MIA FORA NGS HLA-typningskit Til in vitro-diagnostisk brug Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 550 West Avenue, Stamford, CT 06902 USA Tlf: +1 (203) 328-9500 eller (888) 329-0255, Fax: +1 (203) 328-9599 WWW.IMMUCOR.COM Produktdokumentation og oversættelser fås hos: www.immucor.com P R O D U K T I N D L Æ G S S E D D E L INDHOLDSFORTEGNELSE Definition af anvendte symboler... 1 Prøveindsamling og klargøring... 4 Reagenser efter katalognummer.. 2 Procedure. 5 Tilsigtet brug. 3 A. Leverede materialer 5 Oversigt og forklaring.. 3 B. Påkrævede, men ikke leverede materialer. 5 Principper for proceduren... 3 Brugsanvisning 5 Reagenser 3 Kvalitetskontrol 12 A. Identifikation.. 3 Begrænsning for proceduren.. 12 B. Advarsler og forholdsregler. 3 Specifikke ydelseskarakteristika 13 C. Opbevaringsvejledning 4 Fejlfinding. 14 D. Rensning eller behandling før anvendelse.. 4 Begrænsede licenser.. 15 E. Tegn på utilstrækkelig stabilitet. 4 Producentinformation. 15 Instrumentkrav... 4 Anvendte varemærker... 15 Definition af anvendte symboler Batchkode Katalognummer Temperaturgrænse Anvendes senest Serienummer SN Tilstrækkeligt til <n> prøver Forsigtig Se brugsanvisningen Producent Autoriseret repræsentant i Det Europæiske Fællesskab In vitro-diagnostisk medicinsk udstyr Indeholder CONT Conformité Européene Side 1 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)
REAGENSER EFTER KATALOGNUMMER MIA FORA NGS HLA-masterkit, varenummer SR-800-10377 bestående af MIA FORA NGS HLA-reagenskit til typning (SR-800-10365) og magnetisk beadkit (SR-800-10379). MIA FORA NGS HLA-reagenskit til typning (SR-800-10365): a) PCR-reagenser: Bestående af ni (9) individuelle hætteglas Reagens Produktnummer Fyldningsvolumen Opbevaring 1 HLA-A PCR-blanding SR 800 00326 2 HLA-B PCR-blanding SR 800 00327 3 HLA-C PCR-blanding SR 800 00328 HLA-DPA1 PCRblanding 4 HLA-DPB1 PCRblanding 5 HLA-DQA1 PCRblanding 6 HLA-DQB1 PCRblanding 7 HLA-DRB1-S PCRblanding 8 HLA-DRB1-L PCRblanding 9 SR 800 00329 SR 800 00330 SR 800 00331 SR 800 00332 SR-800-00333 SR-800-00334 450 µl -20 til -80 C 24 b) Klargøring af reagenser til bibliotek: Bestående af tolv (12) individuelle hætteglas Reagens Produktnummer Fyldningsvolumen Opbevaring 10 Fragmentationsenzym SR-800-00335 67 µl 11 Fragmentationsbuffer SR-800-00336 168 µl 12 STOP-buffer SR-800-00337 225 µl 13 Enzymblanding til endereparation SR-800-00338 34 µl 14 Buffer til endereparation SR-800-00339 168 µl 15 Enzym til A-hale SR-800-00340 17µl 16 Buffer til A-hale SR-800-00341 118 µl 17 Ligase enzym SR-800-00342 34 µl 18 2X ligasebuffer SR-800-00343 917 µl 19 PCR enzym/bufferblanding SR-800-00344 84 µl 20 Amplifikationsprimere SR-800-00345 12 µl 21 Nukleasefrit vand SR-800-00362 85 µl -20 til -80 C 24 c) Adapterplade (SR-800-00349): Beskrivelse Varenummer Fyldningsvolumen Opbevaring Indeksadapter-plade Tre fyldte kolonner af en 96- brøndplade SR-800-00349 5 µl/brønd -20 til -80 C Magnetisk beadkit (SR-800-10379): a) Magnetiske beads: Bestående af et (1) hætteglas Beskrivelse Delnr. Fyldningsvolumen Opbevaring Fyldt hætteglas, Agencourt AMPure XP-bead SR-800-00378 5 ml 2 til 8 C Side 2 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)
TILSIGTET BRUG MIA FORA TM NGS HLA-typningskittet er beregnet til amplifikation og sekventering af HLA-generne HLA -A, -B, -C, -DRB, - 1/3/4/5, -DQA1, -DQB1, -DPA1 og -DPB1 på Illumina NGS-sekventeringsplatformen. MIA FORA-softwaren er beregnet til at bruges som vejleder til at bestemme HLA-type fra de data, der genereres med MIA FORA NGS HLA-bibliotekskittet. Prøven er beregnet til brug i et laboratorium, der kan håndtere DNA til amplifikation og sekventering. OVERSIGT OG FORKLARING Sekvensbaseret typning af HLA-geners PCR-forstærkede exoner er en almindelig laboratorieprocedure. PCR-amplifikation bruges til at berige målrettede sekvenser, og den efterfølgende HLA-typning bestemmes for de udvalgte regioner. Andre metoder, såsom sekvensspecifik oligonukleotid-sonde (SSOP), sekvensspecifik primer til ekstensionsanalyse (SSP) har også været brugt til at bestemme HLA-typning. MIA FORA NGS HLA-typningssystemet er en ny HLA-typningsmetodologi, der udnytter muligheden for at fange alle relevante regioner af HLA-loci af langtrækkende PCR. Ni PCR-masterblandinger, der indeholder alle nødvendige komponenter til at forstærke hvert gen, herunder enzymer, buffere, dntp er og primere for langtrækkende PCR-amplifikation, leveres i kittet. Det amplificerede DNA kan derefter behandles ved hjælp af MIA FORA NGS HLA-bibliotekskittet til at generere DNA-biblioteket til sekvensering på Illumina-sekventeringsplatformen. Kittet giver mulighed for, at op til 24 prøver kan sekventeres med multipleksing ved hjælp af Illumina-sekventeringsplatformen. PRINCIPPER FOR PROCEDUREN MIA FORA NGS HLA-typningskittet er beregnet til at bestemme typningen af Klasse I og Klasse II HLA-loci ved at sekvensere hele genet eller de mest informative exoner og introner. MIA FORA NGS HLA-typningskittet bruger langtrækkende PCR til at fange og berige de store HLA-gener, HLA -A, -B, -C, -DQA1, -DQB1, -DPA1 -DPB1 og -DRB1/3/4/5. MIA FORA NGS-klargøring af reagenser til bibliotekskittet genererer et bibliotek fra det amplificerede DNA til sekvensering på Illuminasekventeringsplatformen. MIA FORA NGS HLA-typningssoftwaren giver rækkefølgen af de relevante HLA-gener og faseoplysninger til at opnå højopløsnings HLA-typning. REAGENSER A. Identifikation Se tabellerne i afsnittet Reagenser efter katalognummer for at få en komplet liste over produkter og katalognumre. B. Advarsler og forholdsregler 1. Må kun bruges til in vitro-diagnostik inden for den Europæiske Union. 2. Resultaterne fra disse kits bør ikke anvendes som eneste grundlag, hvorpå en klinisk beslutning, der påvirker patienten foretages. 3. Separate laboratorier eller lukkede laboratorierum bør udpeges til både præ-pcr-manipulationer og til post-pcrmanipulationer. 4. Separate pipetter bør udpeges til både præ-pcr-manipulationer og til post-pcr-manipulationer. 5. Biologisk fare: Alle biologiske prøver og blodprøver skal behandles som potentielt smittefarlige. Brug universelle forholdsregler ved håndtering. 6. Pipetter aldrig med munden. Undgå at reagenser og prøver får kontakt med hud og slimhinder. 7. Bortskaf anvendte materialer i overensstemmelse med institutionens og/eller de lokale regler for bortskaffelse af potentielt biofarlige materialer. 8. PCR-teknologien er modtagelig for forurening, især fra dens eget produkt. Aerosoler af PCR-amplikoner, der genereres under post-pcr-trinene, er en hyppig kilde til forurening. Således skal det sikres, at overdreven sprøjt og generering af aerosoler forhindres. Standard PCR-laboratorieforanstaltninger, der omfatter aftørring af arbejdsoverflader med et frisklavet 10 % blegemiddel før forarbejdning eller klargøring af PCR-prøver, brug af ultraviolet (UV) lys i stinkskabe eller biosikkerhedskabinetter imellem brug, rummæssig og tidsmæssig adskillelse af præ- og post-pcr-aktiviteter, brug af alikvote PCR-reagenser, brug af positive og negative kontroller etc. bør også følges under brug af kittet. Anvendelse af ensartet, omhyggelig teknik kombineret med rigelig indarbejdelse og overvågning af kontroller vil sikre en årvågen, proaktiv metode til kontrol og overvågning af PCR-kontaminering. 9. Laboratorier bør validere deres egne rengøringsprocedurer. 10. Forurening af reagenser eller prøver kan forårsage fejlagtige resultater; derfor bør der udvises forsigtighed for at undgå at produktet forurenes under brug. Anvend ikke forurenede reagenser. 11. Brug kitvæskerne som leveret. Fortynding eller ændring kan generere fejlagtige resultater. Bland ikke reagenser mellem forskellige partier. 12. Brug ikke utætte eller umærkede hætteglas. 13. Tidligere frosne prøver eller reagenser skal blandes grundigt og derefter centrifugeres efter optøning inden prøvningen. Undgå at generere skum og bobler i prøverne. 14. Hold alle enzymer og masterblandinger på is eller cryo-blok (2-8 C) ved optøning. 15. Det skal sikres, at prøverøret er forseglet korrekt før forstærkning, så fordampning forhindres. 16. På grund af iboende forskelle i mekanismerne ved termocykler-ydeevne, kan der forekomme variation i resultaterne, når indstillede termoprofiler overføres mellem forskellige mærker og modeller af termocykler-instrumenter. I nogle tilfælde kan reaktionsspecificitet og -sensitivitet blive kompromitteret, hvilket fører til forkert fortolkning og rapportering af data. Alternative termocyklere og profiler skal valideres af brugeren. 17. Andre inkuberingstider eller -temperaturer end de specificerede kan give fejlagtige resultater. Side 3 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)
18. Afvigelse fra den anbefalede brugsanvisning kan medføre at produktets ydeevne bliver mindre end optimal. Afhængigt af arten og alvorligheden af afvigelsesanalysen, kan der forekomme svigt (individuel prøve- samt kørefejl) og/eller fejlagtige resultater. For eksempel har vi bestemt, at brugen af utilstrækkelig/inaktiv bead-rensning i analysen kan medføre en høj forekomst af indeksadapter-fejlkald. 19. Det anbefales at udføre gelelektroforese til analysen af HLA-genamplifikationsprodukter efter størrelse. PCR-produkter bør være visualiseret med ethidiumbromid eller GelRed; andre farvestoffer kan vise svage bånd. 20. Magnetiske beads er brugt i flere trin i protokollen. Det er vigtigt at fjerne ethanol, før du fortsætter til elueringstrinnet uden at lade beads overtørre. Overfladen af de magnetiske beads bør se glasagtig ud, uden synlige væske-pools. Passende tørretid kan bestemmes empirisk i hvert laboratoriemiljø (5-10 minutter). 21. Brug fortyndet frisk 80 % ethanol til hver bead-rensning. 22. Efter hver bead-rensning er der et sikkert stoppunkt, hvorved prøverne eller biblioteket kan opbevares ved -20 C i op til 4 dage. 23. Beskyt PicoGreen -pladerne mod lys for at undgå blegning. 24. Det er afgørende, at fragmentationsreaktionen ikke overstiger 20 minutter og at bead-rensningen udføres med det samme for at sikre korrekt fragment-størrelsesområde. 25. Den A-halede plade skal fortsætte direkte til adapterens ligationstrin. 26. Når du forbereder indeksadapterens ligationsplade, skal du bruge rene handsker under håndteringen af adapterpladen. Fjern forsigtigt pladens segl. Kontroller, at alle brønde i kolonne 1, 2 og 3 indeholder ca. 5 µl opløsning. 27. Det amplificerede bibliotek bør renses senest 1 time efter amplikation. 28. Bibliotekets post-amplifikationstrin skal udføres i et sekventeringsrum eller i et AirClean PCR-kabinet for at undgå kontaminering af indeksadapter-forbundet DNA med færdige produkter, der indeholder Illumina-klyngesekvenser. 29. Opsætning til bibliotekskvantificering af qpcr eller Qubit skal ske i et PCR-stinkskab og med frisk fortyndingsbuffer for qpcr for at undgå forurening. 30. Udfør prøvedenaturering med frisk 0,2 N natriumhydroxid. 31. Udfør al sekvensstyring post-kørsel og vedligeholdelsevask og regelmæssig rengøring. C. Opbevaringsvejledning 1. Opbevar MIA FORA NGS HLA-typningskittet under -20 ºC i en fryser, der skal afrimes manuelt. 2. Komponenterne må ikke anvendes efter udløbsdatoen. 3. Opbevar magnetiske beads ved 2-8 C. D. Rensning eller behandling for anvendelse Se "Prøveindsamling og klargøring." E. Tegn på utilstrækkelig stabilitet 1. Hvis salte har udfældet sig af opløsningen under forsendelse eller opbevaring, skal de genopløses helt inden brug ved at vortexe ved stuetemperatur (18-30 C). INSTRUMENTKRAV 1. Termocykler udstyret med et opvarmet låg, justerbare rampetider og et minimalt termisk område på 2 C til 100 C og en nøjagtighed på mindst +/- 0,5 C. Forholdene for termocyklere skal muligvis ændres for at optimere profilerne. Veriti termocykler fra Applied Biosystems er blevet valideret, mens den kører i standardtilstand med en rampefrekvens på (3,9 ºC/sek). 2. Relevant fluorescerende pladelæser med excitationsfilter ~ 485 nm og emissionsfilter ~ 535 nm til måling af DNA-koncentration, såsom Victor X2, X3 er blevet valideret. 3. Passende metode/apparat til isolering og oprensning af DNA-fragmenter med en størrelse på omkring 400-500 basepar. Pippin Prep TM -instrumentet er et sådant apparat til udvælgelse af størrelse, der er blevet valideret. 4. Valgfrit væskehåndteringssystem til semiautomatiseret bibliotekskonstruktion. Biomek 4000 er et sådant system, der er blevet valideret. 5. Passende metode/apparat for bibliotekskvantificering, såsom qpcr eller Qubit. 6. Illumina sekventeringsplatform der er blevet valideret. 7. MIA FORA NGS-server og software: Immucor varenummer SR-790-00017. PRØVEINDSAMLING OG KLARGØRING Humant genomisk DNA kan renses fra fuldblod og buffy coats ved hjælp af en valideret metode, der opfylder nedenstående kriterier. DNA ekstraheret fra blod bevaret i EDTA er blevet testet og påvist at have den forventede ydeevne i denne analyse. DNA ekstraheret fra blod bevaret i heparin kan ikke bruges i denne analyse. Den isolerede DNA bør være i 10 mm Tris-HCl, ph 8,0-9,0 eller i nukleasefrit vand. Hvis en chelatdanner, såsom EDTA, er tilstede, bør den endelige koncentration af chelatdanneren ikke overstige 0,5 mm. Den endelige DNA-koncentration bør være 5 til 15 ng/µl. Absorbansmålinger af DNA-prøven på 260 og 280 nm bør give et forhold på 1,65 til 2,0. DNA kan anvendes umiddelbart efter isolation eller opbevares ved -20 C i op til 1 år. Gentagen frysning/optøning bør undgås, da dette kan medføre forringelse af DNA. Mindst 50 % af genomiske DNA-prøver skal have fragmenter, der er større end 10 kb for vellykket langtrækkende PCR-amplifikation. Side 4 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)
PROCEDURE A. Leverede materialer (Se tabel i afsnittet Reagenser efter katalognummer for at få specifikke oplysninger) PCR-reagenser Reagenser for klargøring af bibliotek, indeksadapterplade, Ampure -magnetiske beads B. Materialer, reagenser og udstyr, der er påkrævet, men ikke leveres Termocyklere: ABI Veriti -termocykler er blevet valideret Magnetiske stativer til lavvolumen-eluering i 96-brøndplader: Alpaqua Magnum FLX er blevet valideret Magnetiske stativer til magnetisk separation af mikrocentrifugerør: DynaMag-2 Magnet er blevet valideret Bench top plade-spinner og mikrocentrifugerør-spinner Pipettorer, multikanalpipettorer og spidser (1-20 µl, 20-200 µl, 1000 µl) Selvklæbende segl til PCR-plader. Accuseal selvklæbende PCR-film (E & K Scientific kat. nr. T796150, 4titude kat. nr. 4ti-0500) er blevet valideret 1,5 ml centrifugerør og PCR-strip-rør Vortex-mixer Hårde- fuld højde 96-brønds semi-skørt plader (E & K Scientific kat. nr. EK-75012, 4titude kat. nr. 4ti-0770/C) Plade 96-brønds PP sort, v-sort, v-bunds skorstensstil (E & K Scientific kat. nr. 21209, Greiner Bio-One kat. nr. 651209) MicroAmp optisk 96-brønds reaktionsplade (ThermoFisher kat. nr. N8010560) MicroAmp optisk forseglingstape, avanceret klæbemiddel (E& K Scientific kat. nr. T796400, ThermoFisher kat. nr. 4311971) Reagensreservoirer Klare forseglingstapepuder Aluminium forseglingstape Linsepapir Filtreret (aerosolresistente) engangspipettespidser, der dækker området 0,1μl til 1000 μl Ethanol 100 % af molekylærbiologi kvalitet 10 mm Tris-HCl ph 8,0 100 % Tween 20 Natriumhydroxid,1 N Nukleasefrit vand 1,5 % agarose, farvestoffrit, interne standarder, Pippin Prep TM, 250 bp - 1,5 kb, (Sage Science,CDF1510) PhiX Control, v3 (Illumina kat. nr. FC-110-3001) Reagenser for fluorescerende DNA-koncentrationsbestemmelse: Quant-iT Picogreen dsdna-analysesæt er blevet valideret MiSeq V2 300 cyklussæt (Illumina kat. nr. MS102-2002) MiniSeq Reagenssæt for midt-output, 300 cykler (Illumina kat. nr. FC-420-1004) Kvantificeringsmetode/-sæt/-apparat til nøjagtigt bibliotek: Både KAPA-biblioteks kvantificeringssæt og Qubit fluorometer er blevet valideret BRUGSVEJLEDNING Analysen for en kørsel med 24 prøver kan udføres ved hjælp af den manuelle protokol beskrevet nedenfor. Detaljerede manuelle analyseprotokoller for 8, 16 eller 24 prøver og automatiseret protokol for 24 prøver ved brug af Biomek 4000 er tilgængelige fra din tekniske salgsspecialist hos Immucor. BEMÆRK: Vær særdeles forsigtig ved alikvotprocessen. Brug kalibrerede pipetter. Undladelse kan resultere i reagenstab og analysesvigt. Alle temperaturer skal opretholdes nøjagtigt. Bring magnetiske beads til stuetemperatur før anvendelse. Det forstærkede produkt kan opbevares i op til 4 dage ved -20 C før brug. Det forstærkede produkt kan kun fryses og optøes én gang. Gentagen nedfrysning og optøning kan medføre forringelse af forstærket produkt og kan give dårlige resultater, hvis det bruges til at generere bibliotek. A. Genomisk DNA-oprensning Oprens genomisk DNA ved hjælp af valgfri metode. DNA-prøvekrav er som følger: Genomiske DNA-prøver skal udvindes fra fuldblod eller buffy coat ved hjælp af en DNA-ekstraktionsmetode, der kan generere DNA af høj molekylevægt. DNA skal fortyndes i nukleasefrit vand og opbevares ved -20 o C eller derunder. Den endelige DNA-koncentration skal ligge mellem 5-15 ng/µl, idet alle prøver skal holdes på lignende koncentrationer. Juster eventuelt med nukleasefrit vand. Mindst 50 % af uddragne genomiske DNA-fragmenter bør være 10 kb eller større for vellykket langtrækkende PCR. Side 5 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)
B. DNA-amplifikation (PCR) PCR-opsætning 1. Udfyld stregkodefilen til prøver (en Windows kommasepareret CSV-fil) med prøvenavne og stregkodetildelinger, som vist i figur 1. Figur 1. Eksempel på stregkodefil til prøver 2. Opret et projekt i MIA FORA-softwaren efter at en stregkodefil til prøver med prøvenavne og -stregkoder er oprettet. Dette projektnavn er nødvendigt for sekvensatorens kørselsnavn. 3. Etikker tre hård-skal, semi-skørt 96-brønds PCR-plader. 4. Klargør en prøveplade med 100 µl af genomisk DNA pr. brønd til hver prøve ved en koncentration på 5-15 ng/µl fortyndet i nukleasefrit vand. Prøvepladen skal være arrangeret i kolonne 1, 2 og 3 i en 96-brønds plade, som vist i prøvepladen i figur 2. Brønd A1 bør være den negative kontrol (NTC) for 10 mm Tris-HCl ph 8,0, der ikke indeholder DNA, efterfulgt af prøve 1 i B1, prøve 2 i C1 og fortsæt med op til prøve 23 i H3 (figur 2, PRØVEPLADE). 5. Optø PCR-masterblandingerne (P1-P9), bland ved vending eller bland kort på vortex-mixer og spin ned. 6. Centrifuger prøvepladen fra trin 4 i en centrifuge med en pladeholder i 2 min. for at sikre, at genomisk DNA er nederst i brønden. 7. Dispenser 15 µl af PCR-blandingerne P1-P9 i kolonnerne 1-9 af hver af de tre hård-shell, semi-skørt 96-brønds PCR-plader, således at hvert brønd i en kolonne har samme PCR-mix (figur 2). 8. Dispenser omhyggeligt for at undgå bobler i PCR-masterblandingen. 9. Dispenser prøverne fra prøvepladen med en multikanalpipette som følger (figur 2): Kolonne 1 fra prøveplade: 10 µl NTC og prøverne 1-7 i kolonne 1 (A1-H1) til hver af de ni kolonner i PCR-plade 1. Kolonne 1 fra prøveplade: 10 µl af prøverne 8-15 i kolonne 2 (A2-H2) til hver af de ni kolonner i PCR-plade 2. Kolonne 1 fra prøveplade: 10 µl af prøverne 16-23 i kolonne 3 (A3-H3) til hver af de ni kolonner i PCR-plade 3. BEMÆRK: Prøverne skal blandes forsigtigt for at undgå bobler i PCR-masterblandingen, som vist i figur 2. 10. Forsegl PCR-pladerne med selvklæbende PCR-film. Centrifuger PCR-plader en kort tid, placer dem i 3 separate termocyklere og kør MIA FORA HLA_PCR-programmet ved brug af opvarmet låg-indstilling, se tabel 1. SIKKERT STOPPUNKT PCR-produkter kan opbevares ved -20 ºC i op til 4 dage, indtil de er klar til genbalanceringstrinnet. Side 6 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)
Figur 2. Arrangement af prøver og PCR-opsætning Tabel 1. Termocyklerbetingelser for amplifikation Cyklusser (15) Cyklusser (20) Første vent Denaturering Afkøl Ekstension Denaturering Afkøl Ekstension Endelig ekst Vent 94 C/30 sek 94 C/1 m 15 sek 60 C/30 sek 66 C/7 m 30 sek 94 0 C /30 sek 60 0 C /30 sek 66 0 C /7m 30 sek 66 C/10 min 4 C/ 11. Valgfri: Amplifikation kan verificeres ved at køre et par repræsentative prøver på en 0,8 % agarosegel, der indeholder ethidiumbromid eller GelRed. Elektroforese bør gennemføres ved 90 volt i 40 minutter. PCR-fragmenter kan variere mellem prøver på grund af forskelle i introner. De omtrentlige størrelser på PCR-produkter er vist i tabel 2. Tabel 2: Størrelser på amplifikationsprodukter HLA-Locus Størrelse (kb) HLA-A 3,2 HLA-B 4,1 HLA-C 4,4 HLA-DPA 5,0 HLA-DPB 5,2 HLA-DQA 5,8 HLA-DQB 6,3 HLA-DRB1 0,9 HLA-DRB2 5,6 C. Afstemning og pooling af PCR-produkter Koncentrationen af hvert PCR-produkt kan bestemmes ved hjælp af en passende fluorescerende DNA-kvantificeringsreagens, såsom PicoGreen. Baseret på fluorescensmålingerne er PCR-produkter fra alle ni PCR-reaktioner for hver prøve afstemt og poolet i henhold til output fra SironaQuant TM, som fås på MIA FORA NGS HLA-systemet. De poolede prøver renses derefter som klargøring til fragmentering. Side 7 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)
Afstemning og pooling Figur 3. Opsætning af PicoGreen -analyse 1. Kvantificer PCR-produkter ved hjælp af PicoGreen -reagenser: Bring PicoGreen -reagens til stuetemperatur og fortynd det med 1 X TE-buffer (50 µl PicoGreen + 7450 µl 1xTE). Vortex for at blande og beskyt det mod lys indtil brug. Bemærk: Følg reagensernes indlægsseddel, hvis der anvendes andre reagenser til PCR-kvantificering. 2. Klargør seriefremstillede fortyndede standarder i mikrocentrifugerør ved hjælp af 100 ng/µl-kontrollen, der leveres med PicoGreen -kittet. Dispenser 20 µl af hver standard i PicoGreen -plade 1 (sort fuld-skørt måleplader), brønd A10 - E12 som vist i figur 3. Overfør 20 µl 1 x TE-buffer til PicoGreen -plade 1, brønd F10, F11, F12, som vist i figur 3. 3. Tilføj 20 µl fortyndet PicoGreen til hver brønd i de tre PicoGreen -plader, herunder standardbrønde i plade 1, som vist i Figur 3. 4. Tilføj 19 µl 1 x TE-buffer til tre PicoGreen -plader i samme format som de tre PCR-plader. Tilføj 1 µl PCR-produkter til tre PicoGreen -plader, så arrangementet matcher de oprindelige PCR-plader og så der laves 1:20 fortynding af PCRprodukter. Den endelige volumen er 40 µl i alle målte brønde. 5. Centrifuger pladen og inkuber ved stuetemperatur i mindst 5 min. Beskyt pladerne mod lys under inkubationen. 6. Mål fluorescens med filter med excitation ~ 485 nm/emission ~535 nm, 0,1 sek (Victor X3). 7. Gem outputfilen ved hjælp af følgende navngivningskonvention: (Bemærk: Windows: brug tabulatorsepareret tekst; Mac OS: brug Windows formatteret tekst). Projekt_KOLONNE1_Dato.txt (f.eks. ProjektX_KOLONNE1_123115.txt) Projekt_KOLONNE2_Dato.txt (f.eks. ProjektX_KOLONNE2_123115.txt) Projekt_KOLONNE3_Dato.txt (f.eks. ProjektX_KOLONNE3_123115.txt) Kør SironaQuant-afstemningssprogrammet i MIA FORA-softwaren. Anbefalet pmol-værdi er fra 0,0035 til 0,0009 pmol. 8. Spin PCR-plader ned og etiketter en ny plade til næste trin som Projekt_pooled PCR_dato. 9. Fortynd PCR-produkter fra hver locus med 10 mm Tris-HCl-buffer ph 8,0 i henhold til SironaQuant-output inden pooling. 10. Konsolider PCR-produkter fra alle 9 PCR-reaktioner for hver prøve ved at overføre mængder, der er angivet i SironaQuant-output. 11. Forsegl pladerne og opbevar dem ved -20 C, hvis du ikke straks fortsætter til bead-rensningstrinnet. 12. Bring de magnetiske beads til stuetemperatur og bland magnetiske beads med vortex for at genopløse beads jævnt. 13. Tilsæt 55 µl beads pr. brønd af konsoliderede prøver. Bland DNA og beads godt ved at pipettere op og ned mindst 10 gange. 14. Inkuber DNA-beadblandingen ved stuetemperatur i 10 minutter. Overfør pladen til magneten i 5 minutter. 15. Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre beads, mens pladen er på magneten. 16. Lad pladen forblive på magneten for ethanolvasktrinnet. Tilsæt 200 µl frisk fortyndet 80 % ethanol til hver brønd, inkuber i 30 sekunder og fjern derefter omhyggeligt og kassér ethanolen. 17. Gentag ethanolvask to gange (i alt 3 vask). Fjern alle spor af ethanol efter den tredje vask. 18. Fjern pladen fra magneten og lad beads lufttørre. Overfladen af de magnetiske beads skal se glasagtid ud uden synlige væske-pools. Den omtrentlige tørretid kan bestemmes empirisk for hvert laboratoriemiljø (5-10 minutter). 19. Tilsæt 35 µl 10 mm Tris-HCl ph 8,0 ved stuetemperatur til hver brønd. Bland grundigt ved pipettering og inkuber i 5 minutter. 20. Pladen anbringes på magneten, og der inkuberes i 5 minutter eller indtil opløsningen er klar. 21. Med pladen på magneten skal 30 µl af eluatet overføres til den nye 96-brønds PCR-plade mærket: Projekt_afstemt_ren_dato. SIKKERT STOPPUNKT Poolede og rensede produkter kan opbevares ved -20 ºC i op til 4 dage, indtil de er klar til fragmenteringstrinnet. Side 8 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)
D. Opførelse af sekventeringsbibliotek a. Fragmentering 1. Indstil en laboratoriumstimer til 20 minutter inden trin 8. 2. Overfør 20 µl stopbuffer fra rør 12 til hver brønd i kolonne 11 i den nye 96-brøndplade mærket som fragmenteringsplade. 3. Klargør masterblanding til fragmentering ved at overføre 134 µl fra rør 11 (fragmenteringsbuffer) til rør 10 (fragmenteringsenzym). Blandes grundigt på vortex-mixer og centrifugeres kort. 4. Med pipette overføres 23 µl masterblanding til fragmentering, som er klargjort i trin 3 til hver brønd i fragmenteringspladens kolonne 12, så der oprettes en "reservoir"-kolonne med masterblanding. 5. Fra kolonne 12 overføres 6 µl masterblanding til fragmentering til hver brønd i fragmenteringspladens kolonne 1, 2 og 3. 6. Overfør 14 µl af prøven fra den poolede, bead-rensede plades kolonne 1 fra det foregående afsnit (Projekt_Afstemt_ren_dato) til fragmenteringspladens kolonne 1. Bland ved at pipettere op og ned 5 gange. 7. Overfør 14 µl af prøven fra den poolede, bead-rensede plades kolonne 2 fra det foregående afsnit (Projekt_Afstemt_ren_dato) til fragmenteringspladens kolonne 2. Bland ved at pipettere op og ned 5 gange 8. Overfør 14 µl af prøven fra den poolede, bead-rensede plades kolonne 3 fra det foregående afsnit (Projekt_Afstemt_ren_dato) til fragmenteringspladens kolonne 3. Bland ved at pipettere op og ned 5 gange. 9. START TIMEREN og inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter. Det er afgørende, at reaktionen ikke overstiger 20 minutter. 10. Efter 20 minutters inkubation skal 5 µl STOP-buffer straks overføres fra kolonne 11 til kolonne 1, 2 og 3 og blandes grundigt ved at pipettere op og ned 5 gange efter hver tilsætning. 11. Overfør med pipette 200 µl magnetiske beads ved stuetemperatur til hver brønd i kolonne 10 i den fragmenterede prøveplade eller til et rent PCR-strip-rør. 12. Fra kolonne 10, tilsæt 40 µl magnetiske beads til hver brønd med det fragmenterede DNA og bland det langsomt ved at pipettere op og ned 10 gange. Inkuber DNA-beadblandingen ved stuetemperatur i 10 minutter. 13. Overfør pladen til magneten i 5 minutter for at binde beads til siderne af brøndene og kasser omhyggeligt supernatanten ved hjælp af en pipette. 14. Lad pladen forblive på magneten for ethanolvasktrinnet. Vask hver brønd med 200 µl 80 % ethanol, inkuber i 30 sekunder, og fjern forsigtigt væske med en multikanalpipette uden at forstyrre beads. 15. Gentag ethanolvask en gang mere så der vaskes 2 gange i alt. 16. Fjern pladen fra magneten og lufttør for at fordampe overskydende ethanol, indtil pillen af magnetiske beads har et glasagtigt udseende. 17. Fjern pladen fra magneten. Tilsæt 20 µl 10 mm Tris-HCl buffer ph 8,0, som har stuetemperatur, til beads, bland ved pipettering og inkuber i 5 minutter væk fra magneten. 18. Anbring pladen på magneten og inkuber i 5 minutter. 19. Overfør 15 µl eluat til de nye 96-brønds, hård-skal PCR-plader mærket Projekt_Fragmenteret_Ren_Dato og forsegl pladen. Prøverne er nu klar til endereparationstrinnet. SIKKERT STOPPUNKT De fragmenterede og rensede prøver kan opbevares ved -20 C, indtil de er klar til endereparationstrinnet. Det er sikkert at opbevare den godt forseglede, fragmenterede og rensede plade i op til 4 dage ved -20 C. b. Endereparation 1. Ommærk pladen, der tidligere blev fragmenteret og rengjort, til Projekt_Endereparation_Dato 2. Klargør masterblanding til endereparation ved at tilføje 136 µl af rør 14 (endereparationsbuffer) til rør 13 (enzym tll endereparation), vortex, og centrifuger kort. 3. Overfør med pipette 18,5 µl af masterblandingen til endereparation klargjort i trin 1 til kolonne 12 i endereparationspladen mærket Projekt_Endereparation_Dato for at danne en "reservoir"-kolonne. 4. Overfør 5 µl af masterblandingen til endereparation fra kolonne 12 til kolonne 1, 2 og 3 i afstemt, fragmenteret og renset DNA mærket Projekt_Fragmenteret_Ren_Dato, klargjort i det foregående afsnit og bland det ved at pipettere 5 gange. 5. Forsegl pladen med selvklæbende PCR-film og centrifuger kort for at sikre, at al væske ligger i bunden af brønden. 6. Overfør endereparationspladen mærket Projekt_Endereparation_Dato til en termocykler og kør MIA_FORA_endereparationsprogrammet, som vist i tabel 3. 7. Hold pladen ved -20 C, indtil den er klar til A-haledannelse. Tabel 3: Termocykelprogram for endereparation MIA FORA_Endereparation 20 C i 30 min 70 C i 10 min 4 C vent Side 9 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)
c. A-haledannelse 1. Klargør masterblanding til A-hale ved at tilsætte 85 µl af rør 16 (A-halebuffer) til rør 15 (enzym tll A-hale), vortex og centrifuger kort. 2. Overfør med pipette 12 µl af masterblandingen til endereparation klargjort i trin 1 til kolonne 11 i endereparationspladen for at danne en "reservoir"-kolonne. 3. Overfør 3 µl masterblanding til A-hale fra kolonne 11 til hver brønd i kolonne 1, 2 og 3 i den endereparerede plade mærket Projekt_Endereparation_Dato fra det foregående afsnit og bland det ved at pipettere op og ned 5 gange. Ommærk pladen med Projekt_A-hale_Dato. 4. Anbring pladen i termocykler og kør MIA FORA_A-hale-programmet, som vist i tabel 4. 5. GÅ DIREKTE TIL INDEKSADAPTERLIGERINGSTRIN inden for 30 minutter. d. Indeksadapterligering Tabel 4: Termocykelprogram for A-haledannelse MIA FORA_A-hale 37 C i 30 min 75 C i 20 min 4 C vent 1. Brug rene handsker under håndteringen af adapterpladen. Spin kort adapterpladen, før du fjerner pladeforseglingen. Fjern forsigtigt pladeforseglingen fra adapterpladen. Kontroller, at alle brønde i kolonne 1, 2 og 3 indeholder ca. 5 µl opløsning. 2. Klargør masterblanding til ligering ved at tilsætte 850 µl fra rør 18 (ligasebuffer) til rør 17 (ligase enzym), vortex og centrifuger kort. 3. Overfør med pipette 95 µl af masterblandingen til ligering klargjort i trin 2 til kolonne 10 i den A-halede plade mærket Projekt_A-hale_Dato fra det foregående afsnit for at danne en "reservoir"-kolonne. Sæt en ny etiket på pladen med Projekt_Ligering_Dato. 4. Overfør 26 µl masterblanding til ligering fra kolonne 10 til hver brønd i kolonne 1, 2 og 3 i den A-halede plade og bland det ved at pipettere op og ned mindst 5 gange. 5. Overfør 2,5 µl adapter til tilsvarende brønde i ligeringspladen. 6. Bland grundigt og forsegl pladen med selvklæbende PCR-film. Centrifuger kort. 7. Overfør ligeringspladen til en termocykler og kør MIA FORA_ligeringsprogrammet, som vist i tabel 5. Tabel 5: Termocykelprogram for adapterligering MIA FORA_ligering 25 C i 30 min 65 C i 10 min 4 C vent e. Konsolidering af adapterligerede produkter 1. Kombiner 20 µl fra hver brønd i pladen Projekt _Ligering_Dato fra det foregående afsnit til et enkelt 1,5 ml Eppendorf-rør. Mærk røret "Projekt-Dato-Konsolideret." 2. Tilføj 865 µl magnetiske beads til mikrocentrifugerør mærket Projekt-Dato-Konsolideret. Bland grundigt på vortex-mixer. Inkuber i 10 minutter. 3. Overfør røret til magnetisk stativ, indtil opløsningen er klar. Fjern og kassér supernatanten. 4. Mens røret stadig er på magneten, tilsæt 1 ml 80 % ethanol og inkuber i 30 sekunder. Fjern 80 % ethanol uden at forstyrre de bundne beads. 5. Gentag ethanolvask (trin 4) så der vaskes 2 gange i alt. Fjern så meget ethanol som muligt fra røret. 6. Fjern røret fra det magnetiske stativ og lad beads lufttørre i 5-10 minutter, indtil pillen af magnetiske beads har et glasagtigt udseende. 7. Genopløs beads i 63 µl 10 mm Tris-HCl ph 8,0, der har stuetemperatur. Vortex og inkuber i 5 minutter. 8. Anbring røret på magneten, indtil opløsningen er klar, og overfør 60 µl eluat, der indeholder rensede adapterligerede prøver til et rent mikrocentrifugerør. SIKKERT STOPPUNKT Poolede og rensede adapterligerede prøver (bibliotek) kan opbevares ved -20 C, indtil de er klar til at få udført størrelsesvalg i op til 4 dage. f. Valg og amplifikation af størrelsesvalgt bibliotek (Pippin Prep) BEMÆRK: Det forstærkede bibliotek skal renses inden for 1 time efter amplifikation. 1. Udfør en passende metode for størrelsevalg ved biblioteksklargøringen for at isolere fragmenter på ca. 400-500 basepar. Følg brugsanvisningen på produktet, hvis du ikke bruger Pippin Prep. 2. Bland 30 µl af bibliotek med 10 µl af passende markør og overfør det til en bane i Pippin-kassetten. Side 10 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)
3. Opret og kør et program for at vælge bibliotek med fragmentstørrelse mellem 400-500 bp. 4. Optø amplifikationsmoduler fra biblioteksklargøringskit, rør 19, 20, 21 og saml reaktion i et 0,2 ml PCR-striprør som følger: Bland 25 µl amplifikationsblanding fra rør 19, 2 µl primere fra rør 20, 18 µl nukleasefrit vand fra rør 21 og 5 µl størrelsevalgt eluering. 5. Bland forsigtigt og spin ned. Overfør til termocykler og forstærk med MIA FORA_Bibliotek_PCR, som vist i tabel 6. Tabel 6: MIA FORA_Bibliotek_PCR Cyklus (1) Cyklusser (12) Cyklus (1) Første vent Denaturering Afkøl Ekstension Endelig ekst Vent 98 ºC/30 sek 98 ºC/15 sek 65 ºC/30 sek 72 ºC/30 sek 72 ºC/5 min 4 º C/ E. Sekventeringsklargøring BEMÆRK: Åbn og håndter alle post-amplifikationstrin i en udpeget del af laboratoriet, og helst i et PCR-sikkert stinkskab for at forhindre forurening af arbejdsoverflader og sekventeringsreagenser. 1. Overfør 50 µl af det amplificerede bibliotek til et mikrocentrifugerør. Tilsæt 50 µl magnetiske beads, der har rumtemperatur, til biblioteket. Bland grundigt og inkuber i 10 minutter. 2. Efter 10 minutter, placer røret i den magnetiske rørholder, indtil opløsningen er klar, ca. 5-8 min. Fjern og kassér supernatanten. 3. Mens den stadigt er på magneten tilsættes 200 µl 80 % ethanol, og den inkuberes i 30 sekunder. Fjern 80 % ethanol uden at forstyrre de bundne beads. 4. Gentag ethanolvasken (trin 3), så der vaskes i alt 2 gange. Fjern så meget ethanol som muligt fra røret. 5. Tag røret af det magnetiske stativ, og lad beads lufttørre i 5-10 minutter, indtil pillen med magnetiske beads har et glasagtigt udseende. 6. Suspender beads igen i 17 µl 10 mm Tris-HCl ph 8,0 ved stuetemperatur. Kør på Vortex-mixeren og inkuber i 5 minutter. 7. Sæt røret på magneten, indtil opløsningen er klar og overfør 15 µl eluat, som indeholder renset, forstærket sekvenseringsbibliotek, til et rent mikrocentrifugerør. SIKKERT STOPPUNKT Eluerede prøver kan opbevares ved -20 ºC i op til 4 dage. 8. Bestem koncentrationen af biblioteket ved hjælp af metoder, der måler DNA-koncentration nøjagtigt. Immucor anbefaler enten qpcr- eller Qubit-metode til at estimere bibliotekets koncentration. 9. På grund af sekvensatorens art skal sekventeringsbibliotekets koncentration være på mindst 10 nm. Størrelsesfordelingen af biblioteket kan bestemmes ved hjælp af agarosegelelektroforese eller kapillarelektroforesesystem for at kontrollere størrelsen af de resulterende biblioteker. 10. Fortynd biblioteket til 4 nm og klargør derefter et 8 pm (Qubit) eller 12 pm (qpcr) endeligt denatureret bibliotek for MiSeq, og 1,3pM (Qubit) endeligt denatureret bibliotek for MiniSeq. Biblioteket kan spikes med 5 % PhiX Control, hvis det ønskes. 11. Overfør denatureret bibliotek til kassette og kør på sekvensatoren. 12. Følg Illumina-instruktioner til sekvensering af biblioteket. Sørg for, at filnavnet i prøvearket matcher med det projektnavn, der genereres under langtrækkende PCR-opsætningen. F. Dataanalyse De fastq-filer, der genereres af sekvenseringsinstrumentet, skal analyseres med MIA FORA-software for at generere HLAtypningen. Prøveark med prøvenavne og stregkoder og de tilsvarende fastq-filer skal overføres til projektfilen i MIA FORAsoftwaren. Følg softwarens brugervejledning mht. brugen af MIA FORA-software. RESULTATER 1. PCR-amplifikation: Agarosegelanalyse må ikke vise noget produkt i den negative (NTC)-kontrol for at kørslen kan være gyldig. Agarosegel af forstærkede produkter kan vise variationer i størrelse, baseret på forskelle i introniske sekvenser. Se tabel 2 for omtrentlige båndstørrelser. 2. Biblioteksklargøring: Bibliotekskit bør generere et bibliotek, når input DNA-niveauet i SironaQuant er mellem 0,0009 og 0,0035 pmol. Den endelige koncentration af biblioteket skal være mindst 10 nm, og skal kvantificeres nøjagtigt før sekvensering. Biblioteker skal fortyndes til 4 nm før denaturering. Klyngning på MiSeq - og MiniSeq -sæt kan variere afhængigt af nøjagtigheden af kvantificeringen. 8-12 pm bibliotekers klyngetætheder bør typisk variere fra 600-800 K/mm 2 på MiSeq og 160-220 K/mm 2 på MiniSeq. Der skal udvises omhu for at kvantificere biblioteket nøjagtigt. Alle postadapterligerede produkter skal være indeholdt i et PCR-stinkskab eller udpeget område, og friske fortyndingsreagenser skal være parat for at forhindre forurening. 3. HLA-typning genereres af MIA FORA NGS-software og leveres i en rapport. Følg MIA FORA-softwarens brugervejledning for dataanalyse af HLA-typning. Side 11 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)
KVALITETSKONTROL Det er påkrævet, at der køres en negativ kontrol og en valgfri kendt kontrol med hver test, såsom henholdsvis en blindprøve af vand og en tidligere indtastet prøve. Der skal udvises den største forsigtighed ved fjernelse af pladesegl, og pladerne skal være spundet ned inden åbningen. Der skal anvendes nye pladesegl ved hvert trin, hvor pladerne skal forsegles. De brugte pipettespidser bør placeres i hensigtsmæssige beholdere og kasseres. PCR-opsætning skal udføres i et præ-pcr-rum, der er adskilt fra det rum, hvor forstærkede produkter håndteres. Alt genomisk DNA skal fortyndes i nukleasefrit vand. Efter DNA-størrelsesudvælgelse og -forstærkning skal det forstærkede bibliotek håndteres i et separat område, helst et PCR-stinkskab,og håndteres med et separat sæt pipetter. Der bør udvises omhu for ikke at forurene arbejdsområderne med forstærkede biblioteker. Analysen skal køres som anbefalet i denne indlægsseddel samt udføres med alle andre kvalitetskontrolprocedurer, der er i overensstemmelse med lokale, statslige, føderale og/eller akkrediteringsorganers krav. BEGRÆNSNINGER FOR PROCEDUREN 1. PCR og analyse, der er beskrevet i denne indlægsseddel, kræver nøjagtigt kontrollerede forhold. Afvigelser fra validerede parametre kan føre til, at produktet svigter. 2. Hvis mindst 50 % af de indledende DNA-fragmenter er mindre end 10 kb, vil der muligvis ikke blive genereret nok langtrækkende PCR-produkt. 3. Hvis den endelige bibliotekskoncentration er lavere end 10 nm, vil der muligvis ikke blive genereret nøjagtige sekvenseringsresultater. 4. Man vil kunne observere uklarheder i det 4. felt pga. manglende dækning i intronregionen. 5. Tilsætningsstoffer i PCR-blandingen kan interferere med almindeligt anvendte giftfri ethidiumbromid alternativer, der anvendes i agarosegelelektroforese og kan føre til lavere båndintensitet. 6. SYBR grønfarvede agarosegels virker ikke med PCR-produkter. Ethidiumbromid eller GelRed bør anvendes til visualisering af PCR-produkter. 7. DPB1-primeren amplificerer ikke exon 1 og exon 5. Derfor vil ingen kendte polymorfismer i disse exoner blive sekventeret, og de vil blive anført som uklarheder i rapporten. 8. Manglen på genomiske referencesekvenser for DPB1 og de lave niveauer af polymorfi i intron 2 (mellem exon 2 og 3) betyder, at det er en udfordring at udføre faseanalyse for heterozygote prøver. Der kan derfor være en genotype uklarhed, som ikke kan løses. 9. De fremadrettede primere for DPB1 overlapper med de første par baser på exon 2. Polymorfismer i disse sekvenser identificeres derfor ikke ved sekventering. 10. DRB-loci forstærkes som to fragmenter et, der forstærker exon 1 og et andet, der forstærker exon 2 til 6. Intron 1 forstærkes ikke i sin helhed. Fasningen af hele locussen er derfor ikke mulig for DRB1/3/4/5, og hvis der er polymorfismer i Intron 1, vil det resultere i uklarheder i det 4. felt. 11. Den reverse primer for DRB-exon 2 til 6 overlapper 3'-enden af exon 6, og derfor vil polymorfismer i disse sekvenser ikke blive bestemt ved sekventering. 12. I de fleste tilfælde kortlægges forstærkningsprodukterne af exon 1 af DRB1/3/4/5 dårligt til exon 1 af den kendte referencesekvens for DRB5. Derfor, vil contig for exon 1 sandsynligvis ikke blive genereret for DRB5. Da der ikke er nogen kendte exon 1 polymorfismer for DRB5, vil det ikke resultere i nogen uklarhed i HLA-typningen for DRB5. 13. På grund af HLA-typnings komplekse karakter, bør kvalificeret personale gennemgå datafortolkning og typningsopgaver. Side 12 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)
SPECIFIKKE YDELSESKARAKTERISTIKA Der blev udført kliniske undersøgelser på tre steder for at evaluere ydeevnen af MIA FORA NGS HLA-typningskittet. Udførelsen af analysen blev sammenlignet med tidligere typning, der omfattede højopløsning-sekvensbaseret typning (SBT), hvor det var tilgængeligt, og lavere opløsningstypning, hvor SBT ikke var tilgængelig. Prøverne blev udvalgt af teststederne, så de repræsenterede et mangfoldigt sæt HLAtyper, der ville have dukket op i løbet af normal drift. I alt 206 prøver blev testet af stederne i 3 kørsler, som hver brugte to reagenslots. HLAtypningen blev bestemt for HLA-A, -B, -C, -DPA1, -DPB1, -DQA1, -DQB1 og -DRB 1/3/4/5 loci. I alt 3.692 alleler blev vurderet med disse 206 prøver. Resultaterne viste, at de HLA-typer, der blev opnået af MIA FORA-analysen uden genanalysering af fejl og uharmoniske loci, var 99,34 %. Efter genanalysering af de fejlede loci og uharmoniske loci, var den generelle konkordans 99,74 %. Tabel 8: Opsummering af generel konkordans Sted Antal prøver Antal testede loci Antal alleler til konkordansanalyse Konkordans efter genanalysering Sted1 68 748 1223 1220 (99,75 %) Sted2 69 759 1064 1063 (99,91 %)* Sted3 69 759 1241 1236 (99,59 %) * Testen blev ikke gentaget på dette sted. Et DQB1-locus havde utilstrækkelige data. Tabel 9: Resumé af klinisk test pr. locus HLA-loci Oprindelig konkordans Konkordans efter test** HLA-A 100,00 % 100,00 % HLA-B 99,76 % 99,76 % HLA-C 99,51 % 100,00 % DPA1 99,72 % 100,00 % DPB1 99,44 % 99,72 % DQA1 99,26 % 100,00 % DQB1 98,48 % 99,27 % DRB1 98,54 % 99,03 % DRB3/4/5 99,43 % 100,00 % I alt 99,34 % 99,74 % ** Genanalysering inkluderede kald, der blev markeret til gennemsyn, og ikke kunne løses med en manuel kontrol af data. Kald, der ikke kunne foretages på grund af utilstrækkelige data (11/1854 amplifikationer) blev også testet igen. Bemærk: For at få specifikke detaljerede egenskaber vedr. ydeevne, bedes du ringe til Immucor Transplant Diagnostics, Inc. på 1-888-329-0255. Side 13 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)
FEJLFINDING PROBLEM MULIG ÅRSAG LØSNING Ingen bånd på gel efter PCRforstærkning Flere bånd eller udstrygning af bånd efter PCRforstærkning Fluorescerende værdier, som er lave for alle loci DNA-størrelsevalg forkert qpcr R 2 < 0,95 Forstærket bibliotekskoncentration lav MiSeq -klyngning mindre end forventet DNA-kvalitet eller - mængde Termocykler-forhold OD 260/280-forhold mindre end 1,65 DNA fragmenteret Mindst 50 % DNA bør være større end 10 Kb DNA opløses i Tris-HCl eller TE Lav koncentraion af skabelon-dna Ethidium-alternativer anvendes i agarosegel Amplifikationsfrafald Rampehastigheder Temperatur DNA-kvalitet Genoprens DNA'et for at fjerne urenheder. Genekstraher DNA fra prøven. Fortynd prøverne i vand. Sørg for, at DNA-koncentrationen er 50-150 ng/reaktion. Brug ethidiumbromid, hvis båndene er svage på agarosegel, da nogle fluorescerende farvestoffer kan være dæmpede på grund af PCR-blandingens sammensætning. Gentag PCR for amplifikationsfrafald ved brug af resterende reagenser, hvoraf der er nok til fire prøver. Resterende reagenser, der opbevares ved 2-8 o C, er stabile i en uge. Det skal sikres, at rampehastighederne er som angivet i protokollen. Kalibrer PCR-maskinen for at kontrollere udførelsen af PCRmaskinerne. Det skal sikres, at DNA er fortyndet i vand og fri for forurenende stoffer. Følg producenternes vejledninger nøje. Reagenser skal beskyttes mod lys. Fortynd PicoGreen reagens ifølge brugsanvisningen. Fotoblegning af PicoGreen -reagens PicoGreen -reagens Forkert fortynding af reagens Standarder fortyndet forkert Fortynd standarderne ifølge instruktionerne. Følg Sage Sciences fejlfindingsguide for at bestemme om Kontroller elueringsprofil for at sikre, at instrumentets ydeevne er i overensstemmelse med eluering opstod uden fejl specifikationerne. Pippin-instrument Kør 2 µl 1 kb plus-ladder (ThermoFisher) med Instrumentet er ikke kalibreret ekscisionsprotokol på 400-600 basepar. Kør 15 µl af elueret produkt på agarosegel for at visualisere eluering af 500 bp fragment. Genbrug af Pippin-patron Pippin-patron bør kun anvendes en gang. KAPA PCR Forårsaget af en klar outlier Gentag analysen med outlier udeladt. Forurening i reagenserne Gentag KAPA PCR med friske standarder. Ethanol fjernes ikke helt Fjern ethanol, mens pladerne er på magnetholder. Fjern alle spor af ethanol, især efter sidste vask. Beads opbevaret forkert Opbevar beads ved 2 til 8 C - MÅ IKKE NEDFRYSES. Magnetisk bead ren Ethanol ikke frisklavet 80 % ethanol skal forberedes frisk før hver brug. Tørretid kan afhænge af den omgivende temperatur og Beads overtørrer fugtighed. Overvåg beads nøje for at sikre, at beads ikke overtørrer og juster protokollen efter behov. Forkert koncentration af Tris-HCl bruges Sørg for, at Tris-HCl bufferen er 10 mm og ph er 8,0. Pippin-prep eluerer ikke DNA Fejl i fragmentering gennem ligeringstrin Bibliotekskvantificering forkert Illumina-reagenser Kontroller adapterligerede produkter før og efter eluering Amplificeret produkt tabt under beadrensning Fragmenteringsproblemer Kapa qpcr Qubit fluorometer Flow-celle-, instrument- eller reagensproblemer Amplificer 1 µl præ-pippin poolet rent bibliotek med halvdelen af mængden af reagenser til bibliotekets amplifikation. Kør amplificerede produkter (ingen oprensning nødvendig) på en 2 % agarosegel for at afgøre, om en udstrygning af fragmenter er til stede. Genamplificer 5 µl eluering. Hvis biblioteket er >25 nm, kan produkterne visualiseres ved at køre 5 µl på en agarosegel. Oprens 20 µl 2-3 ligerede prøver og NTC ved hjælp af beadrensningsprotokol med 36 µl beads. Eluer produkterne i 10 µl og kontroller om der er fragmentering på en 2 % agarosegel. Hvis fragmentering ikke sker, skal du ringe til teknisk support for yderligere fejlfindingsinstruktion. Følg producentens anvisninger, idet du skal være meget opmærksom på fortyndinger, og verificerer, at standardkurver er korrekt og at Ct-værdier falder inden for standardkurvens lineære område. Følg producentens vejledning og vær meget opmærksom på fortyndinger og brug af friske standardfortyndinger. Hvis prøven falder ud af standardkurven af langtrækkende reagenser, skal der gentages med præcisionsanalyse. Kontakt Illuminas tekniske support, hvis du har problemer med reagenser og instrumenter. Side 14 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)
BEGRÆNSET LICENS VIGTIGT - LÆS GRUNDIGT: Denne Label-licensaftale ("aftalen") er den juridisk bindende aftale mellem dig (herefter benævnt "licenstager") og Immucor Transplant Diagnostics, Inc. ("Immucor") (individuelt, en "part" eller sammen, "parterne"), for anvendelse af reagenser tilvejebragt i nærværende dokument ("reagenser"). Ved brug af reagenserne, accepterer licenstager at være bundet af de vilkår, der er fremsat i nærværende dokument. 1. Brug af reagenser af licenstager. Immucor giver licenstager en ikke-eksklusiv, ikke-overdragelig ret til kun at bruge den overførte mængde af reagenserne i overensstemmelse med de procedurer, der er anført på vedlagte etiket og med de begrænsninger, der er i nærværende dokument. Ejendomsretten til reagenserne må ikke overføres til licenstageren. Immucor bevarer alle rettigheder, der ikke udtrykkeligt gives i nærværende dokument, og der er ingen underforståede tilladelser i nærværende dokument. 2. Ekskluderede anvendelser. Ingen tilladelse gives i nærværende dokument til at licenstager kan bruge andre reagenser end de, som er udpeget i henhold til afsnit 1 i denne aftale. Specifikt gives der ikke i nærværende dokument tilladelse til, at licenstager kan bruge reagenser med henblik på overførsel, salg, videregivelse eller på anden måde give tredjepart adgang til reagenserne eller Mia Fora-produktet. Licenstager har ikke ret til at producere derivater af nogen reagens eller tillade nogen tredjepart at bruge eller sælge reagenser eller derivater af reagenser. Licenstager anerkender, at visse reagenser og deres brug er underlagt tredjeparts patenter og er licenseret af Immucor. Licenstageren må ikke bruge reagenserne, bortset fra som udtrykkeligt tilladt i nærværende dokument. 3. Misbrug af reagenser og skadesløshedsvilkår. I det omfang, det er fastsat ved lov, vil licenstageren forsvare og holde Immucor, Immucors datterselskaber, deres ledere, direktører, embedsmænd, medarbejdere, sponsorer og agenter (samlet "friholdte parter") skadesløse mod ethvert ansvar, tab, skade, krav eller udgift, herunder advokathonorarer, (samlet kaldet "friholdte tab") som måtte opstå af eller i forbindelse med denne aftale, herunder, uden begrænsning, friholdte tab opstået som følge af brug af eller på vegne af licenstageren. Licenstageren vil friholde og holde de friholdte parter skadesløse mod alle og ethvert tab, som måtte følge af, udspringe af eller vedrøre licenstagers misligholdelse af denne aftale; samt krav fra en tredjepart, om at licenstager eller licenstagers brug af reagenserne krænker eller misbruger et patent, ophavsret, varemærke, forretningshemmelighed eller andre immaterielle rettigheder tilhørende sådan tredjepart. 4. Denne aftale gælder kun for reagenserne. Al brug af Mia Fora-softwaren er underlagt den gældende slutbrugerlicensaftale. Denne aftale skal fortolkes og håndhæves i overensstemmelse med lovene i staten New York i USA. Hvis køber ikke er villig til at acceptere vilkårene i denne aftale, er Immucor villig til at acceptere returnering af produktet. Fremstillet af: Immucor, 35 Technology Drive, Suite 100, Warren, NJ, USA 07059. Telefon: +1 (908) 226-8200, Fax: +1 (908) 226-0800 Autoriseret repræsentant: lmmucor Medizinische Diagnostik GmbH, Robert-Bosch-Strasse 32 63303 Dreieich, TYSKLAND Telefon: +49-607 4-84200, Fax: +49-607 4-842099 Teknisk service i Europa: Telefon: +32 (0)3 385 47 91 Dette dokument blev sidst revideret og udstedt: Rev 2, 03 november 2016 ANVENDTE VAREMÆRKER MIA FORA og SIRONAQUANT er varemærker tilhørende Sirona Genomics, Inc. Agencourt og Ampure er varemærker tilhørende Beckman Coulter, Inc. Alle andre varemærker tilhører deres respektive ejere. Side 15 af 15 LC1618CEDA.2 (11/16)