VALIDERING AF DYRKNINGSMETODER I KLINISK MIKROBIOLOGI

Transkript

1 VALIDERING AF DYRKNINGSMETODER I KLINISK MIKROBIOLOGI David Fuglsang-Damgaard Specialeansvarlig overlæge (og teknisk assessor DANAK) Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aalborg Universitetshospital

2 VAL I D ERING AF D YR K NINGSMET ODER I K L I NISK MI K R OBIOLOGI HVAD ER STATUS I DK FOR VALIDERING AF DYRKNINGSBASEREDE METODER KOMPLEKSITETEN I METODERNE MANGEL PÅ GULDSTANDARD BIOLOGISKE FÆNOMENER OG BIOLOGISK DRIFT PRAKTISKE EKSEMPLER PÅ VALIDERING OG UDFORDRINGER

3 VAL I D ERING AN VEN DT SYN TAKS I F OR EDRAGET Validering af analyser/test udføres ved; a) Metoder der ikke er standardmetoder b) b) Metoder, der er udviklet/udformet af laboratoriet c) Standardmetoder der anvendes uden for deres tilsigtede anvendelseområde d) Validerede metoder der efterfølgende er ændret Bør omfatte; Målekorrekthed, målenøjagtighed, præcision, måleusikkerhed, detektionsgrænse Repertérbarhed, intermediær præcision, sensitivitet, specificitet (kvantitative mål) (kvalitative mål) Interfererende substanser, prøvematerialet(standardiseret vs. non standardiseret) Dokumentere den anvendte metode og resultaterne

4 F OR SKELLEN MEL L EM D E VI D ENSKABELIGE D I SCIPLINER Billede omfattet af copyright Link: Efter Auguste Comte ( ) Hierarchy of the Sciences

5 I SO AK K R EDITERING I K L I NISK MI K R OBIOLOGI I D AN MAR K STATENS SERUM INSTITUT (ISO17125) KMA OUH (ISO15189) KMA SLAGELSE (ISO15189) KMA AALBORG (ISO15189) 3 DYRKNINGSBASEREDE METODER AKKREDITERET EFTER ISO15189 LUFTVEJSPATOGENE DYRKNING URINPATOGENE DYRKNING TARMPATOGENE BAKTERIER (DYRKNING) (KMA OUH) (KMA SLAGELSE) (KMA AALBORG)

6 MET ODER I K L I NISK MI K R OBIOLOGI - STAT US ESTIMERET ANDEL I DK IN-HOUSE KOMMERCIEL /STANDARD METODE KVALITETSKONTROL DÆKNING EKSTERN KONTROL INTERN KONTROL MIKROSKOPI 20-40% 60-80% MIDDEL/DÅRLIG DÅRLIG/INGEN DYRKNING >90% <10% DÅRLIG DÅRLIG/INGEN

7 MET ODEANBEFALINGER - EVI D ENS

8 H VOR ER VI MED STAN DARDISERING I D K - T ERMI NOLOGI

9 Transport Opbevaring IT/Svar K OMPL EKSITETEN I MET ODERNE - B L OD DYRKNING Inkubering Mikroskopi Aflæsning Identifikation Resistens Bactec Plademedier Varmeskabe Gram-farvning Api MALDI-TOF-MS Hurtig ID DensiCheck E-test Tablet diffusion

10 K OMPL EKSITETEN I MET ODERNE - U R I NDYRKNING Anvendt apparatur: WASP udsåningsrobot CO 2 inkubator (primær dyrkning) Almindelig inkubator (resistensbestemmelse) Densicheck (resistensbestemmelse) MALDI-TOF-MS apparatur (identifikation) Anvendte reagenser/forbrugsvarer: 3 plademedier 14 resistenstabletter Anvendte bioanalytikere og evt. læger: Op til 4 afhængigt af kompleksitet og tilfældighed I alt mindst 5 apparaturer, mindst 17 komponenter og op til 4 personer for ét fund i en urindyrkning!

11 K OMPL EKSITETEN I MET ODERNE - K EN DT E VS. U K EN DTE U D FALD Tarmpatogene bakterier (Dyrkning) Blod (Dyrkning) Defineret liste over mikroorganismer: Ikke endelig liste over mikroorganismer Campylobacter coli/jejuni? Salmonella species Vibrio cholerae Shigella species Yersinia enterocolitica Historisk <20 kombinationer af svar Historisk >>200 kombinationer af svar

12 K OMPL EKSITETEN I MET ODERNE VAL G AF MET ODE Præanalyse Prøveremedier (diverse fabrikater) Analyse Plademedier (5% blod, 10% blod, chokoladeplade, kromogene, selektive plader, m.fl.) Inkubation (atmosfærisk luft, CO 2, mikroaerofilt, anaerobt) Temperatur (stuetemperatur, 35 C, 37 C, 42 C) Tid (1, 2, 4, 6, 10, 14, 21 dage) Identifikation (MALDI-TOF-MS, API, diverse hurtig test, Resistensbestemmelse (discdiffusion, gradient MIC, mikrotiter MIC, automatiseret MIC) Postanalyse Postanalytisk strukturering af svar (hvad betragtes som (potentielt) patogent og rapporteres)

13 MAN GEL PÅ GU L DSTANDARD F OR EN SYGD OMSENTITET Hvordan defineres en patient som havende pneumokok pneumoni? a) Klinisk pneumoni diagnose (klinisk) b) Röngten thorax med lobær pneumoni (paraklinisk) c) Luftvejsprøve med vækst af S. pneumoniae (paraklinisk) d) Bakteriæmi med vækst af S. pneumoniae (paraklinisk) e) Positiv pneumokok urin antigen test (PUT) (paraklinisk) f) Luftvejsprøve med PCR positiv for S. pneumoniae (paraklinisk) e) Alle øvrige årsager til pneumoni udelukket (paraklinisk) En eller flere af ovenstående kan formentlig anvendes som sammensat Guldstandard, men det er næppe praktisk gennemførbart for alle kombinationer af målorganismer.

14 MAN GEL PÅ GU L DSTANDARD F ORT OLKNING AF B ET YDNING 5 danske KMA er 10 simulerede urindyrkningsfund (ikke dyrket) 21 påviste bakterier = Konsensus rapportering 10af21 Azuz S et al. Infect Dis. 2017

15 VI GT IGHEDEN AF D EN K L I NISKE K ONT EKST Staphylococcus epidermidis, vækst af Podning, sår Vævsprøve 1. tå (Diabetes Mellitus) Kammeprøve (hofteprotese) 5af5 prøver tolkning = hudflora, helt uden betydning! tolkning = hudflora/potentielt patogen? tolkning = signifikant fund! E. coli 10e5 CFU/ml Urin, midtstråle (65 årig uden symptomer) Urin, midtstråle (65 årig med symptomer) tolkning =asymptomatisk bakteuri tolkning =signifikant dyrkningsfund

16 AN VEN DELSE AF K OMMEN TARER/FORTOLKNING H YPPI G Den samlede konklusion kan afhænge af flere (og forskellige) serielle prøver!

17 SER I ELLE PR ØVER SAML ET VU R D ERING

18 SER I ELLE PR ØVER SAML ET VU R D ERING

19 Observeret fordeling % (DNA eller dyrket mængde) MAN GEL PÅ GU L DSTANDARD H VI LKEN MET ODE ER T ÆT TEST PÅ SAN D H EDEN? FP 16s PCR FN dyrkning FN 16s PCR Pasteurella canis Bacillus cereus Rhizobium radiobacter Acinetobacter species Prevotella species Streptococcus agalactiae Staphulococcus aureus s Dyrkning

20 B I OLOGISK D R I FT - H OW T O H I T A MOVI N G TAR GET Billede omfattet af copyright Link: Fysik og Kemi Biologi

21 B I OLOGISK D R I FT - R ESI STENSBESTEMMEL SE E. coli (meropenem resistent) Fænotypisk carbapenemase test: Immunkromatografisk test: PCR (GenXpert): KPC positiv Negativ Negativ Whole-genome-sequencing (WGS): IMI positiv Brandt C et al. Sci Rep. 2017

22 B I OLOGISK D R I FT AR T SBEGREBET OG I D ENT IFIKAT ION Conclusion The bacterial domain of life is not uniform. Instead we see clumps of similar strains that share many characteristics, and with an innate human urge to classify, we have defined these as species. Hanage WP et al. BMC Biology En art er ikke en SI enhed

23 PR AKT ISKE EK SEMPL ER PÅ U D F ORDRINGER PR ÆAN ALYT ISK U SI K KERHED Ofte større end den analytiske usikkerhed; Mikroorganismen Mikroorganismens fordeling Hæmmende faktorer Podepinden Podningsproceduren Transport Temperatur m.fl. Gør det svært at argumentere for at analytiske usikkerheder bestemmes minutiøst i validering

24 S. aureus S. pyogenes PR AKT ISKE EK SEMPL ER PÅ U D F ORDRINGER PR ÆAN ALYT ISK U SI K KERHED Ikke standardiseret prøvemateriale Podning 1 Podning 2 Podning v ++ Podning 2 0 v af20 med overensstemmede kvantitering 8af 20 med varierende kvantitering (minor error) 2af20 med varierende konklusion (major error) + = få kolonier ++ = en del kolonier +++ = mange kolonier Opformering (P. aeruginosa) & hæmning (N. gonorrhoeae) under transport P. aeruginosa ørepodning (antal fund / antal prøver) 2011 (før E-swab) 3.kvartal 47/251 = 0,18 (95%CI: 0,14-0,24) 2013 (efter E-swab) 3.kvartal 67/274 = 0,24 (95%CI: 0,19-0,29) Egne data

25 Log(CFU/ml) PR AKT ISKE EK SEMPL ER PÅ U D F ORDRINGER K VAL ITAT IV OB JEKTIV B ED ØMMEL SE Antal fund rapporteret (urindyrkning) Kvantitering (urindyrkning) 6 1,5 1,7 1,6 5 4 Reference CFU/ml Målt (aflæst) CFU/ml 1,4 1,4 1,5 1,4 AFLÆSNING (MEAN) KONSENSUS AFLÆSNING Lineær (Målt (aflæst) CFU/ml) 0 mdr 6 mdr 12 mdr 18 mdr Log(CFU/ml) Systematiske usikkerhed tiltaget over tid Systematiske usikkerhed i valideringsperioden Egne data

26 PR AKT ISKE EK SEMPL ER PÅ U D F ORDRINGER U F ORUDSETE B I OLOGISKE F ÆN OMEN ER - H ÆMN I NG E. coli (isolat 1) E. coli (isolat 2)

27 PR AKT ISKE EK SEMPL ER PÅ U D F ORDRINGER Hvor mange forskellige bakterier er der i prøven? Tolkning 1: Mikrokolonier i CTX zone er udspaltninger af samme klon der udtrykker kromosomal ampc betalactamase Tolkning 2: Mikrokolonierne i CTX zonen er en unik bakterie der skal betragtes som selvstændigt fund. Eschericia coli Ovenstående vil evt. kunne afklares ved whole-genome-sequencing, men dette er ikke realistisk i en klinisk sammenhæng

28 PER SPEKTIV Der er behov for validering af dyrkningsbaserede metoder og.. der er behov for mere standardisering af dyrkningsbaserede metoder i Danmark men.. der eksisterer ikke en manual for hvordan og Klinisk Mikrobiologi Klinisk Biokemi øvrige laboratorie specialer

29 Spørgsmål og kommentarer?