RPR

RPR 100 72515 500 72516 SÆT TIL KVALITATIV OG SEMI-KVANTITATIV DETEKTERING AF NON- TREPONEMAL SYFILIS-FORBUNDNE, REAGIN, ANTISTOFFER I HUMANT SERUM ELLER PLASMA VED MAKROSKOPISK AGGLUTINATION PÅ ENGANGS-TESTKORT 883684-2014/12

INDHOLDSFORTEGNELSE 1. PÅTÆNKT BRUG... 3 2. SAMMENDRAG OG FORKLARING AF TESTEN... 3 3. PRINCIPPER FOR PROCEDUREN... 3 4. REAGENSER... 4 5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER... 4 6. PRØVEMATERIALER... 5 7. PROCEDURE... 6 8. TESTBEGRÆNSNING... 8 9. SPECIFIKATIONER FOR YDEEVNE... 8 10. BIBLIOGRAFISKE REFERENCER.... 9 [DK] 2

1. PÅTÆNKT BRUG RPR-sæt er beregnet til brug for kvalitativ og semi-kvantitativ detektering af nontreponemale syfilis-forbundne antistoffer (reagin) i humant serum og plasma som hjælp til diagnosticering af syfilisinfektioner. 2. SAMMENDRAG OG FORKLARING AF TESTEN Syfilis er en kronisk infektion, som forløber gennem forskellige stadier: første, anden, tredje og fjerde. Disse stadier viser forskellige kliniske symptomer og giver typisk begyndende chankre og derefter syfilitisk rødmen fuldt af lange latensperioder. En ubehandlet infektion kan til sidst resultere i kardiovaskulære problemer og neurosyfilis. Infektionen er forårsaget af spirokæten Treponema pallidum og fås som regel ved seksuel kontakt, selv om sygdommen også kan overføres ved transfusion af inficeret blod. Intrauterin infektion forekommer også. Organismen har vist sig at være stort set umulig at dyrke i kunstige medier, og infektionsdiagnosen afhænger som regel af tilstedeværelsen af antistoffer i blodet, som viser sig lige efter den indledende infektion og kan fortsætte i mange år. Tests for syfilis udføres i fire kategorier: direkte mikroskopisk undersøgelse, treponemale antistof-tests, non- treponemale antistof-tests og direkte antigen-tests. RPR (hurtig plasma-reagin) er en "non-treponemal" test, hvori de detekterede antistoffer ikke er specifikke for T pallidum, selv om tilstedeværelsen i patientens serum eller plasma er nøje forbundet med infektionen i organismen. Denne type test måler antistofferne (IgG og IgM), som produceres som reaktion på lipoidt materiale, der frigøres fra ødelagte værtsceller samt på lipoprotein-lignende materiale, der frigøres fra spirokæterne. Disse antistoffer har tendens til at forsvinde, når infektionen er kureret. 3. PRINCIPPER FOR PROCEDUREN RPR-sæt bruger kulpartikler belagt med en blanding af lipide antigener, som går i forbindelse med reagine antistoffer, som findes i patientens serum eller plasma. Partiklerne opløses i et medium, der indeholder komponenter til fjernelse af ikkespecifikke reaktioner. Positive reaktioner vises ved makroskopisk agglutination (klumper) af partiklerne. Selv om sættet først og fremmest er beregnet til kvalitative tests, kan antistofniveauet titreres ved dobbelt fortynding. Agglutinationsmønstrene fortolkes med øjet. [DK] 3

4. REAGENSER 4.1. Beskrivelse Identificering på etiketten R1 RPR Antigen R2 Positive control R3 Negative control Beskrivelse RPR-antigen Kulpartikler belagt med cardiolipin og kolesterol-antigen i fosfatbuffer Positiv kontrol Humant se rum inde holde nde antistoffer for T. pallidum, negativ for HBs ant ig e n, ant i-hiv1 / 2 og ant i- HCV ant is t offe r opløs t i fos fat buffe r Negativ kontrol Præsentation 72515 72516 100 tests 500 tests 2 ml 1 ml 10 ml 2 ml Kaninserum i fosfatbuffer 1 ml Dispenseringsflaske (kan genbruges) 1 1 Dispenseringsnål (kan genbruges) 1 1 Testkort (10 cirkler) 10 50 2 ml 4.2. Krav til opbevaring og håndtering Dette sæt skal opbevares ved +2-8 C. Opbevar flaskerne i oprejst tilstand. Må ikke fryses ned. Alle sættets dele, som opbevares ved +2-8 C, kan bruges indtil den angivne udløbsdata på pakken. Efter åbning og hvis de ikke udsættes for kontaminering, kan R1, R2 & R3 reagenserne, der opbevares ved +2-8 C, bruges indtil udløbsdatoen, der vises på mærkatet. 5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Til in vitro-diagnose-brug. Til professionelt brug inden for sundhedssektoren. 5.1. Helbreds- og sikkerhedsforholdsregler: Dette testsæt må kun anvendes af kvalificeret personale, som er uddannet inden for laboratorieteknikker, og som kender de potentielle farer. Bær det nødvendige beskyttelsestøj, handsker og øjen- /ansigtsbeskyttelse, og arbejd korrekt i henhold til god laboratoriepraksis. De leverede kontrolmaterialer stammer fra humant serum. De er blevet testet på donorniveau og fundet negative over for HBs-antigen, anti- HIV1/2 og anti-hcv-antistoffer. Ingen kendt testmetode kan give fuld sikkerhed for, at der ikke forefindes smitstoffer. Derfor skal alle stoffer fremstillet af humant blod, reagenser og humant prøvemateriale håndteres som værende i stand til at overføre smitsomme sygdomme. Overhold følgende forholdsregler for blodbårne patogener, som anbefales i lokale, regionale og nationale bestemmelser. [DK] 4

Biologisk udslip: Spild af materiale, der stammer fra menneskelige kilder, skal behandles som potentielt smittefarligt. Spild, der ikke indeholder syre, bør omgående dekontamineres, herunder spildområdet, materialer og eventuelt forurenede overflader eller udstyr, med et egnet kemisk desinfektionsmiddel, der er effektivt over for potentielt biologisk risikomateriale fra de involverede prøver, (som regel en 1:10 fortynding af husholdningsblegemiddel, 70-80 % ethanol eller isopropanol, en jodopløsning [f.eks. 0,5 % Wescodyne Plus osv. ), og tørres. Udslip indeholdende syre skal absorberes behørigt (tørres op) eller neutraliseres, området skylles med vand og tørres; materialer, der anvendes til at absorbere udslippet, kan kræve bortskaffelse som farligt affald. Derefter skal området dekontamineres med et af de kemiske desinfektionsmidler. BEMÆRK: Anbring ikke opløsninger, der indeholder blegemiddel, i autoklaven! Bortskaf alle prøver og materialer, der har været anvendt ved udførelsen af testen, som om de indeholder smitsomme stoffer. Kemisk, biologisk eller farligt laboratorieaffald skal håndteres og bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale og nationale forskrifter. Sikkerhedsdatabladet findes på www.bio-rad.com. 5.2. Forholdsregler vedrørende proceduren 5.2.1. Forberedelse Resultaternes pålidelighed afhænger af korrekt implementering af følgende regler for god laboratoriepraksis: Undgå sammenblanding eller nogen form for forbindelse mellem reagenser fra forskellige partier i samme testkørsel. Brug ikke reagenser efter udløbsdatoen. Vent 30 minutter, før reagenserne tages i brug, så de kan stabilisere sig ved stuetemperatur (18-30 C). 5.2.2. Bearbejdning Analyseproceduren må ikke ændres. Brug en ny fordelingsspids for hver prøve. Undgå at berøre reaktionsoverfladen på agglutinationskortene. 6. PRØVEMATERIALER Prøver af serum eller plasma (EDTA, natriumcitrat, natriumheparin og ACD) skal være fri for blodceller. De kan opbevares ved +2-8 C i maks. 7 dage, før testen udføres. Prøver, der kræver længere opbevaring, skal fryses ned til -20 C eller lavere. Frosne prøver skal optøs og blandes godt før test. [DK] 5

Gentag ikke fryse-/optøningscyklusser mere end 5 gange. Opvarmede prøver til 56 C i løbet af 1 time har ingen indflydelse på resultaterne. Prøver, der indeholder op til 120 g/l albumin, 200 mg/l bilirubin, 33 g/l triolein og prøver, der indeholder op til 2 g/l hæmoglobin, påvirker ikke resultaterne. Undgå at anvende hyperlipæmiske og hyperhæmolyserede prøver. Hvis prøvematerialet skal transporteres, skal det emballeres ifølge de gældende regler for transport af etiologiske stoffer og helst i nedfrosset tilstand. 7. PROCEDURE 7.1. Nødvendige materialer 7.1.1. Leverede materialer Korrekt kalibreret engangs-pipetteflaske og pipettenål til fordeling af kulpartikler. 7.1.2. Nødvendige materialer, der ikke medfølger Rotator til rotering af testkort ved 100 opm, i en cirkel med en diameter på cirka 1 cm. Korrekt kalibreret og vedligeholdt pipette og nåle til afgivelse af et volumen på 50 µl. 0,9% saltvandsopløsning (til semi-kvantitativ procedure) 7.2. Analyseprocedure Sættet positive (R2) og negative (R3) kontrolprøver skal køres sammen med hver testkørsel. 7.2.1. Kvalitativ test 1. Anbring 50 µl af prøven eller kontrollen i en cirkel på testkortet. 2. Spred prøven og kontrollerne jævnt over cirklens testområde. 3. Ryst flasken med RPR-antigen lige før brug for at sikre grundig blanding, så sedimentation undgås. 4. Sæt pipettenålen på pipetteflasken, og sug RPR-antigenet op. 5. Vend pipetteflasken, og tryk forsigtigt på den for at presse luften ud af nålen. 6. Fordel en enkelt dråbe RPR-antigen ved at holde pipetteflasken lodret over testprøven. 7. Anbring testkortet på en kort-rotator, og rotér ved 100 opm i 8 minutter. 8. Aflæs omgående og tolk resultaterne visuelt i godt lys. (Se 7.4) Bemærk: Hvis det ikke er muligt at aflæse med det samme, skal kortet holdes på kortrotatoren i op til 15 minutter. 9. Hæld ubrugt antigen tilbage i glasrøret fra pipetteflasken. 10. Rengør pipetteflasken og -nålen med destilleret vand, og lad dem tørre, inden de bruges igen. 7.2.2. Semikvantitativ test 1. Lav dobbelte fortyndinger fra ufortyndet til 1:16 i en saltvandsopløsning på 0,9%. 2. Anbring 50 µl af hver fortynding og kontroller i en cirkel på testkortet. 3. Spred hver fortynding jævnt over testcirklen. 4. Fortsæt som ved kvalitativ test afsnit 3. Titer for prøven er udtrykt som reciprok med den højeste fortynding, som viser agglutinationen for kulpartiklerne. [DK] 6

Hvis den højeste, testede fortynding (1:16) er reaktiv, fortsættes med endnu en fortyndingsserie med dobbelt fortynding af prøven fra 1:32 til 1:512 ved anvendelse af saltvandsopløsning på 0,9%. Bland godt, og fortsæt som fra trin 2 i den semi-kvantitative test. 7.3. Kvalitetskontrol Brug positiv kontrol (R2) og negativ kontrol (R3) i hver kørsel for at validere analysen. 7.4. Fortolkning af resultaterne og valideringskriterierne Meget reaktive (SR): Store klumper kulpartikler med en klar baggrund. Reaktiv (R): Store klumper kulpartikler lidt mere spredt end ved meget reaktive. Svagt reaktive (WR): Små klumper kulpartikler med en lysegrå baggrund. Spor reaktiv (TR): Let sammenklumpning af kulpartikler ses typisk som en knap af aggregater i midten af testcirklen eller spredt omkring testcirklens kant. Ikke-reaktiv (NR): Typisk et glat, gråt mønster eller en knap med ikke-aggregerede kulpartikler i midten af testcirklen eller en stor cirkel af kulpartikler uden klumper indeni. Reaktive prøver skal registreres som antistof-positive og skal (på grund af de detekterede antistoffers ikke-specifikke sammensætning) underkastes yderligere tests for at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af specifikke anti-treponemale antistoffer. [DK] 7

For at analysen kan være gyldig, skal den positive kontrol give et kraftigt reaktivt mønster, og den negative kontrol skal give et klart ikke-reaktivt resultat. 8. TESTBEGRÆNSNING Der findes ikke en enkelt test- eller definitiv referencestandard til hver af denne sygdoms stadier. Dermed baserer syfilisdiagnosen fortrinsvist på serologiske tests, som kræver resultater fra både non-treponemale og treponemale metoder. Falske positive resultater kan iagttages, hvis aflæsningen ikke foretages straks efter roteringen. RPR-kultesten er ikke specifik for syfilis. Alle reaktive prøver skal gentestes med treponemale metoder som f.eks. TPHA for at bekræfte resultaterne. 9. SPECIFIKATIONER FOR YDEEVNE 9.1. Præcisionsforsøg Et prøvepanel sammensat af en negativ prøve, 1 lav positiv prøve (titer 1:4) og 1 positiv prøve (titer 1:16) blev testet for repeterbarhed i 8 replikater i samme kørsel. Til forsøg med mellem-præcision og inter-parti-reproducerbarhed blev prøverne testet i 2 replikater om dagen i løbet af 5 dage (aflæsning udført af to forskellige operatører) og på to forskellige partier. 9.1.1. Repeterbarhed Alle negative prøvereplikater gav negative resultater og alle positive prøvereplikater gav positive resultater. 9.1.2. Mellem-præcision / inter-parti-reproducerbarhed Alle negative prøvereplikater gav negative resultater, og alle positive prøvereplikater gav positive resultater uanset betingelserne. 9.2. Klinisk ydeevne 9.2.1. Specificitet Specificitetsforsøget var et retrospektivt forsøg udført på 102 frosne serumprøver fra laboratoriet på et center for seksuelt overførte sygdomme i Frankrig. Resultaterne fra syfilis RPR-analysen blev sammenlignet med en CE-mærket RPR/VDRL-analyse. Totalt antal prøver Start-reaktive (IR) Gentaget reaktive (RR) RR specificitet (%) CI 95% 102 2 (tvivlsom) 0 100% 102/102 [96.4% - 100.0%] For 102 prøver blev 2 prøver fundet tvivlsomme. Efter gentagen test var alle prøver negative. Diagnosespecificiteten for de retrospektive prøver var lig med 102/102 = 100% med et konfidensinterval på 95 % af [96,4% 100,0%]. [DK] 8

9.2.2. Følsomhed Følsomhedsforsøget var et retrospektivt forsøg udført på 101 frosne serumprøver fra laboratoriet på et center for seksuelt overførte sygdomme i Frankrig. Resultaterne fra syfilis RPR-analysen blev sammenlignet med en CE-mærket RPR/VDRL-analyse. Totalt antal prøver Start-reaktive (IR) Gentaget reaktive (RR) RR specificitet (%) CI 95% 101 100 (1 tvivlsom) 101 100% 101/101 [96.4% - 100.0%] For 101 prøver blev 1 prøve fundet tvivlsom. Efter gentagen test var alle prøver positive. Diagnosefølsomheden for de retrospektive prøver var lig med 100% (101/101) med et konfidensinterval på 95 % af [96,4% 100,0%]. 9.3. Analytisk specificitet / krydsreaktiv undersøgelse Den analytiske specificitet for syfilis RPR-analysen blev evalueret på i alt 65 krydsreaktive prøver udvalgt fra andre infektuøse sygdomme og/eller med andre betingelser, som kan give falsk-positive resultater på grund af non-specificiteten (rheumatoid faktor, Lyme-sygdom, EBV, Rubella, leptospirose, SLE (lupus), hepatitis B, hepatitis C, HIV ½, multipara-kvinder, gravide kvinder). Analyse-specificiteten er lig med 100,0% (65/65) med et 95% konfidensinterval på [94,5% - 100,0%]. 9.4. Prozon-effekten Tre (3) meget høje positive ab syfilis-prøver (>1:128) blev testet ufortyndet og fortyndet til verificering af prozon-effektens fravær. Alle ufortyndede positive prøver er positive. Ingen prozon-effekt ses med titere op til 1:256. 10. BIBLIOGRAFISKE REFERENCER. 1. Larsen SA.,Pettit, et coll., EDTA treated plasma in the Rapid Plasma Reagin card test and the toluidine red unheated serum test for serodiagnosis of syphilis. J Clin Microbiology 1983;17;431-5 2. Larsen S.A., Pope V., et coll., A manual of Tests for Syphilis. 9th Edition ;1998; 193 207 3. Portnoy J. Modifications of the rapid plasma reagin (RPR) card test for syphilis, for use in large-scale testing.am J Clin Pathol;1963;40;473-9 4. Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and some biologic features. Clin Microbiol Rev. 1999 Apr; 12(2):187 209. 5. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med. 2009. 47:596-606. [DK] 9

[DK] 10

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tlf.: +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33 2014/12 www.bio-rad.com 883684 [DK] 11