Hæmofili A. Blodets celler og proteiner

Transkript

1 Hæmofili A Blodets celler og proteiner Gruppe B230: Karin Haugaard Jacobsen, Janshini Jeyarajan, Johannes Manner-Jakobsen, Lykke Kirstine Schøning og Lærke Kristine Vinther

2

3 Titel: Hæmofili A Blodets celler og proteiner. Tema: Humanbiologi Projektperiode: P2, foråret 2014 Projektgruppe: B230 Deltagere: Karin Haugaard Jacobsen Janshini Jeyarajan Johannes Manner-Jakobsen Lykke Kirstine Schøning Lærke Kristine Vinther Vejleder: Mette Sondrup Andersen, Aalborg Universitet Bivejleder: Sara Bjørn Aaen, Aalborg Universitet Oplagstal: 8 Sideantal: 67 Bilagsantal og -art: 5 Synopsis: Blodet er et kredsløb, der består af erytrocytter, leukocytter, trombocytter og plasma. Blodet har flere funktioner såsom blodkoagulationen. Når der opstår en blødning i kroppens blodbaner, aktiveres blodkoagulationen, reguleret af koagulationsfaktorerne. Ved en mangel på koagulationsfaktor VIII, vil koagulationskaskaden ikke kunne forløbe, og blødningen ikke standses. Manglen på faktor VIII kaldes også hæmofili A. Via et litteraturstudie er der blevet sat fokus på hæmofilis indflydelse på blødernes mulighed for det gode liv med henblik på behandling. Behandlingsmetoder har gjort det muligt for blødere, at få et langt og godt liv med en større frihedfølelse. Med fokus på blodets bestanddele kobles teori og praksis, hvor blodets celler og proteiner undersøges ved hjælp af henholdsvis mikroskopi og SDS-PAGE. Der blev obseveret et stort antal erytrocytter, en del forskellig leukocytter samt en del trombocytter ved mikroskopi. Ligeledes blev der opnået indsigt i de forskellige blodproteiners størrelser. /Gruppe B230 Afsluttet den Rapportens indhold er frit tilgængeligt, men offentliggørelse (med kildeangivelse) må kun ske efter aftale med forfatterne.

4

5 Forord Denne rapport er udarbejdet på bioteknologiuddannelsen af gruppe B230 på 2. semester ved Aalborg Universitet. Temaet for P2-forløbet er humanbiologi, og underemnet er blodets celler og proteiner, hvoraf projektets specifikke emne er valgt til at være Hæmofili. Formålet med projektet er at kunne gøre rede for blodets bestanddele. Der skal opnås færdigheder inden for opstilling og efterfølgende analyse af eksperimentelle forsøg på blodets celler og proteiner. Til projektet er Harvard-metoden brugt som referencesystem. En stor tak rettes til vores hovedvejleder Mette Sondrup Andersen for hendes vejledning, feedback og for hendes hjælp under forsøgene. Der skal også rettes en tak til vores bivejleder Sara Bjørn Aaen for hendes vejledning og feedback og til sygeplejersken fra Klinisk Immunologisk Afdeling på Sygehus Nord, der tappede blodet til laboratorieforsøget. Ligeledes takker vi overlæge Kim Varming i Blodbanken og overlæge Søren Risom Kristensen på Klinisk-biokemisk Afdeling på Sygehus Syd i Aalborg for rundvisning og indblik i, hvordan de to institutioner fungerer samt for at have besvaret alle vores spørgsmål. Til slut skal der også lyde en tak til gruppe B267a for godt samarbejde i forbindelse med laboratoriearbejdet. /Gruppe B230

6

7 Indholdsfortegnelse 1.0 Indledning Problemformulering Blodet bestanddele Erytrocytterne Hæmoglobin Leukocytter Monocytter Lymfocytter De neutrofile granulocytter De eosinofile granulocytter De basofile granulocytter Trombocytter Plasma Hæmostase Kontraktion af de beskadigede blodkar Dannelse af en trombocytprop Dannelse af fibrinprop Igangsættelsen af koagulationen Hæmofili A Behandling af hæmofili A Ingen behandling Behandlingens historie Livet som bløder Casestudie Behandlingens betydning

8 8.0 Eksperimentel del Teori Stain af celler Histologi af blodceller Mikroskopi Separation af blod Koagulation af plasma Proteiner i blodet SDS-PAGE Materialer og metode Kemikalier Materialer Metode Resultater Centrifugering Mikroskopiresultater Gelresultater Fejlkilder Diskussion Konklusion Perspektivering Litteraturliste Bilag A: Journal

9 Procent 1.0 Indledning For at transporten af ilt, affaldsstoffer og næringsstoffer kan forløbe effektivt, er det nødvendigt med et kredsløb, der kan fragte alle bestanddelene rundt i kroppen. Det cardiovaskulære system er det organsystem, der har ansvaret for, at kroppen får energikilder og byggesten rundt. Det er desuden med til at opretholde hæmostasen. Når et blodkar beskadiges, startes en række reaktioner, der sætter koagulationen i gang. Ved koagulationen dannes det geléagtige blodkoagel, der forsegler det beskadigede område og standser blødningen. Koagulationen reguleres af det, der kaldes koagulationsfaktorer. Ved sygdommen hæmofili opstår der fejl i koagulationen på grund af en mangel på de to koagulationsfaktorer VIII og IX (Sand 2008). Der er cirka 1000 personer på landsplan, der har fået konstateret en blødersygdom. Så sygdommen er ikke særlig udbredt i Danmark. Der findes flere forskellige typer af blødersygdomme, hvor hæmofili A, B, og von Willebrands sygdom er de tre hyppigste (figur 1). De er forårsaget af henholdsvis en mangel på koagulationsfaktor VIII, IX og faktor von Willebrands. Derudover findes der nogle mere sjældne typer, hvor der opstår mangel på koagulationsfaktorne I, II, V, VII, X, XI og faktor XIII. Hæmofili er en X-bundet recessiv sygdom, der oftest opstår i det tidlige fosterstadie. Hæmofili A og B rammer primært drenge, hvorimod von Willebrands sygdom rammer både piger og drenge da den nedarves dominant. Der fokuseres i dette projekt udelukkende på hæmofili A, der rammer cirka 1 ud af i Danmark (Haugaard Nielsen 2007). Fordeling af blødersygdomme Hæmofili A Hæmofili B Von Willebrands sygdom Sjældne Figur 1: Fordelingen af blødersygdomme i Danmark fra Skejby Sygehus og Rigshospital, august 2011 (Bloderforeningen.dk 2014). 3

10 Udviklingen af medicin for hæmofiliramte, også kaldet blødere, er nået til et punkt, hvor der anvendes erstatningsterapi, der forsyner bløderen med den koagulationsfaktor, som mangles i kroppen, og der forskes i genterapi med ønsket om at kurere hæmofili (Haugaard Nielsen 2007). Før 1965 var det kendt blandt personer med medicinsk viden, at blødere ikke levede længere end til de tidlige barneår, fordi der ingen behandling fandtes (Haugaard Nielsen 2007). Ubehandlet hæmofili kan medføre smerter og ikke mindst skader i leddene og i musklerne, og der er en større risiko for tidlig død, da der kan opstå indre blødninger (Hvidtfeldt 2013). Først i det 19. århundrede skete et gennembrud, da en lille dreng overlevede sine kvæstelser ved hjælp af blodtransfusion. Fra dette mirakel, som først blev beskrevet i 1940, og frem til en egentlig behandlingsmetode gik der cirka 25 år. Kryopræcipitat, den første form for faktormedicin, kan som behandlingsmetode både forebygge og standse blødninger, men hos blødere er indsprøjtningerne ofte ubehagelige og tidskrævende (Haugaard Nielsen 2007). I dette P2-projekt ønskes blodets bestanddele undersøgt via et litterturstudie samt laboratorieforsøg. Gennem litteraturstudiet om blodets bestanddele sættes fokus på hæmostase med henblik på at afdække nogle af de faktorer, der er relevante for at forstå hæmofili A. I den forbindelse fokuseres der efterfølgende på behandling. Det diskuteres, hvordan hæmofili kan påvirke menneskeliv, og hvordan konsekvenserne har ændret sig som følge af nye behandlingsmetoder. Der tages udgangspunkt i seks cases, hvor personer med hæmofili beskriver, hvordan deres liv er og har været. Efterfølgende diskuteres, hvilke faktorer ved sygdom og behandling, der påvirker det gode liv. Der foretages herefter laboratorieforsøg med blod, og ud fra resultaterne analyseres blodets bestanddele. Blodets celler undersøges ved mikroskopi af først fuldblod og efterfølgende fraktioneret blod. Til sidst analyseres de forskellige proteiner i blodet ved hjælp af SDS-PAGE for at få et indblik i blodproteinernes forskellige størrelser. 4

11 2.0 Problemformulering For at kunne forstå, hvordan hæmofili påvirker kroppen, undersøges det, hvilke bestanddele der findes i blodet, både teoretisk og i praksis, med specielt fokus på celler og proteiner, og hvilke metoder der kan benyttes for at påvise disses eksistens. Det afføder følgende undersøgelsesspørgsmål: Hvad består blodet af? Hvordan undersøger man blodets bestanddele? Ligeledes vil sygdommen hæmofili blive undersøgt igennem et litteraturstudie med henblik på at forstå, hvordan sygdommen påvirker bløderen, samt hvordan sygdommen påvirker hæmostasen. Det afføder følgende undersøgelsesspørgsmål: Hvordan behandles hæmofili? Er der konsekvenser ved behandlingen? Hvilke konsekvenser har hæmofili, hvis man ingen behandling får? 5

12 3.0 Blodet bestanddele I en organisme så stor som kroppen er det essentielt med et system, der kan transportere eksempelvis ilt og næringsstoffer ud i kroppen. Denne transport består af hjertet, blod og blodkar, og bliver kaldt det cardiovaskulære system eller blodkredsløbet. Det cardiovaskulære system kan deles i to kredsløb; henholdsvis det lille og store kredsløb. Det lille kredsløb er blodets vej fra hjertet til lungerne, og fra lungerne tilbage til hjertet, hvor det store kredsløb omfatter hele kroppen (Nath, Bartholomew 2012). Blodets celler inddeles i tre hovedgrupper (Nath, Bartholomew 2012): Erytrocytterne, cirka 5 millioner per μl blod. Leukocytterne, cirka 7000 per μl blod. Trombocytterne, cirka per μl blod. Blodets celler dannes i den røde knoglemarv. De tre hovedgrupper af blodets celler er knyttet til forskellige fysiologiske funktioner. Ud over de forskellige celler der findes i blodet, indeholder blodet også plasma, vitaminer, hormoner, vand, affaldsstoffer, og næringsstoffer (Lieth 2009). 3.1 Erytrocytterne Erytrocytterne, de røde blodlegemer, som er den hyppigste celletype i blodet, er kerneløse celler, idet selve cellekernen forsvinder, inden erytrocytterne er modnet. Erytrocytterne er specialiserede celler, hvis funktion er, ved hjælp af hæmoglobin, at sørge for iltforsyningen til kroppens celler samt at bringe den dannede CO 2 tilbage fra vævene til lungerne. Figur 2 Mirkroskopi af erytrocytter, der er forstørret 400x (wadsworth.org 2014). 6

13 På grund af denne specifikke funktion adskiller erytrocytterne sig i deres form fra andre celler. Erytrocytternes cellemembran er således elastisk og ændrer form efter dens omgivelser, og den kan flades ud eller foldes efter behov, hvilket betyder, at erytrocytterne kan komme igennem selv kapillærer med en diameter på ned til 4 µm (Nath, Bartholomew 2012). En erytrocyt har en størrelse på cirka 7,5 μm i diameter (figur 2). Erytrocyttens form er bikonkav, hvilket betyder, at begge sider buer indad, således at den er tyndest i midten. Den bikonkave form øger udover fleksibiliteten desuden overfladearealet væsentligt, hvilket betyder, at udvekslingen af O 2 og CO 2 over cellemembranen bliver mere effektiv (Nath, Bartholomew 2012). Endvidere betyder den bikonkave form, at erytrocytterne kan stakkes i såkaldte rouleaux, som gør erytrocytternes flow gennem mindre blodkar nemmere, idet de ikke rammer ind i karvæggen, som enkelte frie erytrocytter ville. Disse rouleaux kan formes og opløses uden, at det påvirker erytrocytterne (Nath, Bartholomew 2012). Udover den bikonkave form og manglende cellekerne, adskiller erytrocytterne sig også fra andre celler, idet de heller ikke indeholder mitokondrier samt en række andre organeller. Størstedelen af erytrocytternes proteiner udgøres således af hæmoglobinmolekyler, og en enkelt erytrocyt indeholder cirka 300 millioner hæmoglobinmolekyler (Sand 2008) Hæmoglobin Det er hæmoglobin, som binder O 2 og transporterer det rundt i det cardiovaskulære system. Erytrocytterne indeholder store mængder af proteinet hæmoglobin, som dermed muliggør bindingen af O 2. Hæmoglobin har en kompleks kvaternær struktur og består af fire polypeptidkæder: to α-kæder og to β-kæder, der er foldet i en globulær form (figur 3) (Nath, Bartholomew 2012). Hver kæde er bundet omkring en hæmgruppe, som består af en porfyrinring med en Fe 2+ -ion bundet (figur 3) (Sand 2008). Denne Fe 2+ - ion er placeret således, at den kan komme i kontakt med O 2 -molekylerne og på denne måde danne oxyhæmoglobin (Nath, Bartholomew 2012). Modsat kaldes et hæmoglobinmolekyle, hvis Fe 2+ -ioner ikke er bundet til O 2 for deoxyhæmoglobin (Nath, Bartholomew 2012). Hæmoglobin er grunden til, at blodet har den karakteristiske røde farve, og det er koncentrationsforholdet mellem de to former oxyhæmoglobin og deoxyhæmoglobin, der giver farveforskellen på det iltede og afiltede blod. Det iltede blod har således den klare røde farve, som man kender den, mens det afiltede blod er mørkere rødlig farve - næsten bordeaux (Nath, Bartholomew 2012). 7

14 Figur 3 Til venstre ses en erytrocyt i frontalt snit. I midten ses hæmoglobins struktur bestående af fire polypeptidkæder - henholdsvis to α-kæder og β-kæder. Hver kæde har en hæm-gruppe bundet til sig med en ikke-kovalent-binding. Længst til højre ses et hæmmolekyle med en jernion i midten, hvortil ilten bindes (Nath, Bartholomew 2012). 3.2 Leukocytter Leukocytter, de hvide blodlegemer, er en stor del af immunsystemets celletyper. Immunsystemet er et system, der har til opgave at opdage og ødelægge indtrængende mikroorganismer (Agger 2011). Der findes fem typer leukocytter i blodet, som bliver klassificeret i granulære og agranulære leukocytter på baggrund af indholdet af specifikke, cytoplasmatiske granula (Geneser 2011). Cytoplasmatiske granula er små vesikler, lysosomer, der fungerer som nedbrydningssystem, der er dannet af cellerne selv (Geneser 2011). De agranulære leukocytter inddeles i (Hall, Guyton 2011): Monocytter (~ 5,3 %) Lymfocytter (~ 30,0 %) De granulære leukocytter inddeles i (Hall, Guyton 2011): Neutrofile granulocytter (~ 62,0 %) Eosinofile granulocytter (~ 2,3 %) Basofile granulocytter (~ 0,4 %) Monocytter Monocytterne er blandt de første af immunsystemets celler, der opdager bakterier eller virus ved en begyndende infektion. Makrofager, der cirkulerer i blodet som monocytter og differentierer til makrofager ved at opholde sig i væv i stedet for, er store fagocyterende celler, som findes i de fleste væv. Cellerne har en diameter på µm (figur 4). Makrofager optager og nedbryder døde celler og er kroppens vigtigste skraldemænd (Geneser 2011). 8

15 Figur 4 Mikroskopi af monocyt, der er forstørret 400x, hvor der ligger erytrocytter omkring (wadsworth.org 2014) Lymfocytter Lymfocytter er til stede i blodet, lymfesystemet og lymfeknuderne og deraf kommer navnet. Der findes to hovedtyper af lymfocytter: B-lymfocytter og T-lymfocytter. Lymfocytter har en diameter på 7 µm (figur 5). Der findes mere sjældne lymfocytter, kaldet store granulære lymfocytter, som har en diameter på µm (Geneser 2011). Morfologisk kan B-lymfocytter og T-lymfocytter ikke skelnes fra hinanden, men funktionelt er de to celletyper forskellige (Agger 2011). B-lymfocytter danner antistoffer, også kaldet immunglobuliner. Antistoffer er opbygget til at kunne binde sig til et bestemt stof, et antigen. Når et antigen trænger ind i kroppen, stimuleres B- lymfocytter. De udvikles her til modne B-lymfocytter, der nu kaldes plasmaceller. Nogle af B- lymfocytterne udvikles til hukommelsesceller, der danner det samme antistof kontinuerligt (Agger 2011). Figur 5 5A Mikroskopi af lymfocyt der er forstørret 400x, hvor der er erytrocytter omkring (wadsworth.org 2014). 5B Der er strukturen af antistof (Tymoczko, Stryer 2012). 9

16 De fleste lymfocytter i kroppen er T-lymfocytter (Geneser 2011). Der findes forskellige undertyper af T-lymfocytter: T-dræberceller, som dræber fremmede celler og kroppens egne celler, hvis de er inficerede. T-hjælpeceller, som aktiverer mange af de øvrige celler i immunsystemet. Nogle af er T- lymfocytterne udvikles også til hukommelsesceller (Agger 2011) De neutrofile granulocytter Den neutrofile granulocyt er den mest talrige af blodets leukocytter, og er den vigtigste fagocyterende celle i inficerede og inflammerede væv. De har en diameter på µm (figur 6). Neutrofile granulocytter er kortlivede celler, som er hurtige til at mobilisere et stort antal fra knoglemarven. De er specialiserede i fagocytose og drab af mikroorganismer. Den neutrofile granulocyt dør selv, når den dræber en mikroorganisme, hvilket resulterer i, at vævets ekstracellulærmatrix nedbrydes. Massen af døde neutrofile granulocytter og den nedbrudte matrix kaldes for pus (Geneser 2011). Figur 6 Mikroskopi af neutrofile granulocyt, der er forstørret 400x, hvor der ligger erytrocytter omkring (wadsworth.org 2014) De eosinofile granulocytter De eosinofile granulocytter er de næsthyppigste granulære leukocytter i blodet. Cellernes diameter er µm (figur 7). De fagocyterer især antigener eller antigenkomplekser, som dannes hos allergiske personer. De eosinofile granulocytter tiltrækkes af histamin, som frigøres i større mængder ved en allergisk reaktion. De eosinefile granulocytter har også en speciel rolle for bekæmpelse af parasitter (Geneser 2011). 10

17 Figur 7 Mikroskopi af eosinofile granulocyt, der er forstørret 400x, hvor der ligger erytrocytter omkring (wadsworth.org 2014) De basofile granulocytter Den mest sjældne celletype af de tre typer granulære leukocytter er den basofile granulocyt. Cellerne har en diameter på µm (figur 8). De basofile granulocytter har ikke en fagocyterende evne. Derfor findes der ikke enzymer i deres granula, men cellernes granula indeholder stofferne histamin og heparin. Stofferne frigives de steder, hvor der foregår en immunreaktion (Geneser 2011). Mere specifikt bevæger de basofile granulocytter sig via blodet hen til skadesstedet dette kan eksempelvis være noget så simpelt som en hudafskrabning eller et stød og bevæger sig ind i det beskadigede væv. Her bliver de stimuleret af immungloboliner klasse E, som bliver beskrevet senere, til at udskille histamin og heparin fra deres granula og ud i interstitialvæsken (Nath, Bartholomew 2012). Figur 8 Mikroskopi af basofil granulocyt, der er forstørret 400x, hvor der ligger erytrocytter omkring (wadsworth.org 2014). Så snart en basofil granulocyt stimuleres, øges koncentrationen af calcium inde i cellen, som medfører, at histamin frigives. Histamin er et kardilaterende stof, hvilket medfører, at blodtilførslen øges til de områder, hvor der foregår en immunreaktion. Kapillærvæggen bliver samtidig mere gennemtrængelig, så leukocytter og antistoffer bedre kan trænge ud i vævene og bekæmpe infektion 11

18 (Springborg 2005). Ligeledes vil inflammationen gøre, at plasmaet, som minder meget om interstitialvæsken, kan trænge ud fra blodkarret og ind i det skadede væv. Det er denne ophobning af plasma, som jo primært består af vand, som man kan opleve som en lokal hævelse ved betændelser (Nath, Bartholomew 2012). Heparin er et antikoagulerende stof. Det har ingen funktion, hvad angår bekæmpelse af infektioner, men heparin forhindrer en koagulation, når immunsystemet er under arbejde. Når kroppens egne celler dræbes, frigives der normalt stoffer, som aktiverer koagulationsprocessen. Dette undgås ved udskillelse af heparin (Springborg 2005). 3.3 Trombocytter Trombocytter, blodplader, har ikke en cellekerne og kan ikke dele sig, og de kan derfor ikke som sådan til trods for navnet betragtes som celler (Hall, Guyton 2011). Alligevel er trombocytterne en væsentlig bestanddel af blodet, da de spiller en vigtig rolle i forbindelse med blodkoagulationen. Trombocytterne har overordnet set tre væsentlige funktioner (Nath, Bartholomew 2012): Frigivelse af en række vigtige stoffer, blandt andet enzymer og faktorer, som er med til at igangsætte og aktivere flere trin i koagulationen. Dannelse af en midlertidig og smidig trombocytprop for at stoppe blødningen, når der sker en skade på et blodkar. Kontraktion ved hjælp af myosin og aktin, som trækker sårkanterne i blodkarret tættere på hinanden og dermed reducerer størrelsen på den dannede trombocytprop og på hullet i karvæggen. Figur 9 Mikroskopi af trombocytter, de små, der er forstørret 400x, hvor der ligger erytrocytter omkring (wadsworth.org 2014). Trombocytter er skivelignende i deres form, hvilket det danske navn, blodpladerne, også indikerer. De er cirka 3-4 µm i diameter (figur 9) (Geneser 2011), og er således væsentligt mindre end blodets 12

19 andre celler, som beskrevet ovenfor. Til gengæld findes trombocytterne i store mængder i blodet; således er der mellem og pr. µl i gennemsnit hvoraf cirka en tredjedel befinder sig i milten og andre organer og kun bliver ført ud i blodcirkulationen, hvis der opstår større blødninger (Nath, Bartholomew 2012). Trombocytter er som nævnt ikke deciderede celler, men nærmere fragmenter af celler dannet ud fra megakaryocytter i den røde knoglemarv; de består således af cytoplasma, som er omkranset af en membran (Nath, Bartholomew 2012). Trombocytterne har dog mange karakteristika, der minder om celler; eksempelvis har de mitokondrier og endoplasmatisk retikulum. Desuden indeholder deres cytoplasma vesikler, hvori der er lagret en række proteiner, som er væsentlige for blodkoagulationen. Ligeledes er trombocytternes membran tilpasset til trombocytternes funktion i koagulationen, idet der i membranoverfladen sidder glykoproteiner. Disse glykoproteiner sørger for at fremme trombocytternes klæbeevne, adhæsion, til beskadigede endothelceller og kollagenfibre, mens de samtidig forhindrer adhædsion til det ubeskadigede endothel (Hall, Guyton 2011). Ligeledes indeholder membranen store mængder af fosforlipider, som også indgår i flere trin i koagulationskaskaden, som beskrives nærmere senere (Nath, Bartholomew 2012). 3.4 Plasma Plasmaet består af % vand. Vandet bruges til at fragte organiske og uorganiske stoffer, der kan opløses i vand. I plasma er der proteiner, der udgør 6-8 % af plasmaet. Plasma indeholder ioner, lavmolekylære organiske stoffer, proteiner og lipider. Nogle af de ioner, der er i blodet, er Na +, Ca 2+, Mg 2+, HCO - 3, Cl -. De lavmolekylære stoffer, der er i blodet, omfatter glukose, aminosyrer, lipider, vitaminer og homoner. Desuden indeholder blodet også affaldsstoffer så som bilirubin, kratin og urinstof. Nogle af de proteiner, der er i plasma, er transportproteiner: albumin, transferrin, lipid-, hormon- og vitamintransportører. Ligeledes er der også en del af immunforsvaret som koagulationsfaktorer, komplementfaktorer og antistoffer. Hvis man centrifugerer blodet med alle koagulationsfaktorer, vil plasmaet dele sig i serum og koagulanter. Serum er plasma uden koagulationsfaktorer (Nath, Bartholomew 2012). Udover de celler, som findes i blodet, findes der også som nævnt ovenfor en del forskellige proteiner. De er involveret i flere forskellige processer lige fra hæmoglobins transport af ilt til deres indflydelse på koagulationsprocessen. Det enkelte proteins funktion er bestemt af dettes struktur og form. Et protein har typisk kun en enkelt funktion at varetage, men kan i enkelte tilfælde udføre 13

20 mere end en opgave. De proteiner, der findes i blodet, kan have en del funktioner (Nath, Bartholomew 2012): Bevægelse: Nogle proteiner kan hjælpe enkelte celler med bevægelse for eksempel til og fra blodbanen. Disse proteiner minder om dem, man ser i muskelceller, som også hjælper med bevægelser. Transport: Drejer det sig om O 2, mineraler eller lavmolekylære stoffer, findes der et protein, der kan binde og frigive det. Et godt eksempel er hæmoglobin, der binder O 2, og frigiver det til de celler, der har brug for det. I cellens indre bliver der ligeledes transporteret lavmolekylære stoffer rundt ved hjælp af protein. Buffer-funktion: De processer, der forløber i blodet, fungerer bedst ved en given ph, og der er derfor proteiner i blodet, der hjælper med at fastholde en mere eller mindre konstant ph på 7,4 samtidig med at forhindre drastiske ændringer heraf. Metabolisme: Grundet enzymers følsomhed over for deres omgivelser, findes der proteiner både til at stoppe og starte metabolismeprocesserne, så der holdes styr på hastigheden af metabolismen, samt hvor den forløber. Forsvar: Nogle proteiner er en del af immunforsvaret og er med til at beskytte os mod sygdom. Ligeledes er der proteiner, der er involveret i koagulationsprocesserne, og dermed beskytter os mod at forbløde. Proteiner andre steder i kroppen kan have flere funktioner, og de enkelte proteiner i blodet kan også have en mere specifik eller specialiseret funktion. Generelt kan det dog siges, at de proteiner, der findes i blodet, er vandopløselige (Nath, Bartholomew 2012). 14

21 4.0 Hæmostase Hæmostase er en fællesbetegnelse for de processer i kroppen, som standser indre eller ydre blødninger ved skade på et blodkar. Formålet med hæmostase er at forhindre blodtab, hvorfor hæmostasen starter øjeblikkeligt, når der går hul på et blodkar. Overordnet set indebærer hæmostasen 3 trin (Sand 2008): De beskadigede blodkar kontraherer. Trombocytter binder sig til skadesstedet og danner en prop, thrombe. Via en kaskadereaktion koagulerer blodet og danner en hårdfør fibrinprop. Disse trin er imidlertid svære at adskille fra hinanden, da mange af reaktionerne i virkeligheden foregår samtidig og på den ene eller anden måde overlapper (Nath, Bartholomew 2012). 4.1 Kontraktion af de beskadigede blodkar Når der sker en skade på et blodkar, kontraherer den glatte muskulatur i karvæggen. Dette bevirker, at blodkarrets diameter formindskes, hvilket nedsætter eller helt standser blodtabet. Denne lokale kontraktion kaldes for en vascular spasm (Nath, Bartholomew 2012). En vascular spasm er den øjeblikkelige reaktion på et beskadiget blodkar, og denne kan vare i op til cirka 30 minutter, og har til funktion at reducere blødningen, indtil de andre mekanismer i hæmostasen kan tage over. Dette trin af hæmostasen kaldes også for den vascular phase (Nath, Bartholomew 2012). En skade på et blodkar betyder også, at der sker en skade på endothelet, laget af epitelceller på indersiden af karvæggen, hvilket medfører en reaktion på skaden (Haugaard Nielsen 2007): Endothelcellerne kontraherer, så de underlæggende celler, membranen af blodkarret, kommer frem. Endothelcellerne frigiver kemiske faktorer og hormoner. Ligeledes frigives peptidhormoner kaldet endothelianer, som stimulerer de glatte musklers kontraktion, samt fremprovokerer vaskulære spasmer. Herudover påvirker endothelianer også det glatte muskelvæv, så reperationsprocessen fremskyndes. Endothelcellernes membran bliver klæbrig. Dette lader cellerne sætte sig omkring brudsstedet. Dette kan helt eller delvist stoppe en blødning, hvilket især er tilfældet i de små kapillærer. Klæbrigheden vil også spille ind, hvis blødningen ikke er stoppet, da det giver trombocytterne et sted at sætte sig fast. 15

22 4.2 Dannelse af en trombocytprop Den næste fase af hæmostasen er dannelsen af en thrombe. Ganske hurtigt, cirka 15 sekunder (Nath, Bartholomew 2012), efter skaden på blodkarret begynder trombocytterne at komme til skadesstedet og klistre sig sammen, aggregerer, samt til blodkarrets inderside, adhærerer (figur 10). Trombocytter klistrer normalt ikke sammen, men skaden på endotellaget og de blotlagte kollagene fibre gør, at trombocytterne bindes hertil (Sand 2008). Denne kontakt gør, at trombocytterne aktiveres og begynder at svulme op og ændre form til at være mere kuglelignende. Samtidig danner de nogle lange udløbere, som strækker sig ud til de omkringliggende trombocytter. På dette tidspunkt begynder der ligeledes en udskillelse af en række aktive stoffer fra vesiklerne. Dette omfatter blandt andet (Nath, Bartholomew 2012): Adenosindifosfat (ADP), som medvirker til, at trombocytterne bliver klæbrige. Dermed fremmer ADP aggregeringen af trombocytter. Tromboxan A 2, som dannes ud fra arachidonsyre fra cellemembranens fosforlipider (Sand 2008). Tromboxan A 2 virker ligesom ADP aggregerende. Koagulationsfaktorer, som er proteiner, der spiller en vigtig rolle i næste fase af hæmostasen nemlig koagulationen. Calcium-ioner, der er nødvendige for, at aggregeringen af trombocytter kan foregå og som også er essentiel for flere af trinene i koagulationsfasen. Figur 10 - Processen for heling af rift på blodkarvæggen. Først strømmer trombocytterne til det skadede område og danner en fleksibel, midlertidigt prop. Efterfølgende dannes via koagulationskaskaden en fibrinprop (Haugaard Nielsen 2007). 16

23 ADP, tromboxan og calciumionerne fremmer aggregeringen og virker dermed på de omkringliggende trombocytter, som derved også aktiveres (Sand 2008); altså er der tale om en positiv feedback-mekanisme. Der aktiveres således hele tiden flere og flere trombocytter, som så tiltrækker endnu flere trombocytter, som klistrer sammen, og i sidste ende danner en thrombe en trombocytprop, som bindes til skadesstedet (Nath, Bartholomew 2012). Den dannede trombocytprop er som regel ret løs og skrøbelig, men den standser oftest blødningen indtil næste trin af hæmostasen; dannelsen af en mere solid fibrinprop (Hall, Guyton 2011). Trombocytproppen kan standse mindre blødninger, faktisk standser trombocytpropper normaltvis flere hundrede af mindre småskader på endotelcellerne hver dag (Sand 2008). Større skader betyder dog, at sårkanterne er for langt fra hinanden til at danne en effektiv trombe. I alle tilfælde er det dog meget vigtigt, at trombocytproppen begrænses til skadesstedet, så de ikke blokerer de almindelige blodkar. Derfor er de forskellige trin i hæmostasen meget nøje reguleret. Denne regulering sker blandt andet ved hjælp af prostacyklin, som hæmmer aggregeringen af trombocytter og deres klæbeevne (Nath, Bartholomew 2012). 4.3 Dannelse af fibrinprop Det overordnede formål med koagulationen er at få dannet fibrintråde, som danner et tæt netværk, hvor blodcellerne, trombocytterne og plasmaet klumper sammen på indersiden, hvorved blødningen standses. Når et blodkar eksempelvis sprænger, sker koagulationen igennem 3 overordnede trin (Hall, Guyton 2011): Der igangsættes en række komplekse kemiske reaktioner, som i sidste ende danner et kompleks af aktiverede substanser, som betegnes prothrombin aktivatorer. Der sker herefter en katalyseret omdannelse af prothrombin til thrombin. Den dannede thrombin fungerer som et enzym, hvor reaktionen, der katalyseres, er omdannelsen af fibronogen (faktor I) til fibrin. Hvert molekyle firbronogenmolekyle får fraspaltet fire lette peptider, hvorved der dannes et molekyle fibrinmonomer. Monomeren kan polymerisere med andre fibrin monomerer og på denne måde dannes lange fibrintråde inden for sekunder. Når en fibrinstabiliserende faktor er til stede, vil der dannes kovalente bindinger mellem de lange firbrintråde på kryds og tværs af de forskellige molekyler, hvilket danner et stærkt tredimensionelt netværk af fibrinmonomerer og fibrinfibre. 17

24 I dette tætte netværk er der indfanget blodceller, trombocytter og plasma, hvorved der er dannet en prop, som standser blodtabet. Få minutter efter proppen er dannet, begynder den at trække sig sammen og presser væske ud fra proppen i form af serum (Hall, Guyton 2011). 4.4 Igangsættelsen af koagulationen Blodkoagulationen igangsættes af et signalmolekyle, hvorefter en kaskadereaktion startes og forløber i forskellige trin, hvorunder koagulationsfaktorer aktiveres (figur 11). Koagultaionsfaktorenes aktiverede form kan så katalysere aktiveringen af den næsten koagulationsfaktor og så videre. Det er netop denne kaskadeaktivering, som sikrer en hurtig respons på et traume, da signalet, der igangsætter reaktionen, bliver forstærket for hvert trin (Tymoczko, Stryer 2012). Der findes to såkaldte aktiveringssystemer; det indre og det ydre. Begge systemer er involveret i reguleringen af koagulationen og deler mange af de samme afsluttende trin final common pathway forskellen ligger i, at de har forskellige triggere, som starter kaskadereaktionerne. Det ydre aktiveringssystem igangsættes ved traume på karvæggene eller de omkringliggende væv, mens det indre aktiveringssystem aktiveres ved traumer på selve blodet eller hvis blodet kommer i kontakt med kollagen (Hall, Guyton 2011). Blodkoagulationen er således afhængig af, at alle koagulationsfaktorerne er til stede, da deres aktiverede form skal aktivere den næste faktor. Mangel på en eller flere koagulationsfaktorer fører til blødersygdomme heriblandt hæmofili A. 18

25 Figur 11 - Koagulationskaskadens forskellige trin, hvor TF står for tissue factor, der er en bindevævscelle, og WF er von Willebrands faktor (Haugaard Nielsen 2007). 19

26 5.0 Hæmofili A Hæmofili A er en meget sjælden sygdom, som primært ses ved drengefødsler, idet sygdommen binder sig til X-kromosomet og nedarves recessivt. Dette betyder, at begge forældre skal have genet, før en pige kan få sygdommen. Sygdommen opstår dog i 30 % af tilfældene spontant ved en mutation i resten af tilfældene er den arvelig (Sundhedsguiden.dk 2014). Hæmofili A kommer til udtryk i form af en øget tendens til flere og større blå mærker, forlænget og voldsommere blødninger og i nogle tilfælde ligeledes spontane blødninger. Sidstnævnte sker oftest i regioner, der bliver udsat for stress på en daglig basis eksempelvis leddene. Blødninger her kan føre til deformiteter og diverse handikap (Sundhedsguiden.dk 2014). Den hyppigste type af hæmofili er netop type A, som cirka 300 personer i Danmark er ramt af (Sundhedsguiden.dk 2014). Hæmofili A skyldes en anormalitet eller mangel på koagulationsfaktoren VIII. Området for normale niveauer af koagulationsfaktor VIII ligger på 50 % %. Under et niveau på 50 % falder koagulationens aktivitet stødt. Fra 25 % - 49 % falder niveauet på faktoren, dog kan koagulationen stadigvæk foregå, den forløber bare langsommere end normalt. Når niveauet af koagulationsfaktor ligger mellem 1 % - 24 %, bliver det klassificeret som hæmofili. Hæmofili A kan inddeles i tre grader: mild, moderat og svær hæmofili A (figur 12) (Haugaard Nielsen 2007). Figur 12 - Procentvis inddeling af koagulationsfaktorniveau i kroppen, hvor man kan se de forskellige grader af hæmofili A, og hvornår der er tale om en blødersygdom (Haugaard Nielsen 2007). 20

27 Et tilstrækkeligt lavt niveau af koagulationsfaktorerne betyder altså, at koagulationen ikke kan forløbe. Ser man på de to aktiveringssystemer, er det i det indre aktiveringssystem, at koagulationsfaktor VIII indgår. Mere specifikt er det i det fjerde trin, hvor faktoren sammen med trombocytter, fosforlipid og faktor III fra de traumatiserede trombocytter indgår i aktiveringen af faktor X. Sagt på en anden måde, så virker faktor VIII som kofaktor for aktiveret faktor IX i reaktionen, der aktiverer faktor X. Derfor vil et underskud på faktor VIII betyde, at aktiveringen af faktor X ikke kan katalyseres, hvorfor kaskadereaktionen ikke forløber videre; der dannes således ikke fibrintråde og blodkoagulationen standser. Da personer med type A hæmofili, som er den mest almindelige form, mangler koagulationsfaktor VIII, kaldes denne også for antihæmofili faktor (Haugaard Nielsen 2007). 21

28 6.0 Behandling af hæmofili A Selvom hæmofili A er en potentielt dødelig sygdom, er den mulig at forebygge og behandle. Det kan derfor være interessant at se på forskellen på at få behandling og på ikke at få behandling. Før i tiden havde blødere mindre chance for overlevelse i forhold til i dag, hvilket viser, hvor meget behandlingen har udviklet sig. 6.1 Ingen behandling Hvis der hverken er blevet anvendt forebyggende præparater eller nogen former for behandling, kan der opstå hyppige ledblødninger og muskelblødninger. Ved ledblødninger opstår der en irritation af ledhulerummets slimhinde, der medfører, at slimhinden svulmer op og danner væske, hvilket kan nedsætte bløderens mobilitet samt være smertefuldt (Hvidtfeldt 2013). Opstår en ledblødning flere gange i samme område, vil ledbrusken blive nedbrudt, ledkapslen misdannet og der opstår knogleskørhed. Det betyder, at personer, der oplever flere ledblødninger, får stive led, som bliver svære at bøje eller bevæge resten af livet. Alt efter graden af hæmofili A medfører blødninger i led typisk smerter og funktionshæmning, der primært indebærer ødelæggelse af knæ, fod- og albueled, og enkelte tilfælde med svær invaliditet (Haugaard Nielsen 2007). De mere hæmmende følger, for eksempel invaliditet, opstår oftest hos personer med svær hæmofili A, som ikke har modtaget nogen form for behandling. Personer med moderat og mild hæmofili A oplever følger i langt mindre grad end ved svær hæmofili A, og der opstår sjældent forandringer i leddene hos personer med mild hæmofili A. Personer med forandringer i leddene kan få tilbudt operation på leddene med det formål at mindske smerter. Der kan også være tilfælde, hvor et kunstigt led bliver implanteret (Hvidtfeldt 2013). Muskelblødninger udløser smerter, der kan minde om en almindelig fibersprængning. Bliver en blødning i muskelvævet ikke behandlet, kan den vare i dagevis. Spontane muskelblødninger ses ved personer med svær hæmofili A, hvorimod muskelblødninger ved moderat og mild hæmofili A opstår efter operation eller en skade. I værste tilfælde kan muskelvævet ved en ubehandlet muskelblødning dø. Dødt muskelvæv er meget smertefuldt. Når muskelvævet dør, bliver det erstattet med enten bindevæv eller arvæv. Bindevæv er stærkt, men kan ikke kontrahere på samme måde som muskelfibre. Jo større en andel af muskelvævet, der dør, jo dårligere bliver bevægeligheden i det ramte område (Hvidtfeldt 2013). Alt efter hvilken sværhedsgrad af hæmofili A, der er tale om, er der stor risiko for at få varige mén. Fysisk bliver kroppen slidt op og der opstår stive led og muskler, som forhindrer naturlig bevægel- 22

29 se, og det kan sågar fører til invaliditet. Udover at der opstår en mindskning i bevægeligheden, er ubehandlede blødere også tvunget til at leve et liv med grumme smerter, der opstår hver gang en blødning ikke kan hele. Det giver ubehandlede blødere en hverdag, hvor sygdommen hæmofili A hele tiden skal være i fokus, da et enkelt uheld kan fører til døden. 6.2 Behandlingens historie Der er stor forskel på, om man bliver behandlet for hæmofili A, eller om bløderen er nødt til at leve med sygdommen, som den er. Da der ikke altid har været medicin til at behandle hæmofili A, er det relevant at undersøge, hvordan blødernes liv har været før, under og efter medicinens udvikling. I 1965 skete det første medicinske gennembrud indenfor behandling af hæmofili A. Kryopræcipitat blev som behandling en realitet, da en ny metode til udfældning af faktor VIII blev opdaget (Haugaard Nielsen 2007). Ved denne metode centrifugeres blodet, så plasmaet og de røde blodlegemer adskilles, hvorefter plasmaet nedfryses til -20 C. Herefter genoptøs plasmaet langsomt til 4 C, hvorved der sker en udfældning af faktor VIII samt fibrinogen. Plasmaet centrifugeres endnu en gang, og produktet, kryopræcipitat, kan fryses og opbevares til behandling af hæmofili A (Haugaard Nielsen 2007). Denne metode er stadigvæk den mest anvendte i udviklingslande, da den er billigere og ikke er teknologisk krævende (Haugaard Nielsen 2007). Kryopræcipitat blev hurtigt udbredt og taget i brug af blodbanker, da den ikke krævede noget særligt udstyr. Metoden var et stort skridt fremad i behandling af hæmofili A, men metoden medførte også en stor smittefare for blodbårne vira (Haugaard Nielsen 2007) heriblandt HIV og hepatitis C fordi det indsamlede blodplasma kunne være inficeret og dermed overføre sygdomme til patienterne med hæmofili A. 91 danske blødere er blevet smittet med HIV igennem denne behandlings form, og 177 er blevet smittet af hepatitis C i perioden fra 1965 til midten af 1980 erne (Bloderforeningen.dk 2014). En af grundene til, at smittefaren for hæmofilipatienter har været så stor, er, at der skal benyttes enormt store mængder blodplasma for at opnå tilstrækkelige mængder til én portion faktorkoncentrat. I Danmark har mængden af plasma, der industrielt skal benyttes for at fremstille én portion faktor, været på 2500 portioner plasma á cirka ¼ liter, (Hvidtfeldt 2013). Dette betyder, at det donerede blod kommer fra lige så mange forskellige donorer. I år 1986 indførte man i Danmark screening og varmebehandling for at undgå at overføre sygdomme, for når man varmer vira op til 80 C gennem 72 timer inaktiveres vira. Der er imidlertid stadigvæk risiko for at blive smittet med Creutzfeldt Jakobs sygdom. Ingen danske blødere har dog fået konstateret sygdommen (Haugaard Nielsen 2007). 23

30 I 1992 var den første rekombinante faktor VIII færdigudviklet. Ved fremstilling af rekombinant medicin anvendes babyhamsternyreceller ved hjælp af gensplejsning. Formålet med gensplejsningen er at kunne producere en stor mængde faktormedicin. Genet, der indeholder den bestemte faktor, man ønsker formeret, kobles sammen med DNA i en hamsters nyreceller metoden kaldes rekombinant DNA-teknik. Genet for den ønskede faktor bliver i hamstercellen transkripteret fra DNA til mrna, som videre bliver translateret til det kodende protein (Haugaard Nielsen 2007). Så babyhamsteren producerer altså det humane protein. Inden cellerne lagres, tester man, om de har den korrekte funktion af det humane gen og ikke indeholder vira, bakterier eller svampesporer. Cellerne opbevares i en masterbank. Cellerne lagers i afdampet gas fra flydende nitrogen, hvor temperaturen er minus 196 C, dette sikrer cellens stabilitet (Haugaard Nielsen 2007). Cellerne tages ud af masterbanken for at masseproducere cellerne. De dyrkes på overfladen af mikropartikler og opbevares i et vækstmedie, der bruges, da det er celledyrkning uden for den levende organisme. Under omrøring udskilles faktoren til vækstmediet. Ved oprensning frasorteres cellerne og vækstmediet med proteinet beholdes. Oprensningen af proteinet forløber over to trin (figur 13) (Haugaard Nielsen 2007): Anionisk ionbytningskromatografi, hvor man ved hjælp af en positivt ladet kolonne adskiller proteiner efter ladning. Først fraskilles de positivt ladede proteiner. Så tilsættes en saltkoncentration, som alt efter mængden af saltvand frasorterer proteiner med samme negative ladning. Til sidst tilføjer man til den separerede faktor et opløsningsmiddel, som kan dræbe vira. Immunoaffinitetskromatografi, hvor der bruges en kolonne med antistoffer på siden, der binder den specifikke faktor. For at udskille faktoren sænkes ph, hvilket medfører, at dele af antistofferne og proteinet får ændringer i ladning og binder dårligere. Under processen er en del af faktoren blevet aktiveret af proteaser, som kan være sket i hamstercellen eller i vækstmediet. For at få det højeste udbytte af faktormedicin skal så vidt muligt alle faktorer aktiveres ved brug af anionisk ionbytningskromatografi. Aktiveringen sker ved hjælp af en lille mængde af aktiv faktor, da en samlet stor koncentration af proteinet i kolonnen vil føre til autoaktivering (Haugaard Nielsen 2007). 24

31 Figur 13 - Anionisk ionbytningskromatografi: En kolonne, der er positivt ladet, hvor kun de negative ladet proteiner bliver i kolonnen, hvorefter den negative koncentration øges, så de forskellige proteiner udskilles, indtil kun den ønskede faktor er tilbage (Haugaard Nielsen 2007). Ved Novo Nordisk A/S anvendes en bestemt type rekombinant medicin fremstillet på faktor VIIa. VIIa er den faktor, som benyttes hos personer, der er under behandling med faktormedicin og danner antistoffer imod faktor VIII. Da personer kan risikere at udvikle inhibitorer, er det nødvendigt med et alternativ (Haugaard Nielsen 2007). Rekombinant faktor VIIa bundet til trombocytters overflade aktiverer faktor X til faktor Xa, og er med til at starte produktionen af trombin og dermed fibrin. Rekombinant faktor VIIa er, som erstatning til faktor VIII eller IX, nødt til at blive anvendt i meget højere doser end kroppens normale niveau, da faktor X ellers ikke vil blive aktiveret særligt effektivt. Det smarte ved faktor VIIa er, at faktoren ikke binder sig til inaktive trombocytter, der vil altså ikke opstå koagulation i hele kroppen (Haugaard Nielsen 2007). 25

32 7.0 Livet som bløder Behandlingsmulighederne har udviklet sig stærkt. Det er derfor interessant at undersøge, hvorledes sygdommen påvirker den enkelte bløder; for hvad betyder det i praksis at leve med en blødersygdom? I det følgende undersøges det, hvilken betydning udviklingen har haft for blødernes mulighed for at leve det gode liv. Når der tales om det gode liv, er der ofte tale om noget psykologisk. Forskere prøver at måle lykke, så bedre liv kan skabes for flest mulige mennesker (Videnskab.dk 2014). Man ser her blandt andet på den psykiske funktionsevne, som beskriver, hvordan mennesker fungerer mentalt, men også kroppens fysiske tilstand og funktionsevne. Det gode liv omfatter således både psykologiske og fysiologiske aspekter (Greve 2014). Da hæmofili A er en sygdom, giver det god mening at tale om det gode liv i forhold til kroppens fysiske tilstand. Ligeledes vil man kunne se på konsekvenserne af et muligt færdighedstab som følge af sygdommen, da sygdommen over tid kan medføre diverse handikap afhængigt af hvor alvorlig sygdommen er. Der er stor sandsynlighed for, at en sygdom som hæmofili kan påvirke de berørte psykisk. Men det er vigtig at fastslå, at sygdom ikke nødvendigvis er det modsatte af sundhed. Selv om man er syg, kan man godt trives, ligesom raske mennesker godt kan have det mentalt dårligt (Greve 2014). Når man forholder sig til det gode liv med henblik på hæmofili A, er der en ting, der umiddelbart virker som et større problem end andet: muligheden for selvrealisering (Seligman 1998). Hvis det gode liv indbefatter muligheden for at opnå sine drømme, vil hæmofili A kunne sætte begrænsninger i forhold til dette. Man vil formentlig aldrig kunne blive professionel fodboldspiller og vil formentlig få anbefalet stillesiddende arbejde. Hvis man ønsker sig andet end dette, kan sygdommen stå i vejen for en drøm og derved direkte i vejen for opnåelsen af det gode liv. Ligeledes er der mulighed for, at lysten til at få børn, hvis man har hæmofili A, kan være nedsat, da risikoen, for at ens barn og ens børnebørn får hæmofili, er større. Drømmer man om børn, kan man derfor stå i et moralsk dilemma, som igen kan have indflydelse på det gode liv (Seligman 1998). 7.1 Casestudie Det er således muligt, at hæmofili A kan have indflydelse på, om man kan opnå det gode liv. 26

33 For bedre at kunne forstå, hvad de forskellige behandlingsmetoder har betydet for personer med hæmofili igennem tiden, tages der her udgangspunkt i seks cases med en række personer, der beretter om deres liv med hæmofili. Undersøgelsen er foretaget af Danmarks Bløderforening (Bloderforeningen.dk 2014). De forskellige cases er udvalgt for at belyse eventuelle forskelle og/eller ligheder imellem blødere, der er født, henholdsvis før og efter faktormedicinen blev tilgængelig. Derfor er der medtaget personer i forskellige aldersgrupper, som på den ene eller anden måde nævner, hvorledes de har oplevet behandlingsmulighederne, og hvorledes deres sygdom har påvirket deres liv. Aage Aages case er interessant, da Aage blev født, før der kom behandlingsmedicin og han nåede at leve et langt liv med sin blødersygdom. Han blev 95 år, inden han døde i 2009, hvor han var den ældste bløder i Danmark og muligvis på verdensplan. Aage nåede at få to børn og fire børnebørn på trods af det moralske dilemma (Bloderforeningen.dk 2014). Han ville egentlig gerne have været landmand, men han måtte finde en anden karriere, da hans hæmofili gjorde, at han ikke ville kunne holde til det. Aage havde til sidst i livet ofte blødninger, der skyldes svage blodkar, dette kan dog være fordi, at Aage var en ældre herre (Bloderforeningen.dk 2014). Paul Paul er 63 år og er dermed født før faktormedicinen blev tilgængelig. Han har hæmofili B i svær grad og kommer fra en familie med mange blødere. I hans generation er der udover ham og hans bror fire andre blødere i deres familie. Paul har ikke som barn tænkt meget over sygdommen, da det først var i tyverne, han begyndte at få blødninger i sine knæ. Han har dog været indlagt i syv uger, da han skulle have trukket visdomstænder ud. Gennem Pauls liv har medicinen udviklet sig meget, så i år 2000, da han skulle have lavet noget ved tænderne, kunne han undgå indlæggelse. Han kan også tage ud at rejse, hvis han tager faktormedicin op til. Han tager kun faktormedicin, hvis han har mistanke om en blødning. I 2006 fik Paul et nyt knæ, efter hans knæ, grundet mange blødninger, fastlåste sig i 14 dage (Bloderforeningen.dk 2014). Palle Palles liv er i høj grad blevet påvirket af behandlingsmulighederne af hæmofili, da han er blevet smittet med HIV gennem faktormedicinen, inden varmebehandlingen blev indført. Dette var, som tidligere nævnt, tilfældet for en stor del af bløderne, inden de grundige screeningsprocesser blev indført. Når Palle tager sin medicin mod HIV, føler han sig syg, hvorimod han føler sig rask, når 27

34 han ikke tager medicinen. Han vil hellere leve et kort, men stærkt liv, end et langt sygdomsfuldt liv, så det kan være svært at finde motivationen til at tage pillerne. HIV-medicinen er dog heldigvis blevet bedre, og Palle har det så godt, at han til tider helt glemmer, at han er syg. Palle beretter, at han ikke bange for døden, da han på en rejse til Australien fik en hjerneblødning og var tæt på at dø. Her fandt han ud af, at døden ikke er farlig. Han er til gengæld bange for at dø langsomt. Han beskriver sig selv som stor, stærk og selvstændig (Bloderforeningen.dk 2014). Theis Theis har hæmofili i svær grad, og han i talesætter, hvordan sygdommen og behandlingsmulighedernes udvikling har påvirket netop hans liv. Han har stort set oplevet hele udviklingen, der er sket inden for behandling af hæmofili, da han er født i starten af 1950 erne, hvor faktormedicinen ikke var opfundet. Da han var barn, fik han og hans forældre at vide, at han ikke skulle regne med at leve længe, da gennemsnitsalderen for blødere var 6-7 år på daværende tidspunkt. Theis beretter, hvordan han som lille kunne mærke, når der var en blødning på vej, og da der ikke var nogen mulighed for behandling, pakkede han en bunke bøger og legetøj sammen, så han var klar til at være sengeliggende det næste stykke tid. Dog erindrer han, at der ikke var meget, som man havde lyst til, da blødningerne forårsagede stærke smerter. I princippet var det muligt at få blodtransfusion som behandling, men denne metode var forbeholdt livstruende blødninger (Bloderforeningen.dk 2014). Muligheden for behandling med kryopræcipitat efter 1965, og især den efterfølgende udvikling indenfor behandlingsområdet, har for Theis medført en enorm glæde og frihed, som han ikke havde tidligere. Theis har nu muligheden for at kunne rejse, og han har været på adskillige rejser til lande langt væk en stor modsætning til, at han ikke engang kunne tage til Bornholm med skolen, uden han fik en blødning som barn (Bloderforeningen.dk 2014). Selv den dag i dag tænker Theis dog meget over at passe på sig selv, og han beskytter sig så vidt muligt mod blødninger, hvilket betyder, at han konstant kigger ned, hvor han går, for at undgå at falde. I dag tager han medicinen præventivt intravenøst, hvilket han bruger cirka 10 minutter om dagen på. Dette ser Theis dog ikke som særligt lang tid, og den præventive behandling har gjort, at Theis ikke har oplevet nogen alvorlige blødninger de sidste år kun mindre blødninger. Grundet fremskridt indenfor behandlingsmetoder tør Theis godt tænke over sin fremtid; han tør at lægge planer længere ude i fremtiden. Til gengæld frygter Theis, at han en dag bliver hjælpeløs og ikke kan udtrykke sin sygdom over for andre, såsom personalet på plejehjemmet. Frygten kom- 28

35 mer delvist fra dengang, han var barn, hvor kendskabet til hæmofili var begrænset, og man ikke kunne behandle Theis og give ham den hjælp, han havde brug for (Bloderforeningen.dk 2014). Jacob Jacob på 34 år, med hæmofili A i svær grad, hører til den yngre generation af blødere i modsætning til Aage, Palle og Theis. Jacob har levet et aktivt liv, hvilket har været muligt på grund af faktormedicinen, som har været tilgængelig igennem hele Jacobs liv. Som helt ung dyrkede Jacob badminton og tennis på konkurrenceniveau. Som barn var han dog ofte indlagt med blødninger, og han husker, at det kunne være svært at føle sig anderledes end alle de andre børn. Sidst i tyverne måtte Jacob dog indse, at han måtte droppe at dyrke sin sport på konkurrenceniveau grundet blødninger i anklerne. Så nu svømmer og cykler han i stedet, da dette ikke udsætter hans ankler for blødninger på samme måde. Jacob kan faktisk mærke, at træningen hjælper på hans led. Jacob og kæresten overvejer at få et barn. Dette har naturligvis startet nogle overvejelser og tanker omkring muligheden for, at barnet arver sygdommen, og om hvorvidt Jacob vil byde sit barn at gå det samme igennem. Jacob mener, at han har haft et godt liv, men at der er nogle forholdsregler, der skal tages (Bloderforeningen.dk 2014). Jesper Jesper på 30 år er ligeledes født efter faktormedicinen blev tilgængelig. Jesper har hæmofili i svær grad, men dyrker sport i form af cykling og har flere gange cyklet på bjergene i Frankrig. Jesper har holdningen, at hæmofili ikke sætter ham begrænsninger, men at det giver ham udfordringer. Jesper har svage ankler og ved derfor godt, at fodbold ikke er sporten for ham, da det er en kontaktsport og derfor er risikoen for blødninger for stor. Da Jesper træner meget, har han lært at kende forskel på at have ondt i anklerne, fordi der er en blødning, og på at have ømme ankler på grund af træningen. Jesper oplever også, at han, hvis han stopper sit aktive liv, kan få problemer med sine led (Bloderforeningen.dk 2014). 7.2 Behandlingens betydning Fælles for alle cases er, at personerne beretter om den frihed, faktormedicinen har givet dem; frihed til at rejse, til at leve aktivt og til at vælge den karriere, de har lyst til. Selv om de fleste ikke føler sig hæmmet af sygdommen, er det dog klart, at chancen for selvrealisering bliver berørt af sygdommen. Jacob måtte droppe at dyrke badminton og tennis på konkurrenceniveau, og Aage måtte fravælge et liv som landmand. 29

36 Sygdommen har før behandlingen blev tilgængelig begrænset en bløderes liv voldsomt. Kvaliteten af det gode liv er forbedret siden den første opdagelse af faktormedicin. Theis, Paul, Palle og Aage er alle tre født før behandlingen og har derfor oplevet sygdommen både med og uden behandling. De ældre blødere, som Theis og Aage, har således oplevet, at der ingen behandling var, og de måtte derfor tage visse forholdsregler i hverdagen. Ligeledes har de oplevet at være indlagt i længere perioder på baggrund af ellers mindre indgreb. Samtidig har Theis og Paul begge som følge af hyppige blødninger i knæ fået indopereret nye proteser. Theis har dog ikke været udsat for alvorlige blødninger i de sidste år (2012), og Paul kan i dag gå til tandlægen som alle andre uden at skulle frygte indlæggelse. På den måde er der sket en forbedring for blødere som Theis og Paul, efter at faktormedicinen er blevet udviklet. Selvom den første behandlingsmetode var revolutionerende, havde den ubehagelige følger, da kryoen klumpede, når den skulle injiceres, og det kunne således blive en langtrukken affære. Derudover risikerede man i værste fald at få følgesygdommene HIV, hepatitis C eller hepatitis B. Palle er en af de uheldige, der fik HIV som et resultat af hans behandling. Det er noget, der i stor grad påvirker det gode liv for ham, da han på HIV- medicin føler sig syg. Som den nyere behandlingsmetode, der var mindre tidskrævende, kom faktormedicinen. Denne medicin kan bløderen selv administrere i hverdagen, uden der er behov for hjælp fra læger eller lignende. Theis og Paul fortæller om, hvordan de i dag kan rejse netop på grund af faktormedicinen, hvilket ikke var muligt for dem førhen. De kan således tage deres medicin forebyggende, og det er muligt for dem at medbringe faktormedicinen på deres udlandsrejser uden at skulle bekymre sig om blødninger eller behandlingsmulighederne i det pågældende land. Fælles for de ældre blødere i de valgte cases er altså, at de på den ene eller anden måde har oplevet deres blødersygdom som en begrænsning hos de fleste ældre blødere, er tilfældet mest tydelig tilbage i tiden, hvor de moderne behandlingsmetoder ikke var tilgængelige. Ser man derimod på de yngre blødere, som er født efter faktormedicinener de ikke nær så begrænset. Jacob og Jesper begge dyrket sport på højt plan. De deler også opfattelsen om, at deres blødersygdom ikke er en begrænsning for dem, men at den giver dem udfordringer. De har begge valgt et aktivt liv og har lært at kende forskel på blødninger og ømme muskler. Denne forskel mellem de ældre og yngre blødere viser, at udviklingen af faktormedicinen har betydet meget for den enkelte bløders hverdag og livsopfattelse. Betragter man udelukkende Theis case, fortæller han, hvordan han er gået fra at få at vide som barn, at han ikke ville leve særligt læn- 30

37 ge, til at han i dag tør lægge planer flere måneder, endda år, frem i tiden. Og fra at skulle ligge ugevis i sengen ved blødninger, kan han nu i stedet tage sin medicin præventivt, hvilket kun tager ham 10 minutter om dagen. Det, som der grundlæggende bliver lagt vægt på, hos bløderne i de valgte cases, er, at faktormedicinen har givet dem frihed og mulighed for en masse ting, de ikke kunne førhen. Samtidig fylder deres sygdom ikke ligeså meget tidsmæssigt som førhen, og de behøver ikke at frygte voldsomme blødninger på samme måde. Dette betyder, at de tør lægge planer for fremtiden. Jacob står i et dilemma med hensyn til, hvorvidt han og hans kæreste skal have børn. I modsætning til dette har Aage fået to børn. Når mennesker får børn, påtager man sig ansvaret for et andet liv end ens eget. Først og fremmest må en bløder spørge sig selv, om sygdommen kan føre til en tidlig død, og om man derfor ikke kan være til stede som forældre. Dette var heldigvis ikke tilfældet for Aage. Ligeledes må blødere, og kvinder med hæmofili i familien, spørge sig selv, om de er villige til at løbe den risiko, der er, for at sygdommen kan videregives til bløderens børn og børnebørn. Der er en stigende kamp om offentlige ressourcer, og bløderen kan derfor spørge sig selv, om man ønsker at videreføre sygdommen til et barn, i en verden, hvor behandling ikke med sikkerhed altid vil være en garanti eller mulighed. Grundet medicinske fremskridt er der i dag mulighed for at få undersøgt, om et barn skulle have hæmofili, længe inden det bliver født. Dette giver mulighed for at få en abort, hvis barnet er sygt. I sidste ende kan en bløder eller bærer af genet helt fravælge at få børn, ikke fordi de ikke vil have børn, men fordi de ikke vil have børn med hæmofili og er imod abort (Bloderforeningen.dk 2014). Selvom hæmofili er en alvorlig sygdom, kan man ved behandling øge livskvaliteten. Bløderne undgår indlæggelse, kraftig blødninger og varige mén, som giver dem en øget frihedfølelse til at rejse og opleve verden, og til at dyrke nogle typer sport. Frygten for døden ligger konstant i de ældres underbevidsthed, og derfor er der markant forskel på opfattelsen af at være syg alt efter om bløderen er født før eller efter behandling. Blødere, der bliver født i dag, bliver derfor hverken fysisk eller psykisk ramt i samme grad. 31

38 8.0 Eksperimentel del Ved hjælp af et mikroskop kan blodcellernes udseende og størrelser beskrives. Blodet centrifugeres, hvorved blodet separeres i 3 fraktioner. Det er herefter muligt at undersøge de enkelte bestanddele under mikroskopet. Dette gøres med henblik på at identificere de forskellige celler i blodet. De 3 fraktioner, hvoraf plasmaet efterfølgende koaguleres for at få to yderligere fraktioner med koagulat og serum, undersøges alle via SDS-PAGE. Her benyttes SDS-PAGE på de 5 fraktioner til at separere de forskellige proteiner efter størrelse med henblik på at få en idé om, hvilke proteiner der potentielt er til stede i blodet. 8.1 Teori Stain af celler For at undersøge blodets bestanddele i mikroskopet, laves der en blodudstrygning, hvor cellerne spredes ud over objektglasset og på den måde kun kommer til at ligge i ét lag yderst på tungen. Der findes forskellige metoder til farvning af cellerne. En meget anvendt metode er Giemsa stain. Denne gør, at erytrocytterne fremstår purpur, kernen på leukocytter bliver blå-lilla, og trombocytternes cytoplasma bliver mørkelilla, og deres granulater bliver rød-lilla. Giemsa er anvendeligt ved blodudstrygninger, fordi det indeholder et surt farvestof kaldet eosin samt nogle basiske farvestoffer methylenblåt og dens oxidative produkter azur A og B. Disse tre danner et kompleks, som gør, at cellerne farves i forskellige farver. Dette kaldes Romanowsky-effekten (Dunning, Safo 2011) Histologi af blodceller Erytrocytter Erytrocytter er i frisk tilstand karakteristiske med deres bikonkave skiver og orangegule farve. Ved en blodudstrygning er erytrocytter makroskopisk lyserøde, da eosinen bindes til cellerne. 99 % af en blodudstrygning udgøres af erytrocytter. Cellerne kan genkendes på en nogenlunde rund form med en diameter på cirka 7,5 µm (figur 2). Den tynde centrale del af cellerne farves betydeligt svagere end den ydre, tykkere ring (Geneser 2011). 32

39 Leukocytter I frisk tilstand ses granulære leukocytters cytoplasmatiske granula som lysbrydende partikler i cellerne (Geneser 2011). Fordelingen af leukocytter i blodet er cirka (Hall, Guyton 2011): 62,0 % neutrofile granulocytter 2,3 % eosinofile granulocytter 0,4 % basofile granulocytter 5,3 % monocytter 30,0 % lymfocytter Neutrofile granulocytter Diameteren lægger på µm (figur 6). Cytoplasmaet i neutrofile granulocytter indeholder talrige granula, hvor de specfikke granula farves svagt og ses som støvlignende partikler, og de azurofile granula ses som et lille antal større granula varierende i farven fra røde til purpurfarvet (Geneser 2011). Eosinofile granulocytter Eusinofile granulocytter har en diameter på 12-15µm (figur 7). Kernen er opdelt med 2 store lapper, som er forbundet af en tynd kromatinstreng eventuelt en indskudt en kromatinklump. Kromatinkornene er grove og farves kraftigt. Cytoplasmaet er fyldt med store, kraftigt eosinofile granula. De dækker sjældent kernen (Geneser 2011). Basofile granulocytter Basofile granulocytter er ved en blodudstrygning kendetegnet ved en diameter på µm og en 2- eller 3- lappet, eventuelt S-formet, kerne (figur 8). Kromatinet er mindre grovkornet og lysere farvet end i de andre granulocyt-typer. De tætpakkede, grove cytoplasmatiske granula er stærkt metakromatiske og farves rødviolet. Metakromasi opstår, når visse bestanddele af væv farves af visse basisk farvestoffer. Farvestoffet kan antage forskellig farve afhængigt af molekylernes aggreagationstilstand. De skjuler ofte kernen. Grundet vandopløselighed er cellerne svære at præservere (Geneser 2011). Monocytter Monocytter har en diameter på µm ved en blodudstrygning (figur 4). Cellerne har en nyreeller hesteskoformet kerne, og kromatinet er karakteristisk finkornet. Det rigelige cytoplasma har en 33

40 gråblå farve, er ofte vakuoleret og indeholder spredte azurofile granula. Cytoplasmaet har ofte i udstrygningspræparater en karakteristisk fold i randen (Geneser 2011). Lymfocytter Lymfocytter har en diameter på cirka 7 µm, hvor kernen er afrundet, og kromatinet er grovkornet (figur 5). Kernen udfylder næsten hele cellen og er kun omgivet af en tynd bræmme af klart blåt cytoplasma enkelte azurofile granula kan ses her. Der forekommer store granulære lymfocytter med en diameter på µm (Geneser 2011). Trombocytter Ved blodudstrygning har trombocytter en diameter på cirka 3-4 µm (figur 9). De er skiveformede og klumper ofte sammen undertiden i større masser. Trombocytter har en central zone, der indeholder granula (granuloméret), som farves purpur til blå. Den centrale zone omgives af en lysere zone (hyaloméret), der ikke indeholder granula. Granula i trombocytter er af flere forskellige typer (Geneser 2011) Mikroskopi Et mikroskop bruges til at forstørre det, der ikke kan ses med det blotte øje. Mikroskopet er et lysmikroskop, som lyser gennem det objekt, man studerer. Lyset har en kegleformet bund og samler lysbølgerne gennem objektet. For lyset er det vigtigt, at lysbølgerne udsendes ved samme svingninger. Dette kan lades sig gøre ved at bruge en halogenlampe, der anvender en lille højtemperaturlyskilde. Det er vigtigt, at objektet, der studeres, er i et tyndt gennemsigtigt lag. Så at når lyset kommer gennem objektet, vises strukturen på objektet og dens matrialeegenskaber. Lyset opsamles i en samlelinse og frembringer et forstørret billede af objektet, som kan ses på kameraet eller i okularet, linsesystem (Tranum-Jensen 2014) Separation af blod Histopaque-1077 anvendes til at skille blodet. Histopaque-1077 består af polysukrose og natriumdiatrizoat, er steril-filtreret og testet for endotoksiner, og har en densitet på 1,077 g / ml. Disse parametre er vigtige for at skille blodet. Endvidere giver natriumdiatrizoat et højt osmotisktryk, hvilket gør, at leukocytterne skilles fra blodet (Sigma-Aldrich 2012). Erytrocytter falder til bunden, da de har en højere densitet, det samme gør granulocytterne. Hernæst vil Histopaque ligge i et lag. Lymfocytter og monocytter samles, idet de har en lavere densitet end erytrocytter og vil ligges sig i et lag ovenpå. Plasmaet ligger øverst (Haugaard Nielsen 2007). 34

41 8.1.5 Koagulation af plasma Når man tapper blod, er der i glasset citrat, EDTA, heparin eller oxalat, da disse binder Ca 2+. Dette er nødvendigt, for at blodet ikke skal koagulere i glasset. For at få blodet til at koagulere skal Ca 2+ - ioner være til stede, da disse spiler en væsentlig rolle i koagulationskaskaden. Ca 2+ indgår, som tidligere nævnt, i flere trin i kaskadesystemet, og når denne inhiberes, forhindres blodet i at koagulere. For at få plasmaet til at koagulere tilsættes CaCl 2 (Haugaard Nielsen 2007) Proteiner i blodet Der findes mange forskellige proteiner i vores blod. Med henblik på de følgende forsøg, er et kendskab til bestemte proteiner relevant. Albumin: Albumin fungerer som transportprotein og transporterer fedtsyrer, galdesyre og ioner. Den udgør cirka 60 % af proteinerne i plasma og udgør ligeledes 60 % af proteinerne i kroppens ekstracellulære væsker. Koncentrationen af albumin er så stor, at den måles i gram per liter. For personer i aldersgruppen år indeholder blodet normalt gram albumin per liter. Man kan derfor forvente at se store koncentrationer af dette protein i SDS-PAGE. Albumin har en tendens til at klumpe sammen med andre albuminproteiner, hvilket gør, at proteinets størrelse kan forekomme varierende. Albumin har en molekylvægt 66,472 kda (Sundhed.dk 2009). Immunglobuliner: Immunglobuliner er med til at koagulere blodet. Der findes et stort antal op imod ti millioner forskellige immunglobiner (Grunnets 2009), og derfor bliver de inddelt i klasser, hvori der kan være forskel fra celle til celle. Immunglobiner IgM, IgG, IgA måles i gram per liter. Af de kendte grupper ses her molekylvægten samt koncentrationen i blodet (Agger 2011), (Sundhed.dk 2009): IgG: 150 kda, koncentration på 6,1-15,7 gram per liter. IgM: 900 kda, koncentration på 0,41-2,42 gram per liter. IgA: 160 kda, koncentration på 0,8-3,9 gram per liter. IgE: 19 kda, koncentration på 0,6 milligram per liter. Koagulationsfaktorer: Der findes 12 koagulationsfaktorer i blodet, hvor 5 af faktorerne har en molekylevægt over 160 kda, og forventes derfor ikke at kunne ses i gelen. De resterende faktorer forventes at kunne ses i fraktion 5 (Singh, Tiwari 2008): Faktor II: 72,5 kda, koncentration på 1,5 milligram per liter. Faktor III: 43,0 kda 35

42 Faktor VII: 45,5 kda, koncentration på 0,005 milligram per liter. Faktor IX: 57,0 kda, koncentration på 0,03 milligram per liter. Faktor X: 59,0 kda, koncentration på 0,15 milligram per liter. Faktor XII: 76,0 kda koncentration på 0,29 milligram per liter. Transthyretin: Transthyretin er et protein, der bidrager til hormon- og vitamintransport. Transthyretin blev før i tiden kaldt prealbumin, da det løb hurtigere i elektroforese end albumin. Proteinet har en molekylvægt på 54,9 kda, og den har en koncentration i blodet på milligram per liter (Sigma-Aldrich 2012). Hormoner: Der findes forskellige hormoner i blodet, de 4, der her nævnes, forventes at kunne ses i fraktion 2, 3 og 4, dog er koncentrationen af hormoner så lav, at det ikke er sikkert, at det er disse, der observeres (Nath, Bartholomew 2012): Insulin: 35,602 kda, koncentration på omkring 0,3864 milligram per liter Thyroideastimulerende hormon/ thyrotropin (TSH): kda Lutropin (LH): kda Prolaktin (PRL): 25,745 kda Follitropin (FSH): 29 kda Hæmoglobin: Mængden af hæmoglobin i blodet måles i millimol per liter. Da hæmoglobin findes i erytrocytterne, forventes hæmoglobin især observeret i fraktion 1 (Sundhed.dk 2009). Hæmoglobin har en molekylvægt på 65,069 kda (Wolframalpha.com 2014) og har en koncentration på 117,53-169,05 gram per liter. Dette inkluderer hæmoglobinen, der findes i erytrocytterne, i blodet er koncentration formentlig væsentligt lavere (Sundhed.dk 2009). Lysozym: Lysozym er et enzym, der katalyserer hydrolyse. Som et resultat kan det findes i en hel del forskellige celler i blodet. Lysozym er et relativt lille protein med en molekylvægt på 14,0 kda, og koncentration i blodet er omkring 5-15 milligram per liter (Sigma-Aldrich 2012). Kolesterol: Den totale koncentration af kolesterol i blodet bliver målt i millimol per liter. Kolesterol hører ind under en gruppe af lipoproteiner. Kolesterol er med til at stabilisere cellemembranen og er derfor til stede i alle kroppens celler (Sundhedsguiden.dk 2014). Kolesterol kan ikke nedbrydes i kroppen og må derfor udskilles fra kroppen, hvis koncentrationen skal reguleres. Der er derfor en mulighed for at se kolesterol i den ekstracellulære væske. Kolesterol har en molekylvægt på 38,665 kda. Derfor forventes det, at kolesterol er til stede i fraktion 3. Raske voksne mennesker har 36

43 en kolesterolkoncentration på under 5 millimol per liter i blodet eller under 193 milligram per liter (Sundhed.dk 2009) SDS-PAGE I forsøgene er der behov for at separere proteinerne efter størrelse. Dette kan gøres ved at køre proteinerne igennem et elektrisk felt. Denne proces kaldes elektroforese. Den specifikke metode, der benyttes, kaldes SDS-PAGE. Proteinerne vil blive elektroforeret i en polyakrylamid gel med hjælp fra SDS, sodium dodecyl sulfate, som har til opgave at denaturere proteinerne. Heraf kommer navnet SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate- polyakrylamidgelelektroforese (Caprette 2012). SDS binder sig til proteinerne, hvilket resulterer i, at proteinerne får en negativ ladning. Større proteiner kan binde mere SDS, men proteinerne bidrager selv med positive ioner, hvilket gør, at proteinerne cirka har den samme ladning i forhold til masse. Dette er vigtigt, da det resulterer i, at proteinerne vil kunne tiltrækkes af en positivt ladet kilde, anode, igennem elektroforese, og gør dette med en næsten identisk hastighed til trods for forskellen i deres størrelse. Selve bindingen med SDS, er dét, der forårsager denatureringen (Caprette 2012). SDS kommer i kontakt med proteinerne, som følge af, at den er blandet i en buffer. Bufferen er med til at sikre en optimal og konstant ph samt at der er ioner tilgængelige, så denatureringen kan forløbe optimalt. Ligeledes forhindrer bufferen proteinerne i at reagere med hinanden og nedsætter deres aktivitet. Bufferen skal også øge densiteten af protein-buffer-blandingen, så blandingen ikke flyder ud af brønden, hvilket vil ødelægge resultaterne (Caprette 2012). Når SDS kommer i kontakt med proteinerne (figur 14), bliver det meste af proteinernes sekundære og tertiære struktur brudt. Dette sker ved, at der bliver tilføjet en negativ ladning til bestemte aminosyrer. Dette medfører, at proteinet bliver strakt ud, da negative ladninger frastøder negative ladninger (figur 14) (Caprette 2012). 37

44 Figur 14 Her ses hvordan SDS folder proteiner ud (Caprette 2012). Ved at opvarme blandingen til 60 C kan man modarbejde bestemte proteiners hydrofobe egenskaber, så SDS også kan have virkning på hydrofobe proteiner eller i områder, hvor proteinet er hydrofobt (figur 14). Dette er dog ikke nødvendigt, da varmen kun fremskynder processen ved at øge aktiviteten på molekylært niveau (Caprette 2012). Hvis man opvarmer sine prøver for meget, risikerer man også at ødelægge proteinerne. Gelen, som har samme densitet hele vejen igennem, har til formål at separere proteinerne fra den positivt ladede kilde. Som et resultat af dette vil små proteiner hurtigere kunne bane sig vej igennem gelen og til strømkilden, da mindre gel skal flyttes for, at proteinet kan komme frem mod strømkilden. Den hastighed, proteinet bevæger sig med, kan udtrykkes som omvendt proportional til logaritmen af proteinets masse. Hvis man har kendte proteiner, kan man sammenligne de ukendte proteiner med disse for at få et overblik over, hvilken masse de ukendte proteiner har. Der er dog andre faktorer, der kan påvirke proteinernes hastighed igennem gelen, da proteinkæderne indeholder forskellige mængder af aminosyrer med forskellig syre/base-egenskaber (Caprette 2012). Hvis man har en ide om, hvilke proteiner der er i en given prøve, kan SDS-PAGE også give et overblik over, hvor mange af bestemte proteiner, der er til stede, da høje koncentrationer medfører et mere synligt resultat i form af et tykkere bånd. Det er dog vigtigt at forstå, at polyakrylamidgelen kun kan rumme en given mængde protein. Hvis koncentrationen er for høj, risikerer man, at protei- 38

45 nerne bryder igennem brønden, og hvis man tilføjer for lidt, risikerer man, at man ikke kan aflæse sine resultater (Caprette 2012). Efter endt elektroforese kan man farve gelen med proteinfarvestof og derved få et kendskab til det molekylære indhold i den analyserede prøve (Agger 2011). 8.2 Materialer og metode Kemikalier CaCl2 AppiChem, Tyskland Ultrapure tris Saveen Werner, Sverige Bromphenolblå Sigma-Aldrich (Fluka), America NaCl Merck KGaA, Germany H2NaO4P Sigma-Aldrich, America KCl Sigma-Aldrich, (Fluka), Amerika SDS AppliChem, BioChemica, Chemica Synthesis Services, Tyskland Ammonium persulfat AppliChem, BioChemica, Chemica Synthesis Services, Tyskland TrisHCl - Saveen Werner, Sverige Urea - Sigma-Aldrich, America Glycin AppliChem, BioChemica, Chemica Synthesis Services, Tyskland Unstained Protein MW marker #26610, Thermo Scientific, America Giemsa Sigma-Aldrich, Amerca Histopaque - Sigma-Aldrich, America Akrylamid Carl Roth GmBH, Karlsruhe TEMED Mp north, America ETOH Kenetyl AS Køge, Danmark Materialer Strømforsyning BIO RAD, Power Pae 300, America Mikroskob: Axioskop Zeiss, Tyskland Centrifugering: Fiber lite piramoon teknologi, Themo Sientific, America Varmeblokke: Techne Dri-block DB-2TC, Storbritannien SDS-udstyr BIO RAD, America 39

46 8.2.3 Metode Før forsøget påbegyndtes var en person fra gruppen i blodbanken og fik tappet blod i et rør med EDTA. Det er dette blod, som benyttes i forsøget. Centrifugering: Der blev udtaget 3 ml blod til et greiner rør, som blev tilsat 2 ml PBS-buffer (137 mm NaCl, 3 mm KCl, 20 mm Na-phosphate, ph 7). Røret vendes et par gange. I et andet greiner rør blev 5 ml Histopaque afmålt. Oven på Histopaque puden blev 5 ml af blodet opblandet med PBS bufferen fra det første rør lagt, således at faserne ikke sammenblandedes. Herefter blev prøverne centrifugeret i 30 minutter ved halv acceleration, halv bremse og 24 C. Efter 30 minutter blev røret udtaget, og der kunne ses en opdeling i 3 fraktioner. Med en finnpipette blev de 3 fraktioner udtaget, og overført til hvert deres eppendorfrør. Fraktion 3 er det øverste lag, fraktion 2 er båndet under fraktion 3 og fraktion 1 er det der ligger i bunden (tabel 1). Fraktion 1 Erytrocytter 2 Monocytter og lymfocytter 3 Plasma 4 Serum 5 Koagulat Blodudstrygning/ mikroskopi: Først blev 2 blodudstrygninger med en dråbe blod fra fingeren udført. Udstrygningerne blev herefter henstillet til tørring. Efter tørringen blev den ene af blodudstrygningerne farvet med Giemsa i stinkskabet i 30 sekunder. Så blev den sat i demineraliseret vand i 3 minutter og skyllet med demineraliseret vand, hvorefter det blev tørret i 10 minutter. Disse objektglas blev isat mikroskopet, hvorefter de undersøgtes for forskellige celletyper, som affotograferedes ved forstørrelser på 100x og 400x. Tabel 1 - Viser de forskellig fraktioner, og hvad der er i dem. Fraktion 3 (plasma) koaguleres og bliver til serum og koagulat. Udstrygning af fraktioner: Fra hver af de 3 fraktioner fra centrifugeringen blev der udtaget en dråbe til en udstrygning efter samme fremgangsmåde som ved blodudstrygningen. De 3 objektglas med de udstrøgne prøver blev alle 3 farvet med Giemsa i stinkskabet, inden de mikroskoperedes. Koagulation af plasma: Til 900 μl af plasma-fraktionen blev der tilsat 100 ml CaCl 2 (250 mm CaCl 2 ). Røret blev inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur, og røret blev centrifugeret ved 40

47 rpm i 5 minutter. Supernantanten (fraktion 4) blev overført til et nyt eppendorfrør. Pellet (fraktion 5) blev skyllet med 3x500 μl PBS buffer (tabel 1). Pellet og supernantanten opbevaredes herefter på is. SDS-PAGE: Først blev 2 geler støbt. Støbning af geler: Separationsgelen blev lavet først; i et greiner rør blandedes 7 ml demineraliseret vand, 4,8 ml nedre tris buffer (1,5 M Tris-base, ph 8,6) og 190 μl 10 % SDS. Herefter tilsattes 7,6 ml 10 % acrylamide/bis, 20 μl temed og 191 μl 20 % APS i et stinkskab. Greiner røret vendtes rundt, så opløsningen blev blandet. Seperationsgelen blev hældt på pladen og ovenpå blev der hældt overlay buffer (0,1 % SDS). Stackinggelen påbegyndtes herefter ved at blande 5,4 ml demineraliseret vand, 2,4 ml øvre tris buffer (1,5 M Tris-base, ph 6,8 med HCl) og 180 μl 10 % SDS i et greiner rør. Herefter blev tilsat yderligere 1,4 ml 30 % acrylamid/bis, 11,5 μl temed samt 60 μl 20 % APS i et stinkskab. Greiner røret vendtes rundt. Overlay bufferen blev hældt af, og stackinggelen tilsattes ovenpå separationsgelen, mens kammen blev vippet på plads. Elektroforese: Fra hver af de 5 fraktioner pipetteredes 15 μl i hver deres brønd i gelen. Fraktion 5 blev opløst med denaturerings buffer (50 mm TrisCl, 8M Urea, 150 mm NaCl, 50 mm DTT, ph 8). Fraktion 1 var meget tyktflydende, så der blev iblandet 15μL loading buffer (0,2 M Tris, 2 % SDS, 0,2 % bromphenolblå, 20 % Glycerol). I den 6. brønd tilsattes en Unstained Protein MW marker # Elektroforesen blev kørt med running buffer (120 mm M Tris-base, 1 M glycin, 0,5 % SDS, ph 8,25) i karret. Der blev kørt 80 V gennem gelen i 10 minutter, efterfølgende 120 V i 30 minutter. Gelen blev sammen med stain (0,2 % Coomassie Brilliant Blue G250, 50 % Ethanol, 7 % CH 3 COOH) opvarmet og farvet i 20 minutter, og efterfølgende affarvet i destain (7 % Ethanol, 5 % CH 3 COOH) natten over. Gentagelse af elektroforesen: Da gelen var blevet destainet, viste det sig, at der var en stor mængde protein i stackinggelen. Dette skyldtes sandsynligvis en meget stor proteinkoncentration. Derfor blev elektroforesen gentaget blot med henholdsvis en 1:1 og en 1:9 fortynding i loadingbuffer af de 5 fraktioner. Dog var der ikke tilstrækkeligt af fraktion 1, hvorfor denne blev udeladt. Ellers fulgtes den samme fremgangsmetode. 41

48 9.0 Resultater 9.1 Centrifugering Figur 15 Centrifugering af blod, hvor man kan se de 3 fraktioner. Fraktion 1 der er erytrocytter, fraktion 2 der er leukocytter og monocytter og fraktion 3 der er plasma. Ved centrifugering blev blodet opdelt i 3 fraktioner. Efter centrifugeringen fremkom følgende fraktionering af blodet (figur 15). Det øverste lag med gullig væske er plasmaet (fraktion 3). Nederst er erytrocytterne og granulocytterne (fraktion 1). Det grålige bånd i midten, den såkaldte buffy coat, som her ikke fremgår særligt tydeligt, indeholder en stor mængde trombocytter, monocytter og leukocytter (fraktion 2). Det fremgår ligeledes tydeligt, at blodet har en høj koncentration af erytrocytter, mens man endvidere ser, at plasmaet udgør størstedelen af fuldblodets samlede volumen. 42

49 9.2 Mikroskopiresultater Figur 16 - Dette er de ufarvede celler fra friskt blod, hvor A er 100x og B, C og D er 400x. På B peger pilne på små prikker, der kan være trombocytter. C peger på tre celler der er større end de andre, og kan være en form for leukocytter. Pilen på D viser en erytrocyt. På figur 16 ser man ufarvede udstrygninger af fuldblod. På 16A er mikroskopet indstillet på 100x, og det ses en stor mængde af blodets bestanddele. Figur 16B-D viser ufarvede fuldblodsudstrygninger, hvor der ses en masse erytrocytter, forstørret 400x. 16B viser en stor mængde erytrocytter, som er kendetegnet ved deres bikonkave struktur og deres orange farve. Der ses også nogle mindre celler nummer 1, som kan være trombocytter i 16B. På figur 16C observeres der muligvis enkelte leukocytter nummer 2. På den sidste figur, D, ses en lys celle nummer 3. 43

50 Figur 17 Mikrospopi af farvet fuldblod hvor 17A er forstørret 100x. 17B-D er forstørret 400x. På figur B ses nogle leukocytter, som antages at være (1) en eosinofil granulocyt, (2) neutrofile granulocytter og (3) en lymfocyt. På figur C ses de samme celler som i figur B, men nu i et andet lys, hvor der ses en firedeling af kernen (1), hvor (3) ses tydeligere. På figur D ses en monocyt (4) og en mulig lymfocyt (5) På figur 17A ses et udsnit af en farvet udstrygning af friskt blod farvet med Giemsa farvning. Det antages, at den største mængde af cellerne er erytrocytter, da erytrocytterne normalt udgør cirka 99 % af blodets celler (Geneser 2011), men for at kunne identificere de forskellige celler og med sikkerhed kunne se kendetegnene ved erytrocytter, forstørres billederne til 400x. Billedet er medtaget, da det giver en god ide om, hvor mange erytrocytter, der reelt er i et område af et udstrygningspræparat. På figur 17B, forstørret 400x, kan man se mange erytrocytter, som er tætpakket, og man kan ane deres bikonkave struktur. Her bliver farvningen tydeligere, hvor man kan se, at erytrocytterne er makroskopisk lyserøde. Cellerne, markeret med numrene 1-3, som er større end erytrocytterne, er sandsynligvis leukocytter. Cellen med nummer 1 er muligvis en eosinofil granulocyt, som kende- 44

51 tegnes ved en todelt cellekerne, hvor kromatinkornene er meget markante grundet kraftig farvning. Cellen der ses har umiddelbart en opdelt cellekerne, og fremstår væsentligt større end de omkringliggende erytrocytter. Cellerne med nummeret 2, har cellekerner, der er delt i flere lapper og er ligeledes kraftigt farvet. Disse kan være neutrofile granulocytter, der i deres cytoplasma har et indhold af granula, der gør, at de farves svagt og ligner støv, hvilket kan anes på den nederste af de to celler. Celle nummer 3 er muligvis en lymfocyt, da det ligner, at cellekernen fylder cellen ud og er kraftigt farvet. På figur 17C ses de samme celler, som fra figur 17B. Figur 17D viser en sammenklumpning af erytrocytter. Ligeledes ses muligvis to andre celler. Cellen markeret med nummer 4 er muligvis en monocyt, som er kendetegnet ved en hesteskoformet cellekerne. Celle nummer 5 kan bare være en farvet plet eller en lymfocyt. Figur 18 Mikroskopi af fraktion 1 (erytrocytter), hvor 18A og 18B. På figur B ses en monocyt (1), samt en sammenklumpning af celler (2). Figur 18A viser yderkanten af udstrygningen, hvor tætheden af celler er lavere, og derfor ses der områder uden celler. Men de karakteriske rouleaux af erytrocytter er tydelig. På figur 18B er det atter tydeligt, hvordan erytrocytterne klumper sammen i rouleaux. Man kan også se en leukocyt, her markeret med nummer 1, som har en cellekerne, der umiddelbart er hesteskoformet, hvilket indikerer, at der kan være tale om en monocyt. Elementet markeret med nummer 2 ligner umiddelbart en sammenklumpning af celler. 45

52 Figur 19 Mikroskopi af fraktion 1, forstørret 400x (erytrocytter). På figur A ses store lag af erytrocytter (1), samt en mulig leukocyt (2). Figur B viser store mængder af celler, samt misfarvninger (1). Figur C viser lymfocytter (1), samt en monocyt (2). På figur 19A ligger erytrocytter i lag og stakke. Elementerne nummereret med 1, som fremstår som hvide plamager. Elementet med nummeret 2 ligner en lilla plet. Figur 19B viser ligesom figur 19A de store hvide plamager, idet cellerne ligger i flere lag. Figur 19C har igen flere lag af erytrocytter, og de lilla pletter med nummeret 1 kunne være lymfocytter. Det ligner desuden, at cellen længst til venstre har en smal krans omkring sig; dog ser farvningen ens ud med cellekernen. Cellen med nummer 2 kunne være en monocyt, kendetegnet ved en hesteskoformet cellekerne samt den karakteristiske lilla farve. 46

53 Figur 20 Mikroskopi af fraktion 2 (monosytter og lymfocytter) der er forstørret 400x. Figur A viser en monocyt (1) og figur B viser en neutrofil graunlocyt (2) På figur 20A kan celle nummer 1 være en monocyt på grund af dens nyreformede cellekerne samt dens finkornede kromatin. De omkringliggende små elementer, der ses, er muligvis trombocytter. Celle 2 på figur 20B kan igen vise en monocyt, da det ligner, at den har en hesteskoformet cellekerne. De omgivende blå elementer er sandsynligvis trombocytter, da de er farvet i midten og er omgivet af en lysere zone. Figur 21 Mikroskopi af fraktion 3 (plasma) der er forstørret 400x. Der ses en samling af trombocytter (1). På figur 21 ses udstrygningen af fraktion 3, hvor det umiddelbart kun er trombocytter, der fremgår. 47

54 9.3 Gelresultater I det følgende afsnit vil resultaterne fra SDS-PAGE-forsøget blive behandlet. Resultaterne af SDS- PAGE behandles ved hjælp af en markør (figur 22), som viser forskellige kendte proteiners størrelse. Her ud fra kan de ukendte proteiner fra fraktionerne 1-5 sammenlignes med markøren for at observere de ukendte proteiners molekylvægt. Ligeledes giver tykkelsen af båndene samt farvens intensitet en indikation på koncentrationen af proteiner ved en given molekylvægt. Figur 22 - Fra venstre mod højre: Fraktion 1 (erytrocytter), fraktion 2 (monocytter og lymfocytter), fraktion 3 (plasma), fraktion 4 (supernantant/serum), fraktion 5 (pellet/koagolant) og den 6. brønd indeholder markøren. Det udtværede resultat skyldes formentlig en for høj koncentration af protein. Der vil blive taget udgangspunkt i figur 23, da den første gel (figur 22) var overloadet med protein, så der skete udtværinger, og ligeledes kan der være tale om forurenede prøver. Ud fra figur 23 vil fokus blive lagt på de fraktioner med fortyndingen 1:9, da der i 1:1 fortyndingerne stadig er sket en del udtværinger. 48

55 Figur 23 Da dette forsøg blev foretaget, var fraktion 1 størknet og kunne derfor ikke benyttes. Derfor ses fra højre mod venstre: fraktion 2 (monocytter og lymfocytter), fraktion 3 (plasma), fraktion 4 (supernantant/serum), fraktion 5 (pellet/koagulant) og den 5. brønd indeholder markøren. De følgende 4 brønde indeholder igen fraktion 2-5, men i en fortynding i forholdet 1:1, hvor de tidligere brønde var fortyndet 1:9. Fraktion 2-4 ser meget identiske ud. Selv om størrelsen af båndene varierer fraktionerne imellem, ses der bånd omtrent de samme steder, hvilket formentligt skyldes, at mange af de samme proteiner er til stede i disse fraktioner. Fraktion 5, som er koagulatet, adskiller sig mere fra de tidligere fraktioner. Da fraktion 5 s bånd er meget svagt synlige i fortyndingen 1:9 i forhold til fortyndingen 1:1, tages der forbehold for begge fortyndinger for at sikre, at alle bånd medtages. Fraktion 2 indeholder monocytter og lymfocytter. Der ses ved 1:9 fortyndingen et tykt, kraftigt farvet proteinbånd ved 116,0 kda, og umiddelbart er der et forholdsvist tykt bånd omkring de 100 kda og et tyndt bånd omkring de 62 kda. Ligeledes ses et halvtykt, svagtfarvet bånd lige omkring 52 kda og et lignende bånd ved 42 kda, mens der fremgår et meget bredt og kraftigt blåt bånd ved cirka 38 kda. Endelig ligger der ved 18,4 kda et tyndt proteinbånd samt et meget lille bånd ved 14,4 kda. Ud fra 1:9 fortyndingen ses der ikke umiddelbart flere bånd, men ser man på 1:1 fortyn- 49

56 dingen ser man et megettyndt og svagt farvet bånd ved 33 kda samt aftegningen af et svagt bånd ved cirka 24 kda. Fraktion 3 indeholder plasma. Der ses i 1:9 fortyndingen igen et kraftigt farvet bånd lige ved 116,0 kda, et lidt mindre bånd ved de 100 kda og et proteinbånd omkring de 62 kda. Ligesom ved fraktion 2 ses der også et bånd ved cirka 52 kda, som dog her er væsentligt svagere i farvningen. Derudover er der også ligesom i fraktion 2 et bånd ved 38 kda, som dog her er væsentligt tyndere og lidt svagere i farven. Ligeledes ses to meget tynde bånd ved henholdsvist 18,4 kda og 14,4 kda, som ligner båndene fra fraktion 2 i tykkelse og farve. Der ses ikke umiddelbart flere bånd i fraktion 3 ud fra 1:9 fortyndingen, men ser man i stedet på 1:1 fortyndingen, fremgår der enkelte nye bånd. Der ses således igen meget tynde bånd ved 33 og 24 kda. Samtidig kan man se, at båndet ved 18,4 kda er tykkere og kraftigere farvet end det samme bånd ved fraktion 2. Desuden ligner det, at netop dette bånd nærmere ligger omkring 20 kda. Fraktion 4 består af serum og har ved 1:9 fortyndingen, ligesom de tidligere fraktioner, et tykt bånd ved 116,0 kda. Ligeledes ligger der igen bånd ved cirka 100 kda, der dog umiddelbart er væsentligt tykkere end i de tilsvarende bånd i fraktion 2 og fraktion 3. Ved 62 kda ligger der igen et tyndt, svagtfarvet bånd, og ved 52 kda ses et klart farvet bånd. Der ses ligesom i de foregående fraktioner et meget tykt og kraftigt farvet bånd ved 38 kda, som minder meget om det tilsvarende bånd i fraktion 1 og to mindre bånd ved henholdsvist 18,4 kda og 14,4 kda. Ser man på 1:1 fortyndingen ligger ser man igen bånd ved 33 kda og 24 kda, førstnævnte en anelse tykkere og kraftigere i farvningen end det tilsvarende bånd i fraktion 2 og 3. Fraktion 5 indeholder koagulat, og i fortyndningen 1:9 er båndene meget tynde og meget svagt farvede, dog ses der umiddelbart svage bånd ved 116,0 kda, 18,4 kda og 14,4 kda samt noget der ligner et bånd ved 45,0 kda. Ser man på 1:1 fortyndingen ser man flere bånd. Her ses svage bånd ved cirka 100 kda og 80 kda og et smalt bånd ved 62 kda. Der ses også et meget tyndt bånd ved cirka 58 kda. Derudover ses igen et lidt kraftigere bånd ved 52 kda og et tykt, kraftigt farvet bånd ved 45,0 kda, samt et lidt mindre ved 38 kda. Slutteligt ses der svage bånd ved 33 kda og 24 kda. Ser man på gelen som helhed, er de to brønde til højre for fraktion 5 i 1:1 fortyndingen blevet forurenet af en af prøverne, da der slet ikke burde være protein i disse brønde. Ligeledes ses en form for udtværing eller lignende mellem fraktion 5 i 1:9 fortyndingen og markøren ved 45,0 kda. Samtidig ligner det, at der er en sammenblanding mellem markøren og fraktion 2 i 1:1 fortyndingen. 50

57 9.4 Fejlkilder Blodudstrygninger er svære at udføre, og det kan for den uøvede have betydning for kvaliteten af de efterfølgende mikroskopibilleder. Blodet skal udstryges i en hurtig jævn bevægelse, ellers risikerer man, at tungen vil blive ujævn, og cellerne vil ligge i et tykt lag. Dette er aktuelt på figurerne 16, 17 og 19. Dog er udstrygningerne generelt bedre i kanten af tungen, som man ser på figur 18. Blodudstrygningen af fraktion 1 (figur 18-19) viser, hvordan erytrocytterne er sammenklumpede. Det kan være fordi, at vores fraktion 1 nåede at tørre ind, da der gik lang tid fra centrifugeringen til mikroskopi af fraktionen. Upræcis indstilling af mikroskopet kan have påvirket vores resultater i en sådan grad, at billederne er svære at analysere grundet mangel på fokus og dårlig belysning. Ved Giemsa-farvningen af de forskellige udstrygninger er det sandsynligt, at der på nogle af mikroskopibillederne er en sammenklumpning af farven (figur 19B). Det kan derfor tyde på, at udstrygningen efter farvningen ikke er blevet skyllet ordentlig ren. SDS-PAGE kan have dannet lufthuller i gelen, der skaber ujævnheder i båndene under elektroforesen. Under tilføjelsen af de forskellige fraktioner kan det ske, at der ved pipettering opstår en forurening af nabobrøndene, der medfører et mere upræcist resultat (figur 25). Fraktion 5 blev opløst i denatueringsbuffer, hvilket kan resultere i en heterogen opløsning, hvor mængden af protein kan variere. 51

58 10.0 Diskussion Med baggrund i litteraturstudiet var der nogle forventninger til, hvilke resultater forsøgene kunne vise. Det var forventet at se en stor mængde erytrocytter, da teorien siger, at disse udgør 99 % af blodets celler. Ligeledes var det forventet, at de leukocytter, der kunne observeres i mikroskopet, primært ville være enten lymfocytter eller neutrofile granulocytter, da disse udgør størstedelen af leukocytterne i blodet. For trombocytterne var det forventet at se disse i fraktion 2 og 3 samt en tydelig størrelsesforskel mellem trombocytterne og de andre celler i blodet. Ser man på selve fraktioneringen af de forskellige blodkomponenter ved hjælp af centrifugering (figur 15) fremgår det, at adskillelsen af de tre faser ikke var helt tydelig. Buffy coaten, fraktion 2, er således svær at skelne fra fraktion 3 rent visuelt, og på toppen af fraktion 1 ses der umiddelbart noget, der kunne ligne et lag af erytrocytter. Det er dog ikke tilfældet, da det er et lag af erytrocytter, der sidder på siden af centrifugerøret. Dette kan have betydet, at dele af enten fraktion 1 eller 3 er kommet med i fraktion 2 under afpipetteringen, hvilket vil have påvirket den efterfølgende mikroskopering og gelelektroforese. Det er dog ikke sandsynligt, at en blanding af fraktionerne har haft indvirkning på mikroskoperingen, da dette ikke fremgår af resultaterne. Ved gelelektroforese er det sværere at se, om der er sket en sammenblanding af fraktionerne, fordi fraktionerne 2, 3 og 4 minder meget om hinanden. Desuden burde Histopaque 1077 ligge som et lag mellem fraktion 2 og fraktion 3 og forhindre en sammenblanding af fraktion 2 og 3. Det svære ved blodudstrygninger er at få den karakteristiske tynde tunge med en yderkant bestående af kun ét cellelag. Det er umiddelbart ikke lykkedes, idet der blev observeret celler i flere lag. Det er derfor ikke muligt at identificere alle cellerne. På de første ufarvede fuldblodsudstrygninger var det tydeligt at se erytrocytterne og trombocytterne på grund af henholdsvis den bikonkave struktur og cellestørrelsen (figur 16B-D). På figur 16A kan man umiddelbart se en stor mængde celler. Det antages, at en stor del af disse er erytrocytter baseret på den store forekomst af disse i blodet. Dog er en forstørrelse på 100x ikke umiddelbart ideel til bestemmelse af celletyper. Kigger man derimod på figur 16B, ses en 400x forstørrelse. Her ser man, at der sandsynligvis har været tale om erytrocytter på 16A, da der her ses et stort antal erytrocytter, som kendes på deres bikonkave form. Desuden ses der på 16B en række mindre elementer markeret med nummer 1, som efter al sandsynlighed er trombocytter, baseret på størrelsen i forhold til de omkringliggende erytrocytter og deres forekomst i blodet ( per µl). Der ses tre elementer på figur 16C, som er markeret med nummer 2, som ikke umiddelbart kan identificeres. Baseret på størrelsen er det muligt, at der er tale om leu- 52

59 kocytter, men da kernerne ikke kan ses, er det ikke muligt at bestemme leukocyttypen eller om det i det hele taget er celler, der ses. Ser man eksempelvis på 16D ligner det, at celle nummer 3 er anderledes end de omkringliggende celler. Der er dog nok stadig tale om en erytrocyt, når man tager størrelsen og strukturen i betragtning. Forskellen fra de andre erytrocytter kan skyldes mikroskopets indstilling, da det kan have noget med lysindstillingen at gøre. Dette kan derfor muligvis også være tilfældet for elementerne med nummer 2 i 16C. Ved en farvning af udstrygningerne med Giemsa vil det være muligt, at bestemme celletyperne mere præcist ud fra blodets bestanddele. De farvede fuldblodudstrygninger viser en del leukocytter. Der ses umiddelbart en del neutrofile granulocytter, lymfocytter, monocytter og en enkelt eosinofil granulocyt i figur 17. Der kan dog være tvivl om, hvorvidt cellen med nummeret 1 på figur 17B er en eosinofil granulocyt, og da der er meget få af disse i blodet, kan det overvejes, om det vitterligt er denne celletype, der er blevet observeret. Da der er langt flere neutrofile granulocytter (62 %) end eosinofile granulocytter (2,3 %), kan det overvejes, om det er en neutrofil granulocyt i stedet. Disse to granulocytter minder en del om hinanden i deres form og størrelse, og farvningen af kernen er i begge tilfælde violet. Derudover kan det være svært præcist at differentiere antallet af lapper i kernen. Ser man eksempelvis på figur 17C ligner det, at celle nummer 1 har en firedelt kerne. Baseret på dette samt koncentrationen i blodet er der efter al sandsynlighed tale om en neutrofil granulocyt. Celle nummer 3 på figur 17B kan umiddelbart ligne en lymfocyt baseret på udfyldningen af kernen. Det er dog umiddelbart svært at vurdere, hvorvidt der i virkeligheden er tale om en celle med en kerne eller om det er en misfarvning. Ser man imidlertid på figur 17C, er celle 3 væsentlig tydeligere, og det fremgår tydeligere, at der er tale om en lymfocyt, da man kan se de grove kromatinkerner omgivet af en tynd krans af blåfarvning, som kan være cellens cytoplasma. Det er således meget muligt, at der er tale om en lymfocyt, hvilket heller ikke er helt urealistisk, da den udgør 30 % af leukocytterne i blodet. På figur 17D er celle nummer 4 umiddelbart en monocyt, da det ved første øjekast ligner, at den har en hestskoformet cellekerne, dog kan det også mere ligne en todelt cellekerne forbundet med en kromatinstreng. Der kan således være tale om en eosinofil granulocyt, der af leukocytterne udgør 2,3 %. Ellers kan der være tale om en monocyt, der dog også er sjælden med sine 5,3 %. Dog kan man antage at der ved sygdom, optræder en større koncentration af leukocytter i blodet til bekæmpelse af mikroorganismer. Dette kan have været tilfældet for donoren af det undersøgte blod, og dermed forklare tilstedeværelsen af de forskellige leukocytter. Cellen med nummer 2 kan bare være en farvet plet, da der ikke umiddelbart er nogen synlig cellekerne. Der kan dog være tale om en lymfocyt, 53

60 men i modsætning til figur 17B og 17C er der ikke umiddelbart en lignende blå omkransning af cellekernen. For lettere at kunne identificere forskellige celletyper fraktioneres blodet. Udstrygningen af fraktion 1 viser som forventet en stor mængde erytrocytter (figur 18 og 19). Dog ligger cellerne i flere lag, bortset fra figur 18, hvor yderkanten af tungen er affotograferet. Det tykke lag har resulteret i, at cellerne klumper sammen i rouleaux nogle steder. Manglen på plasma kan være skyld i sammenklumpningen, da plasma normalvist er med til at gøre blodet homogent. På figur 18B er celle nummer 1 muligvis en monocyt baseret på tilstedeværelsen af en hesteskoformet kerne. Dog ser cellen umiddelbart ret lille ud, idet den har omtrent samme størrelse som de omkringliggende erytrocytter, kan der være tale om en misfarvning. Figur 19A viser flere lag af erytrocytter. Elementerne nummereret med 1, som fremstår som hvide plamager, er sandsynligvis et udtryk for, at erytrocytterne ligger i for tykt et lag. Elementet med nummeret 2 kan muligvis være en lymfocyt grundet kernens udfyldning samt størrelse. Der kan dog også være tale om en farveplet. Det ligner yderligere at denne celle og cellerne nummer 1 og 2 på figur 19C ikke ligger i samme plan, som det andet cellelag. Da der er flere cellelag, er det svært at se cellens bestanddele, og det kan derfor argumenteres, at det er misfarvninger i stedet for leukocytter. På figur 19C er de lilla pletter markeret med nummer 1 muligvis lymfocytter. Dette er muligt, da de umiddelbart er udfyldte med den karakteristiske lilla farve. Desuden passer størrelsen meget godt på lymfocytter (7 µm) i forhold til de omkringliggende erytrocytter. Cellen med nummer 2 på 19C er muligvis en monocyt, da det ligner, at den har en hesteskoformet kerne. Dog er den umiddelbart for lille i forhold til erytrocytterne og cellerne med nummeret 1, da monocytter normalvist har en diameter på μm. Samtidig er figur 19A-C fra udstrygningen af fraktion 1, hvorfor der ikke umiddelbart burde være monocytter til stede. Udstrygningen af fraktion 2 har ikke en særlig høj koncentration af monocytter og lymfocytter, som ellers kunne forventes (figur 20). Der er umiddelbart observeret to monocytter i denne udstrygning, dog kan der i figur 20B ved celle nummer 2 være tale om en neutrofil granulocyt, da kernen kan være opdelt i flere lapper forbundet af en kromatinstreng. Samtidig ser cellen på figur 20A umiddelbart for lille ud til at være en monocyt, som er μm i forhold til de tidligere diskuterede mulige monocytter. Dog burde der være monocytter til stede i denne fraktion, og umiddelbart er celle 1 på 20A umiddelbart den, som ligner en monocyt mest af de observerede celler. Ligeledes ses der muligvis en større mængde af trombocytter i udstrygningen, hvilket er forventet i denne frakti- 54

61 on. Trombocytterne har en tendens til at klumpe sammen og deres størrelse på 3 µm stemmer umiddelbart meget godt overens med elementernes størrelse i forhold til celle 1 i 20A. Det kan samtidig være en mulighed, at nogle af de observerede trombocytter i virkeligheden er støv. I udstrygningen af fraktion 3 er der sandsynligvis observeret trombocytter (figur 21). Det tyder på, at der er tale om trombocytter, da de observerede elementer er klumpet sammen og er purpur til blålige i farven. Samtidig ses der en lys krans rundt omkring de farvede centre, hvilket stemmer overens med trombocytternes histologi. Der er dog mulighed for, at nogle af de mindre partikler er støv. Dette er dog ikke umiddelbart så sandsynligt, da partiklerne også er blevet observeret i udstrygningen af fraktion 2, hvor det er forventet at observere trombocytter. Der er ikke observeret nogle basofile granulocytter i nogen af udstrygningerne, hvilket er forventet, da disse celler udgør fåtallet af leukocytterne, nemlig kun svarende til 0,4 % af det samlede antal. De fem fraktioner blev ligeledes analyseret ved hjælp af SDS-PAGE. Den første gel var svær at aflæse på grund af en alt for stor koncentration af protein (figur 22). Derfor blev forsøget gentaget, denne gang med to fortyndinger af fraktionerne. Selvom fraktionerne er forskellige, hvad angår koncentrationerne, ses der generelt proteinbånd omkring de samme molekylvægte (figur 23). Dette betyder, at der er proteiner med samme molekylvægt i de forskellige fraktioner, hvilket kan indikere, at det muligvis er de samme proteiner, der er til stede i forskellige fraktioner - omend i forskellige koncentrationer. Der er som sagt blevet taget udgangspunkt i de fraktioner med lavest koncentration. Dette er gjort, da flere af fraktionerne har et overload af protein, og derfor er båndene svære at adskille fra hinanden. Problemet med kun at se på 1:9 fortyndingen er, at nogle af de bånd, der er synlige for fraktionerne med højere koncentration slet ikke er synlige ved den lave proteinkoncentration. For at minimere risikoen for, at overse bånd, sammenholdes 1:9 fortyndingen med 1:1 fortyndingen ved tvivlsspørgsmål (figur 23). SDS-PAGE-resultaterne for fraktion 2, 3 og 4 er næsten identiske, idet at båndene har samme størrelse. Dog er mængden af proteinerne varierende. Man ser i fraktion 5 også nogle af de samme bånd, der er dog også en del andre til stede. Derudover er mængden af protein væsentlig mindre. Det vigtigt at tage med, at der findes langt flere proteiner end dem, der er nævnt i forsøgsteorien. Det er muligt, at de proteiner, der bliver omtalt, i realiteten er helt andre proteiner med samme molekylvægt. Det forventes dog, at proteinet albumin er at finde i flere bånd for fraktionerne 2-5, da 55

62 det udgør 60 % af proteinerne i blodet. Derfor var det forventet, at båndet hvor albumin er til stede, vil være til stede i alle fraktionerne. Da fraktion 1 størknede imellem første og anden SDS-PAGE, er der kun resultater fra fraktion 1 i første SDS-PAGE. Første gel er dog så kraftigt overloaded med protein, at man ikke kan adskille båndene fra hinanden. De første bånd i fraktion 2 ligger på 116 kda, omkring 100 kda og 62 kda, hvilket muligvis er albumin. Albumin har en molekylvægt på 66,472 kda, men har tendens til at sammenklumpe og kan derfor optræde med forskellige molekylvægte. Hæmoglobin har en molekylvægt på 65,07 kda, men forventes ikke at fremgå i andet end fraktion 1. Det er dog muligt, at der ved afpippettering er sket en sammenblanding med fraktion 1, og der derfor er hæmoglobin tilstede. Dette er imidlertid ikke videre sandsynligt, da der under mikroskoperingen ikke blev observeret erytrocytter i fraktion 2. Det er umiddelbart ikke afklaret, hvilke proteiner der er beliggende ved en vægt på 52 kda og 42 kda i fraktion 2, men det kan observeres, at der er proteiner til stede. Båndet ved 38 kda kan muligvis være kolesterol, der har en molekylvægt på 38,7 kda. Kolesterol er en mulighed, da lipoproteinet er med til at stabilisere alle kroppens celler. Det er muligt, at båndet med en vægt på 18,4 kda kan indeholde IgE, da proteinets molekylvægt er 19 kda, og IgE er at finde i leukocytter i små mængder. Det sidste bånd omkring 14,4 kda dækker muligvis over lysozym, som er et enzym med en molekylvægt på 14.0 kda. Der er 5-15 mg/l lysozym i blodet, og det er således sandsynligt, at båndet indeholder enzymet. I fortyndingen 1:1 fremgår yderligere to bånd ved henholdsvis 33 kda og 24 kda. Båndet på 24 kda er slet ikke synligt i 1:9 fortyndingen, men det kan skyldes, at koncentrationen er lille. Insulin, som har en molekylvægt på 35,6 kda, er muligvis til stede ved båndet på 33 kda. Det kan måske forklare, hvorfor båndet er så tyndt og svagt farvet, da insulin har en koncentration på blot 0,4 mg/l i blodet. Udover insulin er det en mulighed, at også FSH og TSH er at finde i båndet. De har molekylvægte på henholdsvis 29 kda og kda. Det er dog muligt, at hormonerne insulin, FSH og TSH først er til stede i fraktion 3 og 4. I båndet på 24 kda er prolaktin et muligt bud med sin molekylvægt på 25,7 kda, men det kan dog være usandsynligt, at da molekylvægten på prolaktin er højere end det obseveredes bånds. På den anden side kan vurderingen af båndets molekylvægt være fejltolket. Fraktion 3 og 4 har mange af de samme bånd, og det antages, at båndene indeholder de samme proteiner som i fraktion 2. Dog adskiller fraktion 3 sig ved båndet, der ligger på 100 kda, som sandsynligvis her indeholder lutropin, der har en molekylvægt mellem 85 og 92 kda. Lutropin er et 56

63 hormon og forventes derfor at ses i fraktion 3. Transthyretin har en molekylvægt på 54,9 kda og er eventuelt beliggende i båndet på 52 kda. Derudover ligner det, at det bånd, der før lå på 18,4 kda, i fraktion 3 ligger på 20,0 kda. Det er dog stadigvæk en mulighed, at det er IgE, der kan ses. Båndene i fortyndingen 1:9 på fraktion 5 sammenlignes med båndene i 1:1 fortyndingen, da proteinmængden i fraktion 5 umiddelbart er meget lille. Første bånd ses omkring 116,0 kda, hvor der igen kan være tale om albumin. Båndet ved 116,0 kda i 1:1 fortyndingen muligvis er forurenet, men der er et lignende bånd i 1:9 fortyndingen, hvilket tyder på, at der reelt er tale om et bånd. I fraktion 5 forventes der især at kunne ses nogle af koagulationsfaktorerne. Båndet ved 62 kda eller båndet ved 58 kda kan muligvis være faktor X, da den har en molekylvægt på 59 kda. Samtidig er det muligt, at båndet ved 58 kda også kan være faktor IX, som har en molekylvægt på 57 kda. Båndet ved 45 kda er måske faktor III og faktor VII, som har molekylvægte på henholdsvis 43 kda og 45,5 kda. Koncentrationerne af alle koagulationsfaktorerne er meget små, og derfor giver det god mening, at man næsten ikke kan se båndene i fortyndingen 1:9. Båndet ved 18,4 kda er muligvis IgE, da den er del af koagulationen. De resterende bånd er beliggende på omkring 100 kda, 52 kda, 38 kda, 33 kda, 24 kda, og 14,4 kda, og det er umiddelbart ikke afklaret hvilke proteiner, båndene kan indeholde. Dog er det muligt, at båndene består af aktiverede koagulationsfaktorer, da fraktion 5 er koaguleret. Det er samtidig en væsentlig pointe, at molekylvægtene og koncentrationerne, der er beskrevet for de forskellige koagulationsfaktorer, er for de inaktive former. Det er således muligt, at koncentrationen af de aktiverede faktorer er højere, når vi udelukkende taler om koagulatet. Dette er umiddelbart meget sandsynligt og kan muligvis forklare, hvorfor der ses så mange forskellige bånd i fraktion 5. 57

64 11.0 Konklusion Litteraturstudiet har resulteret i et indblik i sygdommen hæmofili, og sygdommens indvirking på blødere. Ligeledes er behandlingsmulighederne gennem tiden blevet diskuteret; både ud fra deres effektivitet samt de konsekvenser, de medfører for den enkelte bløder. Det kan konkluderes, at den nuværende behandling har gjort livet som bløder væsentlig bedre. Mens man for 100 år siden kun havde en forventet levetid på 6-7 år, kan blødere i dag næsten leve livet som alle andre med lige muligheder for at leve et langt liv ligesom Aage. Ydermere har litteraturstudiet bidraget med en viden, der har lagt grundlaget for at udføre forsøg med blodets bestanddele samt erhverve viden herfra. Forsøgene med blodets bestanddele har resulteret i et indblik i, hvordan undersøgelser af blodet kan udføres. Dette har givet et indblik i, hvor langt teori kan være fra praksis, da der ikke altid ses det forventede. Dette har gjort sig gældende både i blodudstrygningerne og SDS-PAGE. Resultaterne fra blodudstrygningerne med fuldblod og fraktioner har givet en ide, om mængden af blodets forskellige bestanddele. Der er ingen tvivl om, at det store antal af erytrocytter i blodet eller deres bikonkave struktur er til stede. Leukocytterne er rigt repræsenteret med undtagelse af den basofile granolucyt. Dog er Giemsa-farvningen her ikke oplevet som forventet, da flere af cellerne afveg i farverne i forhold til teorien. Ligeledes er det blevet gjort klart, hvor lidt et todimensionelt billede kan fortælle om proteiner samt hvor uendeligt mange proteiner, der findes i menneskekroppen. Metoden SDS-PAGE er med til at give en ide om forskellige proteiners størrelse i blodet, men man har ikke ud fra metoden mulighed for at undersøge størrelsen på et konkret protein, eller bestemme hvilke proteiner, der er til stede. 58

65 12.0 Perspektivering Det er i dag muligt at bestemme et proteins størrelse eller finde et specifikt protein i eksempelvis blodet. Før i tiden blev der benyttet en metode kaldet Edman-degradering, hvori man spalter en mindre del af aminosyrer fra et udvalgt protein. En ad gangen bliver aminosyrerne fraspaltet og derefter bestemt. Når aminosyrerne kendes, kan den opnåede aminosyresekvens sammenholdes med de dengang få kendte sekvenser i databaser. Edman-degradering er en ældre metode, der er besværlig og langsommelig, og i dag findes der også langt bedre og hurtigere metoder til karakterisering af proteiner (Rindom Nørrelykke 2005). I dag findes der en masse data tilgængelige om sekvensering af proteinsekvenser, hvilket gør arbejdet med karakterisering af proteiner en del nemmere. Kombinerer man sekvensdatabaser med massespektrometri går arbejdet betydeligt hurtigere (Rindom Nørrelykke 2005). Massespektrometri er en metode til at bestemme molekylers masse og kemiske struktur (Roepstorff 2009). Men før massespektrometeret anvendes, skal proteinerne separeres via todimensional-gelelektroforese (2DE). 2DE er en kombination af isoelektrisk fokusering (IEF) og gelelektroforese (SDS-PAGE). Ved 2DE separerer IEF proteinerne på deres isoelektriske punkter (pi), og derefter separeres proteinerne på deres størrelse ved hjælp af SDS-PAGE (Kielberg, Rasmussen 2010). Proteinerne bliver altså delt efter både ladning og størrelse, og det er herefter muligt at tage et udsnit af gelen og anvende i et massespektrometer. Første punkt for massespektrometri er at lave en enzymatisk spaltning af et protein til peptider. Man ønsker at opnå peptider med en ensartet størrelse på omkring 7-15 aminosyrer. De ensartede peptider kan nu analyseres i spektrometeret. Dette kan forløbe på to måder. MALDI (matrix assisted laser desorption) ioniserer peptiderne ved en beskydning med en laserstråle, hvorefter de detekteres (Rindom Nørrelykke 2005). Ved ESI (elektrosprayionisering) bliver peptiderne tilføjes i en væskefase og ioniseres i spændingsfelt, der på grund af spændingen danner væsken mikroskopiske dråber, der medfører frigivelse af en gas af peptider (Song, Dyrberg Rand 2012). Forskellen på MALDI og ESI er, at MALDI kun fortæller om peptidernes størrelse, hvor ESI kan fortælle om rækkefølgen af aminosyrer i de enkelte peptider. Ved hjælp af den opnåede viden omkring aminosyrerækkefølgen, kan man finde frem det bestemte protein via en sekvensdatabase (Rindom Nørrelykke 2005). 59

66 13.0 Litteraturliste AGGER, R., Immunologi. Kbh. : Munksgaard Danmark. BLODERFORENINGEN.DK, 2014-last update, Danmarks Bløderforening. Available: [3/20/2014, 2014]. BLØDERFORENINGEN.DK, Bloderforeningen.dk, 2014, 1(1), pp. Blødersygdom-Livet med blødersygdom. CAPRETTE, D.R., , 2012-last update, Experimental Biosciences Resources [Homepage of Rice University], [Online]. Available: [ , 2014]. DUNNING, K. and SAFO, A.O., The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission, 86(2), pp GENESER, F., Histologi : på molekylærbiologisk grundlag / Finn Geneser. In: F. GENESER, ed, 1, 10 edn. Kbh. : Munksgaard Danmark, pp GREVE, B., Sociologi; Modul 3: Det danske samfund - i sociologisk betydning. Bent Greve, Anja Jørgensen, Jørgen Elm Jensen;, 1(1), pp , 80, 81,. GRUNNETS, 2009-last update, Niels Grunnet - proteiner [Homepage of Gyldendal], [Online]. Available: okemi/proteiner2014]. HALL, J.E. and GUYTON, A.C., Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. In: J.E. HALL, ed, 12. ed. edn. Philadelphia, Pa. : Saunders, pp HAUGAARD NIELSEN, R., Hæmofili - Blødernes lange rejse. In: L. PENTER MADSEN, ed, Det medicinerede menneske : lægemiddelrelaterede, tværfaglige udfordringer for biologi og kemi i gymnasiet / forfatterne bag udarbejdelsen... er: Lise Penter Madsen, Rolf Haugaard Nielsen. 2. udg. edn. Kbh. : Danmarks Farmaceutiske Universitet, pp HVIDTFELDT, Blødersygdomme (hæmofili A og B). Hvildfeldt, Lone, Netdocktor.dk, 2013, 1(1), pp. 1- KIELBERG, V. and RASMUSSEN, L., D Elektroforese. Proteiner - oprensning og karakterisering, 4. edn. Gyldendahl, pp

67 LIETH, L., Anatomi og fysiologi. 4. udgave, 1.opslag edn. København 2009: Munksgaard Danmark. NATH, J.L. and BARTHOLOMEW, E.F., Fundamentals of Anatomy & Physiology. In: F.H. MARTINI, ed, 9. ed. edn. Boston, Mass. : Pearson, pp , 656, RINDOM NØRRELYKKE, S., Beck, Proteinkarakterisering ved massespektrometri - fra fødevarer til kræftforskning. Mette Rindom Nørrelykke, Hans Peter Sørensen og Hans Christian Beck, Dansk Kemi, 86(9), pp ROEPSTORFF, P., 05/02/09, 2009-last update, Massespektrometri [Homepage of Gyldendahl], [Online]. Available: etri [15/05/14, 2014]. SAND, O., Menneskets anatomi og fysiologi / Olav Sand... et al.]. 2. udg. edn. Kbh. : Gad. SELIGMAN, M.E.P., What Is The Good Life. 29(10), pp. 1-2,3. SIGMA-ALDRICH, (1), pp. 1-2,3. SINGH, S. and TIWARI, V., Competition Science Vision - Circulation in Mammals. Oct- 2008(1), pp SONG, H. and DYRBERG RAND, K., 2012-last update, Massespektrometri viser vejen til forbedrede proteinlægemidler [Homepage of Københavns Universitet], [Online]. Available: [15/05/14, 2014]. SPRINGBORG, A., Anatomi og fysiologi : ind under huden / Oluf Nielsen og Anni Springborg. In: O. NIELSEN, ed, 2. udg. edn. Kbh. : Munksgaard Danmark, pp. 64. SUNDHED.DK, 2009-last update, Sundhed.dk - Blodprøver. Available: SUNDHEDSGUIDEN.DK, 2014-last update, Sundhedsguiden.dk - Hæmofili (Blødersygdom). Available: [4/29/2014, 2014]. TRANUM-JENSEN, 2014-last update, Jørgen Tranum-Jensen; <br />mikroskop [Homepage of Gyldendal], [Online]. Available: en_histologi/mikroskop [ , 2014]. 61

68 TYMOCZKO, J.L. and STRYER, L., Biochemistry. In: J.M. BERG, ed, Biochemistry. International edition edn. New York, N.Y. : Macmillan, pp , VIDENSKAB.DK, 2014-last update, Hvordan får vi det gode liv? Videnskab.dk [Homepage of Videnskab.dk], [Online]. Available: [4/8/2014, 2014]. WADSWORTH.ORG, 2014-last update, Through the Microscope: Blood Cells [Homepage of New York State Department Of Health], [Online]. Available: [13/05/14, 2014]. WOLFRAMALPHA.COM, 2014-last update, Available: 62

69 Bilag A: Journal Buffer 250 mm CaCl 2 2,7745 g til 100 ml vand. Vi afvejede 2,7757g CaCl2. Der påfyldes vand til de 100 ml på den konisk målekolbe. Øvre tris 12,11g til 200 ml. Der afvejes 12,1091g Ultrapure tris. Kniv spids bromphenolblå afvejes til 0,003g. Det tilsættes i 200 ml målekolbe med demineraliseret vand. Der bruges ph-meter til at indstille ph til 6,8 ved at bruge 1 M HCl (der skulle meget til). Efter at ph er indstillet på fyldes vandt til de 200 ml. Nedre tris Der afvejes 36,342g Ultrapure tris, i en 200 ml målekolbe, hvor der kommer demineraliseret vand i, så man kan opløse stoffet. Der buges ph-meter til at indstille ph til 8,9. Her buges HCl 1 M (igen skulle der meget til). Herefter påfyldes vand til, der er 200 ml. PBS Der afvejes: - 8,0155g af NaCl - 3,1235g af H2NaO4P - 0,2287g af KCl Puttes i en 100 ml konisk målekolbe, og tilsættes demineraliseret vand. ph indstilles til 7 med NaOH 4M. 10 % SDS 100 ml fremstillet ud fra: 10,0022 g SDS Demineraliseret vand tilføjet, indtil 100 ml volumen var opnået. 10 % Ammonium persulfat (APS): 10 ml fremstillet ud fra: 63

70 1,0067 g 10 % Ammonium persulfat Demineraliseret vand tilføjet, indtil 10 ml volumen var opnået. Overlay buffer 100 ml fremstillet ud fra: 10 ml 10 % SDS opløsning Demineraliseret vand tilføjet, indtil 100 ml volumen var opnået. Denaturerings buffer: 100 ml fremstillet ud fra: 0,6077 g 50 mm TrisHCl 48,0476 g 8 M Urea 0,8746 g 150 mm NaCl Demineraliseret vand tilføjet, indtil 100 ml volumen var opnået. Dagen hvor bufferen bruges, blev der tilsat: 0,7738 g 50 mm DDT 5x SDS-PAGE Running buffer 1000 ml fremstillet ud fra: 14,5637 g 120 mm Trisbase 75,1601 g 1 M glycin 5,0013 g 0,5 % SDS Blodudstrygning Fingerspidsen sprittes af. Med en kanyle prikkes hul, så der kan placeres en dråbe blod på glaspladen. Et andet stykke glas bruges til udstrygning af blodet. Dette gøres to gange, da der både skal bruges en der farves med Giemsa. Efter udstrygningen er tørret, farves den ene udstrygning med Giemsa i stinkskabet i 30 sekunder. Herefter 3 minutter i demineraliseret vand, for at til sidst at skylle af med demineraliseret vand. De skal tørre i 10 minutter. Mikroskopet indstilles med 100x først, og her efter 400x. Her tages der billeder af blodpladerne. 64

71 Centrifugering Man tager 3 ml blod og 2 ml PSB buffer i et blucap rør. Røret rystes. I et andet blucap rør tilsættes 5mL Histopaque. Oven på Histopaque lægges blodet med PBS i. Undgå, at det blander sig sammen. (Dette kan dog ikke undgås 100%). Herefter skal prøven centrifugeres og der skal være ligevægt, når man centrifugerer. En vandprøve vejes til samme vægt som vores blod. Prøven centrifugeres i 30 minutter ved halv acceleration og med halv bremse ved 24 grader. Når prøven kommer ud er den delt i lag. Den øverste er plasma, båndet er monocytter og lymfocytter, og den sidste er erytrocytter. Der gemmes i blucap rør og eppendorf rør fra alle lag til videre forsøg. Udstrygning af forskellige fraktioner Af de tre fraktioner bruges en dråbe fra hver til en udstrygning som i 2. En dråbe af plasma udstryges, en dråbe af erytrocytter udstryges, en dråbe af monocytter og en dråbe lympocytter udstryges. Efter de er tørret, skal de farves i stinkskabet. Glasset holdes i Giemsa farven i 30 sekunder og derefter 3 minutter i demineraliseret vand. Herefter skylles de i demineraliseret vand og tørre i 10 minutter. Her bruges mikroskopet til at kigge 100x gange på cellerne og derefter 400x på cellerne. Koagulation af plasma Der pipetteres 900μL plasma over i et eppendorfrør Oven i tilsættes der 100 μl 250 mm CaCl2. Det skal stå i 10 minutter ved stuetemperatur. Herefter skal det centrifugeres ved 14000rpm i 5 minutter ved stuetemperatur. Alt på nær pellet suges op af eppendorfrøret. Pellet vaskes af tre gange med PBS buffer af 500 μl. Det suges op for hver gang, det er blevet skyllet. Begge prøver puttes på is, så de er klar til SDS page. SDS Gel Først vaskes glaspladerne af med ethanol. De samles, så de er klar, når bufferen er blandet. Først blandes separationsgelen i bluecap rør. - 7 ml H2O 65

72 - 4,8 ml Nedre tris μl 10 % SDS Acrylamide/bis er giftig (kræftfremkaldende), så det sidste skal blandes i stinkskabe. - 7,6 ml Acrylaamide/bis - 20 μltemed μl APS 20 % o APS er lavet 10 % stærkere og der er kommet dobbelt så meget i. Blucap røret vendes rund, så det bliver blandet sammen. Nu skal gelen på hældes i glaspladerne. Det gøres med en enegangspipette. Dog kun ca. 3 cm fra toppen. Da der skal være plads til stackinggelen når det er størknet. Efter separationsgelen er kommet i glaspladerne, hæles der overlay buffer på til toppen. Resten af gelen bliver stående ved siden af i en engangspipette, så man 15 min efter kan teste, om gelen er størknet. Når gelen er størknet, helles overlay bufferen af og stackinggelen blandes. Stackinggel blandes i bluecap rør - 5,4 ml H2O - 2,4 ml øvre tris μl 10 % SDS Resten blandes i stinkskab. - 1,4 ml acrylamid/bis - 11,5 μl Temed - 60 μl APS 20 % Bluecap røret vendes rundt, og stackinggelen tilsættes på separationsgelen og kammen vippes på plads. Her lader man igen gelen stå ved siden af med engangspipette, så man kan teste, om den er størknet. Vores fraktioner tages op af fryseren og når de er tøet op, puttes de på is. 66

73 Når gelen størkner, pilles gelen ud sammen med glasset sættes den i karet(med strøm), hvor der hældes running buffer i på begge sider. Running bufferen skal kun hældes i til kanten for, hvis den kommer over gelen, vil strømmen kunne hoppe over i stedet for igennem gelen. Der kommer i brøndene 15 μl af hver af de 5 fraktioner i. - Fraktion 1 er meget tyk, så vi blander 15μL loading buffer i. I den 6. brønd kommer der en markør i. Der sendes 80 V gennem gelen i 10 minutter. Således, at det der er kommet i brønden, ligger sig. Når det har lagt sig, sendes der 120 V gennem gelen i ca. 30 minutter, mens der holdes øje med gelen således at, proteinet ikke løber ud af gelen. Når gelen er færdig med at løbe, tages de op og glaspladen vippes af forsigtigt. Med en skalpel ligges et snit langs glaspladens kant, så man kan få gelen af. Der kommer Stain på gelen og det komme i mikroovnen i mindre end 1 minut. Herefter stilles gelen på en rotations plades med Stainen i 20 minutter. Derefter af hældes Stain i opsamlingskar og skylles med demineraliseret vand. Herefter skal der Destain over gelen og et stykke papir, da det kan suge en del af den blå farve. 67