Den normalfysiologiske hæmostase v. Eigil Vejergang

v. Eigil Vejergang 1. Den normalfysiologiske hæmostase...2 1.1 Karfunktioner...3 1. 2 Trombocytfunktioner...5 1. 2. 1 Adhæsion og aktivering...7 1. 2. 2 Release og aggregation...9 1. 3 Koagulationssystemet...12 1. 3. 1 Koagulationsfaktorer, generelt...13 1. 3. 2 Internt system (FXII,FXI,FIX)...15 1. 3. 3 Internt system (FIX,FVIII,FX)...16 1. 3. 4 Externt system (FVII,TF,FX)...17 1. 3. 5 Ex- og internt system (TF,FVII,FIX,FX)...18 1. 3. 6 Fællessystemet (FX,FV,FII,FI)...19 1. 4 Antikoagulationssystemet...21 1. 4. 1 Serpiner...21 1. 4. 3 TFPI...23 1. 4. 2 Protein C, trombomodulin...24 1. 5. Det fibrinolytiske system...25 1. 5. 1 Intern aktivering...28 1. 5. 2. Extern aktivering...29 1. 5. 3 Exogen aktivering...30 1. 5. 4 Fibrin(ogen)nedbrydning...30

Web-udskrift 2 1. Den normalfysiologiske hæmostase Hæmostase betyder blødningsstandsning. Ved den normale fysiologiske hæmostase forstås et system af naturlige, lokalt fortløbende processer ved og i læderede blodkar, som fører til dannelse af en midlertidig læsionsdækkende prop, kaldet en trombe. Herved hindres udstrømning af blod fra læsionsstedet indtil et andet system, kaldet vævsheling, har repareret blodkarret ved nydannelse af væv. I takt med vævshelingen rydder hæmostasesystemet selv op ved at fjerne den dannede trombe. (figur 1) Set med naturens øjne er de største konstruktionsmæssige udfordringer ved hæmostasesystemet, dels at de hæmostatiske processer kun må forløbe ved karbeskadigelse og ikke, når karrene er intakte og fungerer normalt, dels at processerne som først danner og senere igen fjerner tromben må forblive lokaliserede til læsionsstedet og ikke spredes til resten af karsystemet. Naturen har mødt denne udfordring ved at udvikle et sindrigt samarbejde mellem strukturer og celler i karvæggen, trombocytter i blodet samt et væld af proteiner i blod og ekstracellulærmatrix. Med dette samarbejde er der udviklet initieringsmekanismer, som på molekylært plan kan "sanse" en karbeskadigelse og starte hæmostaseprocesserne, ligesom der er udviklet mekanismer til sikring af læsionslokaliseret dannelse og fjernelse af tromben. Det hæmostatiske system opdeles traditionelt i fire undersystemer: Karfunktioner, som bl.a. består i sammentrækning af tilstødende blodkar, hvorved tilstrømningen af blod til læsionsstedet nedsættes. (figur 1) Trombocytfunktioner, hvorved der dannes en primær trombe. Denne består af en ikke særlig robust sammenklumpning af trombocytter, som er tilhæftet læsionsstedet. (figur 1) Koagulationssystemet, hvorved den primære trombe forstærkes ved indsyning og tilhæftning med meget stærke tråde af fibrin. Koagulationssystemet fremstiller i forbindelse med denne proces selv den benyttede tråd ved en række enzymkatalyserede proteinspaltende reaktioner. Den forstærkede robuste trombe kaldes også en sekundær trombe. (figur 1)

Web-udskrift 3 Det fibrinolytiske system, hvorved den sekundære trombe ved hjælp af enzymkatalyserede proteinspaltende reaktioner nedbrydes i takt med gendannelse af karvæggen. (figur 1) Ofte er grænserne mellem ovenstående undersystemer ikke skarpe og opdelingen af hæmostasesystemet er først og fremmest foretaget for at lette overskueligheden. Udover hæmostasesystemet vil også andre systemer aktiveres ved en karlæsion. Det drejer sig om immunsystemet med tilhørende komplementsystem. Dette system aktiveres resulterende i inflammation, dels for at bekæmpe eventuelt indtrængende mikroorganismer, dels for at fjerne de affaldsprodukter, der opstår ved læsionen og de efterfølgende reparationer. Endvidere skal som før nævnt også vævshelingen aktiveres. Disse systemer vil blive nævnt men ikke beskrevet i dette materiale, men der findes mange mekanismer, som sikrer et koordineret samarbejdet mellem hæmostasen og disse andre systemer. Resten af dette tema vil beskrive de fire undersystemer i hæmostasen detaljeret. Koagulationssystemet og det fibrinolytiske system er opbygget omkring nogle inaktive faktorforstadier, kaldet profaktorer. Disse er i koagulationssystemet symboliseret som ansigter med runde hjørner, og i det fibrinolytiske system som ansigter med skarpe hjørner. (figur 1) 1. 1 Karfunktioner Karsystemet består af arterier, arterioler, kapillærer, venoler og vener. Ved kapillærerne, som er de mindste blodkar, foregår udvekslingen af luftarter samt nærings- og affaldsstoffer mellem blod og vævsceller. Arterier og arterioler - nævnt efter faldende størrelse - transporterer blod fra hjerte til kapillærer. Venoler og vener - nævnt efter stigende størrelse - returnerer blodet til hjertet. (figur 2) Generelt er blodkar opbygget af tre lag. Inderst eller luminalt haves intima, der består af et enkelt lag endothelceller omkranset af en basalmembran og et lag bindevæv, kaldet subendothelet, hvis tykkelse forøges med alderen, men ellers aftager med faldende kardiameter. Herefter følger media, hvis opbygning varierer med blodkarrenes størrelse og type. I elastiske og muskulære arterier samt arterioler består media af et faldende antal lag af elastisk bindevæv og glat muskelvæv, i vener kun af et tyndt lag glat muskelvæv. Yderst ligger adventitia, som består af fibrøst bindevæv indeholdende tilstødende kapillærer, lymfekar og nerver. Kapillærer består oftest kun af et lag endothelceller støttet af basalmembranen. (figur 2)

Web-udskrift 4 Blodkarrenes funktioner i forbindelse med hæmostase kan opdeles i hæmostasebeskyttende (antitrombotiske) og hæmostaseprovokerende (trombotiske) funktioner. Hæmostasebeskyttende (antitrombotiske) funktioner. Disse funktioner varetages af endothelcellerne og sikrer, at hæmostasen ikke aktiveres unødigt i normalt fungerende kar. Frastødning. Indbygget i den luminale side af endothelcellers cellemembran er bl.a. et negativt ladet heteropolysaccharid (glucosaminglycan, proteoglycan), kaldet heparansulfat. Da trombocytter samt koagulations- og fibrinolyseaktive proteiner ligeledes er negativt ladede, vil disse derfor frastødes af endothelcellerne. (figur 2) Inhibitorer. Til endothelcellernes heparansulfat er der endvidere bundet en række inhibitorer for aktive faktorer i koagulations- og fibrinolysesystemet. Det drejer sig bl.a. om antitrombin (AT), trombomodulin (TM) og alfa 2 -makroglobulin (α 2 MG). Disse inhibitorer beskrives indgående under antikoagulationen her og her. (figur 2) Mediatorer. Endelig fremstiller og udskiller endothelceller de hormonlignende stoffer nitrogenoxid (NO) og prostacyklin (prostaglandin I 2, PGI 2 ). NO er et uorganisk stof, der effektivt hæmmer trombocytternes adhæsion. Begge dannes i og udskilles fra endothelceller, begge samarbejder om at hæmme trombocytternes aktivering og begge virker afslappende på karrenes muskulatur (kardilaterende). Prostacyklin tilhører en stofgruppe, der benævnes prostaglandiner og dannes i endothelceller ved en række enzymatiske reaktioner ud fra fedtsyren arachidonsyre, som endothelcellen fremskaffer ved cytoplasmatisk frisætning fra cellemembranens phospholipider. Det hastighedsbegrænsende trin i prostacyklinsyntesen er den første omdannelse af arachidonsyre, som i endothelcellen katalyseres af to isoenzymformer af enzymet cyklooxygenase (COX), en konstitutiv form kaldet COX-1 og en inducerbar form kaldet COX-2. Prostacyklin kan også dannes i endothelceller ud fra et mellemprodukt, der stammer fra trombocytter. Skønt den primære funktion af intakt endothel således er antitrombotisk ved at beskytte mod uhensigtsmæssig og irrelevant trombedannelse i kredsløbet, kan intakt endothel ved betændelsestilstande (inflammation) dog provokeres til at reagere trombotisk, idet endothelceller via inflamationsfremkaldende stoffer fra bl.a. makrofager på overfladen kan udtrykke vævsfaktor (tissue factor TF).

Web-udskrift 5 Hæmostaseprovokerende (trombotiske) funktioner. Disse funktioner varetages af subendothelet samt underliggende strukturer og kan yderligere opdeles i: Reflektorisk kontraktion af arterier og arterioler ved hjælp af muskelvævet i media. Den reflektoriske del af kontraktionen varer kun ca. et halvt minut, men kontraktionen fortsætter ved hjælp af lokalt virkende hormoner, f.eks. tromboxan, der udskilles fra aktiverede trombocytter. Læsionsfremkaldt blotlæggelse af specifikke subendotheliale proteiner. Disse strukturer er normalt afskærmet fra blodet, og kommer i kontakt med dette ved læsion af endothellaget. De vigtigste hæmostasestimulerende strukturer er kollagen, von Willebrand faktor (vwf) og vævsfaktor ("tissue factor" forkortet TF). (figur 2) Der kendes i dag flere forskellige typer af kollagen. Til de typer af kollagen, der findes i karvæggen, eksisterer der opløselige proteiner i plasma, som specifikt bindes hertil, hvorved koagulationssystemet forstærkes. I trombocytternes cellemembraner er indbygget receptorer, som specifikt binder sig til kollagen, vwf og andre subendotheliale proteiner. TF er et protein, som udtrykkes på overfladen af og gennemtrænger cellemembranen hos celler i subendothel, media og adventitia, herunder fibroblast- og nerveceller. TF, der er nødvendig for aktivering og funktion af koagulationsfaktor VII (FVII), findes ikke normalt på overfladen af endothelceller. (figur 2) 1. 2 Trombocytfunktioner Trombocytter dannes ved cytoplasmaafsnøringer fra megakaryocytter i det hæmopoietiske væv i knoglemarven. Megakaryocytterne er udviklet via megakaryoblaster ved at disses kerner har delt sig 4-8 gange uden celledeling. Megakaryocytterne er således multinukleære. Fra hver megakaryocyt afsnøres under normale forhold mellem 300 og 500 trombocytter, som fra knoglemarven frigives direkte til cirkulation i kredsløbet. Modningsprocessen tager ca. fire døgn og stimuleres bl.a. af hormonerne platelet derived growth factor (PDGF) og trombopoietin (TPO). Efter afsnøring fra megakaryocytter cirkulerer 70-80% af trombocytterne i blodet, medens resten hovedsaglig deponeres i milten. Ikke-aktiverede trombocytter har normalt en levetid på 9-10 døgn, hvorefter de destrueres ved fagocytose i det reticuloendotheliale system (RES), specielt i milten.

Web-udskrift 6 Cirkulerende trombocytter er diskoide (skiveformede) i ikke-aktiveret tilstand. I plasmamembranen er indbygget en række glycoproteiner (forkortet GP), som enten er permanent samlede, eller som kan samles til receptorer med betydning for hæmostasen. Glycoproteinerne er oprindeligt opdelt i tre grupper (GPI, GPII og GPIII) baseret på elektroforetisk vandring. I takt med forbedringen af de elektroforetiske teknikker er disse grupper yderligere blevet underopdelt i enkelte proteiner (f.eks. GPIa, GPIb, GPIIb, GPIIIa) ligesom andre proteiner har fået deres egne numre (f.eks. GPIV, GPV, GPIX). I takt med udforskningen af den normale kontakt mellem celler indbyrdes og mellem celler og extracellulære strukturer, har det vist sig, at de hæmostaserelevante trombocytreceptorer for manges vedkommende blot er en del af det uhyre komplekst samspillende register af receptorer, som formidler normal kontakt og kommunikation mellem celler enten direkte eller via ekstracellulære proteiner. Som beskrevet mere detaljeret her er en interessant receptorgruppe i denne sammenhæng de såkaldte integriner, som er opbygget af en α-kæde og en ß-kæde. (figur 3) Under trombocytmembranen ligger bundter af mikrotubuli, som er af betydning for opretholdelse af cellens form. Cytoplasmaet indeholder sammentrækkelige aktin/myosin-filamenter samt granula med forskelligt indhold. Det drejer sig om dels dense-granula og α-granula, dels glykogengranula, der indeholder glykogen til energikrævende processer. Trombocytternes væsentligste funktion er ved karlæsion hurtigt og lokalt at danne en primær trombe, som består af til- og sammenhæftede trombocytter, hvorved læsionsstedet midlertidigt tildækkes. Denne funktion kan yderligere opdeles i følgende delfunktioner: Adhæsion og trombocytaktivering. Ved hjælp af især to receptorkomplekser, benævnt GPIa-IIa (α 2 ß 1 ) og GPIb-V-IX, adhærerer trombocytter til henholdsvis blotlagt kollagen og vwf. Binding af receptorkomplekserne til disse proteiner medfører, at trombocytten aktiveres. Intracellulært aktiveres en række enzymer, som foranlediger, at trombocytten ændrer form ved pseudopodiedannelse, at trombocytten ud fra fedtsyren arachidonsyre danner det trombocytaktiverende hormon, tromboxan A 2 (TxA 2 ), samt at trombocytten ved exocytose frigiver indholdet af dense- og α-granula, en proces benævnt release. Release. Dense- og α-granula indeholder en række stoffer af betydning for den fortsatte aktivering af trombocytter samt for koagulations- og fibrinolysesystemet. Aggregation. Ved hjælp af især receptorkomplekset GPIIb-IIIa (a IIb ß 3 ) på trombocytoverfladen

Web-udskrift 7 binder trombocytterne sig til hinanden med primært fibrinogen som sammenkittende protein. Denne sammenbinding forstærkes af receptorproteinet GPIV, som har bundet sig til proteinet trombospondin (TSP). Retraktion. Ved kontraktion af aktin/myosin-filamenter i de aggregerede trombocytters cytoplasma sker der en sammentrækning af den primære trombe. Aggregationen er hermed blevet irreversibel. 1. 2. 1 Adhæsion og aktivering Ved trombocytadhæsion forstås specifik binding af trombocytter til karvægsproteiner, som blotlægges ved læsion af det luminale lag endothelceller. Ved den efterfølgende trombocytaktivering muliggøres formændring og via release aktivering af ikke-adhærerede trombocytter samt aggregation af disse. Den specifikke trombocytadhæsion formidles af receptorkomplekser på trombocytternes overflade, som er i stand til at genkende og binde sig til ekstracellulære, adhæsive proteiner, kaldet ligander, dels i karvæggens basalmembran, subendothel, media og adventitia, dels i bagvedliggende strukturer. (figur 4) Receptorkomplekser og receptorer. Tabel 3 viser en oversigt over nogle hæmostaserelevante trombocytreceptorer. Nogle receptorer er opbygget som komplekser bestående af to proteinkæder, en α- kæde og en ß-kæde. Disse receptorer benævnes integriner. Der kendes 12 forskellige α-kæder og 7 forskellige ß-kæder, og en given aß-kombination giver teoretisk set en receptor med en given specificitet. I praksis kendes der dog langt færre receptorer end det teoretisk maximale antal (7*12=84). De fleste integriner udtrykkes også på overfladen af andre celler, hvor de deltager i den normale kontakt mellem celler og ekstracellulære strukturer. Det sandsynligvis vigtigste integrin i forbindelse med trombocytternes adhæsion er GPIa-IIa, der består af en α 2 - og en ß 1 - kæde (α 2 ß 1 ), og som binder sig til subendothelialt kollagen. En anden vigtig receptor på overfladen af ikke aktiverede trombocytter er GPIb-V- IX, som binder sig til von Willebrand faktor, et ekstracellulært protein, som er associeret til kollagen. GPIb-V-IX er ikke et integrin. Ud over at binde sig til von Willebrand faktor tjener GPV i komplekset som receptor for trombin. Ved binding af trombin til receptorkomplekset, vil trombin spalte GPV, hvorved trombin bliver i

Web-udskrift 8 stand til at aktivere såkaldte proteaseaktiverbare receptorer (PARs), hvorved trombocytten aktiveres. Ud over ovenstående eksempler på trombocytreceptorer for subendotheliale matrixproteiner bærer trombocytterne også receptorer for mange mediatorer og signalstoffer. F.eks. bærer trombocytterne receptorer for prostacyklin, benævnt hip, der udskilles til blodet af intakte endothelceller og hæmmer trombocytternes aktivering, og for ADP og tromboxan A2, der begge frigøres ved release fra aktiverede trombocytter. Der er foreløbigt fundet to udgaver af ADP-receptoren, som betegnes P2Y(1) og P2Y(12), og trombocytternes receptor for tromboxan A2 betegne TP-receptor. Ved ligandbinding til begge receptorer, aktiveres trombocytterne adhæsionsuafhængigt. Ligander. Tabel 4 viser en oversigt over nogle ekstracellulære proteiner, som via receptorer kan bindes til bl.a. trombocytter. Alle proteinerne, som på nær fibrinogen normalt er tilstede i basalmembranen og underliggende strukturer, hvor de dels deltager i opbygningen af disse strukturer og dels heri er medansvarlige for tilhæftning og indlejring af celler, synes at kunne deltage ved trombocytadhæsionen. Trombocytters α-granula indeholder fibronectin, vwf, vitronectin, fibrinogen og trombospondin (TSP), så ved trombocytternes release, vil koncentrationen af disse proteiner lokalt øges, når trombocytter aktiveres. Endvidere indeholder plasma fibronectin, vitronectin og fibrinogen. De kvantitativt vigtigste proteiner for en fuldgod trombocytadhæsion synes at være kollagen og von Willebrand faktor. von Willebrand faktor dannes i endothelceller, hvorfra en del transporteres til basalmembran og subendothel, samt i megacaryocytter, hvorfor det findes i trombocytters α-granula. Såvel i endothelceller som i megacaryocytter laves von Willebrand faktor som et dimert molekyle, der samles til usædvanligt store multimere (vwf). Disse store multimere findes i subendothelet og α-granula og er excellente til at forankre trombocytter. I plasma findes von Willebrand faktor i mindre udgaver (klinisk biokemisk betegnelse: FVIII:vW), der er mindre gode til at adhærere. Disse mindre multimere menes bl.a. at fremkomme ved, at de store multimere fra en

Web-udskrift 9 dothelcellerne spaltes af såkaldte ADAMTS-13 metalloproteaser. De små mutemeres funktion i plasma er at transportere den koagulationsaktive del af faktor VIII, kaldet FVIII:C. Trombocytaktiveringen starter, når receptorer binder sig til ligander. (figur 4) Trombocytternes receptorproteiner penetrerer plasmamembranen, og på indersiden er de i kontakt med såkaldte G- proteiner og enzymer, som kan aktiveres eller hæmmes, når receptorerne stimuleres. I hvile er enzymet, adenylat cyclase, der katalyserer omdannelse af ATP til cyklisk AMP (camp) aktivt, hvilket bl.a. styres af receptorer for prostacyclin. camp er en intracellulær budbringer, og høj koncentration af denne i cellen medfører bl.a., at Ca 2+ pumpes ind i nogle vesikler. Koncentrationen af Ca 2+ i cytoplasma er således lav. Ved stimulering af receptorer for kollagen, vwf, trombin eller andre aktiverende molekyler hæmmes adenylat cyclase. I stedet aktiveres enzymerne phosphodiesterase og phospholipase C. Førstnævnte katalyserer spaltning af camp til AMP, hvorved cytoplasmakoncentrationen af camp falder. Sidstnævnte enzym katalyserer hydrolyse af et phospholipid i membranen kaldet phosphotidylinositol-bis-phosphat (PIP 2 ) til to sekundære budbringere kaldet diacylglycerol (DAG) og inositoltriphosphat (IP 3 ). Fald i intracellulær koncentration af camp og stigning af DAG og IP 3 medfører direkte eller indirekte bl.a. : Ca 2+ forlader de intracellulære vesikler og cytoplasmakoncentrationen af Ca 2+ stiger. Dette stimulerer kontraktion af actin/myosin-filamenter, som igen har betydning for trombocyttens formændring og udtømning af granula (release). (figur 4) Aktivering af enzymerne phospholipase A 2 og cyclooxygenase. Førstnævnte katalyserer intracellulær frisætning af fedtsyren arachidonsyre fra cellemembranens phospholipider. Sidstnævnte katalyserer det første reaktionstrin i prostaglandinsyntesen af det lokalt virkende hormon, tromboxan A 2 (TxA 2 ), som virker karkontraherende, og som adhæsionsuafhængigt kan aktivere andre trombocytter. (figur 4) 1. 2. 2 Release og aggregation Ved release fra trombocytter forstås frigivelse af stoffer indeholdt i trombocytternes granula og cytoplasma enten til omgivelserne eller som en vedhæftet del af trombocytoverfladen. Ved trombocytternes aktivering og release vil der i udpræget grad forekomme cytoplasmaafsnøringer fra trombocytterne i form af små mikropartikler (PMP - pladederiverede mikropartikler). Overfladen af disse mikropartikler vil have samme beskaffenhed som de hele aktiverede trombocytter.

Web-udskrift 10 Ved trombocytaggregation forstås sammenklæbning af aktiverede trombocytter og mikropartikler. (figur 5) Tabel 5 viser en oversigt over de stoffer, som frigives eller vises på trombocytoverfladen ved trombocytternes release. Nogle af stofferne stimulerer trombocytternes hæmostasefunktioner. De adhæsive proteiner, von Willebrand faktor, fibronectin og vitronectin fra trombocytternes α-granula, foranlediger at aktiveringen og forankringen af trombocytter til de underliggende strukturer forstærkes. ADP fra dense-granula og tromboxan (TxA 2 ) fra cytoplasmaet kan ved binding til receptorer på ikke-aktiverede trombocytter aktivere disse adhæsionsuafhængigt. Desuden virker tromboxan karkontraherende. Fibrinogen (FI) og trombospondin (TSP) fra α-granula er især vigtige for trombocytternes aggregation, men desuden er fibrinogen forstadium for koagulationssystemets slutprodukt, fibrin. (figur 5) Nogle af stofferne stimulerer koagulationssystemet. Pladefaktor 3 (PF3 = pladetromboplastin) og koagulationsfaktor V (FV) fra α-granula vises på trombocytoverfladen og fungerer som ankerpladser for koagulationssystemet. PF3 består af serinholdigt phospholipid, hvortil de vitamin-k-afhængige koagulationsfaktorer kan binde sig. FV fungerer efter aktivering som receptor for aktiveret koagulationsfaktor X (FXa). Højmolekylært kininogen (HMWK) fra α-granula er et protein som deltager i aktiveringen af koagulationsfaktor XI. Faktisk er der til HMWK fra trombocytterne bundet FXI, og ca. 0,5% af den forekommende FXI stammer fra trombocytterne. Ca 2+ fra dense-granula og cytoplasma deltager flere steder i koagulationssystemet og pladefaktor 4 (PF4) fra α- granula stimulerer koagulationen ved at binde sig til heparin og andre heteropolysaccharider, som katalyserer hæmning af koagulationssystemet via antitrombin. (figur 5) Nogle af stofferne hæmmer fibrinolysen. α 2 -plasmininhibitor (α 2 -PI) fra dense-granula hæmmer det centrale enzym i fibrinolysen, plasmin. Vævsplasminogenaktivatorinhibitor (tissue plasminogen activator inhibitor = tpai = PAI-1) fra α-granula hæmmer dannelsen af aktivt plasmin ud fra det inaktive enzymforstadium, plasminogen.

Web-udskrift 11 Nogle af stofferne stimulerer immunsystemet. P-selectin rekrutteres fra α-granula til trombocytoverfladen og til plasma (enten i opløst form eller på overfladen af pladederiverede mikropartikler - PMP) ved trombocytternes release. P-selectin er en receptor for liganderne PSGL-1 og GPIbα. PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand) er et homodimert glycoprotein, som konstitutivt udtrykkes på overfladen af leukocytter og leukocyt- (monocyt-) deriverede mikropartikler (MMP). GPIbα er en del af GPIb-V-IX, trombocytternes receptor for vwf. P-selectins funktioner menes at være tilhæftning af leukocytter til hæmostaseaktive eller inflammatoriske lokalisationer og forstærkning af trombocytternes aggregation. Til stimulering af immunsystemet releaser aktiverede trombocytter også adskillige såkaldte chemokiner fra deres α-granula. Chemokiner virker tiltrækkende på andre celler, og trombocytternes chemokiner tiltrækker især leukocytter. De længst kendte chemokiner fra trombocytter er PF4 og β-tromboglobuliner. Disse to chemokiner siges at tilhøre CXC-klassen, der indeholder 4 konserverede cysteinrester, hvor de to nærmest den N-terminale ende er adskilt med en aminosyre. I dag kendes flere chemokiner, f.eks. interleukin 8 (IL8), RAN- TES og GRO-α. Endelig virker hormonet serotonin fra dense-granula ligesom tromboxan karkontraherende og stimulerer adhæsionsuafhængig trombocytaktivering, og PDGF fra α-granula stimulerer dels knoglemarvens produktion af trombocytter, dels cellevækst i det beskadigede område. Ved trombocytternes aggregation deltager receptorerne GPIIb-IIIa (integrin - a IIb ß 3 ) og GPIV i trombocytmembranen samt de sammenkittende proteiner, fibrinogen og trombospondin. (figur 5) Integrinet GPIIb-IIIa er med sikkerhed i stand til at binde sig til fibrinogen, fibronectin, von Willebrand faktor og vitronectin, og menes ved langsom blodstrømningshastighed i vener og venoler at spille en ikke ubetydelig rolle ved trombocytternes adhæsion. GPIIb-IIIa, som består af en a IIb - og en ß 3 -peptidkæde, bliver først aktiv som receptor, når trombocytten aktiveres. α- og ß-kæderne samles til en aktiv receptor i forbindelse med trombocytaktiveringen, og receptoren transporteres fra indersiden af α-granula til cellemembranen i forbindelse med trombocyttens release. Der findes ca. 50000 kopier af GPIIb-IIIa per aktiv trombocyt, hvilket er mange, og via binding til fibrinogen kan to receptorer på hver sin trombocyt hæfte disse sammen. Sammenhæftningen er ikke robust, men kræver en forstærkning. Dette formidles af receptoren GPIV, som ikke er et integrin, og som kan binde sig til trombospondin. GPIV-trombospondin-komplekset danner med GPIIb-IIIafibrinogen-komplekset et stabilt sammenhæftningskompleks. (figur 5)

Web-udskrift 12 1. 3 Koagulationssystemet Formålet med koagulationssystemet er hurtigt at danne tråde af polymeriseret fibrin, der lokalt væves ind i den primære trombe for at forstærke denne. Kravene til systemet er således hurtighed og præcision. Kravet om hurtighed er opfyldt ved at lade fibrindannelsen forløbe som et kaskadearrangement af enzymaktiveringer med indbygget selvforstærkning (positiv feed back). (figur 6a og figur 6b) Ved kravet om præcision forstås dels, at fibrindannelsen kun må foregå ved karlæsion og dels, at den her skal forblive lokaliseret til den primære trombe. Dette krav opfyldes normalt - ved at initieringen af koagulationssystemet er gjort afhængig af kontakt med et specifikt cellebundet protein i subendothelet - vævsfaktor (tissue factor - TF), - ved at nogle af faktorerne i koagulationssystemet kun er i stand til at blive aktiveret på overfladen af aktiverede trombocytter samt celler, der udtrykker vævsfaktor (FII, FVII, FIX of FX) - ved hjælp af et sindrigt system af inhibitorer, der regulerer kaskadearrangementet. Denne regulering kaldes antikoagulationen. Enzymaktivering. Alle koagulationsfaktorer er proteiner, og består som sådanne af aminosyrer, der via peptidbindinger er polymeriserede til peptidkæder. De fleste koagulationsfaktorer er proenzymer for proteinspaltende enzymer (proteaser). Ved et proenzym forstås et inaktivt enzymforstadium, som for at blive aktivt, skal have fjernet et stykke af sin peptidkæde elller brudt peptidkæden. Herved frisættes enzymets aktive sæde. Inaktive koagulationsfaktorer navngives hyppigst med et F (for faktor) efterfulgt af et romertal (f.eks. FIX). Aktiverede koagulationsfaktorer (ikke vist på figur 6) navngives ved addition af et lille a (f.eks. FIXa). Kaskadearrangement. Når en inaktiv protease i koagulationssystemet ved hydrolyse bliver aktiveret og får fritstillet det aktive sæde, bliver den som aktiv protease selv i stand til at katalysere hydrolysen af en peptidbinding. Hvilken peptidbinding, det drejer sig om (kaldet specificiteten), afgøres af det aktive sædes form samt aminosyrerækkefølgen omkring bindingen, der skal hydrolyseres. Formerne af de aktive sæder i koagulationssystemets proteaser er fra naturens side ordnet således, at proteaserne fortløbende kan aktivere hinanden, og herved opstår kaskadearrangementet. Som illustration af arrangementets hurtighed kan man f.eks. forestille sig, at hver protease per sekund kan aktivere 100 eksemplarer af en inaktiv protease. Et molekyle FXIa giver således per se

Web-udskrift 13 kund 100 molekyler FIXa. Hver af disse vil give 100 molekyler FXa, ialt 10000 molekyler FIXa. Hver af disse vil give 100 molekyler FIIa, i alt 1000000 molekyler FXa o.s.v.. Den sidste reaktion er FIIa's (trombin's) aktivering af FI (fibrinogen) til FIa (fibrin). Fibrinogen er ikke et proenzym, men et langstrakt protein. Ved trombins aktivering, bliver fibrinmolekyler i stand til at binde sig til hinanden i længderetningen, hvorved lange fibrintråde (fibrinpolymere) opstår. Ud fra ganske få aktiverede molekyler i starten af koagulationssystemet foranlediger kaskadearrangementet således en nærmest eksplosionsagtig dannelse af fibrin. In vitro (uden for kroppen) kan kaskadereaktionerne initieres ved at FXII/prækallikrein udsættes for unormale omgivelser f.eks. kollagen, glas eller fedtsyrer. Den første initiering medfører efterfølgende aktivering af FXII, prækallikrein, FXI, FIX og FVIII, en reaktionsrækkefølge som traditionelt benævnes det interne system (figur 6a). In vivo (i kroppen) initieres koagulationssystemet ved at FVII kontakter vævsfaktor. FVII's aktivering ved kontakt med vævsfaktor benævnes det externe system (figur 6b) Den aktiverede faktor VII (FVIIa) kan herefter aktivere både FX of FIX. Begge systemer medfører aktivering af FX, FV, FII og FI, hvorfor denne procesrække benævnes fællessystemet. Positiv feed back. En yderligere hastighedsforøgelse af kaskadearrangementet er frembragt ved at nogle koagulationsfaktorer aktiveres af efterfølgende faktorer i kaskaden. Det drejer sig om FV og FVIII, der begge aktiveres af FIIa og FVII, der kan aktiveres af både FIIa og FXa samt FXI, der kan aktiveres af FIIa. Kaskadearrangementer med positiv feed back er biokemisk set sjældent forekommende, sandsynligvis fordi sådanne systemer nemt løber løbsk. Koagulationssystemet er sikret mod dette med både livrem og seler i form af antikoagulationen. Denne består af tre systemer, og som det vil blive beskrevet under antikoagulationen, reguleres såvel initieringen som hastigheden af koagulationskaskaden herved. 1. 3. 1 Koagulationsfaktorer, generelt Tabel 6 indeholder en oversigt over de kendte og undersøgte faktorer i koagulationssystemet med tilhørende antikoagulation. Oftest anvendes den internationalt vedtagne terminologi for koagulationsfaktorer, som bygger på romertal, men undertiden anvendes trivialnavne som fibrinogen, calci

Web-udskrift 14 umioner, protrombin, trombin m.v.. Nogle koagulationsfaktorer har, ligesom faktorerne i antikoagulationen endnu ikke fået tildelt romertal. Flertallet af koagulationsfaktorer er proenzymer til proteolytiske enzymer, hvilket indebærer, at de cirkulerer i inaktiv form i blodet. De aktive enzymer hører til gruppen af såkaldte serinproteaser, der i deres aktive sæde har aminosyren serin indbygget. Serinproteaserne er fylogenetisk (udviklingsmæssigt) nært beslægtede, og til denne gruppe hører desuden trypsin, chymotrypsin, elastase samt de fibrinolytiske faktorer og nogle af komplementfaktorerne. Tre proenzymaktiveringer formidles af store aktiveringskomplekser, som samles på overfladen af enten aktiverede trombocytter eller celler, der udtrykker vævsfaktor (figur 7b). For at serinproteaserne kan samles i disse komplekser, skal de under koagulationsprocessen bindes til negativt ladet fosfolipid (pladefaktor 3 = PF3) på trombocytoverfladen. Bindingen foregår via Ca2+, og for at den kan foregå, er det nødvendigt, at disse faktorer under dannelsen i leveren forsynes med ekstra carboxylatgrupper (-COO-). De pågældende proenzymer er FII, FVII, FIX, FX og protein C (PC) samt hjælpeproteinet (cofaktor) protein S (PS). Ved carboxyleringen indgår vitamin K samt enzymerne vitamin K-reductase og vitamin K-epoxidreductase. De ekstra carboxylatgrupper bliver påsat glutaminsyrerester i de pågældende faktorer, og sådanne carboxylerede glutaminsyrerester benævnes γ-carboxyglutaminsyrerester (gla). De to ovennævnte enzymer hæmmes af såkaldte vitamin K-antagonister (f.eks. warfarin og dikumarol) ligesom vitamin K-mangel også medfører nedsat carboxylering (figur 7a). To af faktorerne, som ikke er proenzymer, er også indbyrdes fylogenetisk beslægtede. Det drejer sig om FV og FVIII, som er inaktive forstadier til såkaldte cofaktorer. FVIII findes i plasma som et kompleks bestående af FVIII:C (proteinet, som indeholder katalytisk aktivitet) og FVIII:vW (von Willebrand-faktoren - også benævnt vwf). FVIII:vW fungerer i plasma som transportprotein for FVIII:C og fraspaltes ved aktiveringen. Når FVIII:C og FVIII:vW optræder som antigen ved immunokemiske reaktioner, betegnes de h.h.v. FVIII:C:Ag og FVIII:R:Ag. Såvel FV som FVIII fungerer efter aktivering som receptorer for dannelse af to aktiveringskomplekser på overfladen af trombocytterne. FVa kan her sammen med PF3 og Ca2+ binde FXa og protrombin, og dette kompleks - kaldet protrombinasekomplekset - aktiverer protrombin til trombin. FVIIIa kan på analog måde sammen med PF3 og Ca2+ binde FIXa og FX under dannelse af aktiveringskomplekset benævnt tenasekomplekset. Herved aktiveres FX til FXa (figur 7b).

Web-udskrift 15 Ud over FV og FVIII indgår der også i koagulationssystemet andre cofaktorer, f.eks. højmolekylært kininogen (HMWK), PF3, Ca2+, vævsfaktor (FIII, TF) og pladefaktor 4 (antiheparin). HMWK er et protein, der fungerer som hjælpefaktor ved aktivering af FXII og FXI. Det dannes bl.a. i endothelceller og megacaryocytter og frigives ved aktiverede trombocytter's release. PF3 er phosphatidylserin- (kefalin-) holdigt phospholipid, som udtrykkes på overfladen af aktiverede trombocytter og her lokaliseres dels komplekset bestående af Ca2+, FVIIIa, FIXa og FX, der aktiverer FX, dels komplekset bestående af Ca2+, FVa, FXa og FII, der aktiverer FII (figur 7b). TF er som tidligere nævnt et protein, der normalt udtrykkes på overfladen af forskellige celler i karvæggens underliggende strukturer. Dette protein fungerer både som receptor og analogt med FVa og FVIIIa, idet det er nødvendigt for samling af det cellelokaliserede aktiveringskompleks til initiering af koagulationssystemet. Dette kompleks består af Ca2+, TF, FVII og FX og i forbindelse med dette kompleks aktiveres både FVII og FX (figur 7b). Pladefaktor 4 frigives fra aktiverede trombocytter og binder sig til heparin og andre heteropolysaccharider, der katalyserer hæmning af koagulationssystemet via ATIII. Det vigtigste system til regulering af koagulationskaskaden er antikoagulationen. Denne indeholder dels nogle serinproteaseinhibitorer (serpiner), som ved binding til aktive serinproteaser, hæmmer disse. Tre vigtige serpiner er antitrombin (AT - tidligere antitrombin III - ATIII), heparin-cofaktor II samt protease nexin I. Disse inhibitorer er aktive i nærvær af negativt ladet heteropolysaccharid (heparansulfat på celleoverflader eller heparin). Endvidere indgår i antikoagulationen protein C, som aktiveret katalyserer nedbrydning af FVa og FVIIIa, hvorved de to trombocytbundne aktiveringskomplekser opløses. Ved aktivering af protein C indgår trombin, som har bundet sig til trombomodulin, og for aktivitet kræves phospholipid (PL), Ca2+ og en cofaktor, protein S. Endelig indeholder antikoagulationen en speciel hæmmer af initieringskomplekset, der som cofaktor anvender TF. Hæmmeren hedder tissue factor pathway inhibitor (TFPI). Den danner først kompleks med FXa, og dette kompleks hæmmer efterfølgende TF-FVIIa-komplekset (initieringskomplekset). 1. 3. 2 Internt system (FXII,FXI,FIX) Det interne system kaldes traditionelt således, fordi det kan forløbe ved hjælp af faktorer, som man tidligere mente udelukkende fandtes i blodet. I systemet indgår FXII, prækallikrien, højmolekylært kininogen, FXI, FIX, FVIII, FX, Ca2+ og pladefaktor 3.

Web-udskrift 16 In vitro kan koagulationskaskaden begynde med, at FXII aktiveres til FXIIa. Denne reaktion forløber i samspil med prækallikrein, som er et proenzym til kallikrein, en serinprotease, og højmolekylært kininogen (HMWK), et protein, der fungerer som hjælpefaktor (figur 8). Reaktionen kan startes ved kontakt til fremmed overflade (kollagen, glas, kaolin) og menes indledt med en konformationsændring af FXII, som herefter går i kompleks med HMWK og FXI, der i plasma er associeret til hinanden. Dette kompleks aktiverer FXII til FXIIa, der aktiverer prækallikrein til kallikrein. Kallikrein aktiverer herefter mere FXII til FXIIa samt FXI til FXIa. Kallikrein katalyserer endvidere fraspaltning af et lille peptid fra HMWK, kaldet bradykinin, der virker smertefremkaldende og kardilaterende (figur 8). Udover aktivering af FXII og FXI katalyserer kallikrein også omdannelsen af plasminogen til plasmin via plasminogenaktivtoren pro-urokinase. Plasmin kan både spalte fibrin-polymer til såkaldte splitprodukter i fibrinolysen og kan desuden aktivere komplementsystemet på flere niveauer. Her menes prækallikrein at blive aktiveret af en anden protease på overfladen af bla. endothelceller uafhængigt af FXII, men afhængig af HMWK. Aktivering af prækallikrein menes in vivo kun at have betydning for fibrinolysen og komplementsystemet, idet mangel på FXII, HMWK og/eller prækallikrein ikke giver blødningssymptomer, men tværtimod tromboserisiko. FXI-mangel giver derimod en ubetydelig nedsat koagulationsevne. Ud over at kunne aktiveres af FXIIa/kallikrin kan FXI også aktiveres af FIIa (trombin). Denne aktivering af FXI via FIIa menes in vivo at have betydning for forstærkning af koagulationsprocessen. FIX kan ligeledes aktiveres på to måder - af FXIa og af FVIIa. Ved nærvær af Ca2+ hydrolyserer FXIa to peptidbindinger i FIX, som herved aktiveres (figur 8). 1. 3. 3 Internt system (FIX,FVIII,FX) FIX kan aktiveres dels af FXIa fra det interne system og dels af FVIIa fra det externe system. Aktiveringen af FIX via det externe system vil blive beskrevet her. Når FIX er blevet aktiveret, skal der på trombocytoverfladen samles et aktiveringskompleks, for at FX kan blive aktiveret.

Web-udskrift 17 Aktiveringskomplekset, kaldet tenasekomplekset, består af negativt ladet phospholipid (PF3), FVIIIa, Ca2+, FIXa og FX. (figur 9) Både FIX og FX er vitamin K-afhængige koagulationsfaktorer og indeholder således negativt ladede Ca2+-bindende gla-rester. Når Ca2+ har bundet sig til gla-resterne, tjener dette som ankerkæde for FIXa og FX til trombocytoverfladen, idet gla-bundet Ca2+ kan danne kompleksbindinger til trombocytternes negativt ladede phospholipid (PF3). For at orientere FIXa og FX optimalt i forhold til hinanden på trombocytoverfladen kræves endvidere, at FVIIIa har bundet sig til phospholipidet. FVIII, der består af FVIII:C (koagulationsaktiv del) og FVIII:vW (transportdel = von Willebrand faktor), aktiveres af spormængder af trombin (FIIa), som dannes senere i koagulationskaskaden. Ved aktiveringen dissocierer FVIII:vW fra, når FVIII:C omdannes til FVIIIa, der binder sig til trombocytternes phospholipid. Da FVIII:vW udover at være transportprotein for FVIII:C også tjener som adhæsivt protein ved trombocytternes adhæsion til subendotelet, er det ikke utænkeligt, at der allerede under dannelsen af den primære trombe er sket en opkoncentrering af FVIII:C ved læsionsstedet. (figur 9) 1. 3. 4 Externt system (FVII,TF,FX) I det externe system aktiveres FVII til FVIIa, og denne protease kan efterfølgende aktivere FX og/eller FIX. Her beskrives aktiveringen af FVII og FX. Det externe system kaldes traditionelt således, fordi det for at forløbe kræver en faktor, som normalt ikke findes i blodet, nemlig vævsfaktor (TF = FIII). (figur 10) TF er et transmembrant protein, der konstitutivt findes i phospholipidmembranen (PL) på mange vævsceller og celler i karrenes media og adventitia, men kun i endotelcellers membraner efter aktivering af disse. Blodet er således ikke normalt i kontakt med TF, men kommer det ved karlæsion. TF menes bla. at fungere analogt med FVIIIa og FVa ved at orientere FVIIa optimalt i forhold til FX eller FIX, som skal aktiveres. Herudover fungerer TF også som en slags receptor, idet aktivering af TF kan medføre initiering af et signalsystem intracellulært i cellen.

Web-udskrift 18 FVII er et proenzym for serinproteasen, FVIIa. FVII er ligesom FIX og FX en vitamin K-afhængig koagulationsfaktor og binder sig til phospholipid via gla-rester og Ca2+. FVIIa er i modsætning til de fleste andre aktiverede koagulationsfaktorer rimeligt stabil, og cirkulerende FVIIa kan opholde sig længe i blodet (halveringstid: ca. 2,5 timer). Der er således til stadighed spormængder af FVIIa til stede i blodet. (figur 10) Aktiveringen af FVII til FVIIa menes at foregå via spormængder af FVIIa og/eller FXa og samling af et aktiveringskompleks, der består af FVIIa, TF, Ca2+, phospholipid (PL) og enten FX eller FIX: 1. Når blod kommer i kontakt med membranbundet TF vil FVII og evt. spormængder af FVIIa bindes hertil, og danne et lille antal aktiveringskomplekser (ikke-aktiveret FVII har sammen med TF en ringe katalytisk aktivitet). 2. Nu omdannes få molekyler FX til FXa. 3. Det dannede FXa omdanner herefter alt det TF-bundne FVII til FVIIa, som katalyserer omdannelse af mere FX til FXa samt FIX til FIXa. (figur 10) Hvor meget FXa der dannes og hermed hastigheden af koagulationskaskaden afgøres således primært af mængden af TF, der ved karlæsion og ved aktivering af endothelceller kommer i kontakt med FVII og FVIIa. Dette er måden, hvorpå koagulationssystemet menes at starte in vivo. Denne initiering af koagulationssystemet reguleres af et snedigt protein i antikoagulationen, der hedder tissue factor pathway inhibitor (TFPI). Læs om denne regulering her. 1. 3. 5 Ex- og internt system (TF,FVII,FIX,FX) Hermed følger en lille opsummering af reaktionerne ved indgangen til fællessystemet. (figur 11) Som beskrevet tidligere: kan FIX aktiveres af både FXIa fra det interne system og FVIIa fra det externe system. Da starten på det interne system i dag kun menes in vivo at have betydning for det fibrinolytiske system, er aktiveringen af FIX via det externe system den vigtigste in vivo. FXI kan aktiveres af FIIa (trombin) og denne aktivering menes at spille en rolle som forstærkning af fibrindannelsen, f.eks. på steder, hvor vævsfaktor (TF) ikke udtrykkes så kraftigt. kan FX aktiveres af både FVIIa og FIXa (tenasekomplekset). Her er aktiveringen via FVIIa den vigtigste ved initieringen af koagulationen, medens aktiveringen via FIXa er vigtig for det fort

Web-udskrift 19 satte forløb. Sidstnævnte aktivering kan altså betragtes som et forstærkningssystem til dannelse af FXa og fibrin, ligesom aktiveringen af FXI var det. Forstærkningen af koagulationssystemet via FIX/FIXa (tenasekomplekset) spiller dog fysiologisk en meget vigtigere rolle end forstærkningen via FXI/FXIa. Ved arvelige defekter i tenasekomplekset fremkommer de klassiske blødersygdomme, medens arvelig mangel på FXI kun giver moderat blødningstendens. Initieringen af koagulationskaskaden in vivo kan herefter sammenfattes (figur 11): 1. Når blod kommer i kontakt med membranbundet TF vil FVII og evt. spormængder af FVIIa bindes hertil, og danne et lille antal aktiveringskomplekser (ikke-aktiveret FVII har sammen med TF en ringe katalytisk aktivitet). 2. Nu omdannes få molekyler FX til FXa. 3. Det dannede FXa omdanner herefter alt det TF-bundne FVII til FVIIa, som katalyserer omdannelse af mere FX til FXa samt FIX til FIXa. 4. Sandsynligvis forbliver det nyaktiverede FXa på den vævsfaktorbærende celle (fibroblastceller mv.), hvor det på celleoverfladen kan danne kompleks med indfanget FVa med henblik på at aktivere protrombin til trombin. Denne lokale forøgelse af aktivt trombin kan aktivere FVIII til FVIIIa. Herved kan tenasekomplekset bestående af FIXa, FVIIIa og phosphorlipid dannes og således muliggøre aktiveringen af FX på overfladen af de aktiverede trombocytter. (figur 11) 1. 3. 6 Fællessystemet (FX,FV,FII,FI) I fællessystemet aktiveres FV, FII (protrombin), FI (fibrinogen) og FXIII. Den delreaktion i kaskaden, som er studeret mest indgående, er aktiveringen af protrombin til trombin. (figur 12) Protrombin aktiveres ligesom FVII og FX af et makromolekylært aktiveringskompleks (protrombinasekomplekset). Dette samles på trombocytoverfladen og består af FXa, FVa, Ca2+, phospholipid (PF3) og protrombin. FV aktiveres af spormængder trombin (og faktor FXa) ved positiv feedback. FVa binder sig herefter til det negativt ladet phospholipid, hvor det sammen med phospholipidet fungerer som receptor for det netop fremkomne FXa. Gla-resterne i FXa interagerer via Ca2+ med phospholipidet, og desuden forekommer en direkte interaktion med FVa. FVa og phospholipid øger aktiveringshastighe

Web-udskrift 20 den for protrombin ca. 105 gange, og FVa synes at orientere FXa og protrombin optimalt i forhold til hinanden, medens det negativt ladede phospholipid tjener til at øge reaktanternes koncentration. Produktet, trombin, skiller sig ud fra de øvrige vitamin K-afhængige serinproteaser ved at gla-delen under aktiveringen spaltes fra. Trombin har således ikke affinitet til phospholipid, hvilket trombins substrat, fibrinogen, heller ikke har. (figur 12) Trombin har i situationer med forøget tromboseberedskab en række prokoagulante funktioner: Trombin kan via receptorer PAR-1 og PAR-2 på trombocytternes overflade aktivere disse adhæsionsuafhængigt, hvorved trombocytterne releaser en række prokoagulante faktorer. (tabel 5) Trombin kan aktivere hjælpefaktorerene FV og FVIII samt zymogenerne FXI og FVII ved positiv feedback i koagulationssystemet. Trombin kan aktivere FXIII, som er proenzym til en transglutaminase (transamidase), der stabiliserer fibrin-polymere. Endelig og vigtigst er trombin enzymet, der katalyserer omdannelsen af fibrinogen til fibrin. Trombin kan stimulere endotelceller til på overfladen at vise TF og til at udskille vævsplasminogenaktivator (tpa), der under fibrindannelsen skal indbygges i den sekundære trombe for på det rette tidspunkt at kunne aktivere det fibrinolytiske system. (figur 12) Trombin har i situationer uden forøget tromboseberedskab en række antikoagulante funktioner, som opstår ved binding til trombomodulin (TM), og som beskrives i forbindelse med antikoagulationen. Fibrinogenmolekylet er opbygget af 3 par polypeptidkæder, a, ß og?. Man kan forestille sig molekylet arrangeret i 2 symmetriske halvdele hver med en α-, en ß- og en g-kæde. Peptidkæderne synes at være spiraliserede i en tripplespiral, som afsluttes carboxyterminalt med en globulær del i hver halvdel (D). Halvdelenes aminoterminale ender er med disulfidbroer sammenholdt i et globulært domæne centralt på molekylet (E). Ud fra det centrale domæne stikker α- og ß-kædernes aminoterminale ender som fire negativt ladede haler. Ud fra de endestillede domæner stikker α- kædernes carboxyterminale ender som to polære haler.(figur 12) Ved trombins proteolytiske spaltning af først α-kædernes aminoterminale haler og senere ß- kædernes haler falder disse af som h.h.v. fibrinopeptid A (FPA = et peptid med 16 aminosyrer kal

Web-udskrift 21 det A 1-16) og fibrinopeptid B (FPB = et peptid med 14 aminosyrer kaldet Bß 1-14). Herved fremkommer fibrinmonomer, hvor det centrale domænes overskud af negative ladninger er blevet mindre. Polymeriseringssæder fremkommer, hvortil endestillede globulære domæner fra andre fibrinmonomere kan binde sig. Fjernelsen af fibrinopeptid A medfører polymerisering i fibrinmolekylets længderetning, medens fjernelse af fibrinopeptid B muliggør forgreninger af polymerisatet.(figur 12) Med det formål at stabilisere fibrinpolymerisatet med covalente bindinger aktiverer trombin også FXIII til FXIIIa. FXIIIa er en transglutaminase, som katalyserer dannelse af amidbindinger mellem lysin-sidekæder og glutaminsidekæder. Under optimale betingelser dannes op til 6 sådanne krydsbindinger per fibrinmolekyle, og disse krydsbindinger tjener til at gøre tromben mere robust og resistent mod fibrinolyse.(figur 12) 1. 4 Antikoagulationssystemet 1. 4. 1 Serpiner Formålet med antikoagulationen er forhindre koagulationskaskaden mod at løbe løbsk, samt at sikre, at aktiverede koagulationsfaktorer ikke foranlediger systemisk fibrindannelse, hvilket vil sige fibrindannelse andre steder i karsystemet end ved den primære trombe. Antikoagulationen består af tre forskellige mekanismer. 1. Den første mekanisme formidles af serpiner, som er bundet til endothelcellernes luminale overflade, og som her binder allerede aktiverede koagulationsfaktorer, hvorved systemisk koagulation forhindres. 2. En anden mekanisme, som formidles af tissue factor pathway inhibitor (TFPI), hæmmer aktiveringskomplekset i det externe system. Denne mekanismes aktivitet afhænger af aktiveret FX (FXa). 3. Den tredje mekanisme, som er opbygget omkring serinproteasen protein C (PC), hæmmer aktiveringskomplekserne i det interne system og fællessystemet ved proteolytisk inaktivering af FVa og FVIIIa. Denne mekanismes aktivitet afhænger af aktiveret trombin (FIIa). Serpiner. Proteiner, der binder sig til serinproteaser og hermed hæmmer disse, kaldes serpiner. (figur 13) Tabel 7 indeholder en oversigt over ti kendte serpiner i plasma. Alle serpiner hæmmer serinproteaser, men afviger indbyrdes med hensyn til specificitet, d.v.s. med hensyn til hvilke serinproteaser, de kan hæmme. Nogle serpiner hæmmer primært proteaser i koagulationssystemet, andre i det

Web-udskrift 22 fibrinolytiske system og atter andre i komplementsystemet. Der hersker stadig usikkerhed om serpinernes præcise specifiteter, og der med om i hvor høj grad serpiner, som traditionelt hører hjemme i koagulationssystemet, også hæmmer proteaser i det fibrinolytiske system og visa versa. Tre vigtige serpiner i koagulationssystemet er antitrombin (AT) (under navneændring fra antitrombin III (ATIII)), heparin cofaktor II (HCII) og protease nexin I. AT dannes i leveren og inaktiverer alle proteaser i koagulationssystemet på nær FVIIa. Endvidere inaktiverer AT plasmin i det fibrinolytiske system. Inaktiveringen foregår ved, at AT irreversibelt danner et inaktivt 1:1-kompleks (kompleks bestående af 1 molekyle hæmmer og 1 molekyle enzym). Komplekset elimineres via R.E.S.. (figur 13) Bindingen mellem protease og hæmmer øges ca. 103 gange i nærvær af de negativt ladede heteropolysaccharider, heparansulfat på endotelceller og heparin (jvnf. tabel 1). Disse heteropolysaccharider fungerer som katalysatorer for AT's hæmning af serinproteaserne. Bemærk, at ved aktiveringen af trombocytter, secernerer disse bl.a. pladefaktor 4, som hæmmer heparins katalytiske virkning. På trods af, at blodet in vivo opfører sig som om det var hepariniseret, kan heparin ikke påvises i blod. Denne tilsyneladende heparisering kan forklares ved, at endotelcellernes luminale ydre er foret med bl.a. heparansulfat, der fungerer som cofaktor for AT ved inaktivering af proteaserne. Omvendt kan den effektive binding mellem heparansulfat og AT sammen med den relativt høje plasmakoncentration af AT måske give anledning til undren over, at blodet kan koagulere overhovedet. Forklaringen herpå er, at de aktiverede koagulationsfaktorer er beskyttet mod inaktivering, når de er bundet i aktiveringskomplekser på overfladen af bl. a. trombocytter og når de er indlejret i fibrin. HCII er analog med AT m.h.t. opbygning og funktion, men denne inhibitor hæmmer kun trombin. (figur 13) Protease nexin I er ligeledes analog med AT i opbygning og funktion. Dette protein hæmmer trombin, tpa og urokinase, og dets primære funktion synes at være beskyttelse af extravasculær matrix mod tpa's nedbrydning af denne. (figur 13)