PATENT Int. Cl. A 61 k 3/62 Kl. 30h 6

Transkript

1 PATENT Int. Cl. A 61 k 3/62 Kl. 30h 6 Ansøgning nr /65 Indleveret den 25.ma j Fremlagt den 18. d e c emb er DANMARK DIREKTORATET FOR PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET KØBENHAVN Patentbeskrivelsen offentliggjort den 2 7. maj Fortrinsret påberåbt fra den 26.maj 1964 nr.21685/64 (England) The Wellcome Foundation Limited, London, Storbritannien. Fuldmægtig under sagens behandling: Internationalt Patent - Bureau, København. Fremgangsmåde til fremstilling af vaccine indeholdende levende Brucella abortus-organismer. Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af vaccine indeholdende levnde Brucella abortus-organismer. Avirulente stammer af Brucella abortus, såsom stamme S.19, anvendes ved frem= stilling af en vaccine indeholdende levende organismer, mod kalvekastningsfeber hos kvæg. Disse stammer kan dyrkes som overfladekultur på fast medium eller i en luftet, flydende kultur indeholdende næringsstoffer og vækstfaktorer af den art, der er almindeligt kendte til dette formål. Vaccinen oparbejdes sædvanligvis således, at den indeholder et fastsat antal levende organismer Brucella abortus pr. dose. Sådanne vacciner i flydende form har den mangel, at deres holdbarhed er rela, C. Medens en vaccine, tiv dårlig, selv under optimale lagringsbetingelser fra 0 til 4 der er dyrket på fast medium med held kan frysetørres til frembringelse af et produkt med tilfredsstillende holdbarhed, vil kulturer, der er dyrket effektivt, i industriel målestok i et luftet, flydende medium, og derpå frysetørret, Ødelægges temmelig hurtigt ved lagring. - Egnetheden af dyrkningsmetoden og virkningen af frysetørringen og lagringen kan bestemmes ved viabilitettælninger, der angiver antallet af levende organismer før og efter en behandling eller lagring. Det har nu vist sig, at der kan fremstilles et præparat af en avirulent - stamme af Brucella abortus med stor viabilitet ved at dyrke stammen iet næringsmedium, hvis carbonkilde helt eller delvis udgøres af fructose, og frysetørre kulturen. Det har endvidere vist sig, at et sådant præparat har god holdbarhed, da det kan lagres

2 ved lav temperatur i lang tid eller ved en temperatur, svarende til et tropisk klima, i et tidsrum på adskillige dage uden væsentligt tab af viabilitet eller uden Ødelæggelse, der gør vaccinen uanvendelig. Yderligere forbedring af holdbarheden er opnået ved at sætte sucrose til mediet forud for frysetørringen. I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at man dyrker en avirulent Brucella abortus-stamme i et næringsmedium, hvor carbonkilden omfatter fructose i en mængde på mindst 0,1 7,, beregnet som vægt fructose pr. volumen medium, eller i en mængde på mindst 2,5 vægtprocent, beregnet på vægten af den totale carbonkilde, og frysetørre kulturen. Det er i sig selv kendt at anvende fructose som carbonkilde i næringsmedier ved dyrkning af Candida species og Bacillus subtilis, men dette carbonhydrats indflydelse på lagringsbestandigheden af Brucella abortus-vaccine har ikke tidligere været erkendt. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der som carbonkilde udover fructose anvendes ethvert stof, der er kendt til anvendelse til dette formål ved dyrkning af bakterier, specielt Brucella species, og stoffet kan antages at være egnet til opnåelse af det tilsigtede formål, hvis det ved tilstedeværelse i de i betragtning kommende koncentrationer kan sikre formeringen af disse organismer i et kulturmedium. Carbonkilden kan bestå udelukkende af fructose, eller den kan indeholde en vis mængde fructose sammen med andre carbonkilder. I sidstnævnte tilfælde kan fructosen være den væsentlige carbonkilde, eller den kan være den i mindst mængde forekommende komponent i en-blanding af to eller flere stoffer, der anvendes som carbonkilde. Udover fructose -kan carbonkilden f.eks. omfatte hexoser, specielt glucose og gallactose. Tilfredsstillende væksthastighed og udbytte opnås, hvis man ifølge opfindelsen anvender et næringsmedium, der indeholder de som carbonkilde tjenende forbindelser i en mængde på ca. 4 7., beregnet som vægt carbonkilde pr. volumen medium. Som nævnt kan fructosemængden formindskes til ca. 2,5 vægtprocent, beregnet på vægten af den totale carbonkilde, eller til opnåelse af en koncentration på 0,1 7., beregnet som vægtmængde fructose pr. volumen medium, men den forbedring,der opnås med hensyn til holdbarheden, bliver mindre udtalt, når den tilstedeværende mængde fructose nærmer sig de angivne minimumsværdier. En carbonkilde bestående af ca. 25 vægtprocent-fructose og ca. 75 vægtprocent glucose har ifølge opfindelsen vist sig veleg net. Til opnåelse af det tilsigtede formål kan der anvendes ethvert vækstmedium, der foruden en carbonkilde indeholder de sædvanlige og nødvendige næringsstoffer, såsom en nitrogenkilde, uorganiske materialer, vækstfaktorer, oxygen og carbon- -dioxid. Som nitrogenkilde_kan der med fordel anvendes ammoniumsalte eller proteinhydrolysater indeholdende aminosyrer. F.eks. har et kaseinhydrolysat, eller navnlig et produkt fremstillet ved nedbrydning af hestekød med papain vist sig egnet. Til

3 mediet sættes endvidere de sædvanlige phosphater af kalium eller natrium. Der kan tilsættes vitaminer og vækstfaktorer ved tilføjning af gærekstrakter, og oxygeneller carbondioxid-kravet kan opfyldes ved at bringe mediet i kontakt med luft eller med en gasblanding med passende sammensætning. Udvælgelse og sammensætning af et grundmedium egnet til dyrkning af en stamme af Brucella abortus er almindeligt fagmandsarbejde, hvorfor anvendelse af enhver blanding, der omfatter andre materialer, der er kendte til dette formål, falder inden for opfindelsens rammer. Enhver stamme af Brucella abortus,. der har vist sig egnet som avirulent stamme i vaccine kan anvendes. Da stammen S.19 af Brucella abort tus er velkendt og er gjort obligatorisk til det pågældende formål i mange. lande, er ifølge opfindelsen denne stamme særligt egnet til anvendelse ved fremgangsmåden. Til dyrkning af organismen kan anvendes enhver af de sædvanlige metoder, der er egnede til dette formål, og som anvender et vandholdigt næringsmedie. Et flydende medium fremstilles sædvanligvis ved at opløse komponenterne i vand, sterilisere opløsningen og overføre opløsningen i dyrkningsbeholderen på aseptisk måde. Under dyrkningen holdes temperaturen sædvanligvis på ca. 35 C. Som dyrkningsbeholder kan anvendes koniske rystekolber, der rystes ved hjælp af en rystemaskine, og i større målestok har beholdere af aluminium eller rustfrit stål vist sig tilfredsstillende, men der kan også anvendes beholdere af andre typer. Beholderne luftes sædvanligvis fra bunden af det flydende medie. Der kan anvendes omrøring til opnåelse af ensartede betingelser i kulturen. Kulturen kan anvendes to eller tre døgn efter inoculeringen. Et yderligere træk ved opfindelsen bygger på den erkendelse, at den stabiliserende virkning af fructose ved frysetørring og lagring kan forøges yderligere ved tilsætning af glucose til mediet før frysetørringen. I overensstemmelse hermed er en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at der sættes sucrose til kulturmediet før frysetørringen, fortrinsvis i en sådan mængde at mediet opnår en koncentration på ca. 5 %, beregnet som vægt sucrose pr. volumen medium. Den herved opnåede yderligere forbedring viser sig navnlig,.når kulturen, der indeholder organismen ifølge opfindelsen, lagres ved 0-4 C før frysetørringen. Denne lagring ved 0-4 C foretages fortrinsvis i et tidsrum på ca. 7 døgn. Der kan anvendes ethvert af de sædvanlige apparater til frysetørring, der er i stand til at arbejde med et tryk på ca. 0,1 mm Hg. Hverken frysetørring eller koncentrering ved centrifugering før frysetørringen synes at have skadelig indvirkning på holdbarheden af produktet, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Fremgangsmåden belyses nærmere ved hjælp af følgende udførelseseksempler. Eksempel 1 Grundmediet blev fremstillet ved i vand at opløse 30 dele proteinhydrolysat, fremstillet ved nedbrydning af hestekød med papain og indeholdende 4,5 g totalt nitrogen pr. liter, 1 del gærekstrakt, fremstillet ved autolyse, 0,16 dele sekundært

4 natriumphosphat og 4 dele fructose til frembringelse af en opløsning, der efter indstilling af ph-værdien ti1,6,4 med orthophosphorsyre udgjorde 100 dele. Opløsningen blev opvarmet til 100 C og steriliseret ved filtrering gennem et Seitz-filter. Grundmediet, 12 liter, blev aseptisk overført til en aluminiumbeholder på 20 liter, fuldt forsynet med prelplader, og blev podet med ca til organismer af stammen S.19 af Brucella abortus, der havde vokset som skråkultur på en 3 %'s glycerol-agar. Dyrkningsbeholderen blev holdt på C og blev luftet med sterilt luft, der blev indført under omrøreren med en hastighed på ca. 1 liter luft pr. minut pr. liter medium. Efter 72 timers forløb blev kulturen fordelt i portioner på 3 ml i små flasker med eller uden tilsætning af en 50 %'s sucrose-opløsning i en sådan mængde, at sucroseindholdet blev 5 %. Flaskernes indhold blev frosset ved -40 C, og flaskerne blev derpå 'anbragt i en frysetørrer af model Edwards 51P2, der forud var kølet til -40 C og holdtes ved denne temperatur i 3 til 4 timer. Trykket blev derpå reduceret til 0,1 mm Hg-tryk, kølingen standsedes, og temperaturen blev hævet til 25 C i løbet af 24 timer. Flaskerne blev derpå overført til en anden vakuumtørrer, hvori de blev opbevaret ved 0,03 mm Hg-tryk ved stuetemperatur over phosphorpentoxid i 40 timer, hvorpå de blev tillukket under vakuum. Der blev derpå udtaget prøver, der blev undersøgt for viabilitet, og andre prøver blev lagret under forskellige betingelser og prøvet herefter. Resultaterne af adskillige uafhængige eksperimenter fremgår af nedenstående tabel, hvori de anførte viabilitetstal er antallet af levende celler pr. ml divideret med Nr. Fructose % Tilsat sucrose før frysetørring % Viabilitetstal (x 10-9 /m1) før tørring efter tørring Bevaret viabilitet i % "

5 5 1;09,646 Holdbarhed: Nr.LagringstidTemperatur.. lievaret viabilitet i % døgn cfc 1 7, 3-.5,.--,, ' _ Usikkerheden ved disse målinger andrager -20 %. Eksempel 2 Til portioner på 25 ml af det i eksempel 1 beskrevne grundmedium blev podet ca til organismer af stammen S.19 af Brucella abortus under aseptiske forhold i koniske rystekolber på 250 ml, lukket med propper af ikke-hygroskopisk vat. Kolberne blev derpå rystet.på en reciprokerende rystemaskine med en bevægelseslængde på 3,3 cm med en hastighed på ca. 488 rystninger pr. minut. 'Efter 64 timers forløb blev flaskernes indhold hældt sammen og blev fordelt i portioner på 2 ml i små flgsker som beskrevet'i eksempel I. Frysetørringen og prøverne blev-udført som beskrevet i eksempel 1. Resultaterne af uafhængige forsøg er som følger: Nr. Fructose Tilsat sucrose Viabilitetstal (x 10-9 /ml) Bevaret viabilitet % før frysetørfør tørring efter tørring i % -ring % , $ Holdbarhed: Nr'. Lagringstid Temperatur Bevaret viabilitet i % døgn 441 ' '10 7 :

6 Eksempel 3 For at vise de resultater, der opnås ved totalt fravær af fructose blev der udført sammenligningsforsøg på lignende måde som beskrevet i eksempel 2 med den afvigelse, at fructosen blev totalt erstattet med 3 % glucose som carbonkilde. Der blev i disse eksempler ikke tilsat sucrose før frysetørring. Resultaterne var som følger: Nr. Viabilitetstal (x 10-9 /m1) Bevaret viabili Holdbarhed før tørring efter tørring tet i Lagrings- Tempera- Bevaret tid (døgn) tur C ' Eksempel 4 Der blev udført forsøg på lignende måde som beskrevet i eksempel 2 med den afvigelse, at der anvendtes en sammensat carbonkilde. Resultaterne var som følger: Nr. - Dyrkning og frysetørring Carbonkilde Sucrose til- Viabilitetstal (x 10-9 /m1) Holdbarhed Fructose Glucose ført før fryfør tør- efter tør- Bevaret La ". TeWP' Berings- C varet --% % setørring % % ring - ring _ - tid % døgn _.0,5 _ 3,

7 Yderligere eksperimenter, ved hvilke der anvendtes fructosekoncentrationer lavere end 0,1 %, beregnet som vægt pr. volumen, i mediet, viste ingen signifikant forbedring af stabiliteten. I disse og i de øvrige resultater, der er gengivet i de tidligere eksempler, er viabilitetstællingerne i hvert tilfælde det aritmetiske middeltal af fire bestemmelser stammende fra to parallelforsøg. PATENTKRAV 1. Fremgangsmåde til fremstilling af vaccine indeholdende. levende Brucella abortus-organismer,kendetegnet ved, at man dyrker en avirulent Brucella abortus-stamme i et næringsmedium, hvor carbonfcilden omfatter fructose i en mængde på mindst 0,1 %, beregnet som vægt fructose pr. volumen medium, eller i en mængde på mindst 2,5 vægtprocent, beregnet på vægten af den totale carbonkilde, og frysetørrer kulturen. 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendet.egnet ved, at man dyrker stammen S.19 af Brucella abortus. 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2,kendetegnet ved, at næringsmediet indeholder de som carbonkilde tjenende forbindelser i en mængde på ca. 4 %, beregnet som vægt carbonkilde pr. volumen medium. 4. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de foregående krav,kendete g- n e t ved, at den anvendte carbonkilde indeholder ca. 25 vægtprocent fructose og ca. 75 vægtprocent glucose. 5. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de foregående krav,kendete g- n e t ved, at der sættes sucrose til kulturmediet før frysetørringen, fortrinsvis i en sådan mængde, at mediet opnår en koncentration på ca. 5 %, beregnet som vægt sucrose pr. volumen medium. 6. Fremgangsmåde ifølge krav 5,kendetegnet ved, at kulturen lagres ved 0-4 C før frysetørringen. Fremdragne publikationer: Tyske patenter nr ,