COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 HIM TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. Ordreoplysninger COBAS AMPLICOR HIM 48 Tests P/N: 21118390 123 HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 ART: 11 1839 0 US: 83369 Tilsigtet brug COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 US: 83314 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 (v1.5) er en in vitronukleinsyreamplifikationstest til kvantificering af HIV Type 1 (HIV-1) RNA i humant plasma på COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet. Testen kan kvantificere HIV-1 RNA over intervallet 50-750.000 kopier/ml ved anvendelse af en kombination af to prøveforberedelsesprocedurer, procedurerne Standard og UltraSensitive. Testen er beregnet til brug sammen med klinisk fremstilling og andre laboratoriemarkører for sygdomsudvikling til klinisk administration af HIV-1- inficerede patienter. Testen kan bruges til at vurdere patientprognoser ved at måle baseline-hiv-1 RNA-niveauet eller til at overvåge virkningen af antiretroviral behandling ved at måle ændringer i plasma HIV-1 RNA-niveauer i løbet af den antiretrovirale behandling. HIV-1 RNA-niveauer som målt med polymerasekædereaktion (PCR) blev brugt som en af surrogatmarkørerne i den accelererede FDA-godkendelsesproces for protease-inhibitorstofferne INVIRASE (saquinavirmesylat), CRIXIVAN (indinavirsulfat), NORVIR (ritonavir) og FORTOVASE (saquinavir); non-nukleosid revers transkriptase-inhibitorstofferne VIRAMUNE (nevirapin), SUSTIVA (efavirenz) og ZIAGEN (abacavir) samt for revers transkriptase-inhibitorstoffet EPIVIR (lamivudin). COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 er ikke beregnet til screening af blod eller blodprodukter for tilstedeværelsen af HIV-1 eller som en diagnosetest til bekræftelse af en HIV-1-infektion. P/N: 03788598 190 8/2009, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 1/52
Oversigt over og forklaring af teksten HIV (human immundefekt virus) er den virus, der forårsager AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) 1-3. HIV-infektion kan overføres ved seksuel kontakt, via inficeret blod eller inficerede blodprodukter eller fra en inficeret mor til fosteret 4. Tre til seks uger efter udsættelsen for HIV udvikler den smittede typisk et kortvarigt, akut syndrom, der er kendetegnet ved influenzalignende symptomer og ledsaget af høje niveauer af viræmi i det perifere blod 5-8. For de fleste inficerede individer efterfølges dette af en HIV-specifik immunreaktion og et fald i plasmaviræmi, som regel inden for fire til seks uger fra symptomernes indtræden 9,10. Efter serokonversion kommer inficerede individer typisk i en klinisk stabil symptomfri fase, der kan vare i flere år 11-13. Den symptomfrie periode er kendetegnet ved persistent, lavt viræmi i plasma 14 og en gradvis udtømning af CD4 + T-lymfocytter, der fører til svær immundefekt, flere opportunistiske infektioner, maligniteter og død 15. Selvom virusniveauer i det perifere blod er relativt lave i infektionens symptomfrie fase, ser virusreplikation og -clearance ud til at være dynamiske processer, hvor en stor forekomst af virusproduktion og -infektion af CD4 + -celler opvejes af lige store forekomster af virus-clearance, død af inficerede celler og opfyldning af CD4 + -celler, der resulterer i relativt stabile niveauer af både plasmaviræmi og CD4 + -celler 16-18. Kvantitative målinger af HIV-viræmi i det perifere blod har vist, at højere viruskoncentrationer kan korrelere med øget risiko for klinisk udvikling af HIV, og at reduktionen af viruskoncentrationer i plasma kan knyttes til nedsat risiko for klinisk udvikling 19-21. Virusniveauer i det perifere blod kan kvantificeres ved måling af HIV p24-antigenet i serum, ved kvantitativ dyrkning af HIV fra plasma eller ved direkte måling af viral RNA i plasma med teknikker til nukleinsyreamplifikation eller signalamplifikation 22-26. p24-antigen er det primære kerneprotein i HIV og findes i serum enten frit eller bundet til anti-p24-antistof. Frit p24-antigen kan måles med kommercielle enzymimmunanalyser (EIA), selvom nytteværdien af p24-antigen som markør for virusmængden er begrænset, idet antigenet kun kan registreres hos 20% af de symptomfrie patienter og 40-50% af de symptomatiske patienter. Procedurer til at spalte antigen-antistof-komplekser forbedrer sensitiviteten af p24-antigentestene, men virusproteinet kan fortsat ikke registreres hos de fleste symptomfrie patienter 22. Smitsom HIV i plasma kan dyrkes ved podning i aktiverede PBMC er (Peripheral Blood Mononuclear Cell) fra normale donorer. Kvantificering opnås ved podning af PBMC med serielle fortyndinger af plasmaprøven. Kvantitativ dyrkning har begrænset nytteværdi til overvågning af virusniveauer for inficerede individer, idet kun en brøkdel af viruspartiklerne er smitsomme in vitro. Smitsom virus kan ofte ikke registreres hos symptomfrie individer 22. HIV-RNA i plasma kan kvantificeres ved nukleinsyreamplifikation, f.eks. polymerasekædereaktion (PCR) 27-29. I COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 bruges PCR-metoden til at opnå maksimal følsomhed og dynamisk interval for den kvantitative detektion af HIV-1 RNA i EDTA- eller ACD-anti-koaguleret plasma 24. 2/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 8/2009, Revision 8.0
HIV-1 MONITOR Principper for proceduren COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 er baseret på fem hovedprocesser: Prøveforberedelse, revers transskription af target-rna for at generere komplementær DNA (cdna) 30 ; PCR-amplifikation 30 af target-cdna ved hjælp af HIV-1-specifikke komplementære primere, hybridisering af de amplificerede produkter til oligonukleotide prober, der er specifikke for target, samt detektion af de probe-bundne, amplificerede produkter ved kolorimetrisk bestemmelse. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 tillader samtidig revers transskription og PCR-amplifikation af HIV-1 og HIV-1 kvantitativ standard-rna. Master Mix-reagenset indeholder to primere, der er specifikke for både HIV-1 RNA og HIV-1 kvantitativ standard-rna og er udviklet til at give en tilsvarende kvantificering af gruppe M-undertyper af HIV-1. Funktionsevnen for testen med gruppe O-prøver er ikke fastlagt. Kvantificeringen af HIV-1 virus-rna udføres ved hjælp af HIV-1 kvantitiv standard. HIV-1 kvantitativ standard er et ikke-smitsomt RNA-transskript, der indeholder de samme primerbindingssteder som HIV RNA-target og et unikt probebindingssted, der tillader kvantitativ standard-amplikonet at skelnes fra HIV-1- amplikonet. HIV-1-kvantificeringsstandarden er indarbejdet i hver enkelt prøve ved et kendt kopinummer og udføres gennem forberedelsen af prøver, revers transskription, PCR-amplifikation, hybridisering og detektion sammen med HIV-1- target og amplificeres sammen med HIV-1-target. COBAS AMPLICOR - analyseinstrumentet beregner HIV-1 RNA-niveauerne i testprøverne ved at sammenligne HIV-1-signalet med kvantitativ standard-signalet for hver prøve. Kvantificeringsstandarden kompenserer for virkningen af hæmning og kontroller for amplifikationen for at give mulighed for nøjagtig kvantificering af HIV-1 RNA i hver enkelt prøve. Prøveforberedelse COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 kan bruges med én af de to prøveforberedelsesprocedurer: Standard- eller UltraSensitive-proceduren. Ved Standard-prøveforberedelsesproceduren isoleres HIV-1 RNA direkte fra plasma ved lysis af viruspartikler med et kaotropisk stof efterfulgt af fældning af RNA en med alkohol. Med UltraSensitive-prøveforberedelsesproceduren koncentreres HIV-1-viruspartiklerne i plasmaet ved ultra centrifugering efterfulgt af lysis af viruspartiklerne med et kaotropisk stof og bundfældning af HIV-1 RNA med alkohol. Et kendt antal kvantificerings-standard-rna-molekyler tilsættes hver enkelt prøve med lysisreagenset. HIV-1-kvantificeringsstandarden udføres med prøveforberedelse, revers transskription, amplifikation og detektion og bruges til kvantificering af HIV-1 RNA i testprøven. 8/2009, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 3/52
Revers transskription og PCR-amplifikation Valg af target Udvælgelsen af target-rna-sekvensen for HIV-1 afhænger af identificeringen af regioner i HIV-1-genomet, der har maksimal sekvenskonservering. Dermed er udvælgelsen af primere og probe afgørende for testens evne til at registrere HIV-1- genotypen. I COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 bruges primerne SK145 og SKCC1B til at definere en sekvens på 155 nukleotider i det meget konserverede område af HIV-1 gag-gen 31. Gagområdet indkoder de gruppespecifikke antigener eller kernestrukturproteiner på virionet. HIV-1 gaggener er typisk omkring 1500 nukleotider i længden og er placeret ved position 789-2290 i HIV-genomen. Primernes nukleotidsekvens er optimeret for at give equivalent amplifikation af gruppe M-undertyper for HIV-1. Revers transskription Der udføres revers transskriptions- og PCR-amplifikationsreaktioner med det termostabile rekombinante enzym Thermus thermophilus DNA polymerase (rtth pol). Ved tilstedeværelsen af mangan og under passende bufferforhold har rtth pol både revers transkriptase- og DNA polymerase-aktivitet 30. Dermed kan både revers transskription og PCR-amplifikation foregå samtidigt i samme reaktionsblanding. Behandlede prøver tilsættes amplifikationsblandingen i amplikationsrørene (A-rør), hvor der foregår både revers transskription og PCR-amplifikation. Den downstreameller antisense-primer (SKCC1B) og den upstream- eller sense-primer (SK145) er biotinylerede ved 5'-enderne. Reaktionsblandingen opvarmes for at lade downstream-primeren binder specifikt til HIV-1 target-rna et og til HIV-1 kvantitativ standard-rna et. Ved tilstedeværelsen af Mn 2+ og overskydende deoxynukleosid trifosfater (dntp er), herunder deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxycytidin, deoxyuridin og deoxythymidin trifosfater forlænger rtth pol i primerens 5'-3' retning og danner en DNA-streng (cdna), der er komplementær til RNA-target. Targetamplifikation Efter revers transskription af HIV-1 target-rna og HIV-1 kvantitativ standard-rna opvarmes reaktionsblandingen for at denaturere RNA:cDNA-hybriden og blotlægge primerens targetsekvenser. Når blandingen afkøler, binder upstream-primeren (SK145) specifikt til cdna-strengen, rtth pol forlænger i primerens 5'-3' retning, og den anden DNA-streng syntetiseres. Dette afslutter den første PCR-cyklus, der giver en dobbeltstrenget DNA-kopi af targetområdet af HIV-1 RNA et og HIV-1 kvantitativ standard-rna et. Reaktionsblandingen opvarmes igen for at adskille det resulterende dobbeltstrengede DNA og vise primerens targetsekvenser. Når blandingen afkøler, binder primerne SK145 og SKCC1B til target-dna et. Ved tilstedeværelsen af Mn 2+ og overskydende dntp er forlænger rtth pol i primerens 5'-3' retning de binder primerne langs targetskabelonerne for at producere et dobbeltstrenget DNA-molekyle med 155 basepar, kaldet et amplikon. COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet gentager automatisk denne proces et bestemt antal gange, hvor mængden af amplikon-dna fordobles for hver cyklus. Amplifikationen foregår kun i området mellem primerne på HIV-1-genomen. Hele HIV-1-genomet amplificeres ikke. 4/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 8/2009, Revision 8.0
HIV-1 MONITOR Selektiv amplifikation Selektiv amplifikation af target-nukleinsyren fra den kliniske prøve opnås i COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 ved hjælp af AmpEraseenzym (uracil-n-glycosylase) og deoxyuridintrifosfat (dutp). AmpEraseenzymet registrerer og katalyserer nedbrydningen af DNA-strenge, der indeholder deoxyuridin 32, men ikke DNA, der indeholder deoxythymidin. Deoxyuridin findes ikke i naturligt forekommende DNA, men findes altid i amplikon som følge af brugen af deoxyuridin trifosfat som en af dntp erne i Master Mixreagenset. Derfor er det kun amplikon, der indeholder deoxyuridin. Deoxyuridin gør kontaminerende amplikon modtageligt for nedbrydning med AmpErase-enzym før amplifikationen af target-dna'et. AmpErase-enzym, der findes i Master Mix-reagenset, katalyserer spaltningen af deoxyuridin-holdigt DNA ved deoxyuridin-residues ved at åbne deoxyribosekæden ved positionen C1. Ved opvarmning i den første termiske cyklus ved basisk ph i Master Mix brækker amplikonets DNA-kæde ved positionen for deoxyuridin, og dermed kan DNA et ikke amplificeres. AmpErase-enzym er inaktivt ved temperaturer over 55 C, dvs. i de termiske cyklusser, og derfor ødelægges target-amplikonet ikke. Efter amplifikation denatureres resterende enzym ved tilsættelse af denatureringsopløsningen, hvilket forhindrer nedbrydningen af targetamplikoner. Det er påvist, at AmpErase-enzymet i COBAS AMPLICOR HIV- 1 MONITOR Test, v1.5 deaktiverer mindst 10 3 kopier af deoxyuridin-holdig HIV-1-amplikon pr. PCR. Hybridiseringsreaktion Efter PCR-amplifikation tilsætter COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet automatisk denatureringsopløsning til A-røret for kemisk at denaturere HIV-1 og HIV-1 kvantitativ standard-amplikonet for at danne enkeltstrenget DNA. For at opnå kvantitative resultater over et stort dynamisk område foretager COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet serielle fortyndinger af det denaturerede amplikon i detektionskopperne (D-kopper). En opløsning af magnetiske partikler, der er belagt med en oligonukleotid probe, som er specifik for enten HIV-1- amplikonet (SK102) eller HIV-1 kvantitativ standard-amplikonet (CP35) tilsættes i henholdsvis hver af de fire HIV-1-amplikonfortyndinger eller hver af de to HIV-1 kvantitativ standard-amplikonfortyndinger. Det biotin-mærkede amplikon hybridiseres til den targetspecifikke oligonukleotidprobe, der er bundet til de magnetiske partikler. Hver kvantitativ bestemmelse kræver fire uafhængige reagensabsorbansmålinger med HIV-1-probeopløsningen og to absorbansmålinger med HIV-1 kvantitativ standard-probeopløsningen. Detektionsreaktion Efter hybridiseringsreaktionen skyller COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet de magnetiske partikler i D-koppen for at fjerne ubundet materiale og tilsætter derefter avidin/horseradish-peroxidasekonjugat. Avidin/horseradish-peroxidasekonjugatet binder til det biotin-mærkede amplikon, der er hybridiseret til de targetspecifikke oligonukleotid-prober, der er bundet til de magnetiske partikler. COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet fjerner ubundet konjugat ved at skylle de magnetiske partikler og tilsætter derefter en substratopløsning, der indeholder brintoverilte og 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) i hver D-kop. Ved tilstedeværelsen af brintoverilte katalyserer den partikelbundne horseradishperoxidase oxideringen af TMB for at danne et farvet kompleks for hvilket, der måles absorbans ved hjælp af COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet ved en bølgelængde på 660 nm. 8/2009, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 5/52
HIV-1 RNA-kvantificering Samlet HIV-1 A AF Samlet QS A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 kvantificerer HIV-1-virus- RNA ved hjælp af en ekstra targetsekvens (HIV-1 kvantitativ standard), der tilsættes testprøven med en kendt koncentration. HIV-1 kvantitativ standard er et ikkesmitsomt in vitro-transskriberet RNA-molekyle med 233 nukleotider og primerbindende områder, der er identiske med dem i HIV-1-targetsekvensen. HIV-1 kvantitativ standard indeholder primerbindingsstederne SK145 og SKCC1B og genererer et amplifikationsprodukt med samme længde (155 baser) og basesammensætning som HIV-1-target-RNA et. Probebindingsområdet på HIV-1 kvantitativ standard-amplikonet er ændret for at skelne HIV-1 kvantitativ standardamplikon fra HIV-1-targetamplikon. Inden for analysens lineære interval er absorbansen på 660 nm (A 660 ) for hver D-kop proportional med mængden af HIV-1-amplikon eller HIV-1 kvantitativ standardamplikon i D-koppen. COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet beregner den samlede HIV-1 og HIV-1 kvantitativ standard-absorbans ved at gange absorbansen for D-koppen med amplikonfortyndingsfaktoren for den pågældende D-kop og vælger derefter D-koppen med den højeste samlede absorbans. Den beregnede samlede absorbans er proportional med den mængde HIV-1 RNA eller HIV-1 kvantitativ standard-rna, der findes i revers transskription-/pcr-amplifikationsreaktionen. Mængden af HIV-1-RNA i hver prøve beregnes derefter ud fra forholdet mellem den samlede HIV-1-absorbans og den samlede HIV-1 kvantitativ standardabsorbans og input-antallet af HIV-1 kvantitativ standard-rna-molekyler ved hjælp af følgende ligning: [ ] x Input HIV-1 QS-kopier/PCR x Prøvevolumenfaktor = HIV-1 RNA-kopier/ml Hvor: Samlet HIV-1 A = beregnet samlet absorbans for HIV-1-amplikon Samlet QS A = beregnet samlet absorbans for kvantitativ standardamplikon Input HIV-1 QS-kopier/PCR = antallet af kopier af kvantitativ standard i hver reaktion. Dette antal er lot-specifikt Prøvevolumenfaktor = faktor til konvertering af kopier/pcr til kopier/ml AF = Justeringsfaktor, der bruges til at standardisere COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5- testresultater til AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5- testresultater (Justeringsfaktor = 1,11). Prøvevolumenfaktor = 40 (for prøveforberedelsesproceduren Standard) Prøvevolumenfaktor = 4 (for prøveforberedelsesproceduren UltraSensitive) 6/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 8/2009, Revision 8.0
HIV-1 MONITOR Reagenser COBAS AMPLICOR HIM 48 test P/N: 21118390 123 HIV-1 MONITOR Test, ART: 11 1839 0 version 1.5 US: 83369 Prøveforberedelsesreagenser HIM PREP HIV-1 LYS (HIV-1 MONITOR-lysisreagens) Tris-HCl buffer 68% guanidinthiocyanat 3% dithiothreitol < 1% Glycogen + Xn 68% (w/w) guanidinthiocyanat 4 x 9,0 ml Sundhedsskadelig HIV-1 QS, v1.5 4 x 0,1 ml (HIV-1 MONITOR kvantitativ standard, version 1.5) < 0,001% ikke-smitsom in vitro-transskriberet RNA (mikrobiel) indeholdende HIV-1-primerbindingssekvenser og et unikt probebindingsområde < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid HIV-1 DIL (HIV-1 MONITOR-prøvediluent) Tris-HCl buffer < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid 4 x 4,8 ml Kontrolreagenser HIM CTL NHP 4 x 1,6 ml [Negativt plasma (humant)] Humant plasma, ikke-reaktivt ved US FDA-licenserede test for antistof mod HCV, antistof mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg. Der blev ikke registreret HIV-1 RNA, HCV RNA eller HBV DNA med PCR i poolede donorenheder. Der blev ikke registreret HBV-kerneantistof i poolede donorenheder med en FDA-licenseret test. 0,1% ProClin 300-konserveringsmiddel HIV-1 ( ) C [HIV-1 ( ) kontrol] < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid 4 x 0,05 ml 8/2009, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 7/52
HIV-1 L(+)C [HIV-1 MONITOR Lav (+) kontrol] < 0,001% ikke-smitsom in vitro-transskriberet RNA (mikrobiel) indeholdende HIV-1-sekvenser < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid HIV-1 H(+)C [HIV-1 MONITOR Høj (+) kontrol] < 0,001% ikke-smitsom in vitro-transskriberet RNA (mikrobiel) indeholdende HIV-1-sekvenser < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05% natriumazid 4 x 0,05 ml 4 x 0,05 ml Amplifikationsreagenser HIM AMP HIV-1 MMX, v1.5 4 x 0,7 ml (HIV-1 MONITOR Master Mix, version 1.5) Bicinbuffer Glycerol < 0,01% rtth DNA Polymerase (rtth pol, mikrobiel) Kaliumacetat < 0,07% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,001% SKCC1B- og SK145-primere biotinyliseret < 0,01% AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym (mikrobiel) 0,05% natriumazid HIV-1 Mn 2+, v1.5 (HIV-1 MONITOR manganopløsning, version 1.5) < 2% Mangan Eddikesyre Amaranth-farve 0,05% natriumazid Specifikke detektionsreagenser AD3 (Amplikonfortyndingsreagens) EDTA 0,8% natriumhydroxid + Xi HIM DK 0,8% (w/w) natriumhydroxid 4 x 0,1 ml 2 x 75 test Lokalirriterende IM PS1, v1.5 (HIV-1 MONITOR probeopløsning 1, version 1.5) MES-buffer < 0,01% opløsning af Dynabeads (paramagnetiske partikler), der er belagt med HIV-1-specifik oligonukleotid-opfangningsprobe SK102 0,09% natriumazid 2 x 100 test 8/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 8/2009, Revision 8.0
HIV-1 MONITOR IM4, v1.5 (HIV-1 MONITOR probeopløsning 2, version 1.5) Natriumphosphat-buffer < 0,2% rensemiddel 24,9% natriumthiocyanat 2 x 100 test IQ PS1, v1.5 1 x 100 test (HIV-1 MONITOR Kvantitativ standardprobeopløsning 1, version 1.5) MES-buffer < 0,01% opløsning af Dynabeads (paramagnetiske partikler), der er belagt med HIV-1 kvantitativ standardspecifik oligonukleotid-opfangningsprobe CP35 0,09% natriumazid IQ4, v1.5 (HIV-1 MONITOR Kvantitativ standardprobeopløsning 2, version 1.5) Natriumphosphat-buffer < 0,2% rensemiddel 24,9% natriumthiocyanat Generiske detektionsreagenser DN4 (Denatureringsopløsning) 1,6% natriumhydroxid EDTA Thymolblå + Xi DK 1,6% (w/w) natriumhydroxid 1 x 100 test 1 x 100 test Lokalirriterende CN4 (Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat) Tris-HCl buffer < 0,001% Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat Serumalbumin fra kvæg (fra pattedyr) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% Phenol 1% ProClin 150-konserveringsmiddel SB3 (Substrat A) Citratopløsning 0,01% brintoverilte 0,1% ProClin 150-konserveringsmiddel 3 x 100 test 5 x 75 test 8/2009, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 9/52
SB (Substrat B) 0,1% 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) 40% dimethylformamid (DMF) T 40% (w/w) dimethylformamid (DMF) 5 x 5 ml Giftig R: 61-20/21-36 Kan skade barnet under graviditeten. Farlig ved indånding og ved hudkontakt. Irriterer øjnene. S: 53-45 Undgå enhver kontakt - indhent særlige anvisninger før brug. Ved ulykkestilfælde eller ved ildebefindende er omgående lægebehandling nødvendig; vis etiketten, hvis det er muligt. COBAS AMPLICOR WB 500 test P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR vaskebuffer US: 83314 WB (10X-skyllekoncentrat) < 2% phosphat-buffer < 9% natriumklorid EDTA < 2% rensemiddel 0,5% ProClin 300-konserveringsmiddel Advarsler og forholdsregler Til in vitro-diagnostik. 2 x 250 test Denne test er kun beregnet til humant plasma, der er indsamlet i EDTA- eller ACDantikoagulanter. Det er påvist, at heparin hæmmer PCR, og det må ikke bruges med denne procedure. Undgå at pipettere med munden. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområde. Anvend engangsbeskyttelseshandsker, kitler og sikkerhedsbriller ved håndtering af prøver og reagenser. Vask hænderne grundigt efter at have håndteret prøver og reagenser. Undgå mikrobiel og ribonukleasekontaminering af reagenser, når der fjernes aliquoter fra reagensflaskerne. Det anbefales at bruge sterile engangspipetter og RNase-frie pipettespidser. Reagenser fra forskellige lot eller fra forskellige flasker fra det samme lot må ikke blandes sammen. Ubrugte reagenser og affald skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. Et kit må ikke anvendes efter udløbsdatoen. 10/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 8/2009, Revision 8.0
HIV-1 MONITOR Du kan rekvirere MSDS er (Material Safety Data Sheets) hos din lokale Roche-forhandler. Arbejdsgangen i laboratoriet skal være envejs, idet der startes i præamplifikationsområdet og fortsættes i post-amplifikationsområdet (amplifikation/detektion). Præamplifikationsaktiviteterne skal starte med klargøring af reagenser og fortsætte med klargøring af prøver. Beholdninger og udstyr skal være specielt beregnet til hver enkelt præamplifikationsaktivitet og må ikke bruges til andre aktiviteter eller flyttes mellem områder. Der skal bæres handsker i hvert enkelt område, og de skal skiftes, før området forlades. Udstyr og beholdninger, der bruges til klargøring af reagenser, må ikke bruges til klargøring af prøver eller til pipettering eller behandling af amplificeret DNA eller andre kilder til target-dna. Beholdninger og udstyr til post-amplifikation skal altid bibeholdes i post-amplifikationsområdet. Prøver skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med laboratoriesikkerhedsprocedurer som dem, der er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 33 og i CLSI-dokument M29-A3 34. Rengør grundigt og desinficér alle arbejdsflader med en nyfremstillet 0,5% natriumhypochlorit-opløsning i demineraliseret eller destilleret vand. Bemærk! Almindeligt tilgængeligt, flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natriumhypochlorid med en koncentration på 5,25%. En 1:10 fortynding af blegemidlet giver en 0,5% natriumhypochloridopløsning. FORSIGTIG! Dette kit indeholder en komponent (NHP), der stammer fra humant blod. Kildematerialet er testet ved hjælp af test, der er godkendt af Food and Drug Administration (FDA), og blev fundet ikke-reaktive for tilstedeværelsen af antistof mod HCV, antistof mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg). Desuden blev der testet poolede donorenheder. Der blev ikke registreret HIV-1 RNA, HCV RNA eller HBV DNA med PCR, og der blev ikke registreret HBVkerneantistof med en test, der er licenseret af FDA. Ingen kendte testmetoder kan helt udelukke, at produkter, der stammer humant blod, kan overføre smitstoffer. Derfor skal alt materiale, der stammer fra mennesker, behandles som potentielt smittefarligt. NHP skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med laboratoriesikkerhedsprocedurer som dem, der er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 33 og i CLSI-dokument M29-A3 34. Rengør grundigt og desinficér alle arbejdsflader med en 0,5% natriumhypochlorit-opløsning i demineraliseret eller destilleret vand. HIV-1 QS, v1.5; HIV-1 DIL; HIV-1 MMX, v1.5; HIV-1 Mn 2+, v1.5; HIV-1 ( ) C; HIV-1 L(+)C; HIV-1 H(+)C; IM PS1, v1.5 og IQ PS1, v1.5 indeholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Når natriumazid-holdige opløsninger hældes ud i laboratorievasken, skal afløbet skylles med store mængder vand for at undgå ophobning af azider. Brug beskyttelsesbriller, kitler og engangshandsker ved håndtering af HIV-1 LYS; HIV-1 MMX, v1.5; DN4; AD3; IM4, v1.5; IQ4, v1.5; CN4; SB3; SB og arbejdssubstrat (blandet SB3- og SB-reagens). Undgå, at hud, øjne og slimhinder kommer i kontakt med disse materialer. Hvis der opstår kontakt, skal du straks skylle med store mængder vand. Der kan opstå forbrændinger, hvis det ikke behandles. Hvis disse reagenser spildes, skal du fortynde med vand, før de tørres op. Undgå kontakt mellem hud eller slimhinder og SB eller arbejdssubstratet. Hvis der opstår hudkontakt, skal du straks skylle med store mængder vand. SB og arbejdssubstratet indeholder dimethylformamid, der er rapporteret som giftigt ved høje orale doser og kan virke fosterskadende. Undgå hudkontakt, indånding af dampe samt indtagelse. Hvis der opstår hudkontakt, skal du vaske grundigt med vand og sæbe samt straks søge læge. 8/2009, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 11/52
HIV-1 LYS, der indeholder guanidinthiocyanat, eller IM4, v1.5 and IQ4, v1.5, der indeholder natriumthiocyanat, må ikke komme i kontakt med natriumhypokloridopløsning (blegemiddel). Sådanne blandinger kan danne en meget giftig gas. Der skal bruges rør med skruelåg til klargøring af prøver og kontroller for at undgå stænk og potentiel krydskontaminering af prøver. Brug ikke rør med snaplukning. Krav til opbevaring og håndtering Reagenser må ikke nedfryses. Opbevar HIV-1 LYS, HIV-1 QS, v1.5 og HIV-1 DIL ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig til den angivne udløbsdato. Når de er åbnet, skal den ubrugte del kasseres. Der dannes et bundfald i HIV-1 LYS ved opbevaring ved 2-8 C. Før brug skal du opløse bundfaldet ved at opvarme HIV-1 LYS til 25-37 C. Opvarm HIV-1 LYS i højst 30 minutter efterfulgt af grundig blanding, indtil krystallerne er opløst. Før brug skal du undersøge hver enkelt flaske med HIV-1 LYS mod en hvid baggrund for at se, om der er en gul farve eller tegn på utætheder. Hvis der er en gul farve eller tegn på utætheder, må den pågældende flaske ikke bruges. Kontakt det lokale Roche-kontor for at få en ny flaske. Når de er åbnet, skal den ubrugte del kasseres. Arbejdslysisreagenset (klargøres ved at tilsætte HIV-1 QS, v1.5 til HIV-1 LYS) skal opbevares ved stuetemperatur og bruges senest 4 timer efter klargøring. Opbevar HIV-1 MMX, v1.5 og HIV-1 Mn 2+, v1.5 ved 2-8ºC. Disse reagenser kan holde sig til den angivne udløbsdato. Når de er åbnet, skal den ubrugte del kasseres. Working Master Mix (klargøres ved at tilsætte HIV-1 Mn 2+, v1.5 til HIV-1 MMX, v1.5) skal opbevares ved 2-8ºC og kan holde sig i 4 timer ved 2-8ºC. Opbevar NHP, HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C og HIV-1 H(+)C ved 2-8ºC. Disse reagenser kan holde sig til den angivne udløbsdato. Når de er åbnet, skal den ubrugte del kasseres. Opbevar AD3 ved 2-25ºC. Efter indsætning i COBAS AMPLICOR - analyseinstrumentet kan AD3 holde sig i 30 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen, afhængigt af, hvad der indtræder først. AD3 kan anvendes i højst 4 instrumentcyklusser (24 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. Opbevar IM PS1, v1.5 og IM4, v1.5 ved 2-8 C. Disse reagenser kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Når først IM PS1, v1.5 og IM4, v1.5 er blevet blandet, kan arbejdsreagenset holde sig i 14 dage ved 2-8 C. Arbejdsreagenset kan anvendes i højst 2 instrumentcyklusser (24 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. Opbevar IQ PS1, v1.5 og IQ4, v1.5 ved 2-8 C. Disse reagenser kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Når først IQ PS1, v1.5 og IQ4, v1.5 er blevet blandet, kan arbejdsreagenset holde sig i 30 dage ved 2-8 C. Arbejdsreagenset kan anvendes i højst 4 instrumentcyklusser (24 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. Opbevar DN4 ved 2-25 C. DN4 kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Efter åbning kan DN4 holde sig i 30 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen, afhængigt af, hvad der indtræder først. DN4 kan anvendes i højst 4 instrumentcyklusser (24 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. 12/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 8/2009, Revision 8.0
HIV-1 MONITOR Opbevar CN4 ved 2-8 C. CN4 kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Efter åbning kan CN4-reagens holde sig i 30 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen, afhængigt af, hvad der indtræder først. CN4 kan anvendes i højst 4 instrumentcyklusser (24 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. Opbevar SB3 og SB ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig indtil den angivne udløbsdato. Der skal forberedes arbejdssubstrat hver dag ved blanding af SB3 med SB. Arbejdssubstrat kan holde sig i 16 timer på COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet. Udsæt ikke SB3, SB eller arbejdssubstrat for metaller, oxideringsmidler eller direkte lys. Opbevar WB ved 2-30 C. WB kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Undersøg WB før fortynding, og opvarm til 30-37 C for at opløse evt. bundfald igen, hvis det er nødvendigt. Arbejdsvaskebuffer (1X), der er forberedt ved 1:10 fortynding af WB med destilleret eller demineraliseret vand, skal opbevares ved 2-25 C i COBAS AMPLICOR -vaskebufferreservoiret og kan holde sig i 2 uger fra forberedelsesdatoen. Opbevar detektionsreagenser, der ikke er helt opbrugt, ved 2-8 C mellem instrumentkørsler. Kontrollér udløbsdatoen på åbnede reagenser eller arbejdsreagenser, før de indsættes i COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet. Medfølgende materialer COBAS AMPLICOR HIM P/N: 21118390 123 HIV-1 MONITOR Test, ART: 11 1839 0 version 1.5 US: 83369 Prøveforberedelsesreagenser HIV-1 LYS (HIV-1 MONITOR-lysisreagens) HIV-1 QS, v1.5 (HIV-1 MONITOR kvantitativ standard, version 1.5) HIV-1 DIL (HIV-1 MONITOR-prøvediluent) HIM PREP Kontrolreagenser HIM CTL NHP [Negativt plasma (humant)] HIV-1 ( ) C [HIV-1 ( ) kontrol] HIV-1 L(+)C [HIV-1 MONITOR Lav (+) kontrol] HIV-1 H(+)C [HIV-1 MONITOR Høj (+) kontrol] 8/2009, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 13/52
Amplifikationsreagenser HIM AMP HIV-1 MMX, v1.5 (HIV-1 MONITOR Master Mix, version 1.5) HIV-1 Mn 2+, v1.5 (HIV-1 MONITOR manganopløsning, version 1.5) Specifikke detektionsreagenser HIM DK AD3 (Amplikonfortyndingsreagens) IM PS1, v1.5 (HIV-1 probeopløsning 1, version 1.5) IM4, v1.5 (HIV-1 probeopløsning 2, version 1.5) IQ PS1, v1.5 (HIV-1 kvantitativ standard-probeopløsning 1, version 1.5) IQ4, v1.5 (HIV-1 kvantitativ standard-probeopløsning 2, version 1.5) Generiske detektionsreagenser DK DN4 (Denatureringsopløsning) CN4 (Avidin/horseradish-peroxidasekonjugat) SB3 (Substrat A) SB (Substrat B) COBAS AMPLICOR WB P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR vaskebuffer US: 83314 WB (10X-skyllekoncentrat) Nødvendige, men ikke medfølgende materialer Præamplifikation Reagensklargøringsområde COBAS AMPLICOR -A-ring monteret med 12 A-rør Holder til COBAS AMPLICOR -A-ring Eppendorf Multipette -pipette med 1,25 ml Eppendorf Combitip -reservoir (steril, enkeltpakket) Pipetter (kapacitet 50 μl og 100 μl)* med aerosolfilter eller RNase-frie stempelspidser Engangshandsker, uden pulver 14/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 8/2009, Revision 8.0
HIV-1 MONITOR Præamplifikation Prøve- og kontrolforberedelsesområde 2,0 ml rør med skruelåg, sterile (Sarstedt 72.694.006 eller lignende)** 1,5 ml rør med skruelåg, sterile (Sarstedt 72.692.105 eller lignende)** Tube-rack (Sarstedt 93.1428 eller lignende) 95% ethanol, til molekylærbiologi eller histologi (brug nyfortyndet til 70% med destilleret eller demineraliseret vand) Isopropylalkohol, reagenskvalitet Sterile overførselspipetter med lille spids, RNase-frie Sterile serologiske polystyren-engangspipetter (5 ml, 10 ml og 25 ml) Pipetter (kapacitet 12,5 μl, 25 μl, 50 μl, 100 μl, 200 μl, 400 μl, 500 μl, 600 μl, 800 μl og 1000 μl)* med aerosolfilter eller RNase-frie stempelspidser Mikrocentrifuge (maks. RCF 16.000 x g, min. RCF 12.500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M eller lignende Nedkølet ultracentrifuge og rotor med fast vinkel (45 grader, kapacitet til mindst 24 1,5 ml rør) med RCF på 23.600 x g (Heraeus 17RS med HFA 22,1-rotor, Biofuge 28RS eller lignende) Vortex-mixer Engangshandsker, uden pulver Post-amplifikation Amplifikations-/detektionsområde COBAS AMPLICOR -analyseinstrument og printer Brugerhåndbog til COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet Valgfrit: AMPLILINK-software, herunder: Datastation til AMPLILINK-softwaren, med printer Applikationsmanual til AMPLILINK Software Version 3.2 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan - analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet og COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet (til brug med AMPLILINK Software, v3.2 Series) eller applikationsmanual til AMPLILINK Software Version 3.3 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet og cobas p 630-instrumentet (til brug med AMPLILINK Software, v3.3 Series) Rack med D-kopper Destilleret eller demineraliseret vand 5 ml serologiske pipetter Vortex-mixer Engangshandsker, uden pulver * Pipetter må højst afvige 3% fra den angivne volumen. Der skal anvendes aerosolfilter eller RNase-frie stempelspidser, hvor dette er angivet, for at undgå krydskontaminering af prøver og amplikoner. ** Der skal bruges rør med skruelåg til klargøring af prøver og kontroller for at undgå stænk og potentiel krydskontaminering af prøver og kontroller. Brug ikke rør med snaplukning. 8/2009, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 15/52
Indsamling, transport og opbevaring af prøver Bemærk! Håndtér alle prøver som potentielle overførere af smitstoffer. Indsamling af prøver COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 er kun beregnet til plasmaprøver. Blod skal indsamles i sterile rør ved hjælp af EDTA (lavendelblå top) eller ACD (gul top) som antikoagulant. Prøver, der er antikoaguleret med heparin, egner sig ikke til denne test. Opbevar fuldblod ved 2-25 C i højst 6 timer. Brugen af ACD-antikoagulerede prøver giver testresultater, der er omkring 15% lavere end resultater, der er opnået med EDTA-antikoagulerede prøver, på grund af fortyndingseffekten af de 1,5 ml ACD-antikoagulant, der er til stede i blodprøveglasset. Figur 1 viser virkningen af ACD- og EDTAantikoagulanter på HIV-1 RNA-resultater fra plasmaprøver. Figur 1 Sammenligning af ACD- og EDTA-antikoagulanter* * Dataene i Figur 1 blev genereret ved hjælp af AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test med prøveforberedelsesproceduren Standard. Separér plasma fra fuldblod inden 6 timer efter indsamling ved centrifugering ved 800-1600 x g i 20 minutter ved stuetemperatur. Overfør plasmaet til et sterilt polypropylen-rør. Transport af prøver Opbevaring af prøver Transport af fuldblod eller plasma skal foregå i henhold til nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer 35. Fuldblod skal transporteres ved 2-25 C og behandles inden for 6 timer efter indsamlingen. Plasma kan transporteres ved 2-8 C eller nedfrosset ved -20 C til -80 C. Plasmaprøver kan opbevares ved stuetemperatur i op til 1 dag, ved 2-8 C i op til 5 dage eller nedfrosset ved -20 C til -80 C. Det anbefales, at prøver opbevares som 600-700 μl-aliquoter i sterile 2,0 ml polypropylen-rør med skruelåg (f.eks. Sarstedt 72.694.006). Plasmaprøver kan nedfryses og optøs op til tre gange. Figur 2 viser dataene fra disse nedfrysnings- og optøningsundersøgelser. 16/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 8/2009, Revision 8.0
HIV-1 MONITOR Figur 2 Gennemsnitlige HIV-1-resultater fra tre puljer af HIV-1-positivt plasma efter 2, 3 og 4 nedfrysninger/optøninger* Brugsvejledning Bemærk! Bemærk! Bemærk! Bemærk! * Dataene i Figur 2 blev genereret ved hjælp af AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test med prøveforberedelsesproceduren Standard. Detaljerede oplysninger om betjening, udskrivning af resultater og fortolkning af markeringer, kommentarer samt fejlmeddelelser kan findes i (1) brugerhåndbogen til COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet og (2) ved brug af AMPLILINK Software v3.2 findes de i applikationsmanualen til AMPLILINK Software Version 3.2 Series til brug med COBAS AmpliPrepinstrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet og COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet, eller ved brug af AMPLILINK Software v3.3 findes de i applikationsmanualen til AMPLILINK Software Version 3.3 Series til brug med COBAS AmpliPrepinstrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet og cobas p 630-instrumentet. Alle reagenser skal have den omgivende temperatur før brug. Undersøg visuelt, at der er en tilstrækkelig volumen i alle reagenser, før testproceduren påbegyndes. Plasmaprøver skal have den omgivende temperatur før brug. Brug pipetter med aerosolfilter eller stempelspidser, hvor dette er angivet. Vær yderst omhyggelig for at sikre selektiv amplifikation. Der skal bruges rør med skruelåg til klargøring af prøver og kontroller for at undgå stænk og potentiel krydskontaminering af prøver. Brug ikke rør med snaplukning. Bemærk! COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 må kun køres i tilstanden Basic. Kørselsstørrelse Hvert kit indeholder reagenser til fire kørsler af 12 test, der kan udføres separat eller som to kørsler af 24 test. Det højeste antal prøver pr. Testkørsel er 24 (21 prøver + 3 kontroller). Der skal inkluderes mindst én kopi af hver af kontrollerne AMPLICOR HIV-1 ( ), AMPLICOR HIV-1 MONITOR Low (+) og AMPLICOR HIV-1 MONITOR High (+) i hver testkørsel (se afsnittet Kvalitetskontrol ). Prøveforberedelses- og amplifikationsreagenserne er pakket i engangsflasker til 12 test. Den mest effektive brug af reagenser, prøver og kontroller fås ved at behandle dem i batches, der kan ganges med 12. 8/2009, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 17/52
Bemærk! COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 må kun køres i tilstanden Basic. Arbejdsgang Reagensklargøring Prøve- og kontrolforberedelse Bemærk! Bemærk! Bemærk! COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 kan gennemføres på én dag eller over to dage. Hvis testen skal afsluttes på en enkelt arbejdsdag, skal du følge instruktionerne i Reagensforberedelse, prøve- og kontrolforberedelse samt Revers transskription, amplifikation og detektion i rækkefølge. Testen kan gennemføres over 2 dage ved at starte med prøve- og kontrolforberedelse på dag 1 efterfulgt af reagensforberedelse samt revers transskription, amplifikation og detektion på dag 2. For at udføre prøve- og kontrolforberedelse på dag 1 og revers transskription, amplifikation og detektion på dag 2 skal du udføre enten Standard-prøve- og kontrolforberedelse (trin A.1 til og med A.14) eller UltraSensitive-prøve- og kontrolforberedelse (trin B.1 til og med B.19) og opbevare de behandlede prøver som beskrevet i trin A.14 eller B.19. På dag 2 skal du starte med reagensforberedelse, derefter optø de behandlede prøver og kontroller ved stuetemperatur og gå videre til Standard-prøve- og kontrolforberedelse, trin A.15, eller UltraSensitive-prøve- og kontrolforberedelse, trin B.20, til revers transskription, amplifikation og detektion. Udført i: Præamplifikation Reagensklargøringsområdet 1. Fastlæg det relevante antal A-ringe, der skal bruges til testen af patientprøver og kontroller. Placér A-ringen(e) i A-ring-holderen eller -holderne. 2. Forbered Working Master Mix ved at tilsætte 100 μl HIV-1 Mn 2+, v1.5 i ét rør med HIV-1 MMX, v1.5. Det er ikke nødvendigt at måle Master Mixvoluminen. Tilsæt 100 μl HIV-1 Mn 2+, v1.5 til hele flasken med HIV-1 MMX, v1.5. Sæt låg på røret, og bland godt ved at vende røret 10-15 gange. Bland ikke Working Master Mix i en vortex-mixer. Den lyserøde farve i HIV-1 Mn 2+, v1.5 bruges som visuel bekræftelse på, at HIV-1 Mn 2+, v1.5 er blevet tilsat til Master Mix. Kassér det resterende HIV-1 Mn 2+, v1.5. Working Master Mix skal opbevares ved 2-8 C og anvendes højst 4 timer efter forberedelsen. 3. Tilsæt 50 μl Working Master Mix i hvert A-rør med en repetitionspipette eller en pipette med aerosolfilter eller stempelspids. Luk ikke A-rørslågene endnu. Kassér ubrugt Working Master Mix. 4. Placér den eller de A-ring(e), der indeholder Working Master Mix, i en genlukkelig plastpose, og luk posen omhyggeligt. Flyt A-ringen eller -ringene til området Præamplifikation Prøveforberedelse. Opbevar A-ringen eller -ringene med Working Master Mix ved 2-8 C i området Præamplifikation Prøveforberedelse, indtil klargøringen af prøver og kontroller er fuldført. Working Master Mix kan holde sig i 4 timer ved 2-8 C i A-rør, der er lukket inde i plastposen. Udført i: Præamplifikation Prøve- og kontrolforberedelsesområdet For at amplificere tidligere behandlede prøver og kontroller skal du først udføre trinnene i afsnittet Reagensforberedelse. Optø behandlede prøver og kontroller ved stuetemperatur, og fortsæt med Standard-prøve- og kontrolforberedelse, trin A.15, eller UltraSensitive-prøve- og kontrolforberedelse, trin B.20. Der dannes et bundfald i HIV-1 LYS ved opbevaring ved 2-8 C. Før brug skal den opvarmes ved 25-37 C og blandes grundigt for at opløse bundfaldet. Før brug skal du undersøge hver enkelt flaske med HIV-1 LYS mod en hvid baggrund for at se, om der er en gul farve eller tegn på utætheder. Hvis der er en gul farve eller tegn på utætheder, må den pågældende flaske ikke bruges. Kontakt det lokale Roche-kontor for at få en ny flaske. 18/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 8/2009, Revision 8.0
HIV-1 MONITOR Standard-prøve- og kontrolforberedelse A.1. A.2. A.3. Klargør 70% ethanol. Til 12 test skal du blande 11,0 ml 95% ethanol og 4,0 ml demineraliseret eller destilleret vand. Mærk ét 2,0 ml rør med skruelåg for hver patientprøve, og mærk yderligere tre rør med HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C og HIV-1 H(+)C. Klargør standardarbejdslysisreagenset. Bland HIV-1 QS, v1.5 i mindst 10 sekunder i vortex-mixer før brug. For hver batch på op til 12 prøver og kontroller skal du tilsætte 100 μl HIV-1 QS, v1.5 i én flaske HIV-1 LYS og blande grundigt. Det er ikke nødvendigt at måle voluminen af HIV-1 LYS. Den lyserøde farve i HIV-1 QS, v1.5 bruges som visuel bekræftelse på, at HIV-1 QS, v1.5 er blevet tilsat i HIV-1 LYS. Kassér det resterende HIV-1 QS, v1.5. Standardarbejdslysisreagenset kan holde sig i 4 timer ved stuetemperatur. Bemærk! Hvis du bruger frosne prøver, skal du optø disse ved stuetemperatur og blande dem i 3-5 sekunder i en vortex-mixer. Centrifugér prøverøret kort for at samle prøven i bunden af røret. Undgå omhyggeligt at kontaminere handsker, når du håndterer prøver. A.4. A.5. Tilsæt 600 μl standardarbejdslysisreagens til hvert af de mærkede rør, og sæt låg på dem. Kontrollér, at arbejdslysisreagenset er lyserødt for at bekræfte, at HIV-1 QS, v1.5 er blevet tilsat i HIV-1 LYS. Klargør standardkontroller på følgende måde: Bland NHP, HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C og HIV-1 H(+)C i 3-5 sekunder i vortex-mixer. Tilsæt 200 μl NHP i hvert af de tre kontrolrør. Sæt låg på rørene, og bland i 3-5 sekunder i vortex-mixer. Tilsæt 50 μl HIV-1 ( ) C i det rør, der er mærket HIV-1 ( ) C, og som indeholder standardarbejdslysisreagenset og NHP. Sæt låg på røret, og bland i 3-5 sekunder i vortex-mixer. Tilsæt 50 μl HIV-1 L(+)C i det rør, der er mærket HIV-1 L(+)C, og som indeholder standardarbejdslysisreagenset og NHP. Sæt låg på røret, og bland i 3-5 sekunder i vortex-mixer. Tilsæt 50 μl HIV-1 H(+)C i det rør, der er mærket HIV-1 H(+)C, og som indeholder standardarbejdslysisreagenset og NHP. Sæt låg på røret, og bland i 3-5 sekunder i vortex-mixer. A.6. A.7. Tilsæt 200 μl af hver patientprøve i de relevant mærkede rør med standardarbejdslysisreagens. Sæt låg på rørene, og bland i 3-5 sekunder i vortexmixer. Inkubér prøve- og kontrolrørene i 10 minutter ved stuetemperatur. A.8. Tag låget af hvert enkelt prøve- og kontrolrør, tilsæt 800 μl 100% isopropylalkohol (ved stuetemperatur), sæt låg på røret igen, og bland kraftigt i 3-5 sekunder i vortex-mixer. Åbn ikke mere end ét rør ad gangen. A.9. Placér et orienteringsmærke på hvert rør, og placér rørene i mikrocentrifugen med orienteringsmærkerne udad, så alle pellets flugter med orienteringsmærkerne. Centrifugér prøver og kontroller ved maksimal hastighed (12.500 16.000 x g) i 15 minutter ved stuetemperatur. 8/2009, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 19/52
A.10. Brug en ny engangsoverførselspipette med lille spids til hvert rør, og fjern og kassér supernatanten fra hvert rør, idet du omhyggeligt undgår at forstyrre pelleten (der muligvis ikke kan ses). Fjern så meget væske som muligt uden at forstyrre pelleten. Træk langsomt supernatanten tilbage, og lad væsken løbe helt væk fra siderne på røret. Brug ikke vakuumaspiration. A.11. Tilsæt 1,0 ml 70% ethanol (ved stuetemperatur) i hvert rør, sæt låg på igen, og bland i 3-5 sekunder i vortex-mixer. A.12. Placér rørene i en mikrocentrifuge med orienteringsmærkerne udad, og centrifugér rørene i 5 minutter ved maksimal hastighed (12.500 16.000 x g) ved stuetemperatur. A.13. Brug en ny engangsoverførselspipette med lille spids til hvert rør, og fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre pelleten. Pelleten skal være tydeligt synlig ved dette trin. Fjern så meget af supernatanten som muligt. Resterende ethanol kan hæmme amplifikationen. A.14. Tilsæt 400 μl HIV-1 DIL i hvert rør. Sæt låg på røret igen. Bland kraftigt i 10 sekunder i vortex-mixer for at resuspendere RNA-udtrækket. Der kan være noget uopløseligt materiale tilbage. Amplificér de behandlede prøver og kontroller inden for 2 timer efter forberedelse. Hvis amplifikationen ikke kan startes inden for 2 timer efter forberedelse, kan prøverne opbevares nedfrosset ved -20 C eller derunder i op til én uge med højst én nedfrysning/optøning. Hvis de nedfryses og optøs flere gange, kan det medføre tab af antallet af kopier. Bemærk! Hvis de behandlede prøver og kontroller blev opbevaret nedfrosset før amplifikation, skal de optøs ved stuetemperatur og blandes i 5 sekunder i vortexmixer, før du går videre til trin A.15. A.15. Tilsæt 50 μl af hver af de behandlede prøver og kontroller i de relevante A-rør med Working Master Mix ved hjælp af en pipette med aerosolfilter eller stempelspids. Brug en ny spids for hver prøve og kontrol. Undgå omhyggeligt at overføre bundfald, der ikke er gået tilbage i opløsningen. Sæt låg på A-rørene. A.16. Notér kontrollernes og prøvernes positioner i A-ringen eller -ringene. Amplifikationen skal startes senest 45 minutter efter tilsætning af de behandlede prøver og kontroller i A-rørene med Working Master Mix. Flyt de klargjorte prøver og kontroller i A-ringene til amplifikations-/detektionsområdet. Resten af de klargjorte prøver kan fryses ned og opbevares ved -20 C eller derunder i op til en uge med højst én nedfrysning/optøning. Hvis de nedfryses og optøs flere gange, kan det medføre tab af antallet af kopier. UltraSensitive-prøve- og kontrolforberedelse B.1. B.2. B.3. Forkøl ultracentrifugen og rotoren til 2-8 C som beskrevet i betjeningsvejledningen til ultracentrifugen. Klargør 70% ethanol. Til 12 test skal du blande 11,0 ml 95% ethanol og 4,0 ml demineraliseret eller destilleret vand. Mærk ét 1,5 ml rør med skruelåg for hver patientprøve, og mærk tre yderligere rør med HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C og HIV-1 H(+)C. 20/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 8/2009, Revision 8.0
HIV-1 MONITOR B.4. Klargør UltraSensitive-arbejdslysisreagenset. Bland HIV-1 QS, v1.5 i mindst 10 sekunder i vortex-mixer før brug. For hver batch på op til 12 prøver og kontroller skal du tilsætte 25 μl HIV-1 QS, v1.5 i én flaske HIV-1 LYS og blande grundigt. Det er ikke nødvendigt at måle voluminen af HIV-1 LYS. Den lyserøde farve i HIV-1 QS, v1.5 bruges som visuel bekræftelse på, at HIV-1 QS, v1.5 er blevet tilsat i HIV-1 LYS. Kassér det resterende HIV-1 QS, v1.5. UltraSensitive-arbejdslysisreagenset kan holde sig i 4 timer ved stuetemperatur. Bemærk! Hvis du bruger frosne prøver, skal du optø disse ved stuetemperatur og blande dem i 3-5 sekunder i en vortex-mixer. Centrifugér prøverøret kort for at samle prøven i bunden af røret. Undgå omhyggeligt at kontaminere handsker, når du håndterer prøver. B.5. B.6. B.7. B.8. Tilsæt 500 μl af hver patientprøve i de relevant mærkede rør. Tilsæt 500 μl NHP i hvert af de relevant mærkede kontrolrør. Placér et orienteringsmærke på hvert rør, og placér rørene i ultracentrifugen med orienteringsmærkerne udad, så alle pellets flugter med orienteringsmærkerne. Centrifugér prøver og kontroller ved 23.600 x g i 60 minutter ved 2-8 C. Brug en ny engangsoverførselspipette med lille spids til hvert rør, og fjern og kassér supernatanten fra hvert rør, idet du omhyggeligt undgår at forstyrre pelleten (der muligvis ikke kan ses). Fjern så meget væske som muligt uden at forstyrre pelleten. Træk langsomt supernatanten tilbage, og lad væsken løbe helt væk fra siderne på røret. Brug ikke vakuumaspiration. Bemærk! Viruspelleter fra trin B.8 i UltraSensitive-prøveforberedelsesproceduren kan holde sig i op til 6 timer ved stuetemperatur og i mindst 14 dage ved -20 C eller derunder. B.9. Tilsæt 600 μl arbejdslysisreagens i hvert enkelt af de mærkede rør, og sæt låg på rørene. Kontrollér, at arbejdslysisreagenset er lyserødt for at bekræfte, at HIV-1 QS, v1.5 er blevet tilsat i HIV-1 LYS. Bland røret i 3-5 sekunder i vortex-mixer for at resuspendere pelleten. B.10. Klargør UltraSensitive-kontroller på følgende måde: Bland HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C og HIV-1 H(+)C i 3-5 sekunder i vortex-mixer. Tilsæt 12,5 μl HIV-1 ( ) C i det rør, der er mærket HIV-1 ( ) C, og som indeholder UltraSensitive-arbejdslysisreagens. Sæt låg på røret, og bland i 3-5 sekunder i vortex-mixer. Tilsæt 12,5 μl HIV-1 L(+)C i det rør, der er mærket HIV-1 L(+)C, og som indeholder UltraSensitive-arbejdslysisreagens. Sæt låg på røret, og bland i 3-5 sekunder i vortex-mixer. Tilsæt 12,5 μl HIV-1 H(+)C i det rør, der er mærket HIV-1 H(+)C, og som indeholder UltraSensitive-arbejdslysisreagens. Sæt låg på røret, og bland i 3-5 sekunder i vortex-mixer. B.11. Inkubér prøve- og kontrolrørene i 10 minutter ved stuetemperatur. B.12. Tag låget af hvert enkelt prøve- og kontrolrør, tilsæt 600 μl 100% isopropylalkohol (ved stuetemperatur), sæt låg på røret igen, og bland kraftigt i 3-5 sekunder i vortex-mixer. Åbn ikke mere end ét rør ad gangen. B.13. Placér et orienteringsmærke på hvert rør, og placér rørene i mikrocentrifugen med orienteringsmærkerne udad, så alle pellets flugter med orienteringsmærkerne. Centrifugér prøver og kontroller ved maksimal hastighed (12.500 16.000 x g) i 15 minutter ved stuetemperatur. 8/2009, Revision 8.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 21/52