Elucigene CF-EU2v1 Vejledning til analysesoftware

` Elucigene CF-EU2v1 Vejledning til analysesoftware Fremstillet af Gen-Probe Life Sciences Ltd. Heron House Oaks Business Park Crewe Road Wythenshawe Manchester M23 9HZ For salgsafdeling, kundeservice og teknisk support: T: +49 (0) 6122 7076451 F: +49 (0) 6122 7076155 E: eucustomerservice@hologic.com E: eutechnicalsupport@hologic.com CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 1 af 37

GeneMapper-analyse Indledning Nedenstående afsnit beskriver procedurerne til prøveanalyse af Elucigene CF-EU2v1- resultater med Applied Biosystems GeneMapper softwarepakker (version 3.7 eller nyere). Analyseproces Processen til analyse af prøver er opsummeret i nedenstående diagram. Kør amplificerede prøver på den genetiske analysator Åbn GeneMapper-software Tilføj prøve-fsa-filer til projekt Indstil Analysis Method (analysemetode) og Size Standard (størrelsesstandard) til CF-EU2v1 Vælg de korrekte blandingspaneler Kør prøveanalyse Gem projekt Vælg prøve og åbn Plot Window (plotvinduet) Gennemse spor- og genotypedata Udregn prøvens genotyper Udskriv Elucigene CF-EU2v1-prøvespor CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 2 af 37

GeneMapper Åbn GeneMapper programfilen og importer de nødvendige fsa-filer ved at klikke på knappen add samples to project (tilføj prøver til projekt) ( ). Gå til den ønskede Run Folder (kørselsmappe) på mappetræet til venstre på vinduet. Vælg mappen og klik på knappen Add to List >> (tilføj til liste). Kørselsmappen vil nu blive vist i vinduet med prøver, der skal tilføjes. Dobbeltklikker man på kørselsmappens ikon i dette vindue vises de FSA-filer, der skal importeres (figur 1). Fig 1: Prøverne er blevet tilføjet til listen og kan nu tilføjes til projektet. Prøverne tilføjes derefter ved at klikke på knappen Add (tilføj) ( ). Import af CF-EU2v1 GeneMapper-analyseindstillinger i GeneMapper Manager Det er nødvendigt at importere CF-EU2v1-indstillingerne for GeneMapper. Denne proces kontrolleres via grænsefladen GeneMapper Manager (GeneMapper-styring). CF-EU2v1 GeneMapper-indstillingerne kan findes på Gen-Probes hjemmeside: www.gen-probe.com. Disse skal downloades til en korrekt mappe på brugerens system. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 3 af 37

1. Åbn programmet GeneMapper Manager (GeneMapper-styring) ved at klikke på ikonet (figur 2 og 3). Fig 2: Åbning af GeneMapper Manager. Fig 3: Grænsefladen for GeneMapper Manager. 2. Vælg fanen Analysis Methods (analysemetoder), og klik derefter på knappen Import (importer). 3. Gå til og importer den/de nødvendige CFEU2-analyseindstillingsfil(er): 3130 eller 3500 (figur 4). CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 4 af 37

Figur 4: Import af Analysis Methods (analysemetoder). 4. Gentag processen, vælg den relevante fane og importer de tilsvarende filer for: Tabel Settings (tabelindstillinger) Plot Settings (plotindstillinger) Size Standards (størrelsesstandarder) Bemærk: Det er ikke nødvendigt at importere filer for Cluster Plot Settings (gruppeplotindstillinger), Matrices (matricer), SNP Sets (SNP-sæt) og Report Settings (rapportindstillinger). Import af CF-EU2v1-panelindstillinger i Panel Manager Det er nødvendigt at importere CF-EU2v1-panelindstillinger for GeneMapper. Denne proces kontrolleres via grænsefladen Panel Manager (panelstyring). 1. Åbn programmet Panel Manager (panelstyring) i GeneMapper ved at klikke på ikonet. 2. Klik på Panel Manager (panelstyring) på venstre navigationsvindue. Panelstyring vil nu fremstå markeret i blåt. 3. Vælg File/Import Panels (gem/importer paneler). Gå til og importer panelfilen CFEU2 GeneMapper Panels.txt (figur 5). 4. Klik på CFEU2 panel (CFEU2-panel) på venstre navigationsvindue. CF-EU2v1- panelet vil nu fremstå markeret i blåt. 5. Vælg File/Import Bin Set (gem/importer 'bin' sæt). Gå til og importer 'bin' filen CFEU2 GeneMapper Bins.txt (figur 6). 6. Klik på Apply (anvend), og klik derefter på OK. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 5 af 37

Fig 5: Import af filen CFEU2 Panel. Fig 6: Import af filen CFEU2 Bin Set. Ændring af filen Analysis Parameter (analyseparameter) Det kan være nødvendigt at ændre de standard Analysis Ranges (analyseområder) i CF-EU2v1-analyseindstillingerne sådan, at de passer til jeres forhold under kørslen. Minimumsanalyseområdet vil afhænge af de kapillærer og polymer, der anvendes i forbindelse med dataindsamlingen. Få vist de aktuelle analyseindstillinger: 1. Åbn GeneMapper Manager (GeneMapper-styring). 2. Vælg fanen Analysis Methods (analysemetoder). Den importerede CF-EU2v1-fil vil stå anført som CFEU2 Analysis Method (CFEU2-analysemetode). 3. Klik på CFEU2 Analysis Method (CFEU2-analysemetode). Linjen vil nu fremstå markeret. 4. Klik på knappen Open (åbn) og vælg fanen Peak Detector (spidsdetektor) (figur 7). Analyseområderne er som standard sat til at starte ved 1600 og slutte ved 8000. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 6 af 37

Fig 7: Analyseområderne (fremhævet). Sådan findes det korrekte analyseområde for jeres laboratorium: 1. Dobbeltklik i hovedvinduet i GeneMapper på den importerede Run Folder (kørselsmappe) for at se en liste over de fsa-filer, der findes i mappen. 2. Vælg en fsa-fil. 3. Klikker man på fanen Raw data (rådata) vises elektroferogrammet med rådata. 4. Brug 100 bp GS600v2 LIZ-spidsen (orange) som guide, og bestem et datapunkt, der er ca. 100 datapunkter mindre (figur 8). CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 7 af 37

Fig 8: Sådan findes minimumsområdet ved hjælp af prøvens rådata. 5. Sørg for, at det maksimale analyseområde giver plads nok til ca. 100 datapunkter efter 600 bp GS600v2 LIZ-spidsen. 6. Indlæs de nye værdier i CF-EU2v1-analysefilen (der opnås adgang som ovenfor beskrevet). Det kan også blive nødvendigt at ændre Peak Amplitude Thresholds (spidsamplitudegrænsen) afhængig af prøvekoncentrationen. Meget stærke prøver vil have et højt niveau af baggrund, hvilket kan interfere med analysen. For at undgå dette kan grænsen for spidsamplituden øges. For eksempel kan det grønne farvestof indstilles til 100 i stedet for 50. Det vil igen være under fanen Peak Detector (spidsdetektor) i CFEU2 Analysis method (CFEU2-analysemetode) (figur 7). Analyse og genotypebestemmelse af importerede CF-EU2v1-filer 1. Vælg i hovedvinduet i GeneMapper CFEU2 Table Settings (CFEU2-tabelindstillinger) (figur 9). Fig 9: Brug rullemenuen til at vælge CFEU2-tabelindstillingerne. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 8 af 37

2. Vælg på hovedvinduet i GeneMapper den første celle under Analysis Method (analysemetode) og vælg den korrekte analysemetode fra rullemenuen: enten CFEU2_3130 eller CFEU2_3500. Gentag processen for størrelsesstandarden, vælg CFEU2 size standard (CFEU2-størrelsesstandard) på rullemenuen. 3. Vælg panelet CFEU2 for hver prøve (figur 10). Vælg for A-blandingen det underpanel, der indeholder A-blandingen og vælg for B-blandingen det underpanel, der indeholder B-blandingen. 4. Klik på for at starte prøveanalysen. Fig 10: Valg af CFEU2-panelindstillingerne. Gennemgang af CF-EU2v1-spor og genotypedata 1. Vælg Edit/Sort (redigér/sortér). Sortér prøverne ifølge Sample Name (prøvenavn) og klik på OK. 2. Klik på for at Display Plots (vis plot). 3. Brug rullemenuen til at vælge de korrekte CF-EU2v1-plotindstillinger: For at få vist A-blandingen med Poly T-data, vælg: CFEU2 Plot PT-on For at få vist A-blandingen uden Poly T-data, vælg: CFEU2 Plot PT-off CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 9 af 37

Fig 11: Brug rullemenuen til at vælge CFEU2-plotindstillingerne. 4. Plotvinduet vil vise prøvens spordata (figur 12). 5. Det anbefales at plotvinduet har Single click editing (étkliksredigering) aktiveret. Det gøres ved at vælge Alleles/set click editing (Alleler/indstil klikredigering), og kontrollere at denne mulighed er valgt. Fig 12: Vinduet Sample Plot (prøveplot), der viser de mærkede spordata. Elucigene CF-EU2v1 A-blanding Elucigene CF-EU2v1 B-blanding Scoring af diagnostiske spidser En person har to kopier af CFTR-genet. Hvis disse kopier har samme sekvens for et vilkårligt allel, beskrives en person som homozygot på dette sted. Hvis kopierne er forskellige i sekvens for et givent allel, beskrives personen som værende heterozygot (figur 13). Det er A-blandingen (mutant), der bestemmer hvorvidt en person er bærer af en mutation, og dette vises med en blå spids. Mutantblandingen indeholder også primere til det normale F508del-allel, og derfor kan denne blanding bestemme hvorvidt en person er normal for F508del (kun grøn spids), homozygot for F508del (kun blå spids) eller heterozygot for F508del (blå og grøn spids). CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 10 af 37

Hvis der observeres en anden mutation, kan prøven forstærkes med B-blandingen (WT) til påvisning af homozygot eller heterozygot status. Tilstedeværelsen af en grøn spids for det specifikke allel i WT-blandingen indikerer at personen er heterozygot. Hvis den grønne spids mangler, indikerer det at personen er homozygot for denne specifikke mutation. Fig 13: Eksempler på personer a) normale, b) heterozygote og c) homozygote for 711+1G>T-allelet. A B C CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 11 af 37

En person, som er bærer af to forskellige mutationer, betegnes som en sammensat heterozygot (figur 14). A Fig 14: Eksempler på sammensatte heterozygote prøver. A) G85E/D1152H B) F508del/E60X. B Der er inkluderet to hypervariable STR-markører (røde) i begge blandinger. Dette muliggør sammenligning af den forstærkede prøve med mutantblandingen og den forstærkede prøve med WT-blandingen for at reducere muligheden for, at der er taget fejl af prøverne (figur 15). Mangel på disse STR-markører indikerer en fejlslagen prøve. Tilstedeværelsen af STR-markørerne ved meget lave rfu'er indikerer en svag prøve, som bør analyseres med forsigtighed. Fig 15: A-blandings- og B-blandingsplottet viser de to STR-markører for en person. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 12 af 37

De hypervariable STR-markører kan gemmes ved at slå de røde farvestofsdata fra i plotvinduet. Deaktivering af de blå og grønne farvestofsdata vil gøre det nemmere at se STR-markørerne. GeneMapper markørbetegnelse Ved gennemsyn af analyserede spordata i GeneMapper, vil diagnostiske spidser blive mærket med markørens navn og nummer. Diagnostiske spidser i B-blandingen vil kun blive mærket med markørens nummer. Spidsdata for en mærket, detekteret markør kan yderligere undersøges ved at hvile musemarkøren over markørmærket af interesse, hvorefter markørens navn, spidsens størrelse og spidsens højde vises nederst på prøveplotvinduet. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 13 af 37

Korrelationen mellem markørnumrene og markørerne kan ses nedenfor. Detekterede markører Markør nr. Markør Produkt-bp - størrelsesområde (3130/POP7-data) 01 R347H 110.5-116.5 02 R347P 117-123 03 2789+5 G>A 124-130 04 3120+1 G>A 132.5-138.5 05 711+1 G>T 141.5-147.5 06 R334W 147.5-154 07 I507del 156-162.5 08 F508del 163-169 09 3849+10kb C>T 172-178 10 1677delTA 180-188.5 11 1078delT 193-199 12 V520F 206-211.5 13 L206W 215-220 14 W1282X 224.5-230.5 15 R560T 234.5-240.5 16 2347delG 242-246 17 Q890X 250-252 18 R553X 255.5-261.5 19 G551D 265-267 20 S549R(T>G) 267.5-269.5 21 S549N 275-280 22 M1101K 282-288 23 G542X 289-295.5 24 3905insT 297-303.5 25 Y1092X(C>A) 308-314 26 S1251N 315-321 27 444delA 323-326 28 1811+1.6kb A>G 332-338 29 1717-1 G>A 341.5-347.5 30 R117H 349-355 31 R117C 357-360 32 N1303K 360-366.5 33 Y122X 367-373 34 394delTT 377-383 35 G85E 384-390 36 R1066C 391-397 37 1898+1 G>A 398.5-404.5 38 W846X 406-411 39 2184delA 413-418 40 D1152H 423-429 41 CFTRdel2_3 433-439 42 P67L 439.5-445.5 43 2143delT 446-450.5 44 E60X 453.5-460.5 45 3659delC 461-465.5 46 3272 470-476 47 621+1G 485.5-491.5 48 A455E 496-503 49 R1162X 506-512 50 R1158X 516.5-524.5 5T* IVS8-5T 110-130 7T IVS8-7T 140-160 9T IVS8-9T 175-195 CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 14 af 37

* 5T-allelstørrelse Markør Produkt-bp-størrelse Område POP7/3130 5T (9) 117,25 118,75 5T (10) 119,25 120,75 5T (11) 121,25 122,75 5T (12) 123,25 124,75 5T (13) 125,25 126,75 Bemærk: Størrelsersområderne for hver markør kan variere afhængig af det anvendte instrument og polymer. CF-EU2v1 di507del-markør Det er, grundet placeringen af I507-fjernelsen i CFTR-genet muligt at detektere tilstedeværelsen af denne markør gennem et 3 bp-skift i størrelsen af F508del-spidsen, samt som en I507del mutant specifik spids. Der hvor der er et enkelt I507del mutant allel tilstede, vil I507del mutantens spids kunne ses som en blå spids ved ca. 159 bp. Der observeres en vildtype spids for F508del som værende tilstede, men på omkring halvdelen af den spidshøjde, der almindeligvis er forbundet med en homozygot vildtype genotype. Dette ses som en grøn spids ved omkring 167 bp. Der vil derudover også ses en grøn spids ved omkring 164 bp (figur 16). Fig 16: I507del heterozygot prove. En I507del/F508del-prøve vil give en skiftet grøn F508del WT-spids ved ca. 164 bp (3 bp mindre end normalt), en blå F508del mutant spids ved 166 bp og en blå I507del mutant spids ved omkring 159 bp. En I507del/I507del-prøve vil give en blå spids ved ca. 159 bp og en enkel grøn spids ved ca.164 bp (3 bp mindre end den normale F508del-spids, der observeres når I507del ikke er tilstede). Vær opmærksom på at forekomsten af en F508del-mutation forhindrer I507 WTprimeren i at virke. En person, der er homozygot for F508del, vil derfor ikke have nogen I507 WT-spids i WT-blandingen, og en person, der er heterozygot for F508del, vil have en mindre høj I507 WT-spids i WT-blandingen. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 15 af 37

Poly-T-markører Elucigene CF-EU2v1 indeholder NED (gul) mærkede fluorescens ARMS-primere til detektion af IVS8-5T-, IVS8-7T- og IVS8-9T-varianter. Poly-T-oplysninger om en prøve kan bestemmes ved at aktivere visualiseringen af de gule farvestofsdata i GeneMapper CF-EU2v1-indstillingerne. Operatøren kan derfor vælge at få vist disse data, om nødvendigt, under testproceduren i laboratoriet. Bemærk: Der er ikke nogen Poly-T-primere i B-blandingen, og produkterne kan derfor kun ses i A-blandingens prøver. Poly-T-analyse Nedenstående GeneMapper-eksempler viser spidsmorfologikarakteristika for de IVS8- variant-regioner, der testes. Eksempel 1: IVS8-5T/IVS8-9T-prøve Nedenstående eksempel viser A-blandingens resultat, som observeres under brug af CFEU2 Plot PT-on -plotindstillingerne. Hvis de grønne og blå farveoplysninger fjernes fra plotindstillingerne for samme prøve, vises Poly-T-markøren klart, som vist nedenfor. Eksempel 2: IVS8-7T/IVS8-7T-prøve CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 16 af 37

Eksempel 3: IVS8-7T / IVS8-7T-prøven (TG gentagelsesvariabilitet) De to spidser skyldes heterozygositeten af TG-gentagelsesregionen, som er inden for vores amplikon. Denne effekt kan også observeres med 5T og 9T homozygotprøverne. Der er derfor muligt at påvise antallet af TG-gentagelser inden for hver IVS8- polythymidinvariant. Eksempel 4: IVS8-9T/IVS8-9T-prøve Vigtig meddelelse Under visse analyseforhold er det muligt at observerbare farvestofsartefakter kan forstyrre rutineanalysen. Det er vigtigt at brugeren er opmærksom på eventuel interferens for at sikre korrekt dataanalyse. Der kan observeres mærkede farvestofartefakter i form af små blå eller grønne spidser. Disse farvestofsartefakter er generelt mindre end 100 bp i størrelse og vil almindeligvis ikke interferere med dataanalysen. Under normale forhold er disse artefaktspidser ubetydelige i forhold til de sande amplikonspidser og forårsager ikke nogen problemer med analysen. Men når mængden af anvendt amplikon er lille, eventuelt på grund af begrænsende genomisk DNA, virker farvestofsartefaktspidserne større og kan potentielt analyseres som sande amplikonspidser. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 17 af 37

GeneMarker analyse Indledning Nedenstående afsnit beskriver procedurerne til prøveanalyse af Elucigene CF-EU2v1- resultaterne med SoftGenetics GeneMarker, V1.95 softwarepakken. Analyseproces Processen til analyse af prøver er opsummeret i nedenstående diagram. Kør amplificerede prøver på den genetiske analysator Åbn GeneMarker-software Tilføj prøve-fsa-filer til projekt Vælg det korrekte CF-EU2v1-panel og analyseindstillinger Kør prøveanalyse Vælg programmet: ARMS/Comparative Analysis (ARMS/komparativ analyse) Vælg Mutant + Wild-type (mutant og vildtype) eller Mutant Only (kun mutant) Vælg Print (udskriv) Vælg Preview (vis) CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 18 af 37

Tilføjelse af prøvefiler til GeneMaker Åbn programfilen GeneMarker og vælg, når der bedes om det, Open Data (åbn data). Boksen Open Data Files (Åbn datafiler) vises. Klik på knappen Add (tilføj). Dialogen Open (åbn) vises. Gå til den mappe, der indeholder rådatafilerne Vælg alle filerne med CTRL+A eller brug tasten CTRL og/eller SHIFT for at vælge individuelle prøver Klik på knappen Open (åbn) i dialogen Open (åbn). De valgte filer vises i feltet Data File List (datafilliste) (figur 1). Klik på knappen OK i vinduet Open Data Files (åbne datafiler) og prøverne overføres til GeneMaker. Softwaren vil derefter automatisk åbne vinduet Raw Data Analysis (Analyse af rådata) (figur 2). Fig 1: Prøverne tilføjet til listen Data File (datafil). CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 19 af 37

Fig 2: Vinduet Raw Data Analysis (analyse af rådata). Prøvetræ Syntetisk gelbillede Rådataspor Behandling af data Når filerne med rådata er blevet uploaded til GeneMaker, er de klar til at blive behandlet. Behandlingstrinnet inkluder anvendelsen af en størrelsesstandard, filtrering af støjspidser og om ønsket, sammenligning til et kendt allelpanel. GeneMaker kombinerer alle disse trin i ét simpelt værktøj, der kaldes Run Wizard (kørselsprogram) (figur 3). Kørselsprogrammet åbnes ved at klikke på ikonet Run Project (kør projekt) i hovedværktøjslinjen. Fig 3: Run Wizard (kørselsprogram) - vinduet Template Selection (valg af skabelon). CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 20 af 37

Run Wizard (kørselsprogram) - vinduet Template Selection (valg af skabelon) Opret en CF-EU2v1-skabelon og vælg de korrekte indstillinger for Size Standard (størrelsesstandard), Standard Colour (standardfarve) og Analysis Type (analysetype) (som vist i figur 3). Vælg det korrekte panel afhængig af hvilken platform, der anvendes, f.eks. CF- EU2v1_POP7. Disse kan findes på Gen-Probes hjemmeside: www.gen-probe.com. Disse skal downloades til en korrekt mappe på brugerens system. Klik på Next (næste) for at fortsætte. Run Wizard (kørselsprogram) Data Process (databehandling) Vinduet Data Process (databehandling) i Run Wizard (kørselsprogram) gør det muligt for brugeren at vælge spidsfiltreringsparametre. Sørg for, at indstillingerne er valgt, som vist i figur 4 nedenfor. Klik på Next (næste) for at fortsætte. Fig 4: Run Wizard (kørselsprogram) - Vinduet Data Process (databehandling). BEMÆRK: For 3500-data øg Min Intensity (min. styrke) til 300. Run Wizard (kørselsprogram) - Yderligere indstillinger Der er ikke behov for yderligere indstillinger til en CF-EU2v1-analyse. Klik på OK for at fortsætte. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 21 af 37

Fig 5: Run Wizard (kørselsprogram) - Yderligere indstillinger. Boksen Data Processing (databehandling) Hvis der klikkes OK i boksen Run Wizard Additional Settings (kørselsprogram - yderligere indstillinger), vises boksen Data Processing (databehandling) (figur 6). Rådataene behandles og størrelsesbestemmes, hvorefter filtreringsparametrene anvendes, og det valgte CF-EU2v1-panel anvendes. Klik på OK i boksen Data Processing (databehandling), når analysen er færdig. Fig 6: Boksen Data Processing (databehandling). CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 22 af 37

Hovedanalysevinduet Hovedanalysevinduet (figur 7) i GeneMarker har et brugervenligt layout. Dette layout inkluderer: Prøvefillister - ses til venstre på vinduet. Det syntetiske gelbillede - ses øverst på vinduet. Dataelektroferogrammer - ses under gelbilledet. En rapporttabel - ses til højre på vinduet. Det er i dette vindue vigtigt at kontrollere at alle de rigtige spidser i hver profil er blevet taget med. Dobbeltklik på hver prøve, en ad gangen, i prøvefiltræet på venstre side af skærmbilledet. Højreklik på eventuelle tvivlsomme spidser og vælg en af mulighederne i dialogboksen, f.eks. redigér eller slet allel, bekræft eller afbekræft alt efter hvad, der måtte være relevant. Hvis en spids slet ikke er taget med, fordi den ligger under grænsen, kan der manuelt tildeles et allel. Vælg den korrekte Marker (markør) på rullelisten, mens tasten Shift holdes nede, og højreklik på den pågældende spids, og klik så på Insert Allele (indsæt allel) og derefter på OK. Når A- og B-blandingsdata analyseres sammen, er det vigtigt at sikre, at alle STR-spidserne er taget med. Når denne proces er færdig for alle prøverne, kan den næste del af analysen udføres. Fig 7: Hovedanalysevinduet. Prøvefiltræ Syntetisk gelbillede Elektroferogram Rapporttabel CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 23 af 37

Kun analyse af mutant (A-blandingen) Vælg på hovedanalysevinduet rullelisten Applications (programmer) øverst på skærmbilledet. Vælg ARMS/Comparative Analysis (ARMS/komparativ analyse) og derefter Mutant Only (kun mutant). Vælg Poly-T Analysis (Poly-T-analyse) i dialogboksen ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/komparativ - udskrivningsindstillinger), hvis denne analyse ønskes (figur 8). Klik på Preview (vis) i dialogboksen ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/komparativ - udskrivningsindstillinger) for kun at se rapporten Elucigene CF-EU2v1-mutant (A-blandingen) (figur 11). Operatøren kan på dette vindue gennemse og udskrive hver prøverapport. Klik på OK i dialogboksen ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/komparativ - udskrivningsindstillinger) for kun at udskrive rapporten Elucigene CF-EU2v1-mutant (A-blandingen) (figur 11) uden at gennemse den. Fig 8: Kun mutant - boksen ARMS/Comparative Print Settings Box (ARMS/komparativ -udskrivningsindstillinger). Visning af Elucigene CF-EU2v1-rapporten Rapport over kun mutant (A-blandingen) Klik på Preview (vis) i dialogboksen ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/komparativ - udskrivningsindstillinger) for kun at se rapporten Elucigene CF-EU2v1 A-blanding (figur 11). Operatøren kan på dette vindue gennemse og udskrive hver prøverapport. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 24 af 37

Fig 11: Rapportvinduet for CF-EU2v1 kun mutant (A-blandingen). Rapporten Elucigene CF-EU2v1 inkluderer følgende detaljer: Rapporthoved: Indeholder oplysninger om analyse, projekt, prøve og parametre. Underskriftsfelt: Dato- og initialfelt til dem, der gennemgår rapporten. Elektroferogram: Sammenlignelig med analysevinduet ARMS/Comparative (ARMS/komparativ), viser alle farvestofsfarverne for prøvesporet. Rapporttabel: Hovedtabellen viser alle de mutationer, der er blevet testet for med dette kit. Tilstedeværelsen eller den manglende tilstedeværelse af en mutation indikeres med 1 eller 0. Bemærk, at der kun kan rapporteres fuld zygositetsstatus for F508 locus, når det kun er A-blandingen, der ananlyseres. Den anden tabel viser prøvens Poly-T-status, hvis denne funktion er valgt. Analyse af mutant + vildtype (A og B) blandingen Vælg på hovedanalysevinduet rullelisten Tools (værktøjer) øverst på skærmen og derefter File Name Group Tool (filnavngruppeværktøj). Dette åbner skærmbilledet File Name Group Editor (filnavngrupperedigeringsprogram) Indtast i boksen Compare by Section (sammenlign efter afsnit) nummeret på den kolonne, i hvilken prøvenavnet forekommer. Indtast i boksen Match to Identifier by Section (match med identifikator ifølge sektion) nummeret på den kolonne, i hvilken blandingstypen findes, dvs. A eller B. Indtast A i boksen Control Identifier (kontrolidentifikator). Klik på knappen Match og de prøver, der matcher, vil nu blive vist til højre i dialogboksen (figur 9). CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 25 af 37

Fig 9: Skærmbilledet File Name Group Editor (filnavngrupperedigeringsprogram). Gem den gruppe, der matchede, i en korrekt mappe ved at klikke på ikonet øverst på afsnittet Matched Groups (matchede grupper). Vælg på hovedanalysevinduet rullelisten Applications (programmer) øverst på skærmbilledet. Vælg ARMS/Comparative Analysis (ARMS/komparativ analyse) og derefter Mutant + Wildtype. Vælg i boksen ARMS/Comparative Analysis (ARMS/komparativ analyse) først den relevante Group File (gruppefil), vælg derefter Poly-T Analysis (Poly-Tanalyse), hvis denne analyse ønskes og/eller STR Check (STR-tjek) (figur 10a). Klik så på OK for at se vinduet ARMS/Comparative Analysis (ARMS/komparativ analyse) (figur 10b). Fig 10a: Boksen ARMS/Comparative Analysis Settings (ARMS/komparativ analyse - indstillinger). CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 26 af 37

Fig 10b: Vinduet ARMS/Comparative Analysis (ARMS/komparativ analyse). Gupperede filer Elektroferogrammer Forskelshistogram Rapporttabel Visning af Elucigene CF-EU2v1-rapporten Rapport over mutant + vildtype (A- + B-blandingen) Klik på udskrivningsikonet i vinduet ARMS/Comparative Analysis (ARMS/komparativ analyse). Vælg Poly-T Analysis (Poly-T-analyse) hvis denne analyse ønskes og/eller STR Check (STR-tjek) (figur 12a). Klik på Preview (vis) for at få vist Elucigene CF-EU2v1 A- + B-rapporten (figur 12b). Operatøren kan på dette vindue gennemse og udskrive hver prøverapport. Fig 12a: Boksen ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/komparativ - udskrivningsindstillinger). CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 27 af 37

Fig 12b: Vinduet Rapport over CF-EU2v1 mutant + vildtype (A- + B-blandingen). Rapporten Elucigene CF-EU2v1 inkluderer følgende detaljer: Rapporthoved: Indeholder oplysninger om analyse, projekt, prøve og parametre. Underskriftsfelt: Dato- og initialfelt til dem, der gennemgår rapporten. Der er en ekstra tjekkolonne til initialer for den, der gennemgår rapporten. Elektroferogram: Sammenlignelig med analysevinduet ARMS/Comparative (ARMS/komparativ), viser alle farvestofsfarverne for prøvesporet. Rapporttabeller: Hovedtabellen viser alle de mutationer, der er blevet testet for med dette kit. Homozygot eller heterozygot status er angivet med det antal vildtype eller mutante alleler, der rapporteres for hver locus. Den anden tabel viser prøvens Poly-T-status, hvis denne funktion er valgt. Sporsammenligningshistogram: GeneMaker beregner allelforskellene mellem A- og B-blandingssporene og viser dem i et histogram, der findes under prøveelektroferogrammerne. Spidsetiketter Spidsetiketterne er farvekodede i henhold til kvaliteten af matchet mellem den detekterede spids og de observerede panel 'bins'. I elektroferogrammet er markørerne vandrette grå streger og spidsens centrum er markeret med en lodret grå streg. Spidser, der falder uden for panelets markører eller 'bins', er markeret med rødt som Off Ladder (OL). CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 28 af 37

Bemærk: På grund af forskelle i maskinens polymertype og størrelsesstandard kan det være nødvendigt at optimere markør bins for at kunne tilpasse softwaren til de kørselsforhold, der anvendes. Der findes yderligere oplysninger om hvordan panel 'bins' ændres i den GeneMarker manual, der fulgte med softwaren. Scoring af diagnostiske spidser En person har to kopier af AAT-genet. Hvis disse kopier har samme sekvens på et vilkårligt sted, beskrives en person som homozygot på dette sted. Hvis kopierne er forskellige i sekvens for et givent allel, beskrives personen som værende heterozygot (figur 13). Det er A-blandingen (mutant), der bestemmer hvorvidt en person er bærer af en mutation, og dette vises med en blå spids. Mutantblandingen indeholder også primere til det normale F508del-allel, og derfor kan denne blanding bestemme hvorvidt en person er normal for F508del (kun grøn spids), homozygot for F508del (kun blå spids) eller heterozygot for F508del (blå og grøn spids). Hvis der observeres en anden mutation, kan prøven forstærkes med B-blandingen (WT) til påvisning af homozygot eller heterozygot status. Tilstedeværelsen af en grøn spids for det specifikke allel i WT-blandingen indikerer at personen er heterozygot. Hvis den grønne spids mangler, indikerer det at personen er homozygot for denne specifikke mutation. Fig 13: Eksempler på personer a) normale, b) heterozygote og c) homozygote for 711+1G>T-allelet. A B C CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 29 af 37

En person, som er bærer af to forskellige mutationer, betegnes som en sammensat heterozygot (figur 14). A Fig 14: Eksempler på sammensatte heterozygote prøver. A) W1282X/S1251N B) F508del/R560T. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 30 af 37

B Der er inkluderet to hypervariable STR-markører (røde) i begge blandinger. Dette muliggør sammenligning af den forstærkede prøve med mutantblandingen og den forstærkede prøve med WT-blandingen for at reducere muligheden for, at der er taget fejl af prøverne (figur 15). Mangel på disse STR-markører indikerer en fejlslagen prøve. Tilstedeværelsen af STR-markørerne ved meget lave rfu'er indikerer en svag prøve, som bør analyseres med forsigtighed. Fig 15: A-blandings- og B-blandingsplottet viser de to STR-markører for en person. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 31 af 37

De hypervariable STR-markører kan gemmes ved at vælge STR Check (STR-tjek) fra i boksen ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/komparativ - udskrivningsindstillinger), hvis det kun er A-blandingen, der analyseres, eller i boksen ARMS/Comparative Analysis (ARMS/komparativ analyse), hvis A- og B-blandingen analyseres. Visning af kun de røde farvestofsdata i vinduet ARMS/Comparative Analysis (ARMS/komparativ analyse) vil gøre det nemmere at se STR-markørerne. GeneMarker markørbetegnelse Når de analyserede spordata vises i GeneMaker, vil de diagnostiske spidser i A- blandingen blive mærket med markørnavnet. Diagnostiske spidser i B-blandingen vil kun blive mærket med markørnummeret og suffikset WT, når den vises med kun det grønne farvestof valgt. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 32 af 37

Korrelationen mellem markørnumrene og markørerne kan ses nedenfor. Detekterede markører Markør nr. Markør Produkt-bp -størrelsesområde (3130/POP7-data) 01 R347H 110.5-116.5 02 R347P 117-123 03 2789+5 G>A 124-130 04 3120+1 G>A 132.5-138.5 05 711+1 G>T 141.5-147.5 06 R334W 147.5-154 07 I507del 156-162.5 08 F508del 163-169 09 3849+10kb C>T 172-178 10 1677delTA 180-188.5 11 1078delT 193-199 12 V520F 206-211.5 13 L206W 215-220 14 W1282X 224.5-230.5 15 R560T 234.5-240.5 16 2347delG 242-246 17 Q890X 250-252 18 R553X 255.5-261.5 19 G551D 265-267 20 S549R(T>G) 267.5-269.5 21 S549N 275-280 22 M1101K 282-288 23 G542X 289-295.5 24 3905insT 297-303.5 25 Y1092X(C>A) 308-314 26 S1251N 315-321 27 444delA 323-326 28 1811+1.6kb A>G 332-338 29 1717-1 G>A 341.5-347.5 30 R117H 349-355 31 R117C 357-360 32 N1303K 360-366.5 33 Y122X 367-373 34 394delTT 377-383 35 G85E 384-390 36 R1066C 391-397 37 1898+1 G>A 398.5-404.5 38 W846X 406-411 39 2184delA 413-418 40 D1152H 423-429 41 CFTRdel2_3 433-439 42 P67L 439.5-445.5 43 2143delT 446-450.5 44 E60X 453.5-460.5 45 3659delC 461-465.5 46 3272 470-476 47 621+1G 485.5-491.5 48 A455E 496-503 49 R1162X 506-512 50 R1158X 516.5-524.5 5T* IVS8-5T 110-130 7T IVS8-7T 140-160 9T IVS8-9T 175-195 CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 33 af 37

* 5T-allelstørrelse Markør Produkt-bp-størrelse Område POP7/3130 5T (9) 117,25 118,75 5T (10) 119,25 120,75 5T (11) 121,25 122,75 5T (12) 123,25 124,75 5T (13) 125,25 126,75 Bemærk: Størrelsersområderne for hver markør kan variere afhængig af det anvendte instrument og polymer. CF-EU2v1 di507del-markør Det er, grundet placeringen af I507-fjernelsen i CFTR-genet muligt at detektere tilstedeværelsen af denne markør gennem et 3 bp-skift i størrelsen af F508del-spidsen, samt som en I507del mutant specifik spids. Der hvor der er et enkelt I507del mutant allel tilstede, vil I507del mutantens spids kunne ses som en blå spids ved ca. 159 bp. Der observeres en vildtype spids for F508del som værende tilstede, men på omkring halvdelen af den spidshøjde, der almindeligvis er forbundet med en homozygot vildtype genotype. Dette ses som en grøn spids ved omkring 167 bp. Der vil derudover også ses en grøn spids ved omkring 164 bp (figur 16). Fig 16: I507del heterozygot prøve. En I507del/F508del-prøve vil give en skiftet grøn F508del WT-spids ved ca. 164 bp (3 bp mindre end normalt), en blå F508del mutant spids ved 166 bp og en blå I507del mutant spids ved omkring 159 bp. En I507del/I507del-prøve vil give en blå spids ved ca. 159 bp og en enkel grøn spids ved ca.164 bp (3 bp mindre end den normale F508del-spids, der observeres når I507del ikke er tilstede). CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 34 af 37

Vær opmærksom på at forekomsten af en F508del-mutation forhindrer I507 WTprimeren i at virke. En person, der er homozygot for F508del, vil derfor ikke have nogen I507 WT-spids i WT-blandingen, og en person, der er heterozygot for F508del, vil have en mindre høj I507 WT-spids i WT-blandingen. Poly-T-markører Elucigene CF-EU2v1 indeholder NED (gul) mærkede fluorescens ARMS primere til detektion af IVS8-5T-, IVS8-7T- og IVS8-9T-varianter. Poly-T-oplysninger om en prøve kan bestemmes ved at aktivere visualiseringen af de gule farvestofsdata i GeneMarker hovedanalysevindue (figur 7). Poly-T-markørerne kan gemmes ved at vælge Poly-T Analysis (Poly-T-analyse) fra i boksen ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/komparativ - udskrivningsindstillinger), hvis det kun er A-blandingen, der analyseres, eller i boksen ARMS/Comparative Analysis (ARMS/komparativ analyse), hvis A- og B-blandingen analyseres. Operatøren kan derfor vælge at få vist disse data, om nødvendigt, under testproceduren i laboratoriet. Bemærk: Der er ikke nogen Poly-T-primere i B-blandingen, og produkterne kan derfor kun ses i A-blandingens prøver. Poly-T-analyse Nedenstående GeneMarker-eksempler viser spidsmorfologikarakteristika for den IVS8- variant, der testes. Eksemplerne nedenfor viser A-blandingens resultater, sådan som de vises, når der er valgt Poly-T Analysis (Poly-T-analyse) i dialogboksen ARMS/Comparative Print Settings (ARMS/komparativ - udskrivningsindstillinger), og når det kun er A-blandingen, der ananlyseres. Eksempel 1: IVS8-5T/IVS8-7T-prøve CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 35 af 37

Eksempel 2: IVS8-7T/IVS8-7T-prøve Eksempel 3: IVS8-7T/IVS8-7T-prøven (TG gentagelsesvariabilitet) De to spidser skyldes heterozygositeten af TG-gentagelsesregionen, som er inden for vores amplikon. Denne effekt kan også observeres med 5T og 9T homozygotprøverne. Der er derfor muligt at påvise antallet af TG-gentagelser inden for hver IVS8- polythymidinvariant. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 36 af 37

Eksempel 4: IVS8-9T/IVS8-9T-prøven Vigtig meddelelse Under visse analyseforhold er det muligt at observerbare farvestofsartefakter kan forstyrre rutineanalysen. Det er vigtigt at brugeren er opmærksom på eventuel interferens for at sikre korrekt dataanalyse. Der kan observeres mærkede farvestofartefakter i form af små blå eller grønne spidser. Disse farvestofsartefakter er generelt mindre end 100 bp i størrelse og vil almindeligvis ikke interferere med dataanalysen. Under normale forhold er disse artefaktspidser ubetydelige i forhold til de sande amplikonspidser og forårsager ikke nogen problemer med analysen. Men når mængden af anvendt amplikon er lille, eventuelt på grund af begrænsende genomisk DNA, virker farvestofsartefaktspidserne større og kan potentielt analyseres som sande amplikonspidser. ELUCIGENE er et varemærke tilhørende Gen-Probe Life Sciences Ltd. ARMS er et varemærke tilhørende AstraZeneca UK Ltd. QIAAMP er et varemærke tilhørende Qiagen GmbH. GENEMARKER er et varemærke tilhørende SoftGenetics Corporation. GENEMAPPER, VIC, NED og PET er varemærker tilhørende Applied Biosystems, LLC. POP-7 og HI-DI er varemærker tilhørende Life Technologies Corporation MEDDELELSE TIL KØBEREN: BEGRÆNSET LICENS Polynukleotider mærket med farvestoffet VIC, NED og PET og/eller deres brug, kan være beskyttet af et eller flere patenter tilhørende Applied Biosystems, LLC. Købsprisen af dette produkt inkluderer begrænsede, ikke-overdragelige rettigheder under visse krav i visse patenter tilhørende Applied Biosystems, LLC om kun at bruge denne mængde produkt og kun til køberens aktiviteter til detektion af mål inden for human diagnostik. Der gives ingen andre rettigheder. Yderligere oplysninger om købslicens med hensyn til de ovenfor anførte farvestoffer, kan rekvireres hos Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. Copyright 2013 Gen-Probe Life Sciences Ltd. CF2EUGSDA Rev.10/2103 Side 37 af 37