffer 77. Apply Coverslip 78. Rinse Slide With Reaction Buffer 79. Adjust Slide Volume With Reaction Buffer 80. Apply One Drop of OV H2O2 and One Drop of OV DAB, Apply Coverslip, Incubate for 8 Minutes 81. Rinse Slide With Reaction Buffer 82. Adjust Slide Volume With Reaction Buffer 83. Apply One Drop of OV COPPER, Apply Coverslip, and Incubate for 4 Minutes 84. Rinse Slide With Reaction Buffer 85. Adjust Slide Volume With Reaction Buffer 86. Apply One Drop of [HEMATOXYLIN II] (Counterstain), Apply Coverslip, and Incubate for [4 Minutes] 87. Rinse Slide With Reaction Buffer 88. Adjust Slide Volume With Reaction Buffer 89. Apply Coverslip 90. Rinse Slide With Reaction Buffer 91. Adjust Slide Volume With Reaction Buffer 92. Apply One Drop of [BLUING REAGENT] (Post Counterstain), Apply Coverslip, and Incubate for [4 Minutes] 93. Rinse Slide With Reaction Buffer 94. Adjust Slide Volume With Reaction Buffer 95. Apply Coverslip 96. Disable Slide Heater 97. Rinse Slide With Reaction Buffer *one drop is one reagent dispense Patologisk Afdeling Vejle Sygehus, Immunlaboratoriet VSS v12.3 Build 0055 61

Bilag 9: Instruks for mikrotomering af kontrolvæv til special- og immunfarvning på KPA SLB Vejle. De forskellige farvemetoders mikrotomerings niveau er overstreget med lyserødt. Picrosiriusrød er at finde på første side, herefter masson trichrom og til sidst anti-tenascin. 62

63

64

Bilag 10: Oversigt over målinger af basalmembranen for anti-tenascin, masson trichrom og picrosiriusrød. I tabellen er alle patientprøver opstillet over for hver farvning, med tre målinger og heraf middelværdi og den score der blev afgivet for basalmembranens tydeligved ved måling. Patient Anti-tenascin Middelværdværdværdi Score Massons Trichrom Middel- Score Picrosiriusrød Middel- Score A Ingen basalmembran Ingen basalmembran Ingen basalmembran B Ingen reaktion 2,02 2,3 1,93 2,1 +++ 3,17 2,33 3,17 2,9 +++ C Ingen reaktion 2,83 3,16 1,6 2,5 ++ 6,65 6,62 4,73 6 +++ D 4,08 3,18 3,44 3,6 +++ 4,66 4,88 6,53 5,4 +++ 5,66 6,17 6,07 6 +++ E 3,34 2,83 2,32 2,8 + 2,58 3,55 5,84 4 ++ 6,02 4,7 2,8 4,5 ++ F 1,62 1,51 1,89 1,7 ++ 2,26 1,24 1,15 1,6 ++ 3,11 2,61 2,41 2,7 ++ G 2,37 1,13 2,72 2,1 + 2,72 4,45 3,66 3,6 + 1,11 1,45 1,38 1,3 ++ H Ingen reaktion 2,64 3,05 2,15 2,6 + 2,27 2,3 1,01 1,9 + I Ingen reaktion 4,16 2,29 2,67 3 ++ 2,51 2,01 1,69 2,1 ++ J 2,01 2,75 5,34 3,4 + 5,16 5,52 2,07 4,3 + 4,08 4,4 3,28 3,9 ++ K 1,82 2,66 2,17 2,2 + 6 2,68 4,01 4,2 + 1,63 1,81 2,4 1,9 ++ L Ingen reaktion 2,67 3,63 2,8 3 ++ 2,73 3,68 4,08 3,5 ++ M Ingen reaktion 1,92 1,15 2,16 1,7 + 1,63 2,19 2,17 2 + N Ingen reaktion 2,04 1,85 1,25 1,7 + 2,52 2,94 3,47 3 ++ O Ingen reaktion 2,62 2,13 2,88 2,5 + 5,08 5,84 4,68 5,2 ++ P 3,84 7,01 8,16 6,3 + 4,48 3,14 3,07 3,6 ++ 5,09 3,64 5,68 4,8 ++ Q 5,09 2,89 2,72 3,6 + 2,39 4,41 2,94 3,2 + 2,23 2,74 3,29 2,8 ++ R Ingen reaktion 4 6,49 4,36 5 + 4,38 5,73 3,98 4,7 ++ S 2,08 2,76 1,13 2 + 3,26 4,32 2,86 3,5 + 5,65 4,57 3,51 4,6 ++ T 3,87 2,62 4,3 3,6 + 3,69 3,28 3,2 3,4 ++ 3,64 2,05 3,76 3,2 + U Ingen reaktion 2,53 1,43 2,04 2 + 1,51 2,08 1,97 1,8 + V 5,67 11 6,58 7,8 +++ 3,07 4,61 4,87 4,2 + 2,13 3,24 2,33 2,6 + W 7,63 6 6,03 6,6 + 3,21 2,97 3,4 3,2 +++ 2,5 1,97 2,79 2,4 + X Ingen reaktion 4,32 2,29 2,58 3,1 ++ 7,4 14,5 5,32 9,1 + Y 7,54 8,2 6,17 7,3 + 8,6 4,15 2,86 5,2 + 3,93 5,66 4,24 4,6 ++ Z 7,44 9,11 8,3 8,3 + 6,94 5,35 2,72 5 + 10 4,77 5,43 6,7 + Æ 4,24 4,72 3,26 4,1 + 4,68 6,08 7 5,9 + 2,63 3,51 4,65 3,6 + Ø 1,2 1,36 3,19 1,9 ++ 3,28 6,22 4,6 4,7 + 5,97 2,17 2,96 3,7 ++ Å 4,77 4,7 9,19 6,2 ++ 4,88 6,04 3,57 4,8 + 5,87 3,6 1,93 3,8 ++ AA Ingen reaktion 2,4 3,76 3,2 3,1 + 2,08 2,06 2,04 2,1 + 65