UDVASKNING AF PATOGENER GENNEM LERJORDE

Transkript

1 UDVASKNING AF PATOGENER GENNEM LERJORDE Forskningsprofessor Carsten Suhr Jacobsen 1&2 Specialestuderende Tina Bech 1&2 Konsulent Kaare Johnsen 3 Projektforsker Mette Lægdsmand 4 Forskningsleder Ole H. Jacobsen 4 Seniorforsker Ole S. Jacobsen 1 Ph.d. studerende Anita Forslund 2 Projektforsker Lise Tønner Klank 5 Professor Anders Dalsgaard 2 Danmarks og Grønlands Geologiske Undersøgelse, GEUS 1 Det Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet 2 Kaare Johnsen, 3 Det Jordbrugsvidenskabelige Fakultet, Aarhus Universitet 4 Veterinærinstituttet, Danmarks Tekniske Universitet 5 ATV MØDE FRA GYLLE TIL GRUNDVAND OG ANDRE MULIGE PROBLEMKILDER Schæffergården 30. januar 2007

2

3 RESUME GEUS har sammen med Det Biovidenskabelig Fakultet, Københavns Universitet (tidligere KVL) og Aarhus Universitet (tidligere Danmarks Jordbrugsforskning) gennemført undersøgelser over Salmonella sp. bakteriers udvaskning gennem monolitter fra sandede såvel som lerede jorde. Hurtig udvaskning sås kun fra de lerede jorde, hvor vi i mange prøver fandt over.000 Salmonella sp. pr. ml. (til sammenligning må der ikke findes én termotolerant coli-form indikator bakterie pr 0 ml drikkevand). Betydningen af disse resultater diskuteres. INTRODUKTION Mikroorganismer i jord the good, the bad and the ugly I pløjelaget i en dansk landbrugsjord findes der typisk op mod 9 bakterieceller pr. gram jord, og kun omkring 1 % af disse bakterieceller er mulige at dyrke på standard agarplader. Tilsvarende er der mange svampeceller i pløjelaget i en landbrugsjord, og der findes også et stort antal små dyr bl.a. protozoer der lever af bakterier og svampe i jorden. Jordens mikroorganismer repræsenterer en kæmpe forskellighed som vi plejer at forklare med at der, i et porøst medium som jord, er et betydeligt antal mikro-nicher, som enten giver nogle helt specielle livsforhold som passer til mikroorganismer med forskellige egenskaber - eller giver mulighed for, at alle tiders mikroorganismer kan gemme sig i årevis i små sprækker eller porer. Ofte er det en sammenblanding af disse forhold, men det er sikkert og vist, at den mikrobielle forskellighed i jord er enorm. Ved at analysere DNA isoleret fra jord, ved vi, at der findes en lang række forskelligartede DNA sekvenser i jord, og det er tanke-vækkende, at skulle nogle forsøge at opnå en fuldsekvens af DNA fra et gram jord ville det være ligeså vanskeligt som at forsøge at samle humane genomer på en gang /1/. Det påstås nogle gange at når det kommer til mikroorganismer i jord at alt er alle vegne forstået på den måde, at på grund af den enorme forskellighed, findes der i alle jorde, alle typer af mikroorganismer. De er måske ikke aktive lige nu - men til gengæld kunne de blive det, hvis de rette omstændigheder fandtes. Når vi snakker om bestemte mikroorganismer i jord som her smitstoffer (patogener) - er det derfor vigtigt at holde sig for øje at de komplicerede mikrobielle samfund i jord nødvendigvis har en stor indflydelse på hvordan nogle bestemte mikroorganismer i jord opfører sig. Det er vigtigt, at vi forsøger at forstå, at jorden i betydelig grad kan fungere både som et miljø for opformering og reduktion af antal mikroorganismer. F.eks. kan varme forhold føre til vækst af dyrkbare mikroorganismer, eksempelvis kan gruppen af koliforme bakterier formerer sig i jord. I den modsatte retning ses først og fremmest predationen som en vigtig reducerende faktor, idet protozoers græsning af f.eks. patogene bakterier er en vigtig måde til reduktion af antallet af patogene mikroorganismer. Zoonoser og indhold af patogener i husdyrgødning Fem forskellige mikroorganismer er normalt ansvarlige for de fleste undersøgte tilfælde af mavetarmsygdomme i Europa: Campylobacter spp., Salmonella spp. Escherichia coli O157, Yersinia enterocolitica og Cryptosporidíum parvum og i en undersøgelse af over husdyrbesætninger er

4 forekomsten af disse patogener undersøgt i gødningen /2/. Denne britiske undersøgelse viste, at der er store variationer i disse zoonotiske smitstoffers forekomst i forskellige husdyrgødningstyper, Salmonella sp findes generelt i flest besætninger, mens Cryptosporidium parvum findes i færrest besætninger. Vi har valgt at undersøge Salmonella sp. s transport i jord som et eksempel på en almindeligt forekommende patogen bakterie i husdyrgødning. FORSØGSOPSÆTNING Ved at bruge tetracyklinresistens som markør i testbakterier er det enklere at følge hvordan bestemte patogene bakterier udvaskes gennem jord. Vi gennemførte forsøg i fire store monolitter (jordsøjler) i Foulum i foråret 2006, monolitterne var 60 cm i diameter og 0 cm høje (figur 1). To af monolitterne stammede fra en opsprækket lerjord på Sjællands Odde og to stammede fra en sandet jord ved Jyndevad i Sønderjylland. Salmonella DSMZ554 blev dyrket frem i et flydende agarmedium og hvad der svarer til 8x 7 celler ml -1 af denne tetracyklinresistente bakterie blev tilsat til gylle der blev tilført monolitterne svarende til gødning med på 30 tons gylle pr. hektar. Et antal på 8x 7 celler er en høj men realistisk koncentration af Salmonella sp. i gylle, indholdet af Salmonella sp. variere naturligvis meget, og en koncentration af Salmonella sp. er i gennemsnit 2x 3 g -1 i britiske undersøgelser af kvæggødning, hvor man højest fandt 7x 6 g -1 /3/. Jyndevad, sandy soil Sjællands Odde, fracturated loamy soil Figur 1 Udtagning af monolitter fra Sjællands odde og Jyndevad og skematisk fremstilling af opstillingen. RESULTATER OG DISKUSSION Udvaskning af tetracyklinresistente Salmonella DSMZ554 gennem monolitter Udvaskningen af tetracyklinresistente bakterier er vist på figur 2. Det fremgår af forsøgene, at der er en stor forskel på udvaskningen af Salmonella DSMZ554 gennem leret jord og gennem sandet jord. I de sandende jorde sker der et langsommere flow af vand igennem jordene og det er kun i meget få tilfælde at der blev påvist tetracyklinresistent Salmonella DSMZ554 i vand-prøver efter transport gennem jorden. Anderledes ser det imidlertid ud for udvaskningen af Salmonella DSMZ554 gennem den opsprækkede lerjord fra Sjællands Odde. I løbet af 26 dage hvor det gennemstrømmende vand blev analyseret for tilstedeværelse af tetracyklinresistente Salmonella DSMZ554 blev

5 der fra dag 2 fundet bakterien i alle undersøgte vandprøver. Det højeste antal Salmonella DSMZ554, der blev fundet i drænvandet, var celler pr. ml. A B cfu/ml 00 0 cfu/ml time/h time/h Figur 2. Udvaskning af Salmonella DSMZ 554 igennem to monolitter (60x0 cm). A og B er to replikate søjler udtaget på Sjælland Odde. Efter tre uger blev der i begge lermonolitter fundet koncentrationen mellem 300 og 1300 tetracyklinresistente Salmonella testceller pr. ml. De høje koncentrationer af Salmonella DSMZ554 viser at smitstoffer tilført med gylle på jord under særlige omstændigheder kan tilføres grundvand. Drikkevand må ifølge lovgivningen ikke indeholde smitstoffer. Forekomst af Salmonella DSMZ554 i jordlag i monolitter Monolitterne blev skåret op og analyseret 26 dage efter, der var tilsat Salmonella DSMZ554 til overfladen af jorden. Det ses på figur 3 at testbakterien da stadig kan findes i alle fire monolitter. Sammenligning af de lerede og de sandede monolitter viser nogenlunde det samme antal Salmonella DSMZ554 i de øverste cm af jorden i de fire monolitter. Det ses imidlertid, at der er betydelig forskel mellem hvor mange Salmonella DSMZ554 der findes i de nederste jordlag, idet der findes færre testbakterier i den sandede jord. Vi har ikke i denne undersøgelse kigget på langtidsoverlevelsen af bakterien, men andre undersøgelser viser overlevelse af flere patogener i månedsvis /2/.

6 A B depth/cm depth/cm C D depth/cm depth/cm Figur 3: Antal Salmonella DSMZ554 fundet i de forskellige undersøgte jordlag i monolitterne. A og B de to lerede monolitter fra Sjællands Odde. C og D: de to sandede monolitter fra Jyndevad. De fundne værdier for udvaskning af Salmonella DSMZ554 viser at bakterielle smitstoffer hurtigt og i relative høje koncentrationer kan transporteres med drænvand gennem især lerjord. Det er derfor sandsynliggjort at bakterielle smitstoffer i gylle kan transporteres med drænvand gennem jord til grundvand. De fundne resultater er ikke overraskende da transport af partikler (med samme størrelse som bakterier) gennem opsprækket jord er vist at kunne foregå hurtigt. I forbindelse med et stort smitteopsporingsarbejde ved en alvorlig forurening af drikkevandet i byen Walkerton i Canada blev det konkluderet at en fækalforurening med E.coli O157:H7 og Campylobacter jejuni af grundvandet skyldtes infiltrering efter current best manure management practices /4/. Der findes andre eksempler hvor drikkevandsforurening med E. coli O157 er vist relateret til udbringning af husdyrgødning, men her kunne det ikke kon-kluderes at forureningen skete som følge af smitstoftransport gennem jorden, forureningen kunne også være sket gennem overfladeafstrømning til dårligt vedligeholdte brønde eller boringer /5/ og /6/.

7 Fenlon et al 2000 fandt at E. coli O157 blev udvasket til dræn efter udbringning af husdyr-gødning med E. coli O157. Afhængig af regnvejrsintensiteten kunne mellem 0,2% og % af den udbragte koncentration af E. coli O157 genfindes i drænvandet /7/. I et senere studie fandt Vinten et al. /8/ også udvaskning af E. coli O157 til drænvand efter tilsætning af kvæggylle, og i den første drænflowmåling fandt de mellem 1x 3 og 1x 4 CFU ml -1 af E. coli O157. KONKLUSION Disse første danske forsøg med udvaskning af bakterielle smitstoffer gennem monolitter viser at transport og udvaskning gennem jord med drænvand kan ske ved tilførsel af gylle forurening med Salmonella sp. Den hurtigste transport ned i gennem jord skete i den opsprækkede lerjord fra Sjællands Odde og her blev der gentagne gange fundet over.000 Salmonella sp. pr ml i drænvandet. REFERENCER /1/ Craig Venter interview 2006 Discoveries in the dirt. /2/ Nicholson, F.A., Groves, S.J. and Chambers, B.J. (2005) Pathogen survival during livestock manure storage and following land application Bioresource Technology, 96(2), /3/ Hutchison, M. L., Walters, L. D., Avery, S. M., Munro, F., Moore, A. (2005). Analyses of Livestock Production, Waste Storage, and Pathogen Levels and Prevalences in Farm Manures. Appl. Environ. Microbiol. 71: /4/ Unc, A. and Goss, M.J. (2004) Transport of bacteria from manure and protection of water resources. Applied Soil Ecology 25(1), /5/ Dev, V.J., Main, M. and Gould I. (1991) Waterborne outbreak of Escherichia coli O157. Lancet 337,1412. /6/ Swerdlow, D.L., Woodruff, B.A., Brady, R.C., Griffin, P.M., Tippen, S., Donnell, Jr., H.D., Geldreich, E., Payne, B.J., Meyer, Jr., A., Wells, J.G., Green, K.D., Bright, M., Bean, N.H. and Blake, P.A., (1992) A waterborne outbreak in Missouri of Escherichia coli O157:H7 associated with bloody diarrhea and death. Annals of Internal Medicine 117, /7/ Fenlon, D.R., Ogden, I.D., Vinten, A. and Svoboda, I. (2000) The fate of Escherichia coli and E. coli O157 in cattle slurry after application to land. Journal of Applied Microbiology 88: /8/ Vinten, A.J.A.; Lewis, D.R., Fenlon, D.R., Leach, K.A., Howard, R., Svoboda, I., and Ogden, I. (2002) Fate of Eschericai coli and Eschericia coli O157 in soils and drainage water following cattle slurry application at 3 sites in southern Scotland. Soil Use and Management 18(3),

8