Validering af gramfarvning af bakterier

Transkript

1 Valideringsrapport Gramfarvning af bakterier Formålet med valideringen At dokumentere at KMA, OUHs kan anvende gramfarvning til at identificere grampositive og negative bakterier, samt karakterisere morfologi/lejring. Baggrund Gramfarvning er en standardmetode, der siden at gramfarvningen blev beskrevet i 1884 af Chr. Gram, har været en af de primære metoder til at inddele og karakterisere bakterier. Visse grupper af bakterier er dog kendt som gram-labile. På den baggrund er fokus for denne validering blot at dokumentere at metoden giver de forventede resultater på KMA, OUH indenfor grupper af gram-stabile bakteriearter. Analysens robusthed Resultatet af en farvemetode vil afhænge af en række faktorer, blandt andet medarbejderens kompetence, mikroskopets funktionsegnethed og de anvendte reagenser. Af samme grund har KMA mhp. at sikre en til enhver tid optimal kvalitet etableret et system til kompetenceudvikling og registrering, et service- og kontrol-system til apparatur samt inkluderet daglig kontrol af reagenser. Acceptkrav for valideringen Præp nr. Stamme Gram +/- Form, Lejring Acceptkriterier 1 E. coli ATCC Stave 90 % korrekte svar 2 E. fæcalis ATCC Kokker, hobe eller diplo 90 % korrekte svar 3 B. fragilis ATCC Stave 90 % korrekte svar 4 S. pneumoniae ATCC Kokker, diplo 90 % korrekte svar 5 H. influenzae NCTC Stave 90 % korrekte svar 6 S. aureus ATCC Kokker, hobe 90 % korrekte svar 7 P. aeruginosa ATCC Stave 90 % korrekte svar 8 B. thetaiotaomicron ATCC Stave 90 % korrekte svar 9 C. perfringens DSM Stave 90 % korrekte svar 10 C. jejuni ATCC Stave 90 % korrekte svar Beskrivelse af materiale og undersøgelsesmetode til valideringen Materiale Objektglas med 10 ATCC-stammer repræsenterende både grampositive og negative samt forskellig morfologi, se tabel ovenfor. Undersøgelses-metoden De ti forskellige præparater er over tre dage blevet gramfarvet og mikroskoperet af 5 forskellige bioanalytikere. Valideringen baserer sig dog kun på resultater fra 2 dage (10 bioanalytikere), da 3. dags præparater var blevet forurenet med corynoforme stave, og resultater herfra er derfor blevet udeladt. Side 1 af 8

2 Til valideringen er anvendt de samme metoder, som anvendes i den daglige diagnostik, se bilag Mik Gramfarvning, Mik Mikroskopisk form og lejring af bakterier og svampe, MIK - Mikroskopering af gramfarvet præparat og Mik Oversigt over hvad der skal medtages ved mikroskopi. Valideringsgruppe Valideringsrapport udarbejdet af: Afdelingsbioanalytiker Jeannette Mikkelsen. Godkendelse af valideringsrapport: Overlæge Thøger Gorm Jensen. Valideringsresultater Præp. nr. Stamme Gram Bemærkninger % korrekte svar E. coli ATCC E. fæcalis ATCC B. fragilis ATCC S. pneumoniae ATCC H. influenzae NCTC S. aureus ATCC P. aeruginosa ATCC B. thetaiotaomicron ATCC markering sat mellem gram + og -, derfor undtaget 90 9 C. perfringens DSM C. jejuni ATCC Præp. nr. Stamme Form, Lejring % korrekte svar Stave Stave i Kokker i Kokker vinkel hobe i kæde 1 E. coli ATCC E. fæcalis ATCC B. fragilis ATCC S. pneumoniae ATCC H. influenzae NCTC S. aureus ATCC P. aeruginosa ATCC B. thetaiotaomicron ATCC C. perfringens DSM C. jejuni ATCC Vi vurderer ikke person til person variation og dag til dag variation som værende betydende. Konklusion Da valideringsresultater for gramfarvning overholder acceptkrav, betragtes metoden som valideret. Side 2 af 8

3 Bilag 1 MIK - Gramfarvning Gramfarvning: 1. Kontrollér at ethanolen er farveløs. Hvis ikke, kasseres væsken, og nyt fyldes i. 2. Luftørring af præparat. 3. Flambering af præparat. 4. Krystalviolet i 1 minut. 5. Afskylning med vand i max. 5 sek. 6. Jod-Jod kalium i 1 minut. 7. Afskylning med vand i max. 5 sek % ethanol i ca. 30 sek., eller til præparatet er affarvet fuldstændigt. Vug karret under proceduren. 9. Afskylning med vand i max. 5 sek. 10. Karbolfuchsin (10%) i 15 sekunder. 11. Afskylning med vand i max. 5 sek. 12. Aftørring i filterpapir. Farvekarrene til gramfarvningen. Ændret siden sidst: Side 3 af 8

4 Bilag 2 MIK Mikroskopisk form og lejring af bakterier og svampe Form: Bakteriers form er forskellig, og efter formen kan man dele bakterierne op i grupper. De forskellige former er: Kokker (runde), Stave (stavformede, skrueformede). Lejring: Bakterierne har ofte en artstypisk karakteristisk indbyrdes lejring, f.eks. lejrer stafylokokker sig i hobe og streptokokker sig i kæde. Form Lejring Tegning Størrelse I hobe Kokker I kæde Diplo Stave Pleomorfe Længde1-4 µm Bredde 0,3 1 µm Stave Coryneforme Svampe Skrueformede Gærceller Længde 5 20 µm Skimmelsvampe Side 4 af 8

5 Bilag 3 MIK - Mikroskopering af gramfarvet præparat. Præparatet mikroskoperes for bakterier og svampe med 100x objektiv med immersionsolie. Bakteriers gramreaktion, form og lejring LINK bedømmes. Røde bakterier = Gram negative Blå/sorte bakterier = Gram positive Gram negative Gram positive Gærceller farves blå/sorte: Epithelceller og leukocytter (og lungeslim) farves røde: Sporer farves ikke, men ses som lysende afgrænsede opklaringer inde i bakterien Fejlkilder: Kulturens alder: Bakteriekulturer <24 timer gamle er de bedste at farve, herefter kan grampositive bakterier have en tendens til at blive gramnegative Side 5 af 8

6 Antibiotikabehandling: Gram positive bakteriers cellevæg kan beskadiges af antibiotikabehandling, så de ikke kan binde krystalviolet, og dermed ser gram negative ud efter farvning Affarvning: o Tykke præparater er svære at affarve, tynde præparater foretrækkes o For kort affarvning -> Gram negative bakterier kan se gram positive ud o For lang affarvning -> Gram positive bakterier kan affarves og se gram negative ud o Fortyndet alkohol kan affarve nogle gram positive bakterier, vær opmærksom på at alkoholen ikke fortyndes med andre væsker under farvningen Gramvariable bakterier: Mister hurtigt deres gram positive egenskab, og kan kun delvist, eller slet ikke, farves blå/sorte Side 6 af 8

7 Bilag 4 MIK - Oversigt over hvad der skal medtages ved mikroskopi Materiale Bakterier/svampe* Mononukleære celler (billede) Polymorfnukleæreceller (billede) Pladeepithel celler (billede) Cylinderepithel celler (billede) Alveolemakrofager (billede) Krystaller (billede) Spinal X X X Pericardievæske/ Pleuravæske X X X Liquor X X X Ledvæske X X X X (hvis Pus X X X BAL** X X X X X X TB Blod (dyrkningskolbe) Syrealkoholfaste X Trachealsekret*** X X X X X X rekvireret) *For at erklære en mikroskopi negativ for mikroorganismer skal der med 100x objektiv gennemses 100 synsfelter med prøvemateriale. **BAL-væsker screenes med 10x objektiv. Velegnede områder med prøvemateriale (få pladeepithel) udvælges. I disse områder vurderes antal celler med 10x objektiv. Antal mikroorganismer vurderes med 100x objektiv. ***Mikroskopering af trachealsekret foretages ikke rutinemæssigt, men kun ved anmodning fra vagthavende læge, eller hvis rekvirenten beder om det. Side 7 af 8

8 Kvantitering af mikroorganismer og celler Antal mikroorganismer og celler 10 x objektiv 100 x objektiv Enkelte < 10 < 1 En del Talrige > 100 > 10 Side 8 af 8