FREMSTILLING AF INSULINPRODUCERENDE CELLEFABRIKKER I DET VIRTUELLE LABORATORIUM Udgangspunktet fr dette tema er Det Virtuelle Labratrium g undervisningsmateriale m cellefabrikker fra Bitech Academy. Temaet handler m udvikling g brug af cellefabrikker med det frmål at danne prteinet insulin: Ved hjælp af genteknlgi indsættes fremmede gener i mikrrganismer så de mdannes til cellefabrikker, der prducerer værdifulde medicinske stffer sm fx insulin. Diabetes g behandling af diabetes vha. hrmnet insulin berøres krt, mens der er vægt på frskning i nye typer insulin samt udfrdringerne der er frbundet med fremstilling af alternative insulinpræparater. Biinfrmatik med søgning i NCBI, Uniprt g PDB indgår sm et væsentligt element sammen med strukturanalyse i Uniprt, Virtual Ribsme g PyMOL. Undervisningsfrløbet er gennemført på 10 mduler af halvanden time med et biteknlgihld der går i 1.g 1. Kernestf bindingstyper i prteiner prteiner g aminsyrer - struktur g egenskaber mlekylært g cellulært grundlag fr genregulering g prteinsyntese genteknlgi, herunder gensplejsning g genmdificerede rganismer eksperimentelle arbejdsmetder der anvendes inden fr biteknlgi g lægemiddelindustri: celledyrkning, transfrmatin, test af fremstillet insulin på dyremdeller. Supplerende stf Det supplerende stf mhandler sygdmmen diabetes, bilgisk prduktin vha. cellefabrikker, frskning i fremstilling af insulinprducerende cellefabrikker. Ntebkfil med diasshw, arbejdspgaver mm I frløbet brugte vi en SMARTntebk-fil der indehlder diasshw med figurer, arbejdspgaver, links, versigt ver delfrløb, psamlinger med mere. Undervejs blev der tilføjet elevprdukter, elevnter g andet, g eleverne bidrg til at fylde indhld i filen via en interaktiv tavle. Eleverne fik med jævne mellemrum elektrniske handuts med udvalgte slides i pdf-frmat. Ntebk-filen kan knverteres til en pwerpint præsentatin, ligesm de håndskrevne nter, svar på pgaver sv. kan slettes i ntebkfilen. Filen har flere frmål: At præsentere indhldet g arbejdspgaver i de enkelte mduler, at samle infrmatiner, pgaver g prdukter et enkelt sted samt at skabe verblik ver frløbet sm helhed. Eksperimentelt arbejde g prdukter Eleverne skal stifte bekendtskab med mlekylærbilgiske værktøjer g teknikker gennem t øvelser; en øvelse m biinfrmatik g en virtuel øvelse hvr der fremstilles cellefabrikker. Opgavefrmuleringerne ses nedenfr. I biinfrmatikøvelsen sm mhandler insulin, anvender eleverne databaser g prgrammer til at undersøge DNA- g aminsyresekvenser, transkribere DNA til RNA g undersøger sekundær g tertiær struktur. Eleverne guides igennem databaser g prgrammer af t videtutrials mens de løser en bunden pgave. Besvarelsen af pgaven afleveres g evalueres af underviseren. I den anden øvelse fremstiller eleverne insulinprducerende cellefabrikker i Det Virtuelle Labratrium, g arbejder sig gennem de frskellige trin i prcessen med at fremstille cellefabrikker. Prduktet er en screencast, hvr eleven viser g frklarer prcessen fra design af DNA-sekvens ver fremstilling af cellefabrikker til test af prdukt. Prduktet afleveres g evalueres af underviseren 2. 1 Link til frløbsbeskrivelse: https://www.lecti.dk/lecti/73/studieplan/frleb_vis.aspx?phaseid=3114858816&prevurl=studieplan.aspx%3fhldelementid%3d250493 4482%26displaytype%3dugeteksttabel 2 Tre eksempler på screencasts i Det Virtuelle Labratrium http://www.yutube.cm/watch?v=529dezkrmls&feature=bf_prev&list=pl111f0b443541ff18&in... http://www.yutube.cm/watch?v=niwcj-lcqu&feature=bf_next&list=pl111f0b443541ff18&in... 1
Eleverne vejledes i fremstilling af pster sm på en interessant måde frmidler emner der er relateret til frskning i insulin g behandling af diabetes. Artiklerne Genetisk tuning af cellefabrikker gudvikling af hurtigtvirkende insulin er velegnede til at lave psters ver. Sm afrunding afhldes pstersessin, hvr eleverne præsenterer deres psters med et plæg. Pster kan evalueres af undervisningen hvis der er behv. Har man lyst til at inddrage allignment g fylgenier kan pgaven på sidste side benyttes. Øvelse: Biinfrmatikøvelse 1. Opgaver til NCBI s hjemmeside a. Indsæt kdende DNA streng (CDS) b. Indsæt den fulde prtein-sekvens sm kan findes på NCBI s hjemmeside 2. Opgaver til UNIPROT s hjemmeside a. Hvr mange aminsyrer indgår i præ-pr-insulin? b. Angiv med tal hvilke aminsyrer der indgår i præ-pr-insulin c. Angiv med tal hvilke aminsyrer der indgår i pr-insulin d. Angiv med tal hvilke aminsyrer der indgår i insulin e. Hvr mange aminsyrer indgår i insulin? f. Tag et screensht af den sekundære struktur g indsæt her g frtæl krt hvad farvekderne betyder. g. Hvad er M insulin altså den mlare masse fr insulin? Bemærk at man fr prteiner angiver den mlare masse i Da (Daltns) g ikke g/ml sm I kender fra mængdeberegninger. 3. Opgaver til PDB s hjemmeside a. Hvad er kden fr den 3D struktur vi bruger? b. Hvad er pløsningen på den 3D strukturen? 4. Opgaver til Pyml a. Indsæt et billede af 3D strukturen hvr I viser main chain med sticks. b. Indsæt et billede af 3D strukturen hvr I viser cartn visning med A g B kæden i frskellige farver. c. Indsæt et billede af 3D strukturen hvr I viser surface. d. Indsæt et billede af 3D strukturen hvr I viser hydrgen-bindinger. e. Hvilke andre bindinger findes i prteiner? Til læreren Eleverne vil kmme til at arbejde med følgende sider g værktøjer: NCBI: Finde kdende DNA-sekvens fr humant insulin samt aminsyresekvensen fr den kdende del Virtual Ribsme: Translatin af DNA-sekvens til aminsyresekvens. UNIPROT: Undersøge sekundær struktur mm. PDB: hente kde fr 3D-struktur PyMOL: Undersøge insulins 3D-struktur, interne bindinger i mlekylet, alfa-helix, beta-sheet. OBS skal installeres inden brug. Øvelse: Fremstilling af cellefabrikker i Det Virtuelle Labratrium Lav en screencast vha. www.screencast--matic.cm hvr du demnstrerer arbejdsgangen i at fremstille en cellefabrik. Prduktinen skal vare mkring 5-7 minutter. Ganske krt indledning med frmål Løbende præsentatin af de 7 trin i fremstillingen af cellefabrikker Løbende frklaring af hvad du gør g hvrfr du gør det (ikke nget med at det gør du frdi at du ved at det virker) Krt afrunding http://www.yutube.cm/watch?v=luti1w4i0vq&feature=bfa&list=pl111f0b443541ff18&index=10 2
Uplad din screencast til yutube g sørg fr at det kun er persner med linket der kan se videen. HUSK at give s linket så vi kan se hvrdan du fremstiller cellefabrikker. Til læreren Eleverne frventes at gennemgå følgende trin Design af DNA-sekvens med prmtr, ribsmbindingssted, start- g stpcdns, det kdende gen g terminatr Gensplejsning af gærceller med den designede DNA-sekvens vha. elektrpratr Selektin af transfrmerede gærceller på antibitikamedie Bestemmelse af ptimale ph g temperaturfrhld fr vækst Dyrkning i fermentr Oprensning af prdukt vha. HPLC (kun berørt ganske verfladisk) Test af prdukt i kmbinatin med saftevand på diabetiske g nrmale mus - prduktet var enten hurtigtvirkende eller langsmt-virkende insulin afhængig af hvilket gen der blev valgt i design-trinnet Særlige fkuspunkter Eleverne skal kunne beskrive insulins pbygning g redegøre fr sammenhæng mellem struktur, egenskaber g funktin gennemføre kvantitative g kvalitative eksperimenter g undersøgelser dkumentere g frmidle eksperimenter g undersøgelser mundtligt vurdere, hvrdan knkret anvendelse af biteknlgi kan påvirke samspillet mellem levende rganismer g deres mgivelser Frmidling Lave screencast med gennemgang af fremstilling af cellefabrikker i det virtuelle labratrium Lave pster Præsentatin af pster ved pstersessin IT-værktøjer Anvende NCBI, Virtual Ribsme, Uniprt, PDB, PyMl, Anvende Screencast--matic Fremstille cellefabrikker i Det Virtuelle Labrtrium (Bitech Academy) Undervisningsmaterialer Diabetes g insulin. Nv Nrdisk; 17-18 Videlink m RNA splicing: http://www.yutube.cm/watch?v=4x8ek15r8yy Grundbg i Biteknlgi 1; 40-42, 81-86, 145-151 Cellefabrikker: Den biteknlgiske rute fra DNA til prtein, Bitech Academy Genetisk tuning af cellefabrikker, Bitech Academy Udvikling af hurtigtvirkende insulin, Bitech Academy Det virtuelle labratrium, Bitech Academy Psterdesign, Bitech Academy: http://www.bitechacademy.dk/biindex/pster.aspx Vejledning Biinfrmatik del 1 af 2 http://www.yutube.cm/watch?v=-pfxtephece Det centrale dgme, intrns, exns g splicning Plypeptiders pbygning, herunder primær g sekundær struktur Søgning i NCBI-databasen, herunder nukletidsøgning, CDS, FASTA Anvendelse af Virtual Ribsm: Translatin af nukletidsekvens fra NCBI til aminsyresekvens g frklaring readingframe Vejledning Biinfrmatik del 2 af 2 http://www.yutube.cm/watch?v=r-jhvhzs6s Søgning i Uniprt: BLAST af aminsyresekvensen fra NCBI sm sammenligner sekvensen med andre plypeptider, srtering g udvælgelse af søgeresultater, gennemgang af infrmatiner i BLAST et g unik identifikatinskde 3
Søgning i PDB-database: Søgning på Uniprt identifikatinskde, frtlkning af søgeresultater, PDB-identifikatinskde Anvendelse af PyMOL: Henter data fra PDB g laver 3D-struktur af prteinet, visualisering af strukturer vha frskellig repræsentatiner (cartn, sticks, bindinger, sekundære strukturer mm), lave billeder af 3D-strukturer Undervisningsplan Mdul Lektie Emne I timen 3 Fkuspunkter 1 Diabetes g Insulin s. 17-18 Videlink m RNA splicing Videvejledning Biinfrmatik del 1 Intrduktin til biinfrmatik. Det centrale Dgme med vægt på RNA splicing g prteinmdificering. Anvende af NCBI 4 g Virtual Ribsme 5 til biinfrmatikøvelse 2 Grundbg i Biteknlgi 1 s. 145-151 Videvejledning Biinfrmatik del 2 Prteiners pbygning, bindinger g tredimensinale struktur (alfa-helix g betasheet). 3 GBT1 s. 40-42 g 81-86 Bindinger i prteiner 4 Cellefabrikker: Den biteknliske rute fra DNA til prtein (Læs til g med figur 2.3 m design af cellefabrikker hjemme trin 1 læses i timen) Cellefabrikker. Fremstilling af gen ud fra aminsyresekvens. 5 Cellefabrikker: Den biteknliske rute fra DNA til prtein (Læs trin 2 g 3 m fremstilling af cellefabrikker) Besvar spørgsmål i arbejdsarket 6 Cellefabrikker: Den biteknliske rute fra DNA til prtein (Læs trin 4 til 7 m fremstilling af cellefabrikker) Besvar spørgsmål i arbejdsarket 7 Genetisk tuning af cellefabrikker (Læs til Terminatr af transskriptinen ) 8 Genetisk tuning af cellefabrikker (Læs resten) 9 Udvikling af hurtigtvirkende insulin (skim) Psterdesign 10 Frbered plæg til pstersessin Genregulering, ekspressinsvektr, valg af celletype til cellefabrikken. Arb. Ark: Cellefabrikker trin Arb. Ark: Cellefabrikker trin Biinfrmatikøvelse Opgave afleveres Gensplejsning, selektin g Arb. Ark: dyrkning af cellefabrikker. Cellefabrikker trin Oprensning af prtein. Genregulering vha. Prmtr. Genregulering vha. prmtr, ribsmbindingssted, terminatr g start- g stpcdns. Optimering. Aminsyresekvens betydning fr insulins kemiske egenskaber. Opsamling på fremstilling af cellefabrikker Fremstilling af psters g plæg (i grupper) Fremstilling af cellefabrikker i Det Virtuelle Labratrium Pstersessin Opsamling på frløb Anvende Uniprt 6 g PDB 7 samt PyMOL 8 til biinfrmatikøvelse Artikellæsning Læs g frstå Artikellæsning Læs g frstå Artikellæsning Læs g frstå Rundtur i Det virtuelle Labratrium Selvevaluering vha. quiz Opsamling på biinfrmatikøvelse Hvad kan man spørge m til dagens tekst? Selvevaluering vha. quiz Hvad kan man spørge m til dagens tekst? Frmidling g præsentatin Frmidling g præsentatin 3 Se ntebkfil fr diasshw, pgaver, elevprdukter mm. 4 http://www.ncbi.nlm.nih.gv/ 5 http://www.cbs.dtu.dk/services/virtualribsme/ 6 http://www.uniprt.rg/ 7 http://www.pdb.rg/pdb/hme/hme.d 8 http://www.pyml.rg/ 4
Insulin Besvar spørgsmål 1 g 2 i pgaven Insulin g arv 9. Find aminsyresekvensen fr præ-pr-insulinet fra menneske (brug sekvensen fra biinfrmatikøvelsen) g udfør et Blast på Uniprt så du får en liste ver de aminsyresekvenser der mest ligner præ-pr-insulinets aminsyresekvens fra menneske. Brug videvejledningen til databaserne 10 til at gennemføre blast. Tabel 1: Udfyld med rganisme, Uniprt Acess nr, Aminsyresekvens i A- g B-kæde. Tabel 2: Lav parvis sammenligning af aminsyresekvenser fra de seks rganismer g vurder Hvilke rganismes insulin ligner umiddelbart mest menneske-insulin? Hvilken rganismes insulin ligner umiddelbart mindst menneske-insulin? Videvejledningen 11 viser man med GeneBee 12 laver alignment af DNA- eller aminsyresekvenser g får et fylgenetisk træ. Udfør alignment med fylgenetisk træ på dine aminsyresekvenser. Kmmenter alignment g diskuter infrmatinerne i det fylgenetisk træ. Stemmer træet verens med dine vervejelser m hvilken rganismes insulin der ligner menneskeinsulin? Tabel 1: Aminsyresekvens i A- g B- kæde fundet på Uniprt Organisme Hm Chimpanze Gris Kanin Hund Hamster Uniprt access nr P01308 P30410 P01315 P01311 P01321 P01313 Aminsyresekvens i A-kæde Aminsyresekvens i B-kæde Tabel 2: Parvis sammenligning af frskelle i A- g B- kæde Sammenlign aminsyrersekvenserne t g t så du kan se hvr mange frskelle der er mellem rganismerne. Hm Chimpanze Gris Kanin Hund Hamster Hm - - - - - - Chimpanze - - - - - Gris - - - - Kanin - - - Hund - - Hamster - 9 http://www.vire.dk/frykman/pgaver/2006- vejledende/3- insulin%20g%20arv%202006-2vejl.pdf 10 http://www.yutube.cm/watch?v=r- JhVhzs6s&feature=related 11 http://www.yutube.cm/watch?v=wokpvqa2r&feature=related Der er ngle fejl i videen, g alignment er ikke krrekt. Der bør laves en ny videvejledning hvr alignment er krrekt. 12 http://www.genebee.msu.su/services/malign_reduced.html alternativt http://www.genebee.msu.su/services/phtree_reduced.html 5