Baggrund PH.D.- PROTOKOL Human Papillomavirus og Graviditet Læge Ulla Bonde van Zwol Hovedvejleder: Specialeansvarlig overlæge, forskningslektor, Ph.d. Jan Stener Jørgensen Medvejleder: Professor, specialeansvarlig overlæge, dr.med. Ole Mogensen Gynækologisk Obstetrisk Afdeling D, OUH Human papillomavirus (HPV) er et dobbeltstrenget DNA- virus, der replikerer i bl.a. keratinocytter. Virus findes i over 150 typer og kan give infektion i flerlaget pladeepitel i hud og slimhinder hos mennesker. De fleste typer er asymptomatiske ved infektion, men nogle kan give vorter, andre kan forårsage dysplasi og cancer i cervix, vulva, vagina og anus. Ca. 30-40 HPV- typer transmitteres typisk ved seksuel kontakt og inficerer anogenitalregionen. Der findes ikke aktuelt nogen behandling for HPV- infektion, men i de fleste tilfælde cleares den. En dansk undersøgelse, udført før introduktion af HPV- vaccinen (1), har i smearmateriale fra 11.617 danske kvinder i alderen 15-93 år fundet en prævalens af HPV på 26,4%. Der blev undersøgt for forekomsten af 13 high risk (HR) og 5 low risk (LR) HPV- typer. HPV- prævalensen toppede på 50,2% hos unge kvinder på 20-24 år. Det har desuden været rapporteret, at op til 50-80% af alle seksuelt aktive mennesker i løbet af deres livstid vil have haft HPV- infektion på et eller andet tidspunkt. HPV- 16 er den mest prævalente type og findes hos 6,0% af alle kvinder. Forekomsten af HPV stiger i årene efter seksuel debut og falder herefter med alderen. Prævalensen af HPV- 16/18 infektion i kvinder i alderen 15-19 år var 13,6% og øgedes til 18,5% i kvinder på 20-24 år, hvorefter den faldt markant med alderen. Cervikal infektion med HPV er en forudsætning for udviklingen af cervixcancer (2). De fleste HPV- infektioner er forbigående og forårsager ingen cervikal skade. Nogle infektioner er derimod persisterende og kan eventuelt forårsage dysplasi og cancer. Behandlingen for cervixdysplasi og - cancer er bl.a. conisatio, der øger risikoen for sen spontan abort og præterm fødsel (3) (4). Infektion med HPV synes også at kunne påvirke det obstetriske outcome ad en mere direkte vej. Der er endnu kun få studier, der har undersøgt, hvilken indflydelse HPV- infektion har på graviditeter, men resultaterne af disse studier indikerer, at human papillomavirus er associeret med øget risiko for dårligt outcome af graviditeten i form af spontan abort og præterm fødsel. Malhomme (5) undersøgte væv fra spontane aborter og fandt ved et studie i 1997, at 70% af produkterne fra spontan abort indeholdt HPV ved PCR- analyse. Et andet studie (6) påviste, at kvinder med HPV- infektion i anamnesen havde højere risiko for spontan abort (OR 3). Srinivas (7) fandt HPV i 57% af spontane aborter versus 31% af provokerede aborter. Det er desuden vist, at HPV spiller en mulig rolle i genetiske afvigelser i fosteret og dermed ved spontan abort (8). Et amerikansk studie af Gomez et al (9) fandt i 2008, at HPV- DNA oftere er tilstede i den extravilløse trofoblastregion i placenta fra spontan præterm fødsel sammenlignet med kontroller. Resultaterne tyder på, at HPV- 16 kan replicere i extravilløse trofoblastceller, inducere celledød og reducere celleinvasion. Disse effekter kan resultere i fejlagtig invasion af de extravilløse trofoblastceller ind i uterinvæggen og placentadysfunktion. HPV er blevet detekteret ved PCR- amplification af DNA fra celler taget fra amnionvæske fra gravide med påvist genital eller cutan HPV- infektion. Det indikerer, at HPV kan krydse placentabarrieren, når virus er tilstede i cervix (10)(11). Rombaldi et al (12) fandt ved genital swab eller i det perifere blod HPV- DNA hos 49 (77,8%) af 63 kvinder. I 12 af de 49 kvinders moderkager (24,5%) fandt man ligeledes HPV- DNA. Der var type- specifik HPV konkordans mellem genital/placenta- prøverne hos 91,7% (n=11/12). Et andet studie fra 2006 (13) undersøgte 146 prøver af amnionvæske fra 142 kvinder med ukendt HPV- status, men fandt derimod ikke HPV i nogen af prøverne. HPV s rolle ved udvikling af cancer i cervix uteri er velkendt og vides at kunne forebygges ved hjælp af vaccination. Man ved også, at visse bakterier og vira kan medføre øget risiko for spontan abort og præterm fødsel. Hvilken rolle HPV eventuelt spiller i forbindelse med risiko for spontan abort og præterm fødsel, vides der endnu kun lidt om. Spontan abort forekommer i ca. 15% af alle graviditeter. Præterm fødsel defineret ved fødsel før graviditetsuge 37+0 forekommer i Danmark hos 6-7% og før uge 32+0 hos 1,5% af alle gravide. For tidlig fødsel har store såvel personlige som samfundsøkonomiske omkostninger. Mortaliteten blandt de ekstremt præmature børn (< 28+0) er høj og morbiditeten blandt de overlevende børn er betydelig. 1
Formål og hypoteser Vores studier bygges op omkring to hypoteser. Den ene er, at genital infektion med HPV er associeret med øget risiko for spontan abort og præterm fødsel. Den anden antagelse er, at Humant Papillomvirus kan ascendere fra vagina til uterus gennem cervix og krydse placentabarrieren. Disse hypoteser ønsker vi at efterprøve ved vores studier. Med studierne ønsker vi mere specifikt at finde svar på følgende: 1. A. Prævalensen af HPV- infektion i cervix uteri hos kvinder i graviditetsuge 11-14. B. Prævalensen af HPV- infektion i cervix uteri hos kvinder, der får foretaget prænatal diagnostik i form af chorion villus biopsi. Det udhentede væv undersøges ligeleledes for HPV- infektion. Det vil derved kunne undersøges, hvorvidt HPV forekommer intrauterint og synes at være en ascenderende infektion. 2. Prævalensen af HPV- infektion i cervix og graviditetsvæv ved spontan abort op til graviditetsuge 22+0. Resultaterne herfra sammenholdes med resultaterne fra studie 1A for at undersøge om HPV- infektion har indflydelse på risikoen for spontan abort. 3. Prævalensen af HPV- infektion i cervix hos gravide til terminen, d.v.s. graviditetsuge 37+0-42+0. Resultaterne herfra anvendes som normal materiale. Der tages swab fra såvel vaginalt fødende samt kvinder, der får foretaget elektivt sectio. 4. Prævalensen af HPV- infektion i cervix hos kvinder med ekstrem præterm fødsel graviditetsuge 22+0 og 28+0 og meget præterm fødsel graviditetsuge 28+1 til uge 32+0. Resultaterne sammenholdes med tallene fra studie 3 for at undersøge om genital HPV- infektion har indflydelse på risikoen for spontan præterm fødsel op til uge 32+0. Materiale og metode Design: Observationelle og case- kontrol studier 1. Prævalensen af asymptomatisk HPV- infektion hos tidligt gravide. a) En kohorte af 91 kvinder undersøges i forbindelse med nakkefoldsscanning i uge 11-14 med swab fra cervix uteri samt blodprøve med henblik på at påvise eventuel HPV- infektion og gøre typebestemmelse. b) En kohorte af 91 kvinder, der skal have foretaget chorion villus biopsi på baggrund af eksempelvis risikoberegning undersøges med swab fra cervix uteri og det udhentede væv vil blive undersøgt for HPV- infektion og typebestemmelse gøres. Desuden tages blodprøver med henblik på analyse for antistoffer mod HPV. 2. Prævalensen af HPV- infektion ved spontan abort eller missed abortion op til gestationsalder uge 22+0. 91 kvinder med inkomplet, igangværende spontan abort eller missed abortion op til gestationsuge 22+0 undersøges med swab fra cervix uteri og med blodprøve før evacuatio med henblik på at påvise eventuel HPV- infektion og - typebestemmelse. Det udhentede væv undersøges for HPV, og der gøres typebestemmelse. Der tages blodprøver for HPV- antistoffer. 3. Prævalensen af asymptomatisk HPV- infektion hos gravide til terminen. En kohorte af 91 kvinder undersøges med swab fra cervix uteri i forbindelse med elektivt sectio. Swab tages desuden fra cervix fra 91 kvinder, der føder spontant vaginalt til terminen. Der gøres PCR- analyse på swab og HPV- typebestemmelse. Der tages blodprøve fra alle kvinderne med henblik på detektion af evt. HPV- infektion og - typebestemmelse. 4. Prævalensen af HPV- infektion hos kvinder med præterm fødsel i uge 22+0 til uge 32+0. 91 kvinder med truende for tidlig fødsel undersøges med swab fra cervix i forbindelse med indlæggelsen. Blodprøve tages på kvinderne med henblik på påvisning af HPV- antistof og - typebestemmelse. 2
Fra alle deltagende kvinder vil desuden blive taget vaginal podning til senere brug for undersøgelse af vaginalt mikrobiom. Den første kontakt til patienten vil ske ved den læge, jordemoder eller sygeplejerske, der tilser patienten i forbindelse med hendes ambulante besøg/indlæggelse på afdelingen. Patienten vil i den forbindelse blive informeret såvel mundtligt som skriftligt om projektet samt om hendes rettigheder i relation til eventuel deltagelse i projektet. Patienten vil ligeledes blive informeret om mulighed og ret til at have bisidder til stede under informationen, der vil blive givet under uforstyrrede forhold i et undersøgelseslokale eller på enestue. Patienten vil blive tilbudt den fornødne betænkningstid, før hun tager stilling til eventuel deltagelse. Alle deltagende kvinder vil blive bedt om at udfylde spørgeskema til belysning af følgende forhold: Alder, etnisk herkomst, ægteskabelig status, uddannelsesniveau, alder ved seksuel debut, antal partnere, brug af p- piller, kaffe, alkoholforbrug, rygning, højde, vægt, HPV- relateret sygdom, medicinske lidelser, tidligere aborter og fødsler. Dette med henblik på statistiske vurderinger omkring disse faktorers eventuelle betydning for spontan abort og præterm fødsel. De cervikale swabs, abortvæv og placentabiopsier fra CVS analyseres for 35 typer HPV ved hjælp af multiplex PCR, og der gøres typebestemmelse. Blodprøverne analyseres for HPV- antistoffer ved VLP multiplex serologi, og der gøres typebestemmelse. For alle 4 studier gælder følgende in- og eksklusionskriterier: Inklusionskriterier: Eksklusionskriterier: Alder 18 år, singleton graviditet. Tidligere conisatio, kendt aktuel cervikal dysplasi, vaccineret med Gardasil eller Cervarix. Det indsamlede materiale vil blive opbevaret anonymiseret i forskningsbiobank op til 10 år efter afsluttet projekt. Initiativtagere til projektet er specialeansvarlig overlæge, forskningslektor, ph.d. Jan Stener Jørgensen og professor, specialeansvarlig overlæge, dr.med. Ole Mogensen. Statistiske overvejelser Et dansk studie af Susanne Krüger Kjær et al (1) fandt forekomst af ikke- typespecificeret HPV- infektion hos 26,4% af de undersøgte kvinder i alderen 15-93 år. Nulhypotesen i vores studier er, at der ingen forskel er at finde mellem de undersøgte kvinders HPV- prævalens i de respektive studier. Således vil der da ingen forskel være mellem tidligt gravide ved tidspunktet for nakkefoldsscanningen (studie 1A) og kvinder med spontan abort (studie 2). Tilsvarende vil der ifølge nulhypotesen ikke være nogen forskel at påvise mellem gravide til terminen (studie 3) og kvinder i præterm fødsel (studie 4). Vores hypoteser antager, at der er en forskel på de respektive grupper. Vi har estimeret prævalensen af HPV i grupperne af tidligt gravide kvinder ved nakkefoldsscanning (1) og kvinder med spontan abort (5-7) til henholdsvis 20% og 40%. Samme prævalens forventer vi, der er ved de prætermt fødende (9), altså 40% positive for HPV. I gruppen af fødende til terminen forventes 20% at være HPV- positive (1). Ved beregning af størrelsen af stikprøvegrupperne er vi gået ud fra 10.000 fødsler over 2 år på OUH, idet indsamling af prøver vil foregå over denne periode. Der foretages ca. 300 moderkagebiopsier om året på OUH. Antallet af evacuatio uteri pr. år er ca. 400 pr. år. Der er ca. 50 meget præterme fødsler pr. år på OUH. Ud fra disse tal forventer vi, det vil være muligt at inkludere de ønskede antal patienter i undersøgelserne. Sikkerhedsintervallet er sat til 95% og signifikansniveauet til 5%. Det giver en sandsynlighed på 5% for at få et signifikant resultat på grund af rene tilfældigheder, selvom nulhypotesen skulle være korrekt. Den nødvendige stikprøvestørrelse er beregnet til 91 kvinder i hvert studie. Styrken i vores studier fastsættes til 80%. Kvinderne vil være tilfældigt udvalgte patienter, der ses på OUH i de respektive sammenhænge nævnt ovenfor indenfor de to år prøveindsamlingerne finder sted. I alt vil 546 patienter blive inkluderet. 3
Beregningerne er foretaget på følgende måde: Patientantal Der antages en hyppighed på 40% af HPV i testgruppen og en hyppighed på 20% i kontrolgruppen. Styrken sættes til 80% og signifikansniveauet til 5%. Til brug for beregning af patientantal er anvendt følgende STATA- kommando: sampsi 0.2 0.4, p(0.8) Dette giver et patientantal på 91 i hver gruppe. D.v.s. at vi vil have 6 x 91 = 546 patienter i alt. Hvervning og samtykke Patienten vil blive såvel mundtligt som skriftligt informeret om projektet og gives mulighed for at have bisidder tilstede under informationen. Ligeledes oplyses patienten om forsøgspersoners rettigheder. Informationen vil blive givet af den jordemoder, sygeplejerske eller læge, der har med patienten at gøre. Der vil blive indhentet skriftligt tilsagn fra patienten om samtykke til deltagelse. Dette tilsagn kan patienten til en hver tid trække tilbage, hvis hun ikke længere ønsker at deltage. Dette vil ingen konsekvens have for den videre behandling. Der vil typisk være mulighed for en betænkningstid for patienten på timer til dage. Projektet vil 1. år blive finansieret ved SDU, 2. år ved hjælp af midler fra Regionens ph.d.- pulje og 3. år er der udstedt underskudsgaranti for fra Gynækologisk Obstetrisk Afdeling D, OUH. Der er indtil videre doneret 50.000 kr. fra Sanofi Pasteur MSD. Der vil blive søgt diverse fonde til finansiering af drift og løn for 3. år af studiet. Forsøgsansvarlige har ingen særlig tilknytning til nævnte medicinalfirma. Etiske overvejelser Projektet er anmeldt til Videnskabsetisk Komité og vil efterleve den af Indenrigs- og Sundhedsministeriet udgivne Bekendtgørelse nr. 806 af 12. juli 2004 om information og samtykke ved inddragelse af forsøgspersoner i biomedicinske forskningsprojekter. Alle forsøgspersoner vil blive informeret mundtligt og skriftligt om procedure og formål med undersøgelserne. Samtykke til deltagelse i studiet samt til journalindsigt vil blive indhentet skriftligt. Deltagelse er frivillig og forsøgspersonen vil til enhver tid kunne trække sit tilsagn om deltagelse tilbage uden konsekvens for den øvrige behandling af patienten. Alle personlige oplysninger er omfattet af tavshedspligt. Forsøgspersonerne vil ikke modtage vederlag for deltagelse. Biobank De indsamlede prøver vil blive opbevaret i en biobank til brug ved senere studier ved OUH omkring human papillomavirus og graviditet. Prøverne vil efter afslutning af dette projekt blive anonymiserede. Der vil ingen ulemper være forbundet med indsamling af prøverne. Dette vil blive gjort i forbindelse med en gynækologisk undersøgelse og en blodprøvetagning. Begge disse undersøgelser skal for langt de fleste af patienterne ske i forbindelse med deres udredning/behandling under alle omstændigheder. Der vil ingen risici være forbundet med prøvetagning for patienten. Materialet vil blive destrueret senest 10 år efter afslutning af dette projekt. 4
Risici, bivirkninger og ulemper Ved podning fra cervix uteri og vagina vil der blive indsamlet et ubestemt antal celler til undersøgelse. Ved blodprøven til brug for analyse af serumantistoffer mod HPV, vil der blive udtaget ca. 5 ml blod pr. patient. Såvel podning som blodprøve vil ingen nævneværdige risici, bivirkninger eller ulemper have for patienterne, der i forbindelse med deres udredning/behandling i de flestes tilfælde i forvejen skal have foretaget gynækologisk undersøgelse og blodprøvetagning. De patienter, der indgår i studiet i forbindelse med moderkagebiopsi, normalt fødende til terminen eller planlagt sectio til terminen, vil få foretaget podning fra cervix uteri, vagina og blodprøvetagning på grund af deres deltagelse i dette projekt. Dette vil kunne anses som en ulempe. Perspektiv Studierne vil bidrage til øget viden om forekomsten af human papillomavirus hos gravide kvinder i Danmark og HPV s eventuelle rolle ved spontan abort og præterm fødsel. Hvis HPV viser sig at være associeret med dårligere graviditets outcome, vil dette kunne influere på vaccinationsindikationen og på længere sigt kunne reducere antallet af ufrivillige tidlige aborter og spontane præterme fødsler. Forventede artikler med præsentation af de indhentede data uanset udfald: 1. Human Papillomavirus infektion i cervix uteri hos tidligt gravide 2. Human Papillomavirus forekomst intrauterint i 2. trimester 3. Human Papillomavirusinfektion i cervix uteri hos gravide til terminen 4. HPV- infektion og præterm fødsel Økonomi Projektet er tildelt et årsværk i forbindelse med optag af cand.med. Ulla Bonde van Zwol på ph.d.- uddannelsen. Derudover har Region Syddanmark støttet projektet med 500.000 kr. via Regionens ph.d.- pulje. Medicinalfirmaet Sanofi Pasteur MSD har støttet projektet med 50.000 kr. Forsøgsansvarlige har ingen særlig tilknytning til støttegiverne. Tid og sted Fra 1. november 2012 til 31. oktober 2015 på Gynækologisk Obstetrisk Afdeling, OUH og Sygehus Svendborg. 5
Reference List (1) Kjaer SK, Breugelmans G, Munk C, Junge J, Watson M, Iftner T. Population- based prevalence, type- and age- specific distribution of HPV in women before introduction of an HPV- vaccination program in Denmark. Int J Cancer 2008 Oct 15;123(8):1864-70. (2) Franco EL, Rohan TE, Villa LL. Epidemiologic evidence and human papillomavirus infection as a necessary cause of cervical cancer. J Natl Cancer Inst 1999 Mar 17;91(6):506-11. (3) Albrechtsen S, Rasmussen S, Thoresen S, Irgens LM, Iversen OE. Pregnancy outcome in women before and after cervical conisation: population based cohort study. BMJ 2008;337:a1343. (4) Noehr B, Jensen A, Frederiksen K, Tabor A, Kjaer SK. Loop electrosurgical excision of the cervix and subsequent risk for spontaneous preterm delivery: a population- based study of singleton deliveries during a 9- year period. Am J Obstet Gynecol 2009 Jul;201(1):33-6. (5) Malhomme O, Dutheil N, Rabreau M, Armbruster- Moraes E, Schlehofer JR, Dupressoir T. Human genital tissues containing DNA of adeno- associated virus lack DNA sequences of the helper viruses adenovirus, herpes simplex virus or cytomegalovirus but frequently contain human papillomavirus DNA. J Gen Virol 1997 Aug;78 ( Pt 8):1957-62. (6) Sikström B, Hellberg D, Nilsson S, Brihmer C, Mårdh PA. Contraceptive use and reproductive history in women with cervikal human papilloma virus infection. [11], 273-284. 1995. Ref Type: Generic (7) Srinivas SK, Ma Y, Sammel MD, Chou D, McGrath C, Parry S, et al. Placental inflammation and viral infection are implicated in second trimester pregnancy loss. Am J Obstet Gynecol 2006 Sep;195(3):797-802. (8) Matovina M, Husnjak K, Milutin N, Ciglar S, Grce M. Possible role of bacterial and viral infections in miscarriages. Fertil Steril 2004 Mar;81(3):662-9. (9) Gomez LM, Ma Y, Ho C, McGrath CM, Nelson DB, Parry S. Placental infection with human papillomavirus is associated with spontaneous preterm delivery. Hum Reprod 2008 Mar;23(3):709-15. (10) Armbruster- Moraes E, Ioshimoto LM, Leao E, Zugaib M. Presence of human papillomavirus DNA in amniotic fluids of pregnant women with cervical lesions. Gynecol Oncol 1994 Aug;54(2):152-8. (11) Favre M, Majewski S, De JN, Malejczyk M, Orth G, Jablonska S. A possible vertical transmission of human papillomavirus genotypes associated with epidermodysplasia verruciformis. J Invest Dermatol 1998 Aug;111(2):333-6. (12) Rombaldi RL, Serafini EP, Mandelli J, Zimmermann E, Losquiavo KP. Transplacental transmission of Human Papillomavirus. Virol J 2008;5:106. (13) Ruffin MT, Bailey JM, Roulston D, Lee DR, Tucker RA, Swan DC, et al. Human papillomavirus in amniotic fluid. BMC Pregnancy Childbirth 2006;6:28. 6