Identifikation af Candida species på kromogene medier

Transkript

1 Bioanalytikerstuderende Majbritt Bach Rasmussen 2013 Identifikation af Candida species på kromogene medier Studienummer: I vejleder: Birte Sivebæk Lektor Cand. Scient. K vejleder: Dorte Paulmann Bioanalytikerunderviser Antal tegn: inklusiv mellemrum 0

2 Indhold Forord Introduktion Baggrund Formål Problemformulering Mål formuleringer Teori Candida Identifikation af Candida species på KMA AUH Kromogene medier BD CHROMagar Brilliance Candida ChromID Candida Materialer Candida species isolater Kontrolstammer Diverse Metode Litteratursøgning Metode Identifikation af Candida species i forsøget Databehandling Resultater BD CHROMagar Brilliance Candida

3 5. 3. ChromID Candida Sensitivitet og specificitet Blandingskulturer Diskussion Diskussion af metode Diskussion af BD CHROMagar Diskussion af Brilliance Candida Diskussion af ChromID Candida Diskussion af blandingskulturer Konklusion Perspektivering Referencer Bilag Bilag 1 Isolater bloddyrkninger KMA AUH Bilag 2 Data BD CHROMagar Bilag 3 Data Brilliance Candida Bilag 4 Data ChromID Candida Bilag 5 Udregning for sensitivitet for C. albicans Bilag 6 Udregning for sensitivitet og specificitet Bilag 7 Blandingskulturer BD CHROMagar Brilliance Candida ChromID Candida

4 Forord Dette Bachelor projekt er udarbejdet af bioanalytikerstuderende Majbritt Bach Rasmussen under modul 14 på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling på Århus Universitetshospital. Forsøget er planlagt i samarbejde med bioanalytikerunderviser Dorte Paulmann og er udført i perioden uge 43 og i samarbejde med bioanalytikerstuderende Christina Hedegaard Hansen og Kasper Klitgaard Lauritzen. Dette projekt henvender sig til bioanalytikerstuderende, bioanalytikere og til fagligt personale og afdelinger med interesse i Candida species og identifikation af disse på kromogene medier. Tak til de øvrige studerende for godt samarbejde og sparring og tak til Birte Sivebæk og Dorte Paulmann for god vejledning under projektet Dato Majbritt Bach Rasmussen 3

5 1. Introduktion Baggrund Candida er en gærsvamp der forekommer i naturen, hos planter og dyr, samt i normalfloraen hos mennesker i huden, i tarmen og slimhinderne. I Danmark er der dokumenteret 500 forskellige arter, hvoraf 10 hyppigt er årsag til infektioner med Candida, candidose (1) (2), og disse 10 Candida species er årsag til mere end 90 % af observerede alvorlige infektioner (1). Candida er opportunister der etablerer en infektion når værtens immunforsvar svækkes, men de betragtes som lavpatogene. Candida infektioner ses derfor ofte hos immunsupprimerede eks. HIV og onkologiske patienter i kemobehandling (2), hos ældre mennesker, ved antibiotisk behandling, ved fremmedlegemer eks. katetre, tørre slimhinder og strålebehandling (1). Ved behandling med antibiotika er der observeret øgede mængder Candida i normalfloraen. Dette kan blot være en kolonisation uden infektion til følge eller det kan medføre en infektion. Kolonisation af Candida medfører hyppigst generende og ikke livstruende kutane infektioner der ofte ses i slimhinder og hudfolder (1). Candida kan sprede sig til blodet og forårsage livstruende candidæmi og desuden udvikle Candida infektioner i de indre organer. Candida species ses hyppigt ved nokosomielle infektioner. På intensiv afdelinger anvendes der ofte bredspektrede antibiotika, som kan medføre at patienternes slimhinder koloniseres af Candida og som følge heraf udvikle candæmi. I Danmark var incidensen af candæmi i / indbyggere, og mortaliteten ved denne tilstand er over 40 %. I USA var Candida den 4 hyppigste årsag til sepsis i 2008 (1). Forekomsten af infektioner med Candida, er stigende som følge af højere levealder og den stigende anvendelse af antibiotika og cytostatika (2). Det er derfor af høj prioritet at 4

6 mikrobiologiske afdelinger i Danmark kan diagnosticere Candida species hurtigt og korrekt (3). Den hyppigst forekommende art ved infektioner er C. albicans, som ses ved ca. 50 % af alle Candida infektioner (3). C. glabrata ses med en øget hyppighed og udgør ca. 20 % af Candida infektionerne (1). De mest virulente arter er C. albicans og C. tropicalis. C. glabrata, C. lusitaniae og C. kefyr er moderat virulente. De mindst virulente arter er C. krusei, C. parapsilosis og C. guilliermondii (1). C. albicans er følsomme for fluconazol ligesom flere af de øvrige arter (1) (2). Hos disse øvrige arter kan der observeres varierende følsomhed der skyldes en udviklet resistens eks efter gentagne behandlinger og C. krusei er resistent overfor fluconazol (4). Idet C. albicans er den hyppigst forekommende kilde til Candida infektioner og mest virulente igangsættes fluconazol behandling indtil der foreligger en arts identifikation (2). De Candida species der er resistente overfor fluconazol skal behandles med mere bredspektrede og dyrere medikamenter der er virksomt på alle Candida arter (2). Caspofungin, Micafungin, Amphotericin B, Voriconazol og Posaconazol er effektivt og virker på alle Candida arter (2). Ampfotericin B er toksisk for den humane organisme ved systemisk brug og derfor begrænses anvendelsen (3). Klinisk mikrobiologisk afdeling, KMA, på Aarhus Universitetshospital, AUH, benytter BD CHROMagar fra Becton, Dickinson og Company til identifikation af Candida species, som kan identificere visse arter inden for 48 timer (5). Der er udviklet flere kromogene medier til identifikation af Candida species fra flere producenter. Oxoid har udviklet Brilliance Candida (6) og Biomérieux har udviklet ChromID Candida (7). Ifølge begge producenter kan disse medier identificere C. albicans inden for 24 timer og nogle øvrige arter inden for timer (6) (7). 5

7 Det er vigtigt at identificere den specifikke Candida art, med henblik på hurtig og korrekt behandling Formål Formålet med projektet er at undersøge om ChromID Candida eller Brilliance Candida kan identificere Candida species på kortere tid og om de har en større sensitivitet og specificitet end BD CHROMagar Problemformulering Hvilke fordele og ulemper er der ved at benytte Brilliance Candida og ChromID Candida til at identificere Candida species i forhold til BD CHROMagar og hvilket medie bør anvendes på Klinisk mikrobiologisk afdeling? 1. 4 Mål formuleringer Der ønskes undersøgt om ChromID Candida og Brilliance Candida er hurtigere til at identificere Candida species end BD CHROMagar. Dette undersøges ved, at 100 kendte isolater af Candida species fra bloddyrkninger udstryges på de tre forskellige kromogene medier og farveudviklingen observeres efter 24 og 48 timer. Disse farveudviklinger bør føre til en identifikation af de Candida species, som de kromogene medier ifølge producenterne kan identificere. Der foretages en metodesammenligning af de tre kromogene medier efter 24 og 48 timer. Dette gøres ved at identifikationer der foretages under forsøget vurderes i forhold til Vitek 2 der tidligere har identificeret de 100 isolater til artsniveau. Derefter udregnes mediernes sensitivitet og specificitet til at identificere Candida species. Der ønskes undersøgt om der kan foretages en korrekt identifikation ved blandingskulturer med Candida species. Dette gøres ved at blande to - tre 6

8 forskellige Candida species i en McFarland opslæmning og udstryge denne suspension på de kromogene medier. Derefter observeres om de udstrøgne Candida species kan identificeres ifølge producenternes beskrivelser efter 24 timer og 48 timer. 2. Teori Candida Candida er encellede gram positive organismer. Cellerne er ovale, runde eller aflange med evt. knopskydninger og hyfer (5). De formerer sig ved knopskydning hvor cellen modnes og danner en dattercelle. Dattercellen, blastoconidium, vokser og adskilles fra modercellen (1). Dattercellen kan også forlænge sig på modercellen og danne lange trådformede sammenhængende celler, pseudohyfer. De kan også danne lange trådlignende strukturer med parallelle vægge, ægte hyfer (8). Figur 1 viser mikroskopi af Candida med knopskydninger og hyfer (9) Denne forøgelse af celler vil føre til dannelse af kolonier der ligner bakterie kolonier på næringssubstrater. Kolonierne er ofte flødefarvede med glat overflade og der kan evt. observeres frynser omkring kolonierne der får dem til at fremstå stjerneformede. Der er observeret gulligbrune og laksefarvede kolonier med ru og rynket overflade, hvis der er udtalt hyfedannelse (1). 7

9 C. albicans er den mest virulente patogene Candida species. Candida har forskellig virulensfaktorer der er afhængige af adhæsiner, produktionen af enzymer der fremmer invasion og deres dannelse af hyfer som fremmer penetration (8). Candida har en udtalt evne til at adhærere til celleoverflader og derefter udskiller de enzymer der nedbryder det omkringliggende væv. Candida kan penetrere det omkringliggende væv med pseudohyfer og hyfer og spredes til blodet og etablere infektioner sekundære steder (1). Candida har desuden en evne til at adhærere til plasticmaterialer, som eks. intravenøse katetre hvor de danner en biofilm og beskyttes og integreres i materialet (1). Derfor er de vanskelige at behandle og det bidrager til resistensudvikling (10). Intravenøse katetre og øvrige fremmedlegemer er ofte årsag til candæmi og potentielt kontaminerede katetre og øvrige fremmedlegemer udskiftes ved mistanke om infektion (11). Ved ikke livstruende infektioner opstartes behandling med Fluconazol og ved candæmi igangsættes bredspektret behandling eks. Caspofungin og Amphotericin B der effektivt kan behandle de fleste Candida species (10) (4). En tidlig behandling er ofte nødvendig for en god prognose (10). Det er relevant at identificere Candida species, for at undersøge om det er en tilfældig kolonisation eller en systemisk infektion og ved mistanke om dette foretages podninger fra relevante steder og bloddyrkninger (11) Identifikation af Candida species på KMA AUH Candida species kan identificeres ud fra koloniernes morfologi på dyrknings medier og ved mikroskopi af deres strukturer (12). På KMA AUH udstryges Candida kolonier på BD CHROMagar, inkuberes ved 37 0 C og arten identificeres visuelt efter 48 timer (5). Ved en rekvireret Candida undersøgelse udstryges prøvemateriale på Sabourad agar og derefter på BD CHROMagar der identificeres efter 48 timer. 8

10 Ved positive bloddyrkninger mikroskoperes blodet og ved fund af Candida udstryges blod på Sabouraud med glucose og inkuberes i 24 timer. Derefter identificeres og resistensbestemmes Candida species på Vitek 2 (5). Resistensbestemmelse er vigtig ved alvorlige infektioner og hvis den påviste Candida ikke er en C. albicans eller hvis personen tidligere har været i behandling for Candida (12) Kromogene medier De kromogene medier er selektive og bruges til isolering og identifikation af visse Candida species. De er tilsat antibiotika, hvoraf to af dem er tilsat Chloramphenicol der virker bredspektret for bakterier (6, 13, 14) Medierne skal inkuberes i et givent tidsrum ved en given temperatur. Nedenfor vises tabel med producenternes anbefalinger (6, 13, 14). Medier Inkubationstemperatur Inkubationstimer Ilt forhold Øvrige BD 35 ± 2 0 C Aerobe Mørkt CHROMagar Brilliance 30 0 C Aerobe Ingen Candida ChromID Candida 37 0 C Aerobe Mørkt Tabel 1 viser producenternes anbefalinger for inkubationstemperatur, tid, ilt forhold og øvrige forhold for BD CHROMagar, Brilliance Candida og ChromID Candida ( 6, 13, 14) 1 Mediet skal identificeres i 42 timer for at opnå fuld farveudvikling af kolonier Medierne indeholder chromogener der frigiver forskellige farvede forbindelser hvis de nedbrydes eller hydrolyseres af enzymer fra Candida species. Visse Candida species kan direkte påvises på medierne (6, 13, 14). Nedenfor vises tabel med producenternes beskrivelse af farveudviklinger der kan identificere eller være vejledende til identifikation af visse Candida species (6, 7, 13, 14): 9

11 Candida species BD CHROMagar Brilliance Candida ChromID Candida C. albicans Lysegrønne - mellem Grønne Lyseblå mørkeblå grønne C. glabrata Rosa lys/mørk lilla Gule, beige og brune - C. krusei Lys rosa med hvid kant Tørre lyserøde og brune Hvide C. tropicalis Blågrønne metal blå m/u violette haloer Mørkeblå Lyserøde C. dubliniensis Markant grøn Grønne - C. lusitaniae Creme rosa Gule, beige og brune Lyserøde C. guilliermondii Creme rosa - - C. parapsilosis Creme rosa Gule, beige og brune - C. kefyr Creme rosa Gule, beige og brune Lyserøde Tabel 2 viser producenternes beskrivelser af de farveudviklinger der vil observeres ved visse Candida species på BD CHROMagar, Brilliance Candida og ChromID Candida ( 6, 7, 13, 14) BD CHROMagar Ifølge producenter kan dette medie identificere C. albicans, C. krusei og C. tropicalis (14). Ifølge producenter forekommer C. dubliniensis markant grønnere på mediet og yderligere test for at identificere denne art er nødvendig (14). Øvrige Candida species kan ikke identificeres fordi deres farveudvikling kan forekomme ved flere arter. Ifølge producenter forekommer C. glabrata med lilla nuancer på dette medie, men dette kan ligeledes observeres ved øvrige arter hvorfor denne art anbefales bekræftet med yderligere konfirmatoriske test (14). Ifølge producenterne kan blandingskulturer nemt skelnes fordi de forskellige Candida species vil udvikle hver deres specifikke farve (14). 10

12 Figur 2 viser grønne C. albicans kolonier, lyserøde C. krusei kolonier med hvid kant og blå C. tropicalis kolonier med violette haloer på BD CHROMagar. Billedet er fra producentens produkt hjemmeside (15) Brilliance Candida Dette medie kan ifølge producenter identificere C. albicans og C. dubliniensis indenfor 24 timer og C. krusei og C. tropicalis kan identificeres efter timer (16). Ifølge producenter er gule, beige og brune kolonier vejledende om C. glabrata, C. kefyr, C. parapsilosis og C. lusitaniae efter timer (16). Dette medie indeholder to chromogener X- NAG der registrerer hexosaminidase aktivitet og BCIP der registrerer alkalisk phosfatase aktivitet. Det er den samme kromogene reaktion der sker for C. albicans, C. dubliniensis og C. tropicalis men øvrige reaktioner i mediet gør at C. albicans og C. dubliniensis kan differentieres fra C. tropicalis (6). Øvrige Candida species forekommer med farver der skyldes en blanding af naturlig pigmentering og alkalisk phosfatase aktivitet. Ifølge producenter kan disse arter differentieres ud fra deres farve og morfologi af erfarent personale (6). Mediet indeholder et uigennemsigtigt middel der ifølge producenterne skal forbedre farve definitionen på mediet især ved differentiering af blandingskulturer (6). 11

13 Figur 3 viser grønne C. albicans kolonier, beige C. glabrata kolonier, brune C. parapsilosis kolonier, tørre lyserøde C. krusei kolonier og mørkeblå C. tropicalis kolonier på Brilliance Candida. Billedet er fra producentens produkt hjemmeside (6) ChromID Candida Ifølge producenter kan dette medie identificere C. albicans indenfor 24 timer (13). Ifølge producenter forekommer C. dubliniensis ofte lysere blå og observeres først efter 48 timer. Der kan desuden ses blå kolonier ved eks. Trichosporon, C. tropicalis og sjældne bakteriearter der er resistente overfor antibiotika i mediet. Disse blå kolonier kan alle differentieres fra C. albicans ved deres morfologiske udseende (13). Dette medier indeholder et chromogen der hydrolyseres af hexosaminidase, som gør at C. albicans kolonier bliver blå. Hydrolyse af et andet chromogen gør, at C. tropicalis, C. lusitaniae og C. kefyr bliver lyserøde på dette medie, men der kan observeres hvide kolonier efter 24 timer inden den lyserøde farveudvikling forekommer (13). 12

14 Figur 4 viser blå C. albicans kolonier og lyserøde kolonier der indikerer C. lusitaniae, C. kefyr og C. tropicalis. Billedet er fra producentens produkt hjemmeside (17) 3. Materialer 100 isolater udvalgt ud af 667 Candida species fundet i bloddyrkninger hos 361 patienter i perioden 1/ / på KMA AUH. Disse isolater er tidligere blevet identificeret på Vitek 2 og de 100 isolater repræsenterer de hyppigst forekommende arter (bilag 1) Candida species isolater Candida species Antal isolater Forekomst % C. albicans C. glabrata 9 24 C. krusei 9 3 C. tropicalis 10 5 C. guilliermondii 2 >1 C. lusitaniae 2 >1 C. dubliniensis 8 3 C. parapsilosis 6 2 Tabel 3 viser antal isolater der er udvalgt af de forskellige Candida species til forsøget og desuden deres forekomst i bloddyrkninger på KMA AUH (bilag 1) 13

15 3. 2. Kontrolstammer Kontrol stamme Kontrol nummer C. albicans CCUG C. glabrata ATCC 2950 C. krusei CCUG C. tropicalis CCUG Tabel 4 viser de indkøbte ATCC og CCUG stammer der bruges til kvalitetssikring af medierne under forsøget ATCC = American Type Culture Collection CCUG = Culture Collection University of Góteborg Diverse Medie Lot nummer Udløbsdato BD CHROMagar Candida medium Oxoid Brilliance Candida agar Biomérieux ChromID Candida agar Blodagarplader 5 % SSI / / / Tabel 5 viser de tre kromogene medier der undersøges i forsøget Utensilier Lot nummer 1 µl podenåle µl podenåle Plastrør 5 ml Vatpinde Tabel 6 viser diverse utensilier der er anvendt til forsøget 14

16 Apparatur Mærke Kamera Canon EOS 3D DensiCHEK plus Biomérieux Mikroskop Olympus CX 31 Varme rum 37 0 C Kølerum C Tabel 7 viser diverse og teknik der er anvendt til forsøget 4. Metode Litteratursøgning Der er løbende søgt litteratur under forsøget og opgaven. Google, diverse lærebøger og Region Midt s elektroniske dokumentsamling er anvendt til opgaven. De videnskabelige artikler der er inddraget i opgaven er fundet på Google Scholar under følgende søgeord: Dubliniensis, Brilliance candida Oxoid, Candida id og chromagar temperatur. Søgningerne har været begrænset til mennesker og nyere artikler fra Der er dog medtaget to artikler fra 2001 og 2002, fordi de belyser forsøget med deres observationer. Producenternes beskrivelser om deres medier og billeder af disse er søgt på producenternes hjemmesider Metode Der udvælges 100 isolater fra 100 forskellige patienter for at tage hensyn til, at der kan observeres variationer indenfor den enkelte art. Derved opnås et større vurderingsgrundlag end hvis der inddrages to isolater fra én patient. Isolaterne overføres fra 5 % blodplade til BD CHROMagar, Brilliance Candida og ChromID Candida ved en trekantsudstrygning til enkeltliggende kolonier. 15

17 Medierne inkuberes mørkt ved 37 0 C og vurderes visuelt efter 24 og 48 timers inkubation med udgangspunkt i producentens beskrivelser. Forsøget er blindet for at sikre objektivitet under identifikationerne. Der udarbejdes skemaer til beskrivelser af de visuelle observationer og identifikationer og der foretages billeddokumentation undervejs. Udstryge isolater på blodplader Inkubere ved 37 0 C i 48 timer Udstryge kolonier fra blodplader på kromogene medier Inkubere mørkt ved 37 0 C Visuel vurdering af kromogene medier efter 24 og 48 timer Figur 5 viser et flowdiagram over arbejdsprocessen for de undersøgte medier Isolater fra én patient udstryges af én person for at sikre ensartethed og udelukke at forskellige teknikker giver anledning til fejlkilder under databehandling. Den samme procedure udføres for kontrolstammerne som med prøverne. Medierne kvalitetssikres ved at kontrolstammer dagligt observeres for at bekræfte, at medierne fungerer optimalt. De videreføres direkte til nye kromogene medier, fordi de på denne måde allerede vil være i gang med at producere enzymer og deres kolonier vil derfor hurtigere udvikle farve på medierne. Der fremstilles 10 blandingskulturer ud fra de udvalgte isolater. Dette gøres ved at fremstille McFarland suspensioner med 2-3 forskellige Candida Species i hver af dem. Candida species overføres fra blodplader til et rør med saltvand og DensiCHEK Plus anvendes til at måle turbiditeten under fremstilling. Suspensioner i intervallet [ 0,50 1, 00 ] accepteres. De udstryges med vatpinde og 10 µl podenåle i en trekantsudstrygning til enkeltliggende kolonier på de kromogene medier. 16

18 4. 3. Identifikation af Candida species i forsøget Identifikationerne udføres ved at vurdere prøverne i forhold til producenternes beskrivelse af arternes udvikling af farver på medierne. Kolonier med tvivlsomme farver og hvide kolonier identificeres ikke efter 24 timer for at sikre, at der ikke forekommer et farveskift. Efter 48 timer foretages en endelig identifikation der kategoriserer isolatet som en specifik Candida species ud fra producenternes beskrivelser eller blot Candida species uden yderligere identifikation. Fordi medierne observeres over 48 timer accepteres lysere og mørkere nuancer indenfor de forskellige arter. Efter 48 timer vil der være udviklet flere kolonier der kan producere flere enzymer og derfor udvikle mere farve på medierne end efter kun 24 timers inkubation. Derfor uddybes nedenfor med billeder fra forsøget der illustrerer acceptgrænserne ( bilag CD). BD CHROMagar C albicans kolonier forekommer ifølge producent lysegrønne og mellemgrønne. Kolonier med grønlige nuancer identificeres som C. albicans: Figur 6 og 7 viser lysegrønne og mellemgrønne C. albicans kolonier på BD CHROMagar Ifølge producent forekommer kolonier af C. krusei lyse rosa med en hvid kant. Denne hvide kant er under forsøget observeres tør hvorfor denne tørhed beskrives under denne art på dette medie. Tørre lyse rosa og tørre rosa kolonier identificeres som C. krusei: 17

19 Figur 8 og 9 viser tørre lyse rosa og tørre rosa C. krusei kolonier på BD CHROMagar Ifølge producent udvikler C. tropicalis blågrønne til metalblå kolonier med eller uden violette haloer. Kolonier med blålige nuancer med eller uden violette haloer identificeres som C. tropicalis: Figur 10 og 11 viser blå lilla og blå C. tropicalis kolonier med violette haloer på BD CHROMagar Brilliance Candida Oxoid Ifølge producent forekommer C. albicans og C. dubliniensis kolonier grønne. Grønne kolonier identificeres som disse arter: 18

20 Figur 12 og 13 viser grønne og mørke grønne C. albicans kolonier på Brilliance Candida Ifølge producenter forekommer kolonier af C. glabrata, C. parapsilosis, C kefyr og C. lusitaniae med beige, gule og brune farver. Disse farver identificeres som disse arter: Figur 14 og 15 viser beige og mørke beige C. glabrata kolonier på Brilliance Candida Ifølge producent forekommer C. krusei kolonier tørre rosa og brune. Tørre rosa og mørke rosa kolonier identificeres som C. krusei : Figur 16 og 17 viser tørre lyse rosa og tørre mørke rosa C. krusei kolonier på Brilliance Candida 19

21 Ifølge producent forekommer C. tropicalis kolonier blå. Kolonier med blålige nuancer identificeres som C. tropicalis : Figur 18 og 19 viser lyse lilla - blå og blå C. tropicalis kolonier på Brilliance Candida ChromID Candida Biomérieux Ifølge producent forekommer kolonier af C. albicans blå. Kolonier med blålige nuancer identificeres som C. albicans : Figur 20 og 21 viser turkise og blå C. albicans kolonier på ChromID Candida Ifølge producent forekommer kolonier af C. lusitaniae, C. kefyr og C. tropicalis med lyserøde kolonier og disse identificeres som disse arter: 20

22 Figur 22 og 23 viser lyse lyserøde C. lusitaniae og lyserøde C. tropicalis kolonier på ChromID Candida Databehandling Data behandles med udgangspunkt i de identifikationer der er foretaget på medierne vurderet iforhold til identifikationerne af isolaterne på Vitek 2. Der foretages en metodesammenligning af de tre medier ved at udregne antal korrekte identifikationer på hver medie efter 24 og 48 timer og herunder den procentvise identifikation. Dertil opstilles fejlidentifikationer af Candida species der er foretaget på medierne. Der udregnes sensitivitet for C. albicans identifikation efter 24 og 48 timer på medierne eftersom to af producenterne garanterer identifikation af denne art indenfor 24 timer. Der udregnes desuden sensitivitet og specificitet for Candida species generelt for medierne efter 48 timer. Sensitiviteten viser mediernes evne til korrekt at identificere de Candida species producenten beskriver og specificiteten viser mediernes evne til at differentiere de øvrige Candida species der ikke bør føre til en identifikation af en specifik art. Derudover udregnes hvor mange af de ustrøgne arter der kan identificeres efter 24 og 48 timer på medierne ved blandingskulturerne. 21

23 5. Resultater De identifikationer der er foretaget under forsøget er vurderet i forhold til de tidligere identifikationer af isolaterne på Vitek BD CHROMagar Nedenfor vises resultater over identifikationer på BD CHROMagar (bilag 2). Candida art og antal isolater BD CHROMagar 24 t / 48 t BD CHROMagar 24 t / 48 t % C. albicans ( 54 ) 6 / / 100 C. krusei ( 9 ) 8 / 8 89 / 89 C. tropicalis ( 10 ) 0 00 C. species ( 27 ) 9 0 / 70 Total / / 91 Tabel 8 viser antal og procentvise identifikationer af Candida species efter 24 og 48 timer på BD CHROMagar 1 4 isolater havde ikke opnået fuld farve af alle kolonier og der blev observeret hvide kolonier Nedenfor vises resultater over fejl identifikationer på BD CHROMagar (bilag 2). Isolat nummer Fejl ID på BD CHROMagar Vitek 2 Identifikation 26 C. species C. krusei 6, 21, 76, 80, 81, 82, 83, 94 C. albicans C. dubliniensis Total 9 Tabel 9 viser identifikationer på BD CHROMagar der ikke stemmer overens med identifikationerne på Vitek 2 22

24 5. 2. Brilliance Candida Identifikation af Candida species på kromogene medier Nedenfor vises resultater over identifikationer på Brilliance Candida (bilag 3). Candida art og antal isolater Brilliance Candida 24 t / 48 t Brilliance Candida 24 t / 48 t % C. albicans ( 54 ) 47 / / 100 C. dubliniensis ( 8 ) 2 / 8 25 / 100 C. glabrata ( 9 ) 5 / 9 56 / 100 C. lusitaniae ( 2 ) 1 / 1 50 / 50 C. parapsilosis ( 6 ) 6 / C. krusei ( 9 ) 8 / 8 89 / 89 C. tropicalis ( 10 ) C species ( 2 ) 0 / 2 00 Total / / 98 Tabel 10 viser antal og procentvise identifikationer af Candida species efter 24 og 48 timer på Brilliance Candida Nedenfor vises resultater over fejl identifikationer på Brilliance Candida (bilag 3). Isolat nummer Fejl ID på Brilliance Candida Vitek 2 Identifikation 78 C. species C. lusitaniae 26 C. g-k-p-l C. krusei Total 2 Tabel 11 viser identifikationer på Brilliance Candida der ikke stemmer overens med identifikationerne på Vitek ChromID Candida Nedenfor vises resultater over identifikationer på ChromID Candida (bilag 4). Candida art og antal isolater ChromID Candida 24 t / 48 t ChromID Candida 24 t / 48 t % C. albicans ( 54 ) 21 / / 100 C. lusitaniae ( 2 ) 0 / 2 00 C. tropicalis ( 10 ) C species ( 34 ) 0 / 24 0 / 71 Total / / 90 Tabel 12 viser antal og procentvise identifikationer af Candida efter 24 og 48 timer på ChromID Candida 1 18 isolater havde ikke opnået fuld farve af alle kolonier og der blev observeret hvide kolonier 23

25 Nedenfor vises resultater over fejl identifikationer på ChromID Candida (4). Isolat nummer Fejl ID på ChromID Candida Vitek 2 Identifikation 64, 77 C. t-k-l C. guilliermondii 6, 21, 76, 80, 81, 82, 83, 94 C. albicans C. dubliniensis Total 10 Tabel 13 viser identifikationer på ChromID Candida der ikke stemmer overens med identifikationerne på Vitek Sensitivitet og specificitet Nedenfor vises den udregnede sensitivitet for identifikation af C. albicans efter 24 og 48 timer på BD CHROMagar, Brilliance Candida og ChromID Candida (bilag 5). Kromogene medier Sensitivitet 24 timer % Sensitivitet 48 timer % BD CHROMagar Brilliance Candida ChromID Candida Tabel 14 viser sensitiviteten for identifikation af C. albicans på BD CHROMagar, Brilliance Candida og ChromID Candida efter 24 og 48 timer Nedenfor vises den udregnede sensitivitet og specificitet for identifikation af Candida species på BD CHROMagar, Brilliance Candida og ChromID Candida efter 48 timer (bilag 6). Kromogene medier Sensitivitet 48 timer % Specificitet 48 timer % BD CHROMagar Brilliance Candida ChromID Candida Tabel 15 viser sensitivitet og specificitet for identifikation af Candida species på BD CHROMagar, Brilliance Candida og ChromID Candida efter 48 timer 24

26 5. 5. Blandingskulturer Der er fremstillet 10 blandingskulturer med 2-3 Candida species på hver medie. Nedenfor vises resultater over de udstrøgne arter der kunne identificeres efter 24 og 48 timer på BD CHROMagar, Brilliance Candida og ChromID Candida efter 24 og 48 timer (bilag 7). Blanding Candida species BD CHROMagar 24 t / 48 t 1 C. dubliniensis 0 / 0 C krusei 1 / 1 2 C. parapsilosis C. albicans 3 C. albicans C. krusei 1 / 1 4 C. dubliniensis 0 / 0 C. parapsilosis 5 C. lusitaniae C. tropicalis 6 C. guilliermondii C. albicans 7 C. albicans C. krusei C. tropicalis 8 C. glabrata C. albicans C. tropicalis 1 / 1 Brilliance Candida 24 t / 48 t 1 / 1 1 / 1 0 / 0 1 / 1 1 / 1 1 / 1 1 / 1 9 C. glabrata C. krusei 1 / 1 10 C. glabrata C. albicans Total (10) 0 / 8 0 / 9 0 / 8 ChromID Candida 24 t / 48 t 0 / 0 1 / 1 0 / 0 1 / 1 1 / 1 1 / 1 1 / 1 1 / 1 Tabel 16 viser korrekte identifikationer af Candida species på blandingskulturer foretaget efter 24 og 48 timer på BD CHROMagar, Brilliance Candida og ChromID Candida vurderet iforhold til identifikationer på Vitek 2 25

27 Nedenfor vises resultater over fejl identifikationer på BD CHROMagar, Brilliance Candida og ChromID Candida (bilag 7). Blanding Fejl ID på BD CHROMagar Fejl ID på Brilliance Candida Fejl ID på ChromID Candida Vitek 2 Identifikation 1 C. albicans C. albicans C. dubliniensis 4 C. albicans C. tropicalis C. albicans C. dubliniensis Total Tabel 17 viser identifikationer ved blandingskulturer på BD CHROMagar, Brilliance Candida og ChromID Candida der ikke stemmer overens med identifikationerne på Vitek 2 6. Diskussion Diskussion af metode De præanalytiske forhold har været generelle for medierne på trods af producenternes individuelle anvisninger. De er blevet inkuberet ved 37 0 C i 48 timer ud fra gældende retningslinier på KMA AUH og efter anvisninger bør BD CHROMagar inkuberes ved C, Brilliance Candida ved 30 0 C og ChromID Candida ved 37 0 C (6, 13, 14). Dette kunne have medført andre farveudviklinger end de beskrevne, fordi de er med udgangspunkt i at mediet inkuberes ved 30 0 C. De medier hvor der blev udstrøget to isolater på observeres en mere intens farveudvikling og færre enkeltliggende kolonier. Det gjorde det nemmere at identificere arterne, men sværere at observere hvide kolonier. Desuden observeres der ved disse en tendens til kontaminering, men dog tydelig at adskille især med den viden, at isolaterne er renkulturer. Koncentrationerne i blandingskulturerne er ukendt og nogle arter observeres voksende ind over andre arter og virker hæmmende. Det er uvist om de dominerende arter er tilsat i en højere koncentration eller om deres vækst er mere dominerende uanset deres koncentration. Ved en infektion med flere arter vil dette nok afspejle den samme problematik nemlig at nogle arter kan observeres i en øget mængde end de øvrige arter. 26

28 C. dubliniensis burde ikke være medtaget i blandingskulturerne, fordi der er en grundlæggende problematik for medierne i at differentiere denne fra C. albicans. Det vil derfor fejlagtigt nedsætte mediernes sensitivitet til at identificere blandingskulturer. Forsøget omfatter ikke C. kefyr, men denne art udgør kun 0, 3 % af de positive bloddyrkninger på KMA AUH og har derfor en mindre klinisk relevans end de øvrige arter (bilag 1). Ved at identificere Candida species ud fra producenternes beskrivelser kan der blot undersøges om arterne udvikler de farver producenterne lover. Hvis der udvikles en korrekt farveudvikling vil denne fremstå som en korrekt identifikation også ved de arter, hvor mediet ikke kan differentiere flere arter fra hinanden. C. albicans kunne observeres efter 24 timer på alle medierne, men fordi der observeredes hvide kolonier blev de inkuberet igen. Isolaterne er renkulturer og derfor var der tale om kolonier der ikke har udviklet farve endnu og ikke øvrige species, men det ville være uklart i den daglige rutine. Det er ikke optimalt at udregne den generelle sensitivitet og specificitet for medierne, fordi de udregnes for flere arter. De burde udregnes for hver art, men det er kompliceret for de arter der ikke kan differentieres fra de øvrige. De mest interessante resultater er sensitiviteten for C. albicans der er entydig og bruges til metodesammenligning af medierne. Derudover er det yderst relevant, at observere hvilke arter der har et karakteristisk udseende og farve der kan identificeres på trods af at producenten ikke beskriver dette for mediet Diskussion af BD CHROMagar Ifølge Willinger et al. observeres der ikke optimal farveudvikling for C. albicans efter 24 timer (18) og dette observeres ligeledes under dette forsøg. Men farverne varierer ikke fra 24 til 48 timer, men imellem isolaterne hvor der ses store variationer i de grønne kolonier. Mediet har en sensitivitet til at identificere C. albicans på 11 % efter 24 timer, som stemmer overnes med producentens anbefaling om først at identificere denne efter 42 timer (14). 27

29 Ifølge Eraso et al og Metin et al kan C. dubliniensis ikke differentieres fra C. albicans (19, 20) ligesom det blev observeret under dette forsøg. Ifølge Messeir et al observeres disse mørkegrønne kolonier først efter 96 timers inkubation (21), hvor producenterne beskriver denne farveudvikling efter 48 timer (14). Ifølge Khan et al er C. dubliniensis følsomme for Fluconazol undtagen 2, 5 %, hvilket betyder at den manglende differentiering ikke vil have nogen behandlingsmæssig relevans. C. dubliniensis er nært beslægtet med C. albicans, men adskiller sig ved ikke at have de samme evner til at danne hyfer, hvilket gør den mindre virulent end C. albicans (22). Ifølge Eraso et al er sensitiviteten for identifikation af C. krusei 100 % (19) og under dette forsøg kunne 89 % C. krusei identificeres efter 24 timer. Ifølge Venezia et al kunne C. krusei ikke differentieres fra C. lusitaniae og C. parapsilosis der også udvikler lyserøde kolonier (23). Der observeres i dette forsøg tydelige forskelle mellem C. krusei og disse to øvrige arter. C. krusei udvikler tørre store lyserøde kolonier efter kun 24 timer og de øvrige to arter udvikler blanke creme farvede lyse rosa kolonier efter 24 timer. Isolat 26 observeres atypisk. Ifølge Eraso et al og Messeir et al forekommer C. tropicalis kolonier mere violette end blålige som i producentens beskrivelse (19, 21). Dette blev også observeret under dette forsøg, hvor kolonierne forekom blålige grænsende til lilla, grå og generelt blege og grumsede sammenlignet med en intens blå farve på kontrolstammen. Ingen af dem kunne identificeres efter 24 timer og efter 48 timer blev 100 % identificeret med store variationer i farverne. På trods af de mange nuancer var de dog karakteristiske for denne art, ligesom flere nuancer og violette haloer er beskrevet af producenterne (14). Ifølge Messeir et al kan C. glabrata ikke differentieres fra øvrige arter (21). Under dette forsøg observeredes en tendens til, at C. glabrata udvikler karakteristiske lilla kolonier efter 48 timer, men de forekom også lyse rosa og kunne forveksles med C. lusitaniae og C. parapsilosis. Generelt udvikler mediet mange nuancer inden for hver art og de øvrige Candida species. C. krusei er den eneste art der udvikles ensartet i farven 28

30 6. 3 Diskussion af Brilliance Candida Sensitiviteten for C. albicans er 87 % efter 24 timer og ifølge producenter kan denne art identificeres efter 24 timer. 13 % blev ikke identificeres efter 24 timer, fordi der blev observeret hvide kolonier der ikke kunne identificeres. Efter 48 timer blev 100 % identificeret og der blev ikke observeret hvide kolonier. Ifølge producenten kan C. dubliniensis ikke differentieres fra C. albicans og dette observeres ligeledes under forsøget. Ifølge Messeir et al. kan C. glabrata differentieres fra de øvrige arter der også udvikler beige, gule og brune farver ved, at der udvikles lyserøde kolonier efter 72 timer (21). I dette forsøg observeres C. glabrata kolonier udvikle en beige farve, hvor de øvrige arter observeres lysere beige med et gyldent udseende efter 24 timer. C. glabrata kan tydeligt differentieres efter 48 timer, eftersom det er den eneste af disse arter der skifter farve til mørke brune kolonier undtagen ved isolat 69, hvor der observeres en defekt i mediet. 89 % af C. krusei blev identificeret efter 24 timer med tørre rosa kolonier der er beskrevet af producenter. Denne tørhed er karakteristisk for C. krusei og der observeres ligeledes ved dette medie at isolat 26 er atypisk med koloni morfologi og farve. 100 % af C. tropicalis blev identificeret efter 24 timer. Denne art er blevet identificeret med blå lilla kolonier efter 24 timer, fordi de var blålige og ikke kunne forveksles med øvrige arter på mediet. Efter 48 timer observeres kolonierne mørkeblå. Generelt er farverne tydelige og ensartede på dette medie og den visuelle vurdering af farverne er optimal på den hvide agar. Dette gør mediet mere brugervenligt og vil i den daglige rutine kunne lette arbejdsgangen ved en hurtigere og mere simpel vurdering af de forskellige farver Diskussion af ChromID Candida Sensitiviteten for C. albicans er 39 % efter 24 timer og ifølge producenter burde dette medie kunne identificere C. albicans efter 24 timer. Efter 48 timer blev 100 % identificeret, men der blev observeret hvide kolonier ved 33 % af dem. 29

31 Ifølge Eraso et al observeres C. dubliniensis turkis efter 48 timer, men det samme var tilfældet ved 3 % af C. albicans (19). Under dette forsøg observeredes C. dubliniensis også at udvikle turkise kolonier efter 24 timer og forblev turkise efter 48 timer. C. albicans blev også observeret udvikle turkise kolonier efter 24 timer, men skiftede til blå kolonier efter 48 undtagen 3, 7 % som fortsat var turkise. Ifølge Eraso et al. observeres C. tropicalis med lyserøde og blå kolonier (19). Under dette forsøg observeredes C. tropicalis med tørre lyserøde kolonier med eventuelle blå kolonier. Det er de tørre lyserøde kolonier der observeres karakteristiske for denne art og ikke forekomsten af blå kolonier som ifølge Eraso et al. De øvrige arter der også udvikler lyserøde kolonier kan nemt differentieres fra C. tropicalis, fordi deres kolonier er lyserøde og blanke. Ifølge Eraso et al. kan C. krusei identificeres på dette medie med en sensitivitet på 100 % efter 48 timer, men at dertil kræves erfaring (19). Under dette forsøg observeredes ligeledes, at C. krusei udvikler tørre karakteristisk hvide kolonier, som der nemt kunne differentieres fra de øvrige hvide og blanke kolonier og 89 % kunne differentieres efter kun 24 timer. Generelt er mediet let at observere, fordi der kun observeres tre farver og alle øvrige species udvikler hvide kolonier der ikke forstyrrer observationerne af de øvrige farver Diskussion af blandingskulturer Det er generelt for medierne, at ingen af dem kan identificere alle de udstrøgne arter efter 24 timer. Efter 48 timer kan alle arter identificeres i de enkeltliggende kolonier, hvor der ses tydelige flotte farver der gør, at arterne kan differentieres fra hinanden. Efter 24 timer kan BD CHROMagar identificere C. krusei, Brilliance Candida kan identificere C. krusei og C. tropicalis og ChromID Candida kan identificere C. albicans og C. tropicalis. 30

32 C. krusei vokser dominerende på BD CHROMagar og Brilliance Candida og dette observeres ligeledes for C. tropicalis på ChromID Candida. Disse arter hæmmer de øvrige arters vækst og farveudvikling. Desuden ses en tendens til, at øvrige arter virker hæmmende på C. albicans. På ChromID Candida observeres lysegrønne kolonier efter 24 timer, hvor der generelt ikke udvikles tydelig grønne farver på de to andre medier efter 24 timer. Generelt ses en tydelig differentiering af arterne på alle tre medier efter 48 timer, men på Brilliance Candida er det nemmere at differentiere arterne, fordi der udvikles intense farver på den hvide agar. 7. Konklusion Det er vigtigt at kunne identificere C. glabrata og C. krusei, fordi de ofte er resistente overfor Fluconazol og de observeres med øget forekomst. Det er desuden vigtigt for afdelingen, at benytte et kromogent medie til at identificere Candida species, hvor der ikke er behov for yderligere konfirmatoriske test. Der observeres mange nuancer og utilfredsstillende farver på BD CHROMagar. Brilliance Candida er brugervenlig med de intense farver der forekommer tydeligt på den hvide agar. Der er kun få farver at observere på ChromID Candida, hvorfor identifikationen forenkles. Brilliance Candida har den højeste sensitivitet til at identificere C. albicans efter 24 timer og der observeredes fuld farveudvikling efter 48 timer. De øvrige medier var der en betydelig lavere sensitivitet og der observeres ikke fuld farveudvikling af alle C. albicans kolonier efter 48 timer. Isolat 26 observeres atypisk på alle medierne og kunne være en anden art der er forbyttet under den præanalytiske proces. Derfor bør denne ikke medregnes i identifikationerne, hvorfor alle medierne har en sensitivitet til at identificere C. krusei efter 24 timer. C. glabrata kan identificeres på BD CHROMagar efter 48 timer og Brilliance Candida efter 24 timer. Denne art kan forveksles med andre arter, men hvis C. glabrata ikke kan differentieres vil dette resultere i en fejlbehandling og ifølge forsøget vil dette kun observeres i få tilfælde. 31

33 ChromID Candida har den største evne til at identificere C. albicans på blandingskulturerne efter 24 timer, men på Brilliance Candida var differentieringen optimal på den hvide agar efter 48 timer. Brilliance Candida er det mest egnede medie til identifikation af relevante Candida species, fordi der kan udføres identifikation efter 24 timer af relevante Candida species. Mediet er mere brugervenligt og en hurtigere identifikation er ressourcebesparende. Der er dog en problematik i, at mediet ikke kan differentiere blandingskulturer efter kun 24 timer. Hvis dette medie indføres i den daglige rutine, bør dette opvejes imod, at der i de fleste tilfælde kan afgives korrekt svar til rekvirenten efter 24 timer. 8. Perspektivering Det er af stor vigtighed at undersøge, hvilke kromogene medier der bedst kan identificere Candida species eftersom der observeres en øget forekomst af Candida infektioner. Derfor stilles der store krav til de kromogene medier for at kunne leve op til de udfordringer en eventuelt fortsat stigende forekomst bringer med sig. Der er behov for at medierne ressourcesparende, nemt og billigt kan identificere de arter der er relevant at identificere. Det kunne være relevant, at undersøge flere blandingskulturer, fordi der observeres en tendens til at, C. albicans hæmmes af øvrige arter på medierne. Ligesom der er udviklet flere kromogene medier, der kunne undersøges for deres evner til, at identificere de relevante Candida species. Hvis Brilliance Candida indføres, som identifikationsmedie for Candida species på KMA AUH kunne det være relevant, at udføre en undersøgelse, hvor det inkuberes efter producentens anvisninger. Dette for at observere om mediet er endnu bedre til identifikation efter disse forhold end de er observeret i forsøget. 32

34 Referencer Forside billeder er blandingskulturer fra forsøget på BD CHROMagar, Brilliance Candida og ChromID Candida 1. Klinisk mikrobiologi og infektionsmedicin. Niels Høiby og Peter Skinhøj Fadl s forlag 3 udgave, 1 oplag Lægehåndbogen. Sundhed dk. Gærsvampeinfektioner i mund og svælg (set 5 oktober 2013). Tilgængelig fra URL: 3. dbio.dk. Gær er ikke bare gær (set 7 oktober 2013). Tilgængelig fra URL: udkommet-5--marts-2004/gaer-er-ikke-bare-gaer- 4. E dok. Infektionsafdeling Q Candidiasis (set 7 oktober 2013). Tilgængelig fra URL: 575CF00378B18&dbpath=/edok/editor/AAUHIN.nsf/&windowwidth=1100&windowheig ht=600&windowtitle=s%f8g 5. E dok. Klinisk mikrobiologisk afdeling bakteriologi Candida species gærsvampe (set 4 oktober 2013). Tilgængelig fra URL: 6. Oxoid microbiology products. Dehydrated culture media (set 9 november 2013). Tilgængelig fra URL: N&org=&img=CM1002E&sec 7. ChromID Candida Biomérieux USA (set 9 november). Tilgængelig fra URL: 8. Medicinsk mikrobiologi. Miklos Degré et al. 3 udgave 1 oplag 2008 Gyldendal. 33

35 9. Mikroorganismer omkring en tand, tandlæge Jakob Kihl 2012 (set 9 november 2013). Tilgængelig fra URL: Sundhed dk. Systemiske svampeinfektioner (set 7 december 2013). Tilgængelig fra URL: Pro medicin dk. Invasiv candidiasis (set 7 december 2013). Tilgængelig fra URL: Statens serum institut. Candidiasis (set 7 november 2013). Tilgængelig fra URL: ChromID Candida brugsvejledning (set 10 november 2013). Tilgængelig fra URL: fiches/apipdf/g%c3%a9lose%20chromid%e2%84 %A2%20Candida-_12088_-_H_-_43631_-_43639.pdf 14. BD CHROMagar Candida Medium brugsanvisning 2013 (set 8 november). Tilgængelig fra URL: BD Product center (set 8 november 2013). Tilgængelig fra URL: Oxoid Brilliance Candida Thermo Fisher Scientific (set 10 november 2013). Tilgængelig fra URL: Chromogenic medium for the selective isolation of yeast and the direct identification of Candida albicans Biomérieux USA 2012 (set 9 november 2013). Tilgængelig fra URL: Willinger B et al. Performance of Candida ID, a New Chromogenic Medium for Presumptive Identification of Candida Species, in Comparison to CHROMagar Candida. J Clin Microbiol 2001; 39(10):

36 19. Eraso E. et al. Evaluation of the New Chromogenic Medium Candida ID 2 for Isolation and Identification of Candida albicans and Other Medically Important Candida Species. J. Clin Microbiol 2006;44(9): Metin D. et al. Do incubation temperature, incubation time, and carbon dioxide affect the chromogenic properties of CHROMagar. Turk J Med Sci 2012;42(6): Messeir I. et al. Strengths and Limitations of different Chromogenic Media for the Identification of Candida Species. Journal of Microbiology 2012; 2(5): Khan Z et al. Candida dubliniensis: An Appraisal of Its Clinical Significance as a Bloodstream Pathogen. PLOS one 2012 DOI: /journal.pone Venezia M et al. New Chromogenic Agar Medium for the Identification of Candida spp. Appl Environ Microbiol 2002; 68(7):

37 Bilag Bilag 1 Isolater bloddyrkninger KMA AUH Candida species Patienter antal Patienter % C. albicans C. glabrata C. tropicalis 16 4 C. krusei 10 3 C. dubliniensis 11 3 C. parapsilosis 7 2 C. guilliermondii 2 <1 C. lusitaniae 2 <1 C. kefyr 1 <1 Candida species (non albicans) 7 2 Total

38 Bilag 2 Data BD CHROMagar Identifikation af Candida species på kromogene medier Nr Prøvenr Kendt C. art ID Farve 24 ID Farve 48 Vores ID B C. glabrata lys rosa X rosa lilla C. species 2 B C. krusei X Tør lys rosa Tør rosa C. krusei 3 B C. albicans Hvid grøn X Grøn C. albicans 4 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 5 B C. glabrata lys rosa hvid X rosa- lilla C. species 6 B C. hvid grøn X Grøn C. albicans dubliniensis 7 B C. glabrata Lys rosa X rosa lilla C. species 8 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 9 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 10 B C. glabrata lys rosa hvid X rosa - lilla C. species 11 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 12 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 13 B C. parapsilosis Hvid X Hvid C. species 14 B C. glabrata lys rosa hvid X rosa - lilla C. species 15 B C. glabrata lys rosa hvid X rosa - lilla C. species 16 B C. albicans grøn hvid X Grøn C. albicans 17 B C. Tropicalis lys lilla X Blågrå C. Tropicalis 18 B C. albicans X Grøn Grøn C. albicans 19 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 20 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 21 B C. hvid grøn X Grøn C. albicans dubliniensis 22 B C. lusitaniae Hvid X Hvid C. species 23 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 24 B C. tropicalis lys lilla X Blågrå C. tropicalis 25 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 26 B C. krusei Hvid X Lys rosa C. species 27 B C. krusei X Tør lys rosa Tør rosa C. Krusei 28 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 29 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 30 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 31 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 32 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 33 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 34 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 35 B C. krusei X Tør lys rosa Tør rosa C. Krusei 36 B C. krusei X Tør lys rosa Tør rosa C. Krusei 37 B C. albicans hvid grøn X Grøn C. albicans 37