Human Biologi Blodtypebestemmelse og og bloddonation

Transkript

1 Gruppe BIOTEKNOLOGI, B267b AALBORG BIOTEKNOLOGI, TEKNISKE AALBORG Human GYMNASIUM Biologi TEKNISKE GYMNASIUM Aalborg Universitet Human Biologi Blodtypebestemmelse og og bloddonation Chatpakorn R. R. Christiansen, Jeppe Jeppe Julius Julius Krogh, Krogh, Jette Fischer Jette Petersen, Fischer Petersen, Josefi-ne Lin Josefi-ne P. Lin Henriksen, P. Henriksen, Mie Mandal Mie Mortensen Mandal & Mortensen Patrick Skov & Schacksen Patrick Skov Schacksen Side 0 af XII

2 Studienævn for Industri Gruppe B267b Human Biologi Aalborg og Global Universitet Bioteknologi Forretninfsudvikling Fibigerstræde 16 DK 9200 Aalborg Øst Tlf Titel: Human Biologi Blodtypebestemmelse og bloddonation Semester: 2. semester Semester tema: Human Biologi Projektperiode: 3. februar 2014 til 21. maj 2014 ECTS: 15 Vejleder: Mads Sønderkær & Sara Bjørn Aaen Projektgruppe: B267b Chatpakorn R. Christiansen Jeppe Julius Krogh Jette Fischer Petersen Josefine Lin P. Henriksen Mie Mandal Mortensen Patrick Skov Schacksen Oplag: Antal sider: Appendiks: 3 stk. 53 sider 12 sider Projektet omhandler genotypisk og fænotypisk bestemmelse af blodtypen i forhold til ABO- og rhesus systemet. Dette skulle i praksis gøres via metoderne eldonkort, PCR og PCR-RFLP. Efter PCR, var der dog ikke noget brugbart genomisk materiale at udføre PCR- RFLP med, hvilket betød at formålet med forsøget ikke blev opnået. Dette skyldes sandsynligvis forkerte koncentrationer af de indgående parametre i forsøget, og i en gentagelse af forsøget er dette noget, der kunne ændres. Bloddonation spiller en væsentligrolle i det danske samfund, da sygehusvæsnet er afhængigt af at kunne modtage blod fra frivillige donorer i diverse situationer. Derfor blev der i dette projekt undersøgt, hvordan man opretholder et stabilt bloddonorkorps. Her blev det klarlagt, at uselviske og selviske motivationer er de væsentligste faktorer for at melde sig som bloddonor. Denne viden kan de danske blodbanker udnytte til at hverve nye bloddonorer og bibeholde de eksisterende. Ved at underskrive dette dokument bekræfter hvert enkelt gruppemedlem, at alle har deltaget lige i projektarbejdet og at alle således hæfter kollektivt for rapportens indhold. Side 1 af 53

3 Forord Dette projekt er udarbejdet af bioteknologigruppen B267b fra Aalborg Universitet på 2. semester i forbindelse med projektmodulet human biologi under vejledning fra Mads Sønderkær og Sara Bjørn Aaen. Der er i rapporten benyttet kildehenvisninger efter Harvardmetoden, og kilderne vil blive angivet som (Efternavn, år). Står en kilde til sidst i et afsnit efter punktum, så dækker kilden hele afsnittet. Står en kilde før punktum, dækker kilden kun den pågældende sætning. Kildehenvisningerne henviser til litteraturlisten. Tabeller og figurer er nummereret i henhold til kapitlerne. Der er vedlagt bilag indeholdende materialeliste og databehandling. Der rettes en tak til hovedvejleder Mads Sønderkær og bivejleder Sara Bjørn for vejledning, konstruktiv kritik samt hjælp i laboratoriet. Endvidere rettes en tak til ledende overlæge Kim Varming, Blodbanken i Aalborg og Aalborg sygehus Syd for rundvisning og besvarelse af spørgsmål. Gruppe B267b, Aalborg Universitet, 21. maj 2014 Side 2 af 53

4 Indholdsfortegnelse 1. INTRODUKTION PROBLEMANALYSE HJERTETS OG BLODETS OPBYGNING OG FUNKTION DET CENTRALE DOGME OPBYGNING AF ABO- OG RHESUSSYSTEMET ABO- OG RHESUSSYSTEMETS BETYDNING FOR BLODTRANSFUSION GENETISK VARIATION AF BLODTYPER DELETION AF RHESUSBOKSE PROBLEMFORMULERING METODETEORI FÆNOTYPISK BESTEMMELSE VIA ELDONKORT GELELEKTROFORESE ISOLATION AF GENOMISK DNA KONCENTRATIONSBESTEMMELSE AF DNA VIA SPEKTROFOTOMETRI PCR POLYMERASE CHAIN REACTION - AMPLIFICERING AF DNA-SEKVENS RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM POLYMERASE CHAIN REACTION FORSØGSDESIGN FÆNOTYPISK BESTEMMELSE AF BLODTYPEN OPRENSNING OG ISOLERING AF GENOMISK DNA FRA MUNDSKRAB KONCENTRATIONSBESTEMMELSE VIA NANODROP PCR AMPLIFICERING AF SPECIFIK RHESUS-SEKVENS RESULTATER FÆNOTYPISK BESTEMMELSE AF BLODTYPEN GENOTYPISK BESTEMMELSE AF RHESUS BLODTYPEN DISKUSSION KONKLUSION OPRETHOLDELSE AF ET STABILT BLODDONORKORPS DEN BAGVEDLIGGENDE MOTIVATION FOR DONORSAGEN SUNDHEDSMÆSSIGE GEVINSTER OG PROBLEMATIKKER VED BLODDONATION OPSAMLING PÅ DEN KONTEKSTUELLE ANALYSE LITTERATURLISTE APPENDIKS... I APPENDIKS I - RHESUS BOKSE... I APPENDIKS II - MATERIALELISTE... VII APPENDIKS III - DIXON Q TEST... IX Side 3 af 53

5 1. Introduktion Blod har op gennem historien fascineret os mennesker. Blodet er blevet tillagt utallige kulturelle, religiøse og videnskabelige betydninger. Det har i mange år stået klart, at livet selv afhænger af blodet, fordi den menneskelige organisme har brug for blodet til at transportere affaldsstoffer, næringsstoffer, kuldioxid og ilt rundt i organismen. Dette gør blodet til et evigt aktuelt emne, og samtidig er det et område, hvor der er meget medicinsk forskning, og hvor der hele tiden sker en udvikling. (Bloddonorerne i Danmark, 2011) I 1628 blev blodets cirkulation beskrevet af William Harvey, hvormed den moderne tidslinje for blodets egenskaber begyndte. Allerede i 1667 blev den første succesfulde transfusion rapporteret, dette skete med blodet fra et får til et menneske (AABB, 2014). Herefter skulle der gå omkring 150 år, før den første blodtransfusion skete fra menneske til menneske. Dette fandt sted i 1818, hvor transfusionen blev foretaget af James Blundell (AABB, 2014). I 1901 blev det af Karl Landsteiner bevist, at der findes forskellige blodtyper. Dette skete med klassificeringen af ABO-blodtypesystemet i 1909, og den første beskrivelse af rhesussystemet i 1939 ligeledes fortaget af Landsteiner. I 1932 blev den første blodbank stiftet i Sankt Petersborg, og i samme år blev det første bloddonorkorps etableret i København. (AABB, 2014) Siden da har man i det danske sundhedssystem været helt afhængige af det frivillige donorkorps for at kunne have en tilstrækkelig mængde af blod til akut syge og tilskadekomne patienter på de danske sygehuse (Bloddonorerne i Danmark, 2011) Siden 1932 er der sket meget indenfor det danske bloddonorkorps, og der var i 2009 omkring bloddonorer, hvilket gav omkring portioner blod. (Dit Blod, 2010). Dette antal af donorer er påkrævet for, at den danske forsyning af blod er tilstrækkelig, og derfor vil der i dette projekts kontekstuelle analyse blive undersøgt, hvordan man opretholder et stabilt bloddonorkorps i en dansk blodbank. Ydermere vil det blive diskuteret, hvilke motivationsgrunde og udfordringer, der er forbundet med det at være bloddonor i Danmark, og i hvilken grad donorsagen påvirker de frivilliges opnåelse af det gode liv. Enhver organisme har antistoffer i blodet, der gør, at visse blodtyper er uforligelige med dens egen type. Dette betyder, at blandingen af to uforligelige blodtyper vil skabe en respons fra immunforsvaret i form af en antigenantistofreaktion. (Bloddonorerne i Danmark, 2011) Derfor er det vigtigt for lægerne at kende patientens blodtype inden en blodtransfusion kan påbegyndes, hvilket muliggøres i kraft af blodtypesystemerne rhesus og ABO. Der findes otte forskellige blodtyper; A +, A -, B +, B -, AB +, AB -, O + og O -. Blandt disse er der en universaldonor O -, som kan donerer blod til alle de andre blodtyper, og en universalrecipient AB +, som kan modtage blod fra alle andre blodtyper. Dette skyldes de antigener, som er placeret på overflade af erytrocytterne. Hvis organismen udsættes for antigener, som er forskellige fra dens egen, vil den producere et antistof, som nedbryder det fremmed antigen. (Bloddonorerne i Danmark, 2011) Problemanalysen vil i dette projekt omfatte to spor: en redegørelse for blodet og hjertet som organsystem, herunder blodets bestanddele og funktion samt en beskrivelse af sammenhængen Side 4 af 53

6 mellem immunforsvaret, blodet, antigener og antistoffer. Yderligere vil der være en gennemgang af de genetiske faktorer, som er afgørende for organismens geno- og fænotypiske blodtype. I problemanalysen vil det endvidere blive beskrevet i hvilke situationer donorblod benyttes til transfusioner, samt hvornår det er muligt at overføre blod fra en organisme til en anden. I det tilhørende forsøg, vil den fænotypiske blodtype for gruppemedlemmerne blive bestemt via eldonkort, og derudover vil genotypen for rhesusblodtypen blive kortlagt. Side 5 af 53

7 2. Problemanalyse 2.1. Hjertets og blodets opbygning og funktion Hjertets primære opgave som organ er at pumpe blodet rundt i kroppen og opretholde blodtrykket. Det er placeret i thorax forskudt cirka to tredje dele til venstre af den menneskelige midterlinje. Anatomisk består hjertet af fire kamre; to atrier og to ventrikler kaldet forkamre og hjertekamre, som er delt i højre og venstre. Atrierne og ventriklerne er adskilt af de to hjerteklapper, som kaldes de atrieventrikulære ventiler. Det højre atrium modtager afiltet blod fra kroppen, som har transporteret oxygen og næringsstoffer til cellerne. Blodet løber fra atriet ned i den højre ventrikel, hvorfra det bliver pumpet ud i lungerne, hvor det igen bliver iltet. Det iltede blod passerer ind i det venstre atrium og videre til den venstre ventrikel, hvorfra det bliver pumpet rundt i kroppen med oxygen til organismen. Når blodet har forladt hjertet løber det, via blodårerne, ud i kroppen. Arterier transporter blod fra hjertet, og vener transporter blod til hjertet. Årene har forskellige navne alt efter størrelse. Arterierne inddeles i; aorta, arterier, arterioler og kapillærer, hvor venerne inddeles i; kapillærer, venoler, vener og Vena Cava. Al udveksling af stoffer mellem blodet og væv sker i kapillærerne. Kapillærerne er de eneste årer uden eller med en delvis membran, hvilket muliggør stofudvekslingen. (Martini et al., 2012) Blodet består af to overordnede dele; Hæmatokrit og plasma. Hæmatokrit udgør mellem procent af helblodets volumen, og er en blanding af erytrocytter, leukocytter og trombocytter. De resterende procent er plasma, som er den ekstracellulære matrix, hvori erytrocytterne, leukocytterne og trombocytterne befinder sig. (Martini et al., 2012) Erytrocytter er den oftest forkomne celletype i blodet, hvor de udgør 99,9 procent af hæmatokriten (Martini et al, 2012). Deres primære opgave er at transportere oxygen til cellerne og kuldioxid fra cellerne. De har en levetid på cirka 120 dage (Bloddonorerne i Danmark, 2002) De er formet som bikonkave diske, og måler cirka 7,5 nm i diameter - 2,5 nm hvor de er tykkest, og 0,8 nm hvor de er tyndest, jævnfør figur 2.1B (Martini et al., 2012). Denne opbygning giver erytrocytterne et stort overflade/volume forhold, hvilket gør diffusionen af oxygen og kuldioxid ind og ud af cellerne hurtigere. Formen gør endvidere cellerne i stand til at stakke sig, så de kan passere uhindret gennem de smalle kapillærer. Den sidste funktion, som formen giver erytrocytterne, er at de er meget fleksible, hvilket er en fordel, når cellerne transporteres rundt med blodet i årene. Side 6 af 53

8 Figur 2.1, A: Erytrocyttens tredimensionelle struktur i plasmaet. Figur 2.1B viser et tværsnit af en enkelt erytrocyt med de almindelige målintervaller af diameter og tykkelse. (Martini et. al., 2012 revideret) Erytrocytter har ingen nukleus indeholdende deoxyribosenukleinsyre (DNA). Da erytrocytter transporter oxygen rundt i kroppen, ville det ikke være optimalt, hvis de havde en kerne med DNA, som oxygenet kunne reagere med, da dette kunne forsage mutation i DNA et (Martini et al., 2012). Erytrocytterne er i stand til at binde oxygen og kuldioxid, fordi de indeholder proteinet hæmoglobin. Hæmoglobin er en tetramer, som består af fire polypeptidkæder - to alfa og to beta. Hver polypeptidkæde indeholder en hæmgruppe, som er det pigment, der giver blodet dets røde farve. Hver af hæmgrupperne indeholder en jernion (Fe 2+ ) gennem kompleksbindinger, hvilket betyder, at ionen kan interagere med et oxygenmolekyle og danne oxyhæmoglobin (HbO 2 ). Dette sker ved en kovalent binding mellem jernionen og oxygenmolekylet (Casiday & Frey, Hemoglobin and the Heme Group: Metal Complexes in the Blood for Oxygen Transport, 1998). Et hæmoglobinmolekyle, hvis jernionen ikke har bundet et oxygenmolekyle, kaldes deoxyhæmoglobin. Blod med oxyhæmoglobin har en klar rød farve, hvor deoxyhæmoglobin har en mørkere rød farve. En erytrocyt indeholder omkring 280 millioner hæmoglobinmolekyler (Martini et al, 2012). Opbygningen af et hæmoglobinmolekyle fremgår af figur 2.2. Mængden af transporteret oxygen afhænger af iltniveauet i plasmaet. Når oxygenniveauet i plasmaet er lavt, vil hæmoglobin frigive oxygen til vævene og under disse omstændigheder vil mængden af kuldioxid (CO 2 ) i de perifere kapillærer stige. Jernionerne i hæmgrupperne vil i dette tilfælde binde CO 2 og danne carbaminohæmoglobin. Hvis oxygenniveauet i kapillærerne derimod er højt, vil hæmoglobin frigive CO 2. (Martini et al, 2012) Side 7 af 53

9 Figur 2.2: Illustration af hæmoglobinmolekylet, som befinder sig i erytrocytterne. Hæmoglobinmolekylet består af fire forskellige polypeptidkæder to alfa- og to betakæder. Derudover fremgår hæm-gruppens placering i hæmoglobinmolekylet samt en skematisk tegning af denne, hvori jern er bundet. (Martini et al., 2012) Immunsystemets opbygning og funktion Blodet har, udover transport af næringsstoffer, også til opgave at transporterer immunsystemets celler rundt til beskadiget eller inficeret væv. Immunsystemet beskytter kroppen imod fremmedlegemer som patogener og inddeles i to dele; Det medfødte og det adaptive. I begge disse indgår leukocytter eller hvide blodlegemer. Leukocytterne optræder i et væsentligt lavere antal end erytrocytterne og har en varierende levetid fra få timer til flere år. Der findes to overordnede typer af leukocytter, som inddeles i agranulocytter og granulocytter. Disse celler dannes i knoglemarven og modnes af hæmatopoietiske stamceller, hvorefter de migrerer fra knoglemarven ud i det perifere væv, hvor de beskytter vævet mod patogener. (Martini et al., 2012) Det medfødte immunsystem kaldes også for det uspecifikke system, hvilket vil sige, at det responderer på samme måde overfor alle typer af fremmedlegemer. Det medfødte system omfatter cellerne basofiler, eosinofiler, neutrofiler og monocytter. Monocytter udgør normalt 2-8 procent af leukocytterne i blodet (Martini et al., 2012). Deres opgave er at optage og destruere nedslidte celler og mikroorganismer. Monocytterne cirkulerer i blodbanen i omkring 24 timer, før de bevæger sig ud i det perifere væv, hvor de omdannes til makrofager. Makrofager er aggressive fagocytter, som opsluger organismer på størrelse med eller større end den selv. Aktive fagocytter frigiver kemikalier, kaldet kemotaxis, som tiltrækker neutrofiler, monocytter og andre fagocytotiske celler. (Martini et al., 2012) Granulocytter er betegenelsen for basofiler, eosinofiler og neutrafiler, som beskytter mod bakterielle infektioner og allergiske reaktioner. (Bloddonorerne i Danmark, 2002) Agranulocytter er betegnelsen for lymfocytter og monocytter, men det er kun monocytterne der indgår i det medfødte immunsystem. Foruden celledelen Side 8 af 53

10 omfatter det medfødte system eksempelvis fysiske barrierer, inflammatoriske responser og immunologisk overvågning. (Martini et al., 2012) I forhold til det medfødte immunsystem, er det adaptive immunsystem specifikt. Det vil sige, at det er specialiserede celler, der angriber et specifikt fremmedlegeme ved at genkende antigener på overfladen af fremmedlegemerne og producerer antistoffer mod det specifikke antigen. Den immunologiske respons er forskellig hos individer, da det afhænger af, hvilke antigener individet er blevet udsat for gennem livet. (Bloddonorerne i Danmark, 2002) En væsentlig del af det adaptive immunsystem består af lymfocytter, som udgør procent af leukocytterne. Lymfocytterne migrerer kontinuerligt igennem blodbanen ud i det perifere væv og tilbage til blodbanen, hvilket har betydning for den immunologiske overvågning. Størstedelen af lymfocytterne findes i bindevævet eller i organerne, og inddeles i to undertyper; T- og B- lymfocytter. (Martini et al., 2012) Koagulationen af blodet har en betydning for immunsystemet, da denne proces kan reparere en skade i epitelvævet, så patogener ikke direkte kan trænge ind i kroppen. Cellerne, som står for denne proces, kaldes for trombocytter og disse initierer samt kontrollerer koagulationsprocessen. Trombocytterne dannes ligeledes i knoglemarven og cirkulerer derefter i blodbanen i 9-12 dage, før de fjernes af fagocytter (Martini et al., 2012). Stoffer i beskadiget væv som eksempelvis kollagen gør, at trombocytterne agglutinerer og danner en blodpladeprop, som stopper blødningen. Sårskorpen dannes herefter af erytrocytter, trombocytter og plasma. (Bloddonorerne i Danmark, 2002) Immunsystemet omfatter også antigener og antistoffer. (Janeway et al., 2001) Antigener kan bestå af proteiner, kulhydrater eller glycoprotein og findes på overfladen af celler, vira og bakterier. Toksiner og bakterier kan også være antigener. (Martini et al., 2012) Når organismen udsættes for et patogen indeholdende et specifikt antigen, som er forskellig fra dens egne, danner immunforsvaret et specifikt antistof mod antigenet. Antistoffet produceres i B-lymfocytterne, og flyder rundt i plasmaet og kan sammen danne et kompleks (Martini et al., 2012). Udsættes organismen senere hen for samme specifikke antigen, kan immunforsvaret genkende det, og via antistofferne nedbryde antigenet inden, eksempelvis en sygdom, opstår. Antistofproduktionen hører således under det adaptive immunforsvar, da det er en forsvarsmekanisme, som udvikles gennem hele livet afhængigt af de specifikke patogener, som organismen udsættes for. (Janeway et al., 2001) 2.2. Det centrale dogme Fælles for levende organismer er, at nukleus indeholder arvematerialet DNA, som er en genetisk kode, der danner baggrund for proteinsyntesen. Generne, som udgør arveanlægget, består af et stykke af det DNA, som udgør rygraden af kromosomet. Generne indeholder områder kaldet exons, som koder for aminosyrer, og områder som ikke koder for noget kaldet introns. Et gen er Side 9 af 53

11 en del af et kromosoms DNA-sekvens. De findes i samtlige humane celler, med undtagelse af erytrocytterne, og indeholder menneskets 46 kromosomer. Det samlede antal af en organismes kromosomer kaldes genomet. (Gehani et al., 2013) Genomet er den samlede mængde af arveanlægget fordelt på de 22 autosomer og de 2 kønskromosomer X og Y. I 1987 påbegyndtes det humane genomprojekt (HUGO) med formålet at bestemme basesekvensen for det menneskelige genom. Det har vist sig, at genomet indeholder cirka tre milliarder basepar (bp). (Bremer, 2002) På kromosomet findes allelerne, som er forskellige udgaver af gener, der er bestemmende for de arvelige egenskaber. Arveanlægget udgøres af to alleler, hvor den ene stammer fra moderen og den anden fra faderen. (Wolsing & Peder, 2002) Disse to alleler danner tilsammen organismens genotype og det er på grundlag af denne, at fænotypen opstår. Er de to alleler ens med hensyn til en egenskab, er organismen homozygot, og er de forskellige er den heterozygot. Alleler kan også have forskellig dominans. Er den ene allel recessiv og den anden dominant, vil det være den dominerende allel, der udtrykkes i fænotypen i form af eksempelvis øjenfarve eller blodtype. Fænotypen er således det synlige udtryk, som afgøres af genotypen. (Martin og Hine, 2008) Genotypen dikterer fænotypen via proteinsyntesen. Dette sker ved at DNA i nukleus først transskriberes til små transportable messengerribonukleinsyre-molekyler (mrna). Det RNA, som svarer til intronsområderne på genet, fraspaltes og herefter splejses exonområderne sammen, hvorved det brugbare mrna dannes. Udover mrna findes der to øvrige typer af RNA i cellerne; transport RNA (trna) og ribosomalt RNA (rrna). Disse har forskellige strukturer og funktioner, men er alle krævet i proteinsyntesen (Martini et al., 2012). Den genetiske kode deles herefter op i tripletter (codons), der består af tre baser. Disse tre baser koder for én bestemt aminosyre (Bremer, 2002) mrna et transporteres efterfølgende ud af nukleus og videre ud i cytoplasmaet. Her aflæses den genetiske kode for proteinernes aminosyresammensætning i mrna et af ribosomerne. I ribosomerne placeres mrna'et overfor det trna, som har en triplet(anticodon), som er komplementær til mrna's triplet. Den aminosyre som trna koder for sættes derefter på det voksende protein, og på denne måde translaterer ribosomerne den genetiske kode til aminosyre, som er byggestenene i de funktionelle proteiner. Det er disse funktionelle proteiner, som er afgørende for cellens fænotype (Bremer, 2002) Processen kan deles op i; DNA mrna aminosyre funktionelt protein cellens fænotype organismens fænotype. (Gehani et al., 2008) Denne sammenhæng kaldes i molekylærbiologien det centrale dogme, da det forklarer sammenhængen mellem organismens genotype og fænotype. Det centrale dogme blev opdaget i 1950'erne, og regnes for et af de største gennembrud indenfor biologisk forskning i det århundrede. (Bremer, 2002) DNA består af en kæde af nukleinsyre, som er store organiske molekyler, der udgøres af fosfat, nitrogen, oxygen, hydrogen og carbon. Nukleinsyrerne har til formål at oplagre og bearbejde den Side 10 af 53

12 genetiske information. Man opdeler nukleinsyrerne i to klasser; deoxyribonukleinsyre (DNA) og ribonukleinsyre (RNA). Disse to klasser adskiller sig i gennem deres struktur, funktion og opbygning. (Martini et al., 2012) Nukleinsyrernes rolle er at oplagre og videregive information af essentiel betydning for proteinsyntesen. De består af en eller to kæder, som formes ved dehydreringssyntese. De individuelle underenheder kaldes for nukleotider, og disse består af en pentose bundet til en fosfatgruppe og en nitrogenholdig base. Pentosen er et kulhydrat, der i DNA er deoxyribose og i RNA er ribose. Der findes fem forskellige nitrogenholdige baser i nukleinsyrer; Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G), Cytosin (C) og Urasil (U). Baserne ses i figur 2.3. Adenin og guanin er puriner, som er dobbeltringede molekyler, mens cytosin, thymin og uracil kaldes pyrimidiner, som er enkeltringede molekyler. Begge klasser af nukleinsyrer indeholder adenin, guanin og cytosin, mens thymin udelukkende er i DNA, og uracil kun findes i RNA, hvor den erstatter thymin. Det er denne basesekvens, som indeholder den genetiske kode. (Martini et al., 2012) DNA er opbygget af to polynukleotidkæder, som snor sig om hinanden i en højresnoet dobbelthelix, som det fremgår af figur 2.4. Disse to strenge kan adskilles ved høj temperatur til to enkeltstrengede komplementære DNA-strenge og sammenholdes af hydrogenbindinger mellem de nitrogenholdige baser. Baserne parrer altid med deres komplementære baser i den modsatte kæde. Således baseparrer A altid med T og G altid med C. (Gehani et al., 2008) Dette fænomen kaldes baseparringsprincippet, og betyder at der ud fra en kæde i DNA altid kan dannes den komplementære streng. (Wolsing & Peder, 2002) Dannelsen af én DNA-streng foregår altid ved den fosfatgruppe, som sidder på 5' positionen (upstream) i deoxyribose i det nukleotid, som skal indbygges. Fosfatgruppen binder sig til den fremkomne streng igennem OH-gruppen, som sidder på 3' positionen (downstream). De to komplementære strenge dannes i hver sin retning og er dermed antiparallelle (Gehani et al., 2008). En enkelt humancelles DNA har en samlet længde på omkring 2 meter (Gehani et al., 2008). For at hele genomet skal kunne være i hver eneste celle i organismen, undtagen erytrocytterne, er DNA'et viklet omkring spoleformede proteiner kaldet histoner. Denne struktur kaldes chromatin og er det materiale, som kromosomerne er opbygget af. (Gehani et al., 2008) Side 11 af 53

13 Figur 2.3: Baserne som indgår i DNA og RNA (Gehani et al 2008) Figur 2.4: DNA er en del af kromosomet (lilla X) og i selve DNAet sidder baserne overfor hinanden jf. baseparringsprincippet (Gehani et al revideret) Side 12 af 53

14 2.3. Opbygning af ABO- og Rhesussystemet De fire blodtyper i ABO-systemet opdeles efter hvilke antigener, der bindes til erytrocytterne. Desuden indeholder plasmaet antistoffer, som er en immunrespons ved udsættelse for fremmede antigener, eksempelvis hvis man udsættes for en uforligelig blodtype eller et patogen. Den første blodtype kaldes A, fordi erytrocytterne har A-antigener på overfladen, samt at blodets plasma indeholder B-antistoffer. Den anden blodtype kaldes B og indeholder B-antigen på overfladen af erytrocytterne, og har A-antistoffer i plasmaet. Den tredje er AB, som indeholder både A- og B- antigener på overfladen, og indeholder derfor hverken A- eller B-antistoffer i plasmaet. Den fjerde kaldes 0, fordi både A- og B- antigenerne er fraværende, og derfor indeholder blodet både A- og B-antistoffer. Blodtyperne er illustreret i figur 2.5 (Berg et al., 2012) Antistoffet anti-a binder sig til N-acetylgalaktosamin og neutraliserer på den måde antigenets funktion. Antistoffet anti-b binder sig til galaktose, men har ellers den samme effekt. (Daniels, 2013) Udover A- og B-antigenerne findes der også et h-antigen, og forskellen mellem disse afgøres af et enkelt molekyle. h-antigenet er en sammensat kæde af fukose, galaktose og N- acetylglukosamin. Kædens struktur kaldes et oligosakkerid, som opbygges ved, at der på overfladen af erytrocytten bindes et galaktosemolekyle, hvortil et N-acetylglukosamin molekyle binder sig. Til N-acetylglukosaminmolekylet binder der sig et galaktosemolekyle, som igen bindes til fukose, hvilket resulterer i et h-antigen. Til h-antigenets andet galaktose kan der binde sig N-acetylgalaktosamin, hvilket betyder, at h-antigenet bliver til et A-antigen. Hvis der i stedet bindes et galaktose, vil det resultere i et B-antigen. Dette illustreres af figur 2.5 (Daniels, 2013) Der findes som udgangspunkt ikke et rhesus(rhd)-antistof i kroppen. Det opstår udelukkende, hvis en RhD-negativ person modtager blod fra en RhD-positiv person, hvorved der opstår en antistof-antigenreaktion, hvilket kan medføre hæmolytisk anæmi (Knudsen, 2011). Et eksempel er den reaktion, som opstår når en RhD-negativ kvinde danner antistoffer mod et RhDpositivt foster, hvis fosterets blod kommer i kontakt med moderens. Fosterets overlevelse er ikke truet af reaktionen, men i fald at kvinden igen bliver svanger med et rhesuspositivt barn, kan RhD-antistofferne passere gennem placenta og nedbryde fosterets erytrocytter. Dette kan medføre hæmolytisk anæmi, som kan betyde at fosteret går til grunde (Knudsen, 2011). For at forhindre at kvindens immunforsvar danner antistoffer mod fosteret, tilbydes hun antenatal rhesus profylakse med en μg anti-d immunglobulin infusion i uge 29 og igen efter fødslen (Sundhedsstyrelsen, 2013) Side 13 af 53

15 Figur 2.5: Skematisk tegning over de forskellige blodtypers antigener og deres molekylære sammensætning ABO- og rhesussystemets betydning for blodtransfusion En blodtransfusion anvendes for at erstatte blodtab ved eksempelvis kirurgiske indgreb, hvor man ønsker at opretholde et tilstrækkeligt cirkulerende blodvolumen under eller efter indgrebet. Ligeledes benyttes blodtransfusioner i forhold til blodsygdomme, hvor man søger at opretholde et tilstrækkeligt hæmoglobinniveau, eftersom at dette ofte reduceres som følge af eksempelvis leukæmi og anæmi. Endeligt benyttes blodtransfusioner for at genoprette blodvolumen efter større skader på organismen. (Hasselbalch et al., 2011) I Danmark består transfusionen udelukkende af blodkomponenter. En transfusion med erytrocytter gives, når blodprocenten er for lav, hvilket typisk kommer til udtryk i form af træthed, svimmelhed og åndedrætsbesvær. Blodplader overføres ved transfusion, når koncentrationen af disse er for lav. Blodplasmaet indeholder proteiner, der ligesom blodpladerne, har en betydning for blodets evne til at størkne. Ved mangel på plasma foretages en infusion med dette.(hansen, 2014) De risici, der normalt forbindes med transfusioner er risikoen for at få overført uforligeligt blod. Dette sker ved cirka 6 ud af enheder blod, der gives. (Hasselbalch et al., 2011) For at kunne overføre blod fra et individ til et andet, er det nødvendigt at donorblodet, som overføres ved en blodtransfusion, er forligeligt med recipientens blod. At blodet er forligeligt betyder, at der ikke findes antistoffer i blodet, som kan forårsage en antigenantistofreaktion. Hvis donor og recipients blodtyper er uforligelige, kan det føre til hæmolytisk anæmi, hvor erytrocytterne nedbrydes. For at sikre at dette ikke sker benyttes ABO- og rhesussystemet (Knudsen, 2011). Det er muligt at give blod til en recipient med samme blodtype som donoren Side 14 af 53

16 selv. Der er dog også andre tilfælde, hvor det er muligt at donerer blod til recipienter med andre blodtyper end donorens. (Nobelprize.org, 2001) En type A kan ikke modtage type B på grund af B-antistofferne. Det omvendte gælder for type B, som ikke kan modtage blod fra type A af samme grund. Type AB har ingen antistoffer og kan derfor både modtage blodtype A og blodtype B. Ved type O er der ingen antigener, og derfor er der både A- og B-antistoffer, hvilket betyder, at der kun kan modtage blod fra andre med type O. Det særlige ved denne blodtype er, at blodet indeholder antistoffer mod både type A og B, og dermed kan denne blodtype donerer blod til alle andre blodtyper. Derfor kalder man også type O - for universaldonoren. Type AB + kaldes for universalrecipient, fordi denne type kan acceptere alle blodtyper. (Martini et al., 2012) Rhesusfaktoren har også en betydelig rolle i forhold til bloddonation. Rh + blod kan aldrig gives til en recipient med Rh - blod, men det omvendte er muligt. Således kan Rh - blod doneres til en recipient med Rh + blod. (Nobelprize.org, 2001) I tabel 2.5 er der listet samtlige forhold med bloddonorer og recipienter. Tabel 2.5: Oversigt over de mulige transfusioner mellem forskellige blodtyper. "x" markerer en forligelig transfusion af blodkomponenter. Side 15 af 53

17 2.5. Genetisk variation af blodtyper ABO-systemet opdeles yderligere i grupperne: A 1, A 2, B, AB og O. Forskellen imellem blodtyperne er et enkelt molekyle. For blodtype A er der et ekstra galaktose, for B er der et N- acetylgalactosamin og for O er der ikke et ekstra molekyle. Forskellen for dannelsen af blodtyperne er det specifikke enzym i glykotransferasen, hvori kulhydraterne på oligosakkaridet fastsættes. Baseparrene, der koder for glykosyltransferasen og dermed antigenerne, er lokaliserede på kromosom 9 - mere præcist position 9q34.2 i baseparsekvens (NCBI, 2014), som består af syv exoner samt seks introner (Seltsam et al., 2013). Positionsangivelsen betyder således at hele ABO-genet sidder på kromosom 9, lang arm, region 3, 4. bånd, underbånd 2 (Wagner & Flegel, 2000). Den genetiske kode for det katalytiske domæne på enzymet er lokaliseret på de to sidste exoner. Exon 6 består af 135 basepar, og exon 7 består af 688 basepar. Et eksempel på en genetisk variation er A 1 og A 2. Forskellen mellem disse er en substitution af nukleotid 467 på exon 7, samt det faktum at på A 2 er der ikke et nukleotid på position i exon 7 se tabel 2.6. Denne forskel forårsager en forstyrrelse i A 2 s stopcodon, hvilket medfører, at den har 21 ekstra aminosyrer, som ændrer enzymets katalytiske domæne (Seltsam et al., 2013). Forskellen mellem A 1 og A 2 er ikke signifikant og beskrives derfor som samme enzym - nemlig α-1,3-n-acetyl-d- Galaktosaminyltransferase, som har til funktion at danne N-acetylgalaktosamin. Den genetiske kode for blodtype B beskriver dannelsen af enzymet α-1,3-d-galaktosyltransferase, som danner galaktose. Forskellen på de resterende blodtyper illustreres i tabel 2.6. Ved blodtype O forekommer der en deletion på exon 6 i baseparret 261, hvilket forårsager en defekt, som resulterer i dannelsen af h-antigenet. (Ringel et al., 1999) Indenfor ABO-systemet findes fire fænotyper, der enten kan være homozygot eller heterozygot. På tabel 2.7 under øverste række med fænotyper fremgår det, at eksempelvis blodtype A kan fremkomme ud fra de nedarvede genotyper AA og AO, hvor det dominerende gen er A, og det recessive gen er O. De dominerende gener for fænotyperne er henholdsvis A og B, og hvis begge antigener er til stede fremkommer blodtypen AB. Blodtypen O kan kun forekomme i fæ notypen, hvis begge forældre er bærer af den recessive allel. (Bloddonorerne i Danmark, 2000). Indenfor rhesussystemet er der beskrevet 49 forskellige antigener (Flegel, 2006), men det er kun ved et specifikt antigen, at der kan forekomme immunisering i blodet. Den genetiske kode for dette antigen er et basepar langt gen, som er placeret på 1p36.11 mellem (NCBI, 2014), kaldet D-antigen eller RhD. Dette protein bliver syntetiseret, hvis genet er tilstede i genomet. Hvis man besidder RhD genet, beskrives blodtypen som rhesus positiv også kaldet RhD +, og modsat hvis man mangler genet, er man rhesus negativ eller RhD - (Flegel, 2006). Der er tre mulige genotyper og to mulige fænotyper for rheusgenet, hvilket fremgår af tabel 2.8. I Side 16 af 53

18 genotypen kan der forekomme D eller d, hvor D er det dominerende gen, og d er det recessive gen. Tabel 2.6: Basepar for exon 6 og 7, der afgør ABO blodtypen på kromosom 9. (Ringel et al revideret) Hvor A er Alanin, C er Cystein, G er Glycin og T er Threonin (Daniels, 2013) Tabel 2.7: Krydsningsskema for nedarvede rhesus D alleler, (Bloddonorerne i Danmark, revideret) Blodtype (genotype) Erytrocytters overfladeproteiner (fænotype) Plasmaantigener (fænotype) Blodtype A (alleler AA,AO) Blodtype B (alleler BB, BO) Blodtype AB (alleler AB) Blodtype O (alleler OO) A antigen B antigen A og B antigener Igen antigener B antistof A antistof Ingen antistoffer A og B antistof Tabel 2.8: Krydsningsskema for nedarvede rhesus D alleler, (Bloddonorerne i Danmark, revideret) Gen fra fader Gen fra moder Genotype Antigener Fænotyper D d D D DD dd D RhD positiv D d Dd d d dd - RhD negativ Side 17 af 53

19 2.6. Deletion af rhesusbokse Til genotypisk bestemmelse af rhesusgenet RHD undersøges rhesuslokuset, som er et bestemt område på kromosomet. Rhesusgenerne RHD og RHCE er placeret på 1p34.1-1p36 (Wagner & Flegel, 2000). Rhesusgenerne RHD og RHCE og er adskilt af SMP1genet. Derudover er der to rhesusbokse kaldet upstream (U) og downstream (D) med U før RHD genet og D efter. RHD genet er placeret specifikt mellem baseparrene (NCBI, 2014), SMP1genet er placeret mellem (NCBI, 2014) og RHCEgenet er placeret mellem (NCBI, 2014), hvor RHD og RHCE vender modsat hinanden. RHD genets retning, læst fra venstre side, går fra 5 enden til 3 enden, modsat RHCE genet, som går fra 3' enden til 5' enden. (Wagner & Flegel, 2000). Rhesus boksene på figur 2.7 er angivet som U og D. Disse to rhesus bokse består af omkring basepar med 98,6 procents homologi. Upstream rhesusboksen U på figur 2.7 ender omkring basepar før RHD genets 5 ende. Downstream rhesusboksen D på figur 2.7, starter 104 basepar efter RHDs stopcodon. Den høje homologi mellem upstream og downstream rhesusboksene kan resultere i ulige homologe rekombinationer mellem rhesusboksene, hvor der dannes en enkelt hybrid rhesusboks. Dette resulterer i deletion af RHD gen, hvilket betyder, at blodtypen er rhesusnegativ. Denne kombination af rhesusboksene vil forekomme imellem baseparrene , grundet en næsten identisk sammensætning.(wagner & Flegel, 2000) Figur 2.7: Skematisk struktur af Rh lokus. Position og retning af rhesus boksene U og D, samt generne RHD og RHCE adskilt af SMP1 genet er illustreret. Exons for rhesus boksene er indikeret på vertikal linje under pilene, og introns er områderne i mellem tallene. De to rhesus gener er separeret med SMP1 genet, som er omkring 30 kb, hvor generne vender modsat hindanden med 3 enderne. (Wagner & Flegel, 2000 revideret) Side 18 af 53

20 3. Problemformulering Den gennemgåede teori benyttes til at bestemme fæno- og genotype for udvalgte gruppemedlemmer. Den fænotypiske og genotypiske bestemmelse af blodtyperne ABO og rhesus er relevant i forhold til blodtransfusion, da ikke alle blodtyper er forligelige. For at klarlægge blodtypen vil gruppemedlemmer få bestemt deres blodtype fænotypisk via eldonkort. Hernæst skal genotypen for rhesussystemet bestemmes ved først at isolere genomisk DNA og derefter amplificere de områder på generne, hvor den genetiske variation findes via PCR-RLFP. Det er essentielt for samfundet at have en stabil population af bloddonorer, da blodtransfusioner er nødvendige indenfor sygehusvæsnet. Derfor er det centralt at undersøge, hvordan en stabil population af bloddonorer opretholdes. For at kunne besvare dette spørgsmål, er der foretaget en analyse med fokus på, hvilke selviske og uselviske motiver, som driver donorerne og de kommende donorer. Dette analyseres i forhold til hvervning af nye donorer og oplysning om bloddonation generelt via hverve- og oplysningskampagner. Endvidere diskuteres det, hvordan blodbankerne kan minimerer de negative konsekvenser, som bloddonation kan medføre, da disse kan føre til både fysisk og psykisk ubehag hos bloddonorerne. Dette kan føre til at eksisterende donorer vil falde fra, og at blodbanken samtidig kan miste potentielle donorer. Side 19 af 53

21 4. Metodeteori 4.1. Fænotypisk bestemmelse via eldonkort Her blev Eldonkort Skola Kit SKS fra Eldonkort Biological A/S anvendt. Eldonkortet er imprægneret med antigener (anti-a, anti-b og anti-d), som anvendes til detektering af ABO- og rhesus systemet ved tilførsel af DNase-frit vand og blod til kortet. Hvis der opstår en agglutination, betyder dette, at testpersonen har den pågældende blodtype. Derudover er der et kontrolfelt, som kan detektere invalide resultater. (Bienek & Charlton, 2011) 4.2. Gelelektroforese Gelelektroforese er en analytisk metode, som anvendes til separation af biologiske makromolekyler ved brug af et elektrisk felt og en gelmatrix. Metoden anvendes ved at tilsætte en opløsning af proteiner, DNA eller RNA til gelmatricen, hvorefter de biologiske makromolekyler separeres af tiltrækningskræfter fra en gennemløbende strøm. (Yilmaz, Ozic & Gok, 2012) Ved separationen tilsættes molekylerne således, at migreringen sker fra katoden til anoden for DNA og proteiner, men dette afhænger generelt af molekylets ladning. Migreringshastigheden v for de individuelle makromolekyler i gelmatricen afhænger af deres nettoladning z, det elektriske felts styrke E og friktionskoefficienten f. Sammenhængen mellem dette udtrykkes ved: Udover denne sammenhæng er migreringshastigheden også afhængig af ladning/masseratio og strukturen af de individuelle molekyler samt gelmatricens temperatur, porøsitet og viskositet (Reddy & Raju, 2012). Der anvendes oftest porøse gelmatricer, da porerne i gelen separer molekylerne, hvor mindre molekyler får en større mobilitet end større molekyler. (Berg et al., 2012) I forbindelse med separation af DNA er den hyppigst anvendte gelmatrix agarosegelen. Agarosegel er en polymer af disakkaridet agarobiose, som består af galaktose og 3,6-anhydrogalaktose (Reddy & Raju, 2012). Ved anvendelse af agarosegelelektroforese kan migreringshastigheden af DNA-molekyler justeres ved at ændre på koncentrationen af agarose og spændingen. Tiltrækningskraften fra den gennemløbende strøm påvirker de negative fosfatgrupper på DNA-molekylerne, som migrerer imod anoden. For at visualisere makromolekylernes migrering i gelen kan der anvendes et fluorescerende farvestof som ethidiumbromid. Ethidiumbromid farver DNA-molekylerne ved at interkalere i DNAstrukturen og emitteres ved bølgelængden mellem nm, som er udenfor det synlige spektrum. Derfor benyttes loading-dye indeholder bromphenolblåt, som migrerer med Side 20 af 53

22 omtrent samme hastighed som DNA-molekylerne på 300 basepar. (Yilmaz, Ozic & Gok, 2012) 4.3. Isolation af genomisk DNA Der findes forskellige metoder til oprensning af DNA. Metoden, som beskrives her, bygger på kittet QIAamp DNA Investigator. DNAet befinder sig i nukleus og er omgivet af membraner, hvilke kan lyseres ved tilsætning af ATL-buffer indeholdende sodiumdodecylsulphate (SDS) og edetinsyre. SDS er et anionisk, denaturerende detergent og har en amfifil struktur med både hydrofob og fil karakter samt en negativ polaritet. Denne egenskab medfører, at SDS er i stand til at interagere med hydrofobe molekyler, såsom fosforlipid i cellemembranen, med dens hydrofobe ende, hvorved hydrofobe interaktioner mellem lipid-lipid, protein-protein og protein-lipid brydes. (Thermo Scientific) Derudover indeholder bufferen edetinsyre (EDTA), som inhiberer proteiner, herunder nukleaser, der findes i cellen. Inhibering af nukleaser opstår ved, at EDTA danner chelat-forbindelser med divalente kationer, hvilke er kofaktorer for nukleaser (Wilson & John, 2010). Til prøven tilsættes proteinase K, som er et proteolytisk enzym, for at inhibere nukleaser ved endolytisk kløvning ved carboxylsiden af alifatiske, aromatiske eller hydrofobe aminosyrer til inaktive peptider (Thermo Scientific). Kittets proteinase K er en serinprotease og inhiberes ikke af EDTA, SDS og manglen på tilstedeværelsen af kofaktorer. (Walker & Raphley, 2009) Efter enzymet er tilsat, inkuberes prøven ved 56 grader celsius, da dette er enzymets optimumtemperatur (Thermo Scientific). Herefter tilsættes AL-buffer indeholdende guanidinhydrochlorid, som er et stærkt kaotropisk salt. Dette salt har en denaturerende effekt, som forøger opløseligheden af hydrofobe molekyler ved at bryde vandets hydrogenbindinger. (Thermo Scientific) Guanidinhydrochlorid inhiberer desuden proteinase K. Dernæst tilsættes AW1-buffer, vaskebuffer, blandet op med % ethanol for at forøge renheden af DNA, som binder til sig til den ph afhængige silica-membran på QIAamp MinElute kolonnen, hvilket kun finder sted ved høj koncentration af et kaotropisk salt. Dette er for at vaske uønskede proteiner og reagenser fra prøven. (Qiagen, ) Guanidinhydrochlorid i AW1-bufferen sikrer en videre denaturering af proteiner og dehydrering af DNAet. Prøven vaskes endnu engang med AW2-buffer indeholdende en Tris-opløsning, som fjerner salt, hvorefter prøven centrifugeres og afdampes for ethanol (Forensic Biological Section Qiagen, 2012). Til sidst elueres prøves med ATE-buffer for at løsne DNAet fra membranen. Dette sker, fordi ph-værdien stiger til 8,3, hvor absorptionen af DNA er tæt på 0 (Qiagen, ). Eluatet fungerer desuden som et opbevaringsmedie, da EDTA forhindrer nedbrydning af DNAet. Side 21 af 53

23 4.4. Koncentrationsbestemmelse af DNA via spektrofotometri Koncentrationsbestemmelse af DNA-prøver udføres ved brug af NanoDrop, der anvender spektrofotometri med et absorptionsspektrum på nm til måling af absorbans, som derefter omregnes til en koncentration. Spektrofotometri er en metode beskrevet ved relationen mellem en transmission T af lys med en intensitet P efter at have passeret en væske med en oprindelig lysintensitet P 0 hvilket er defineret som: (Mygind, 1995) og I de fleste tilfælde tages der udgangspunkt i absorbans A, som udtrykkes Ovenstående sammenhæng er Lambert-Beers lov, som beskriver absorption proportionalt med lysvejen l i cm, koncentrationen C i molær M og ekstinktionskoefficienten i. Ekstinktionskoefficienten er en konstant og afhænger af bølgelængden. (Mygind, 1995) DNAmolekyler absorberer lys ved bølgelængden 260nm, hvorimod proteiner absorberer ved 280 nm. A260/A280 ratio beskriver derfor forholdet mellem koncentrationen af DNA-molekyler og proteiner, hvilket indikerer renheden af prøven. Hvis ratioen for DNA og protein ligger på cirka 1,8, accepteres dette generelt som rent DNA, ligger den på cirka 2,0, accepteres dette generelt som rent RNA og ligger den under både 1,8 og 2,0, indikere dette en kontaminering. A260/A230 ratio beskriver en sekundær indikering af renheden af DNA-prøven, hvor A230 er den bølgelængde, som organiske forbindelser absorberes ved. Intervallet af denne ratio ligger mellem 1,8-2,2 og har ofte en værdi højere end A260/A280 ratioen. (Thermo Scientific, 2008) 4.5. PCR Polymerase Chain Reaction - Amplificering af DNA-sekvens Polymerase chain reaction (PCR) er en molekylærbiologisk metode, der benytter samme princip om fordobling, som den levende celle. Dette muliggør amplificering af DNA op til en størrelsesorden på til kopier af en specifik DNA sekvens. PCR, eller in vitro kloning, er en automatiseret proces, som består af en række fasetemperaturændringer også kaldet cyklusser. Dette gør det muligt at amplificere DNA uden brug af en bakterie, kaldet in vivo kloning, som var den foregående metode til samme proces. (Zador, 2011) Forud for processen findes den DNA-sekvens, skabelonen, som ønskes amplificeret. Det er en primer, som bestemmer hvilket sted amplificeringen af DNAet påbegyndes. En primer er en bestemt enkeltstrenget DNA-sekvens, der enten binder sig specifikt eller uspecifikt til skabelonstrengen. En optimal primer er bp lang, da dette er den optimale længde for, at primeren både kan være tilstrækkelig specifik og stadig let kunne binde sig til den ønskede DNA- Side 22 af 53

24 sekvens. Primerens denatureringstemperatur beregnes og estimeres endvidere ud fra guanin- og cytosinindholdet, da det menes at være en indikator for dette. (Amrita University, 2014) En primer denatureres og bliver til to enkeltstrengede DNA-sekvenser, som hver løber den modsatte vej af hinanden, altså er de anti-parallelle, og da deres baser er placeres modsat hinanden, er de to primere komplimentære. Her kaldes primerne henholdsvis forward og reverse og bestemmer replikationens begyndelse og slutning i forhold til den DNA-sekvens, som ønskes amplificeret. (The University of Queenland, 2014) Primerne er placeret på hver sit enkeltstrengede DNA. Forwardprimeren er placeret ved 5'enden og syntetiserer imod 3' enden, og reverseprimeren er placeret ved 3'enden og syntetiserer imod 5' enden. Primeren gør det muligt for polymerasen at syntetisere DNAet. (NCBI) Polymerasen, er en Thermus Aquaticus(Taq) polymerase, der består af en polypeptid, med en molekylevægt på cirka 94 kda. Der kan også benyttes andre polymeraser. Taq polymerase er et varmebestandigt enzym, som er i stand til at syntetisere DNA ved temperaturer omkring vands kogepunkt (Life Technologies, 2010) Taq polymerase har temperaturoptimum på cirka 70 grader celsius afhængigt af enzymtypen. (Zador, 2011)Foruden den korrekte temperatur, kræver den varmestabile polymerase frie divalente kationer for at kunne fungere optimalt, da disse er en kofaktor for polymerasen og er med til at stabilisere enzymets struktur. Polymerasen binder magnesium (Mg 2+ ), og for at denne kation kan benyttes, skal den molære koncentration af Mg 2+ overskride koncentrationen af fosfatgrupper, som endvidere påvirkes af nukleotider og primere. Det gør derfor en standardisering umulig, da den bestemmes individuelt for hver applikation. (Amrita University, 2014) Cyklusserne i PCR består af tre trin, som indebærer en denaturering, en annealing og en primer ekstension, hvilket fremgår af figur 4.5. Endvidere foregår disse cyklusser ved helt bestemte temperaturer, som er tilpasset optimale forhold for de benyttede reagenser. Efterfølgende foretages en ekstra forlængelsesfase, hvor temperaturen fastholdes på grader celsius i 5-15 minutter for at sikre, at samtlige resterende skabeloner er fuldt forlængede. Til sidst sænkes temperaturen til 4-15 grader celsius i en udefineret tidsperiode, som benyttes til kortvarig opbevaring af prøven. (Zador, 2011) Side 23 af 53

25 Figur 4.5 De tre trin i en PCR cyklus. De orange områder af sekvensen angiver de flankerende sekvenser, mens det gule område angiver den sekvens, som ønskes amplificeret. De farvede pile (blå, rød, grøn og lilla) angiver primerne, og i hvilken retning polymerasen syntetiserer DNA-sekvensen (fra 5 enden til 3 enden). De lyseblå og lyserøde sekvenser med pile angiver, at denne syntetisering fortsætter ud over den ønskede sekvens. De lysegrønne og lyslilla sekvenser er produktet af det område, som ønskes amplificeret. (Berg et al., 2012 revideret) Den initialiserende fase, som er den første PCR cyklus, består af en opvarmning til grader celsius. Ved denne temperatur nedbrydes hydrogenbindingerne mellem de komplementære baser i det dobbeltstrengede DNA, hvilket resulterer i enkeltstrenget DNA. Temperaturen fastholdes i sekunder, bestemt efter koncentrationen af DNA i prøven. Hernæst følger en tempereringsfase, hvor temperaturen sænkes til grader celsius i sekunder. Her tempereres primerne til deres optimum, som i de fleste tilfælde vil være 3-5 grader celsius under primernes denatureringstemperatur (Tm), og binder sig til deres respektive sekvenser på det enkeltstrengede DNA. De DNA-DNA hydrogenbindinger, som dannes mellem primeren og skabelonen, kan kun forekomme hvis primersekvensen matcher skabelonsekvensen næsten fuldstændigt. Polymerasen bindes herefter til primerne. Efterfølgende hæves temperaturen til grader celsius, hvor Taq polymerasen har sit optimum. Polymerasen syntetiserer her den komplimentære DNAstreng fra 5 til 3 enden, og benytter her de tilsatte frie nukleotider som byggeklodser til at opbygge den matchende DNA-streng. (Maloy et al., 1994) DNA, som er syntetiseret i den første cyklus, har primeren som 5 enden samt en variabel 3 ende. Når disse strenge denatureres, vil den oprindelige streng rehybridisere til primeren således, at produktet med en variabel 3 ende vil fortsætte med at blive syntetiseret i efterfølgende PCR-cyklusser. For hver cyklus vil der kun produceres en kopi af hvert produkt. Den anden cyklus af denaturering, temperering og primerekstension producerer produktsekvens, der har den ene primer som 5 enden og den anden primer som 3 enden. Hver streng fra denne produktsekvens er komplementær til en af de to primere, og kommer derfor til at fungere som skabelon i de efterfølgende PCR-cyklusser. Dette betyder også, at der sker en ekspotentiel akkumulering af produktsekvensen for hver runde PCR-amplifikation. For hver n cyklus vil der ske en 2 n -gange amplifikation af det specifikke DNA fragment, såfremt der ikke findes en begrænsende faktor. (Maloy et al. 1994) (Berg et al., 2012 revideret) 4.6. Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction Der findes endvidere en PCR metode kaldet Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction (RFLP-PCR). Denne metode er effektiv til detektering af genotyper (Rasmussen, 2012) og benytter detekteringen af fragmenter af diverse længder, efter kløvningen med et specifikt enzym ved navn restriktions endonukleaser. (NCBI) Denne metode benytter sig ligeledes af gelelektroforesen for visualisering af resultat. Den første fase i denne proces foregår ved en amplifikation af DNA-fragmenter indeholdende de genotypiske variationer, som ønskes undersøgt. Endvidere bliver fragmenterne behandlet med RE. Tilstedeværelsen eller fraværet af restriktionsenzymets genkendelsessites resulterer i formationen af restriktionsfragmenter af Side 24 af 53

26 forskellig størrelse. Disse fragmenter kan vægtfordeles ved agarose gelelektroforese. (Rasmussen, 2012) Hvis der i overstående processer ikke findes en begrænsende faktor, vil processen forløbe eksponentielt, og der vil teoretisk ikke være nogen begrænsning for, hvor hurtigt amplificeringen kan forløbe. (Zador, 2011) Side 25 af 53

27 5. Forsøgsdesign Forsøgsdesignet tager udgangspunkt i artiklen af Wagner & Flegel (2000). Da selve rhesusgenet er basepar langt, er det ikke muligt at amplificere dette ved hjælp af PCR. (NCBI, 2014) Der ønskes i stedet at amplificere dele af de to rhesusbokse, som befinder sig henholdsvis upstream og downstream for rhesusgenet. De to rhesusbokse er hver cirka bp lange og cirka 98,6 procent homologe. I hver af rhesusboksene er der en sekvens på bp, som indeholder identifikationssekvensen for RHD negative haplotyper. For at amplificere den rhesus-negative identificerende region, benyttes primere, som bindes på hver side af denne. Disse primere er henholdsvis rez7 og rnb31 jævnfør figur 5.1, hvor rez7 er uspecifik for 5 enden af den identificerende region for begge rhesusbokse. rnb31 er kun specifik for 3 enden af den identificerende region af downstream rhesusboksen jævnfør figur 5.2. Det bånd, der forventes efter en gelelektroforese, er cirka bp. Længden af dette bånd blev fundet på baggrund af den restriktionsanalyse, der foretages i artiklen af Wagner & Flegel (2000). Her benyttes samme primere (rez7 og rnb31) til at fremstille det specifikke amplikon, som efterfølgende klippes med restriktionsenzymet PstI. I rhesus-negative haplotyper er der tre PstI restriktionssites i amplikon, som resulterer i fragmenter på henholdsvis 1888 bp, 564 bp, 397 bp og 179 bp. Downstream rhesusboksen af rhesus-positive haplotyper mangler et restriktionssite, og derfor fremkommer der kun tre fragmenter frem for fire. Fragmenterne har længderne 1888 bp, 744 bp og 397 bp. Heterozygote haplotyper (RHD - /RHD + ) viser en blanding af den negative og positive haplotype. 564 bp fragmentet fremstår svagere, fordi heterozygoter ikke klippes med PstI. Rnb31 primeren amplificer ikke upstream rhesusboksen af RhD-positive haplotyper illustration af de forskellige haplotyper fremgår af figur 5.3. (Wagner & Flegel, 2000) Figur 5.1 Skematisk billede af rhesusgenet med upstream rhesusboks (grå), downstream rhesusboks (sort) samt forward primer (rez7) og reverse primer (rnb31) Rhesusboksene er hver cirka bp, mens primer rez7 er 23 baser og rnb31 er 27 baser (Wagner & Flegel, 2000 revideret). RHD genet er bp. (NCBI, 2014) rez7 primersekvens: 5 CCTGTCCCCATGATTCAGTTACC 3 rnb31 primersekvens: 5 GCACCGCCAAAAACAAACAAAAAAACC 3 Figur 5.2: Primersekvenser for henholdsvis forward (rez7) og reverse (rnb31) primerne. Begge skvenser er angivet fra 5 enden til 3 enden (Wagner & Flegel, 2000) Side 26 af 53

28 Figur 5.3: Amplificeringsmetoden PCR-RFLP, som benytter primere lokaliseret i rhesusboks sekvenserne. Lane 1-3 er den RHD-negative, homozygote haplotype, lane 7-9 er den RHD positive, homozygote haplotype, og lane 4-6 er den RHD heterozygote haplotype. (Wagner & Flegel, 2000 revideret) 5.1. Fænotypisk bestemmelse af Blodtypen Det første der blev gjort, var udleveringen af; Eldon Skola Kit SKS , DNasefrit vand og pipette til testpersonerne. Dernæst blev der dryppet en dråbe DNA-frit vand på hver af eldonkortets fire felter. Herefter blev en finger aftørret med en renseserviet og derefter blev blodprøven udtaget. Blodet blev fordelt ved at bevæge eldonsticken rundt i opløsningen. Herefter blev eldonkortene lagt på en jævn overflade, hvor resultatet efter nogle minutter kunne aflæse. Dette blev gentaget blot med visse ændringer, som var en tilsætning af mere blod samt at kortet blev vippet op og ned Oprensning og isolering af genomisk DNA fra mundskrab Gruppen valgte fire personer, og derfor blev der opstillet fire eppendorfrør. Ved udtagelse af mundskrab blev der benyttet en steril vatpind, hvor enden af pinden, bestående af vat indeholdende DNA, blev klippet af og placeret i et eppendorfrør dette blev gjort for hver af prøverne. I prøverne blev der tilsat 20 μl proteinase K og 400 μl ALT lyseringsbuffer, efterfulgt af vortex i 10 sekunder. Derefter blev prøverne inkuberet ved 56 grader celsius, og vortexet i 10 sekunder hvert 10. minut. Efter en times inkubering, blev prøverne centrifugeret ved 900 rpm i 12 sekunder og tilsat 400 L AL lyseringsbuffer. Prøverne blev vortexet igen i 15 sekunder, og temperaturen blev efterfølgende ændret fra 56 til 70 grader celsius, hvor prøverne blev udtaget og vortexet i 10 sekunder hvert 10. minut. Prøverne blev dernæst centrifugeret i 15 sekunder ved 900 rpm og tilsat 200 L 99,9 procent ethanol med efterfølgende vortex i 15 sekunder. 700 L lysat fra hvert eppendorfrør blev overført til en søjle med et filter, hvorefter prøverne blev centrifugeret i et minut og centrifugeret igen, hvis der var behov for dette. Den væske, som blev centrifugeret gennem filtret, blev hældt over i en waste -beholder, så opsamlingsrørene kunne genbruges. Da prøverne var centrifugeret helt igennem, blev der tilsat 500 L AW1 vaskebuffer, og prøverne blev igen centrifugeret. Efter centrifugeringen med AW1 vaskebufferen blev der tilsat 700 L AW2 vaskebuffer, og prøverne blev centrifugeret igen. Opsamlingsrørene blev endnu engang tømt, og der blev nu tilsat 700 L 99,9 procent ethanol. Prøverne blev centrifugeret i tre minutter ved rpm og efterfølgende overført til et nyt eppendorfrør. Filtrerne skulle stå til Side 27 af 53

29 afdampning i 10 minutter ved stuetemperatur, hvorefter der blev tilsat 50 L ATE elueringsbuffer til hver af prøverne. Dernæst skulle prøverne stå ved stuetemperatur i fem minutter og efterfølgende centrifugeres i et minut ved rpm. Herefter blev der udtaget 10 L af lysatet, som blev tilsat 2 L loading dye. De to væsker blev mikset ved at pipetterer op og ned et par gange og var efterfølgende klar til at blive loaded til en 1 % TAE-agarosegel. Ved støbning af gel blev der først rengjort gelkar og kamme med 70 % ethanol. Herefter blev enderne på gelkarret forseglet ved brug af en holder til gelkaret. Gelen blev blandet i en 250 ml bluecap falske, hvori der blev afvejet 1 g agarose, hvortil der blev tilsat 101 ml 1xTAE buffer til agarosen. Låget til bluecap flasken blev skruet løst på og dernæst sat i mikrobølgeovnen. Opløsningen blev opvarmet af flere omgange indtil alt agarosen var opløst. For at opløse agarosen bedre blev indholdet af bluecapflasken swirlet under opvarmningen af gelen, hvis den begyndte at boble. Da agarosen var fuldstændig opløst, blev der tilsat en dråbe Ethidium bromid. For at fordele Ethidium bromid i gelen, blev indholdet af bluecapflasken igen swirlet. Dernæst blev gelen overført til det rengjorte gelkar, hvor kammene blev sat i den ene ende af gelen, hvor den skulle størkne i minutter. Da gelen var størknet blev denne overført til et elektroforesekar, hvorefter der blev tilsat 1xTAE buffer oven på gelen til det dækkede. I gelen blev der tilsat en 1 kb DNA ladder og efterfølgende prøverne i brøndende. Fra hver prøve, indeholdende genomisk DNA, blev der udtaget 10, hvortil 2 DNA loading buffer blev tilsat. Da alle prøver samt markøren var tilsat brøndende blev elektroforesekarret tilsluttet en strømforsyning, som blev indstillet til 90 V og stod i mindst 45 minutter. Efterfølgende blev der taget billede af gelen under UV-belysning. Samme fremgangsmåde, som ovenfor beskrevet, blev udført i forbindelse med gelelektroforesen af PCR-produktet Koncentrationsbestemmelse via NanoDrop NanoDrop-apparatet var tilkoblet en computer og rengjort før brug. NanoDrop-programment indstilles til nuclein acid. Herefter skulle apparatet kalibreres med milliq vand. ATE elueringsbufferen blev anvendt som reference til Blank prøve. Målingerne blev foretaget i form af en 2 L prøve. Prøverne blev målt ved at tilsætte 2 L prøve på NanoDrop-hovedet, og stemplet blev lukket ned over hovedet, hvorefter der blev trykket measure. Efter hver prøve blev apparatet rengjort med en kleenex. Programmet gav en kurve, samt målinger ved forskellige bølgelængder. Resultaterne for A260/A280, A260/A230 og koncentrationen blev noteret. Der blev som minimum udført en trippelbestemmelse af prøverne, hvorudfra der blev lavet en gennemsnitsbestemmelse og standardafvigelse. Der blev udført en Dixons Q-test for alle prøver, hvorved outliers blev fjernet. Udregninger for Dixon Q-test fremgår i appendiks III. Side 28 af 53

30 5.4. PCR Amplificering af specifik rhesus-sekvens Før PCR blev koncentrationerne af oprenset genomisk DNA, som skulle benyttes, udregnet. Prøvernes slutvolumen skulle være 50μL, med en totalvolume som fremgår i tabel 5.4. Der blev fremstillet fem forskellige prøver fire med forskellige koncentrationer af genomisk DNA samt en negativ kontrol. Den negative kontrol blev fremstillet af gruppe B228. Dette blev gjort ved først at tilsætte den beregnede mængde DNase-frit vand til hver af de fire PCR-rør, hvorefter den beregnede mængde genomisk DNA blev tilsat. For at fordele DNAet i vandet, blev der pipetteret op og ned flere gange. Herefter blev der tilsat 7 forward primer, rez 7, og 7 reverse primer, mb31. Disse blev også fordelt i opløsningen ved at pipetterer op og ned flere gange. Herefter blev prøverne sat på is, mens mastermixen blev fremstillet. I alt skulle der fremstilles 104,5 mastermix til begge forsøgsgrupper. Dette betød, at der først blev tilsat 55 10x Long PCR buffer med 15 mm MgCl. Dernæst blev der tilsat 44 dntp mix, som blev blandet med Long PCR bufferen ved igen at pipetterer op og ned. Til sidst blev der tilsat 5,5 Long PCR enzymmix, som blev blandet ved at pipetterer op og ned. Til hver af de fremstillede prøver med genomisk DNA, som havde et volumen på 40,5, blev der tilsat 9,5 mastermix. Herefter blev prøverne sat i PCR-maskinen, hvor reaktionen skulle forløbe i cirka to timer PCR-programmet er listet i tabel 5.5. Materialelisten til forsøget kan findes i Appendiks II Tabel 5.4: Indhold af prøverne. Mængden af genomisk DNA og DNase-frit vand er markeret med x, da dette blev tilpasset hver enkelt prøve. Indhold Mængde Koncentration Forward primer rez7 7 μl 100 pmol/μl Reverse primer mb31 7 μl 100 pmol/μl Genomisk DNA 20 μl 200 ng/μl DNAsefrit vand 6,5 μl 10X long PCR buffer med 15 5 μl mm MgCl dntp mix 4 μl 2mM stykket Long PCR enzym mix 2,5 units per 0,5 μl Side 29 af 53

31 Tabel 5.5: PCR cyklus (forsøgsprotokol). Temperatur Tid Cyklusser 94 3 min sek sek sek (45 sek/kb) sek sek sek (45 sek/kb) + 2xs/cyklus min 1 4 Pause Side 30 af 53

32 6. Resultater 6.1. Fænotypisk bestemmelse af blodtypen Hvert gruppemedlems blodtype blev fænotypisk bestemt ved hjælp af eldonkort, hvoraf der blev foretaget en dobbelt- eller en trippelbestemmelse af blodtyperne jævnfør figur 6.1 og 6.2. Fænotypen blev bestemt i forhold til ABO- og rhesus systemet, sammenholdes resultaterne fra første og anden fænotypisk bestemmelse ses følgende resultater. Flere af resultaterne fra den første fænotypiske bestemmelse fremstår ikke særlig tydelige, hvilket betyder, at fænotyperne i flere tilfælde var svære at aflæse eksempelvis prøve 1.1 og 3.1. Jævnfør figur 6.1 sammenholdes de to fænotypiske bestemmelser, hvor der observeres agglutinering for forsøgsperson 1 i B-antistoffeltet ved første fænotypiske bestemmelse, mens der i anden fænotypiske bestemmelse ses agglutinering i både B-antistoffeltet samt i rhesusantistoffeltet. Forsøgsperson 2 viser ingen agglutinering i nogle af antistoffelterne ved både første og anden fænotypiske bestemmelse. Tredje forsøgsperson fremviser agglutinering i A-antistoffeltet samt i feltet med rhesus antistof ved både første og anden fænotypiske bestemmelse. Den sidste forsøgsperson 4, kan der observeres agglutinering i A-antistoffeltet ved første fænotypiske bestemmelse. Ved anden fænotypiske bestemmelse hos forsøgsperson 5 ses der både agglutinering i A- og B-antistoffeltet. Jævnfør figur 6.2 sammenholdes tre fænotypiske bestemmelser, hvor der hos forsøgsperson 5 observeres en agglutinering i A-antistoffeltet ved første fænotypiske bestemmelse. Det kan ikke afgøres, om der er tale om en rhesus negativ eller positiv forsøgsperson, da der ikke var tilsat tilstrækkeligt blod til rhesusantistoffeltet. Ved anden fænotypiske bestemmelse hos forsøgsperson 5 blev der foretaget en trippelbestemmelse. Alle tre bestemmelser viste agglutinering i alle antistoffelter samt i kontrolfeltet. Forsøgsperson 6 viser ingen agglutinering i nogle af antistoffelterne ved første fænotypiske bestemmelse, men viser til gengæld agglutinering i rhesusantistoffeltet ved anden fænotypiske bestemmelse. Der blev fortaget en dobbeltbestemmelse for anden fænotypiske bestemmelse, da der var agglutinering i kontrolfeltet for den første bestemmelse.. Sidste forsøgsperson 7 viser kun agglutinering i B-antistoffeltet ved første fænotypiske bestemmelse. For forsøgsperson 7 blev der ikke foretaget nogen anden eller tredje fænotypisk bestemmelse. Ved første fænotypiske bestemmelse er der ingen af de syv forsøgspersoner, der fremviser agglutinering i kontrolfeltet. Til gengæld er der flere af forsøgspersonerne, der viser agglutinering i kontrolfeltet ved anden fænotypiske bestemmelse. Side 31 af 53

33 Figur 6.1: Sammenligning af anden og første fænotypiske bestemmelse med eldonkort. Hvert eldonkort er nummereret således, at første tal angiver hvilken fænotypisk bestemmelse der er tale om, mens andet tal refererer til forsøgspersonerne 1-4. Figur 6.2: Sammenligning af anden og første fænotypiske bestemmelse med eldonkort. Hvert eldonkort er nummereret således, at første tal angiver hvilken fænotypisk bestemmelse der er tale om, mens andet tal refererer til forsøgspersonerne 5 og 6. hvor der er foretaget en trippelbestemmelse samt forsøgsperson 7. Side 32 af 53

34 Tabel 6.1: Resultaterne fra henholdsvis første og anden blodtypebestemmelse med Eldonkort. (?) angiver at rhesus blodtypen ikke vides. (x) angiver intet resultat. Tomme celler angiver at der ikke er foretaget en bestemmelse Personer Første Eldonkort Anden Eldonkort Tredje eldonkort 1 B - B + 2 O - O - 3 A + A + 4 A - AB - 5 A? x x 6 O - x O + 7 B - Jævnfør tabel 6.1 kan det konkluderes, at første og anden fænotypiske bestemmelse ikke stemmer overens hos flere af forsøgspersonerne. I hver bestemmelser er der en eller flere forsøgspersoner, hvor resultatet ikke kan aflæses. I første fænotypiske bestemmelse var cirka 71 procent af fors øgspersonerne testet som værende rhesus negativ. Dette tal er faldet til cirka 33 procent i anden fænotypiske bestemmelse. Denne blev foretaget på baggrund af, at mange af forsøgspersonerne blev testet som værende rhesus negative. Da rhesus negative kun udgør cirka 15 procent af den danske befolkning, ville dette betyde, at én person, fra den samlede forsøgsgruppen med syv personer, skulle testes rhesus negativ. Det viste sig, at der var fem ud af syv forsøgspersoner, som var testet rhesus negative. Efterfølgende blev datomærkningen af kittet undersøgt, og her viste det sig, at denne var tæt på udløbsdatoen. Den anden fænotypisk bestemmelse blev derfor foretaget med et kit af nyere dato Genotypisk bestemmelse af rhesus blodtypen Efter en fænotypisk bestemmelse af blodtypen ønskedes det at bestemme blodtypen genotypisk i forhold til rhesusblodtypen. Derfor blev det intakte genomiske DNA oprenset, hvorefter specifikke genkendelsessekvenser i rhesusboksene for rhesusgenet skulle amplificeres ved hjælp af PCR. På baggrund af en PCR-RFLP af amplikonnet fra PCR reaktionen, skulle der afgøres, om der var tale om rhesus negative eller rhesus positive haplotyper. Jævnfør figur 6.2 indeholder P1 mest DNA, mens P3 indeholder mindst DNA. P2 og P4 befinder sig mellem prøverne med mest og mindst DNA. Det ses endvidere, at P1 og P4 indeholder et tydeligt bånd af intakt genomisk DNA, mens P2 og P3 kun frembringer et svagt bånd. Desuden ses der også, at der i gelen både er en del DNA, som forbliver i brøndene, samt tilstedeværelsen af smear i alle prøverne. Side 33 af 53

35 Figur 6.2 Gelen fra oprensningen af genomisk DNA. M er en 1 kba markør, P angiver prøverne og B angiver brøndene. Prøverne og brøndene er desuden nummereret fra 1-4, som svarer til det antal forsøgspersoner, der deltog. På gelen er der desuden markeret bånd med intakt DNA. Udover en gelelektroforese blev der foretaget en koncentrationsbestemmelse af det oprensede genomiske materiale, og de gennemsnitlige resultater heraf ses i tabel 6.2. Sammenholdes koncentrationsmålingerne for de enkelte prøver, stemmer disse fint overens med gelen fra figur 6.2. Fra gelen blev den højeste intensitet af båndene observeret i P1, hvilket også fremgår af tabel 6.2, hvor P1 har den højeste, gennemsnitlige koncentration. Fra tabellen ses den laveste koncentration ved P3, hvilket der også blev observeret fra gelen i figur 6.2. P3 er speciel i og med, at der blev fortaget to ekstra målinger, fordi der var et stort udsving i de tre første koncentrationsmålinger Ud af disse koncentrationsmålinger, var der én, der lå markant væk fra de andre, hvilket resulterede i den højeste, gennemsnitlige koncentration, hvilket ikke fremgik af gelen. Koncentrationerne fra tabel 6.2 angiver desuden, at P2 indeholder mere DNA end P4, hvilket ikke er det, der fremgår af gelen. Side 34 af 53

36 Tabel 6.2: Gennemsnitlige resultater af koncentrationen og renheden af henholdsvis nukleinsyrer (A260/A230) og DNA (A260/A280). Desuden er standardafvigelserne for samtlige gennemsnitlige resultater opgivet. (*) angiver, for DNA (A260/A280), prøver uden for renhedsintervallerne (1,7-2,0), mens (*), for nukleinsyrer (A260/A230) angiver, prøven inden for renhedsintervallet (2,0-2,2). Fra tabel 6.2 fremgår desuden renhedsbestemmelser af DNA, som er angivet med forholdet mellem mængden af DNA og protein, (ratio A260/A280) og forholdet mellem DNA og rene nukleinsyrer (ration A260/A230). Fra ratioen (A260/A280) fra tabel 6.2 kan det observeres, at flere af prøverne ligger uden for DNA-renhedsintervallet, som er mellem 1,7-2,0. Det er kun gennemsnittet af P1 og P2, der ligger indenfor renhedsintervallet. Renhedsintervallet for nukleinsyre (A260/A280) er en smule højere end for selve DNAet mellem 2,0-2,2. Det er kun P1, som befinder sig inden for dette interval. I henhold til figur 6.3 ses der på gelen ingen specifikke rhesus-sekvenser efter PCR-reaktion. Af gelen fremgår der dog et svagt smear i bunden af gelen for hver af prøverne, hvilket indikerer, at der er DNA tilstede. De gennemsnitlige koncentrationsmålinger fra NanoDrop kan ses i tabel 6.3. Jævnfør tabel 6.3 ligger gennemsnittet for alle prøverne indenfor renhedsintervallerne både for DNA (A260/A280) og nukleinsyrer (A260/A230). Grundet tilstedeværelsen af en luftboble blev der desuden foretaget en ekstra måling af P4. Sammenholdes koncentrationsmålingerne fra tabel 6.2 med koncentrationsmålingerne fra tabel 6.3, kan der observeres, at der er sket en amplificering af DNA i og med, at samtlige koncentrationer er steget. Sammenholdes koncentrationsmålingerne fra tabel 6.2 med gelen fra figur 6.3, stemmer disse ikke længere overens med forventningerne, da gelen ikke viser nogen bånd. Derudover kan det observeres, at markøren på de to geler ser forskellige ud, og disse burde ligne hinanden i og med, at der er tale om tilsætning af præcis samme markør. Side 35 af 53

37 Tabel 6.3: fremviser gennemsnitlige resultater af koncentrationen og renheden af henholdsvis nukleinsyrer (A260/A230) og DNA (A260/A280). Desuden er standardafvigelserne for samtlige gennemsnitlige resultater opgivet. Figur 6.3: Gelen fra PCR-reaktionen af oprenset DNA. M er en 1 kb markør, P angiver prøverne og B angiver tomme brønde. Prøverne og brøndene er desuden nummereret fra 1-4, som svarer til det antal forsøgspersoner, der deltog. Side 36 af 53

38 7. Diskussion Formålet med forsøget var at foretage en fænotypisk bestemmelse af både ABO- og rhesus blodtypen, samt at foretage en genotypisk bestemmelse af rhesus blodtypen. Den genotypiske rhesus blodtype blev bestemt ved at oprense genomisk DNA, hvorfra specifikke sekvenser af rhesusboksene skulle amplificeres. Dernæst var det meningen, at genotypen for rhesus blodtypen skulle identificeres ved restriktionsanalyse i det område af rhesusboksene, som var identificerende for den genetiske variation af blodtypen. Restriktionsanalysen kunne ikke fortages, da gelen efter PCR ikke viste noget resultat, hvorved forsøgets formål ikke kunne opnås. Samtlige af gruppens medlemmer blev testet fænotypisk via eldonkort. Resultatet viste at fem ud af syv gruppemedlemmer fra første fænotypiske bestemmelse var rhesus negative, hvilket svarer til 71 procent. En af forsøgspersonerne havde ikke fået tilstrækkeligt med blod på kortet til, at dette med sikkerhed kunne aflæses. Resultatet virkede usandsynligt, da rhesuspositiv er den oftest forkomne blodtype og ses ved cirka 85 procent af den danske befolkning. På baggrund af disse resultater blev forsøgskittet undersøgt, og her viste det sig, at dette var tæt på udløbsdatoen. Derfor blev der foretaget en anden fænotypisk bestemmelse med et eldonkit af nyere dato. Den fænotypiske bestemmelse viste denne gang, at to ud af seks var rhesus negative, som svarer til cirka 33 procent, hvilket virker mere troværdigt. At resultaterne fra de to fænotypiske bestemmelser var så forskellige kunne tyde på, at det første eldonkit rent faktisk var for gammelt eller, at selve udførelsen af den første fænotypiske bestemmelse ikke var korrekt. Til forskel fra første fænotypiske bestemmelse blev der tilsat mere blod til hver af prøverne ved den anden fænotypiske bestemmelse, hvilket i højere grad synliggjorde flere af resultaterne. Desuden blev forsøgsvejledningen også grundigere læst igennem, og her stod blandt andet, at blodprøven på eldonkortet skulle fordeles ved at vippe kortet, så flest mulige antistoffer kom i forbindelse med blodprøven. Der var dog flere af forsøgspersonerne ved anden fænotypiske bestemmelse, som måtte udføre testen flere gange, da der opstod agglutinering i kontrolfelterne. Hos en af forsøgspersonerne var det stadig ikke muligt at bestemme blodtypen efter tredje forsøg. Dette kan også sætte spørgsmålstegn ved validiteten af dette eldonkit. For med sikkerhed at afgøre eldonkortenes validitet burde der have været foretaget mange flere bestemmelser af blodtypen. Resultaterne fra oprensningen af genomisk DNA viste, at der var intakt genomisk DNA tilstede i alle prøverne. Derudover viste gelen, at der også var varierende intensitet af båndende og dermed forskellige DNA-koncentrationer. Renhedsbestemmelserne af prøverne var meget varierende. Dette resulterede i, at kun to af prøvernes gennemsnitlige renhed lå inden for det angivne renhedsinterval, hvilket tyder på, at der enten er noget galt med proceduren eller udførelsen af forsøget. Side 37 af 53

39 Hvis der havde været tid til at gentage forsøget, vil der blive ændret på eksempelvis disse parametre; procedure ved mundskrab, volumen af udtaget lysat, brug af vaskbuffer og tilsætning af elueringsbuffer. Prøverne, hvorfra der skulle oprenses DNA, kom fra et mundskrab. Til mundskrabet blev der anvendt en steril vatpind. Udførelsen af mundskrabet var fra protokollen upræcis, hvilket betød, at mundskrabene blev udført forskelligt fra gruppemedlem til gruppemedlem. Nogen brugte lang tid på at udtage prøven, mens andre blot lavede et kort og overfladisk skrab. Dette betyder at mængden af indsamlet DNA sandsynligvis har varieret, således at nogle gruppemedlemmer har indsamlet mere DNA end andre hvilket også fremgik af resultaterne. Forskellen i mængden af indsamlet DNA kunnet forbedres, hvis protokollen havde en mere detaljeret beskrivelse af udførelsen af mundskrabet. Udførelsen af forsøget kunne også forbedres, hvis den samme person udtog alle prøverne fra de resterende forsøgspersoner eller ved, at forsøgsdeltagerne var enige om, hvor lang tid mundskrabet skulle vare. På denne måde kunne sikres mere konsistente resultater. En forbedring af indsamlingen af DNA, vil kunne medfører en højere koncentration af DNA, hvilket vil være fordelagtigt når dette senere skulle amplificeres, da dette resulterer i flere templatestrenge. Udover udførelsen af mundskrabet kunne forsøget forbedres i forbindelse med udtagelse af lysat. Ved dette trin blev protokollen ikke fulgt. Der blev kun udtaget 700 µl lysat, som efterfølgende blev overført til en elueringssøjle, hvor DNAet opsamles, vaskes og til sidst elueres. Den samlede volumen af lysat var 1020 µl, hvilket betød at der stadig var 320 µl lysat tilbage i eppendorfrøret for hver af prøverne. Protokollen foreskrev, at alt lysat skulle overføres og ikke kun 700 µl. Hvis forsøget skulle udføres igen, vil udførelsen blive ændret således, at alt lysatet denne gang vil blive udtaget. Ud fra renhedsbestemmelserne af både DNA og nukleinsyrer fremgik det, at en del af resultaterne ikke lå inden for renhedsintervallet. Dette betød, at DNAet fra prøverne ikke var blevet renset tilstrækkeligt. Til rensningen af prøverne blev producentens protokol til dels ændret. I stedet for at skifte til nye opsamlingsrør efter hver vaskebuffer, som producenten foreskrev, blev disse tømt, og elueringssøjlen blev sat ned i det samme opsamlingsrør. Dette kan muligvis betyde, at opsamlingsvæsken er kommet i kontakt med elueringssøjlen, hvilket protokollen stærkt fraråder. Hvis elueringssøjlen kommer i kontakt med opsamlingsvæsken, vil uønskede komponenter overføres til elueringssøjlen, og når elueringen af DNA finder sted, vil de uønskede komponenter komme med ned i eluatet hvilket resulterer i urenheder. Ved en gentagelse af forsøget, kunne der både vælges at følge protokollen samtidig med, at der måske kunne udføres flere vasketrin eksempelvis to gange med AW1 buffer og to gange med AW2 buffer. Selve elueringstrinnet blev udført som protokollen foreskrev. Der kunne benyttes et elueringsvolumen mellem µl i dette forsøg blev der benyttet 50 µl elueringsbuffer. Side 38 af 53

40 Hvis forsøget skulle udføres igen kunne der udtages eksempelvis 30 µl af eluatet og tilsættes til søjlen igen således, at der blev foretaget en ekstra eluering, og herved ekstrahere mere DNA. Der kunne også tilsættes ekstra elueringsbuffer, hvilket også kunne medføre en yderligere ekstraktion af DNA. Amplifikationen af den rhesus-specifikke sekvens via PCR viste ingen brugbare resultater, da der ingen bånd var. Ud fra gelen forventedes det at se bånd med en baselængde på ca bp i alle prøverne, men på gelen fremgik der ingen bånd. Hermed kan det bekræftes, at der er sket en fejl i PCR, hvilket understøttes af resultaterne fra både NanoDrop og gelelektroforese, hvor der var DNA tilstede før PCR men ingen DNA tilstede efter PCR. Ud fra NanoDropmålingerne så det umiddelbart ud som om, at der fra PCR-reaktionen var blevet amplificeret en væsentlig mængde DNA. Dette blev vurderet ud fra, at DNA-koncentrationen var steget samtidig med, at renhedsintervallet for gennemsnittet af samtlige prøver var overholdt. Men da der blev tilsat 14 µm primer, hvor der i stedet skulle have været tilsat 0,3-1 µm, betød det en fortyndningsfejl. Ud fra dette må det konkluderes at det DNA, der blev observeret fra gelen som et svagt smear, der var primerne, som overskyggede det amplificerede DNA. Hvis forsøget skulle gentages, er dette en parameter, som skal ændres. Såfremt resultaterne ikke forbedres af denne ændring, kunne selve forsøgets design ændres i forhold til følgende parameter: magnesiumchloridopløsningen, dntp mix og Long PCR Enzyme mix (Taq polymerase). Ændringer i koncentrationen af magnesiumchloridopløsningen i forsøget, ville yderligere stabilisere DNA-polymerasen, da magnesiumchlorid er en kofaktor for denne, og hermed være med til at opbygge mere DNA. En anden ændring, som kunne fortages er i forhold til dntpmix. Hvis der ikke har været tilstrækkelig mængde af baser i prøven, har Taq polymerasen ikke haft nok at opbygge DNA-strengene af, hvorved båndene på gelen ville blive meget svage. Hvis der blev tilføjet yderligere Taq polymerase, ville dette betyde, at der kunne replikeres mere DNA. Vejlederen tilknyttet dette forsøg havde allerede forsøgt at ændre templatekoncentrationen, primerkoncentrationen og magnesiumchloridkoncentrationen - men uden ændring af resultatet. (Sønderkær, 2014) Til forskel fra artiklen af Wagner & Flegel (2000) blev der ikke foretaget en specifik detektering af rhesusboksene, men kun et udsnit af disse. Hvis rhesusboksene specifikt skulle have været undersøgt, ville der forventes en sekvens med en længde på omkring bp. Dette skyldes, at downstream rhesusboksen har en basesekvens på bp, mens upstream rhesusboksen har en basesekvens på bp. Desuden vil der kun ses rhesusbokse af haplotyper, som ikke indeholdte RHD genet. Dette skyldes at rhesusgenet indeholder bp, og derfor er for stort til at vandre i gelen, hvorved det forbliver i brøndene. Side 39 af 53

41 Genotypen af prøverne kunne også have været bestemt endnu mere direkte ved at foretage en sekventering af rhesusboksene. I den sekventering, som der blev benyttet i artiklen, blev der brugt interne primere med overlappende fragmenter. Dette betød, at der i alt blev brugt seks forskellige primerpar. Der kunne således benyttes flere primerpar for at forbedre det af gruppen udførte forsøg. Side 40 af 53

42 8. Konklusion Ud fra første forsøg med Eldonkort fremgik det, at 71 procent af gruppens medlemmer var rhesus negative. I gentagelsen af forsøget faldt dette tal til 33 procent. Resultatet fra andet forsøg er mest validt, da sandsynligheden for, at alle gruppemedlemmer er rhesusnegativ er 1, procent. Den store del af rhesus negative i gruppen ved første forsøg kan forklares med, at det benyttede kit var tæt på udløbsdatoen. Ud fra billedet af gelen kan det konkluderes, at der var intakt genomisk DNA tilstede efter oprensningen men med forskellige intensiteter i båndene. Koncentrationsbestemmelse af prøverne var meget varierende, da kun to af prøvernes gennemsnitlige renhed lå inden for renhedsintervallet. Dette kan skyldes fejl i metode og udførelse. Ved amplifikation af DNA, gennem PCR, var der efterfølgende ingen bånd på gelen men kun svage smear, hvilket indikerer, at der ikke var noget DNA tilstede. Derimod viste koncentrationsbestemmelsen, at der var DNA til stede i samtlige prøver inden for renhedsintervallet. Ud fra gelen kunne det dog konstateres, at der var tale om primere og ikke DNAprøverne. Der var en betydelig fortyndingsfejl i primerkoncentrationen, hvilket betød at primerne overskyggede amplikonnet af DNAet fra prøverne. Udfra forsøget var det således ikke muligt at kortlægge genotypen for rhesusgenet via restriktionsanalyse, da der efter PCR ikke var noget brugbart genomisk DNA til stede. Side 41 af 53

43 9. Opretholdelse af et stabilt bloddonorkorps Bloddonation har en væsentlig sundhedsmæssig rolle i samfundet, da det tappede blod benyttes til diverse kirurgiske indgreb og til forebyggelse af bestemte sygdomme. En stor andel af blodforsyningen anvendes i forbindelse med levertransplantation, store brandsårsskader og knoglemarvstransplantation. Alle tre situationer kræver en stor blodtilførsel, og på Rigshospitalet, hvor der stilles cirka blodportioner til rådighed årligt, anvendes der omkring af disse til de tre angivne situationer (Bloddonorerne i Danmark, 2004). Selve tapningen foretages i den lokale blodbank, som indgår i et nationalt samarbejde med landsorganisationen Bloddonorerne i Danmark. Denne udgøres af medlemmer, men har årligt et frafald på (Bloddonorerne i Danmark, 2011). På grund af dette frafald, skal der hele tiden rekrutteres nye donorer, for at opretholde et stabilt niveau af tilgængeligt blod indenfor sygehusvæsnet. Derfor er opretholdelsen af et stabilt bloddonorkorps et centralt emneområde at behandle, og dette vil være omdrejningspunktet for denne kontekstuelle analyse. I Danmark er bloddonorer frivillige personer, som har tilmeldt sig donorsagen uden forventning om belønning. Blodmængden, som tappes per gang, er procent. Mænd kan maksimalt tappes hver tredje måned, mens kvinder maksimalt kan tappes hver fjerde til sjette måned. I nogle tilfælde vil bloddonoren kun blive tappet en til to gange om året afhængigt af blodtype og donors sundhed. Der stilles forskellige krav til bloddonorer som befolkningsgruppe, som for eksempel at de skal have en alder mellem år, en vægt på mindst 50 kg og et stabilt hæmoglobinniveau på over 7,8 mmol/l for kvinder og 8,4 mmol/l for mænd. I tillæg til disse kriterier skal man som bloddonor overholde karantæneregler, som er forskellige sundheds- og adfærdsmæssige krav. Ved overtrædelse af karantæneregler udelukkes donoren fra at donere blod. Karantænereglerne omfatter for eksempel mindre lidelser som allergi eller almen sygdom samt mere alvorlige lidelser som eksempelvis diabetes, cancer og HIV. De mindre alvorlige lidelser resulterer i en karantæneperiode, indtil donoren er medicinfri, mens de alvorlige lidelser resulterer i en permanent udelukkelse fra donorkorpset. Karantænereglerne er udarbejdet for at beskytte både bloddonoren og recipienten mod sygdomssmitte og risikobetonet adfærd. (Bloddonorerne i Danmark, 2011) Bloddonorer udgør omkring fire procent af den samlede danske befolkning, hvilket er akkurat tilstrækkeligt til at opretholde den fornødne blodforsyning. Derfor kan et for stort frafald af donorer hurtigt bliver kritisk. Det årlige frafald af bloddonorer skyldes, at disse ikke længere overholder de angivne krav. (Mast, 2013). Det er derfor vigtigt, at blodbankerne løbende hverver nye donorer. (Bloddonorerne i Danmark, 2011) Det er endvidere vigtigt at have en tilstrækkelig bloddonorpopulation, da hyppige blodtapninger kan medføre jernmangel og nedsat hæmoglobinniveau, hvilket er risikofaktorer, som blodbankerne ikke vil udsætte de frivillige for. Ved at forøge antallet af bloddonorer formindskes disse risici, samtidig med at blodforsyningen i Danmark gavnes ved at der opnås en større tilgængelig mængde af blod. Side 42 af 53

44 Da det er så kritisk for det danske sygehusvæsen at have en stabil tilgængelig blodforsyning, er det relevant at undersøge hvilke udfordringer, som er forbundet med opretholdelsen af et stabilt bloddonorkorps Den bagvedliggende motivation for donorsagen Motivation er en vigtig del af at være bloddonor. Hvis motivationen ikke er til stede hos de enkelte individer, vil de ikke melde sig til donorsagen, og som eksisterende medlem kan man miste interessen for donorsagen og melde sig ud. Derfor er det vigtigt at forstå, hvilke motiver som ligger til grund for at være donor. Bloddonorer i Danmark har undersøgt den danske befolknings motiver for donorsagen(bloddonorerne i Danmark, 2011). På baggrund af denne undersøgelse er organisationen kommet frem til, at folk ofte træffer deres valg på en emotionel baggrund. Undersøgelsen viser desuden, at motivationen for at blive bloddonor kan inddeles i uselviske og selviske årsager. Uselviske motiver: Man ønsker at redde liv og ser dette som en god ting Man ønsker generelt at hjælpe sine medmennesker (Altruisme)" (Bloddonorerne i Danmark, 2011) Selviske motiver: (Bloddonorerne i Danmark, 2011) Social status i form af, at man ønsker, at andre mennesker synes, at man er god Man vil sikre, at der er blod nok, hvis ens nærmeste eller en selv får brug for blod Man får det både fysisk og psykisk bedre, når man har afgivet blod Man vil gerne give den mængde blod tilbage, som man selv eller ens nærmeste har modtaget. På baggrund af undersøgelsen har Bloddonor i Danmark ligeledes fundet frem til en del brugte begrundelser for ikke at blive bloddonor. Disse begrundelser er ofte associeret med negative følelser i forhold til det at være bloddonor eller de omgivelser, som bloddonorerne befinder sig i. De hyppigste benyttede begrundelser er følgende: Motiver for ikke at bliver donor: (Bloddonorerne i Danmark, 2011) Direkte modvilje mod at komme på et sygehus Den individuelle indsats er for lille sammenholdt med problemets størrelser. Det giver ikke nogen mærkbar ændring, om man er donor eller ej Angst for kontakt med sygehusvæsenet Angst for nåle og kanyler, som forbindes med smerte Utryg i forbindelse med tapning og derved frygt for at miste selvkontrollen - panik. Side 43 af 53

45 Fra en tysk undersøgelse, omhandlende facetter af altruisme, har Otto og Bolle (2011) fundet frem til, at altruisme ikke er et homogent motiv. Det kan derimod, som det også er gjort i det ovenstående, beskrives både som selviske og uselviske motiver. De adskiller motivation for bloddonation som enten personlig hjælp, som svarer til selvisk motivation eller generel hjælp, som svarer til uselvisk alturisme. Til sidst i undersøgelsen udførtes en altruismepersonlighedstest, som er test, der undersøger i hvor grad, at man ønsker at hjælpe sine medmennesker. I undersøgelsen deltog 345 personer heraf mente 121, at det hyppigste motiv for bloddonation er donering, fordi man en dag selv har brug for det. Ud af disse 121 personer, var 45,4 procent bloddonorer forud for undersøgelsen. (Otto og Bolle, 2011) Det er bemærkelsesværdigt, at motiver som næstekærlighed og ansvar ikke dominerer denne undersøgelse, da dette er nogle af de motiver, som Bloddonorer i Danmark fremhæver i deres undersøgelse Sundhedsmæssige gevinster og problematikker ved bloddonation Et alternativt syn på motivationen kan ligge i påstanden om, at bloddonorer er sundere end den almene befolkning (Femke et al., 2012). Denne sammenhæng ses i forhold til fysiologiske ændringer og påvirkninger i kroppen, der opstår efter blodtapning. Konsekvenser af blodtapning kan både være gavnlige og skadelige, men da de skadelige konsekvenser kan forbygges, kan der argumenteres for, at bloddonorer generelt har en sundhedsmæssig fordel. Dette kan relateres til det selviske motiv, som forskriver fysisk og psykisk velvære. En af de gavnlige konsekvenser, mener forskere, er at blodtapning har en sammenhæng med nedsættelse af serum ferritin, som er et jernlagerende molekyle. Nedsættelsen af dette forebygger et stressstadie kaldet for oxidativ stress, som er en ubalance mellem oxidanter og antioxidanter (Finaud et al., 2006). Forebyggelse af oxidativ stress har en gavnlig fysiologisk effekt på kroppen, da dette kan formindske tilfælde af kardiovaskulære sygdomme såsom arteriosklerose og myokardieinfarkt. Disse sygdomme er blandt de hyppigste dødsårsager i det moderne samfund. (Jaarsveld & Pool 2001) Et andet eksempel på en gavnlig konsekvens er, at bloddonorer jævnligt testes for diverse sygdomme, og derved kan sygdomme detekteres i et tidligt stadie, hvorved patientens prognoser forbedres. Sådanne positive konsekvenser bør tiltrække potentielle donorer, og derfor kunne blodbankerne og landsorganisationen udnytte det, når de hverve nye medlemmer. For at tiltrække flere donorer, kan der ligges fokus på at nedsætte de skadelige konsekvenser i forbindelse med bloddonation som eksempelvis jernmangel. Jernmangel er defineret som en tilstand, hvor der opstår mangel på mobiliserbare jernlagre, formindskelse i mætningen af transferrin og en stigning i transferrin-receptorer i cirkulationen. En mere kritisk tilstand af jernmangel er associeret med anæmi. Anæmi er en betegnelse for blodmangel, det vil sige, at hæmoglobinkoncentrationen i blodet er nedsat (Geneser,2010). Jernmangel i forbindelse med bloddonation, har en betydning for donorens velvære, da der kan opstå træthed, svimmelhed, Side 44 af 53

46 nedsat fysisk ydeevne, hjertebanken, åndedrætsbesvær, hovedpine, øresusen samt spiseforstyrrelsen Pica. (Hasselbalch, 2014) Andre, mere alvorlige konsekvenser af jernmangel, findes indenfor områderne: Nedsat kognitiv udvikling, nedsat resistens mod infektioner, nedsat vækst og øget tungmetalabsorption. Anæmi kan både forekomme som en konsekvens af jernmangel, eller opstå af andre årsager - hvis individet for eksempel mangler vitaminer eller rammes af en infektion. (Hasselbalch, 2011) I forbindelse med anæmi nedsættes hæmoglobinniveauet. Hæmoglobin er ansvarligt for transport af ilt rundt i blodet, og et nedsat hæmoglobinniveau kan medføre symptomer, der minder om dem, der ses ved jernmangel såsom træthed, svimmelhed, nedsat fysisk ydeevne med flere. Herunder beskrives hvordan nogle af de mere alvorlige konsekvenser vil påvirke det psykisk og fysisk velvære hos donorerne. Ud fra dyreforsøg har World Health Organization (WHO et al. 2001) konstateret, at jern spiller en nøglerolle for hjernens funktion og den kognitive udvikling. Dette skyldes, at hjernen blandt andet benytter jern i forbindelse med myeliniseringsprocessen, hvor myelinhinder er de enheder af nervecellerne, som sikrer en hurtig transport af nervesignaler (Martini et al., 2012). WHO et al. (2001) har endvidere fundet tydelige beviser for, at de resultater, som man ser i dyremodellerne, også gælder for mennesket. Et af de forsøg, som der er foretaget på mennesker er i forbindelse med teenagepiger, hvor WHO et al. (2001) på baggrund af denne undersøgelse har konkluderet, at jerntilskud medfører mindre grad af træthed og udmattelse, højere koncentration i skolen samt bedre humør. Herudover har WHO et al. (2001) også dokumenteret, at neurologisk dysfunktion hos både unge børn, teenager og voksne også er associeret med jernmangel, hvilket betyder, at den undersøgelse, som er baseret på teenagepiger, sandsynligvis også vil være gældende for voksne individer. Dette er essentielt i forhold til, at de individer, der kan blive bloddonorer har en alder mellem år. WHO et al. (2001) har via undersøgelser konkluderet, at der i populationer med jernmangel er en højere dødelighed på grund af infektioner, i forhold til populationer, hvor der ikke er udbredt jernmangel i befolkningen. Dette skyldes den indvirkning, som jern har på immunsystemet. I situationer med jernmangel har leukocytterne generelt en reduceret kapacitet til at dræbe fremmede mikroorganismer. Derudover har lymfocytterne en nedsat evne til at replikere sig, når disse stimuleres af mitogener, og derved nedsættes koncentration af de celler, som er ansvarlige for immunitet. En anden problematik i forbindelse med jernmangel er lidelsen Pica. Pica er en tilstand, hvor individer tvangsspiser substanser, som normalt ikke forbindes med almindelige fødevarer. Disse substanser er normalt isterninger, jord, ler, kalk og rengøringsmidler. WHO et al. (2001) har fundet frem til, at cirka procent af bloddonorer med jernmangel lider af Pica, hvilket er Side 45 af 53

47 meget højere, end hvad der er observeret i den generelle population. Pica kan dog forholdsvist nemt helbredes ved hjælp af oralt indtag af jerntilskud. Flere af ovenstående konsekvenser af jernmangel udsættes bloddonorer i højere grad for end den generelle befolkning. En reduktion af konsekvenserne kan være med til at højne bloddonorens velvære, hvilket kan øge attraktiviteten og motivationen for donorsagen. Formår blodbankerne ikke at forbedre de negative konsekvenser som jernmangel, vil de eksisterende og nye donorer muligvis frafalde på baggrund af det psykiske og fysiske ubehag. De mindre alvorlige konsekvenser kan forholdsvist nemt forbygges via jerntilskud. Ved oral indtagelse af 20 mg jerntabletter i 60 dage vil det tabte jern efter en donationen kunne erstattes. Blodbanken kan derfor forbygge eventuelt ubehag hos donorer, ved at udlevere jerntabletter til donorer, som oplever disse negative konsekvenser. En anden mulighed er en forlængelse af perioden mellem donationerne, hvorved donoren selv kan genetablere sine jernlagre. Mange flergangsdonorer har først gendannet deres jernlagre og hæmoglobinniveau seks måneder eller længere efter bloddonationen, og i sådanne tilfælde ville et oralt jerntilskud være en ideel behandlingsform (Mast, 2013). Udover jernmangel er nedsat hæmoglobinniveau også en væsentlig konsekvens der kan medvirke til at skabe frafald i bloddonorpopulationen. Et lavt hæmoglobinniveau kan forårsages af en bloddonation, og kan i dette tilfælde forhindres via jerntilskud og/eller vitaminer som vitamintilskud i form af B12 og folinsyre (Hasselbalch, 2011). Lavt hæmoglobinniveau kan også have naturlige årsager, som ikke skyldes bloddonation. Dette kan have en betydning for donorens fremtid indenfor korpset. Fra en undersøgelse indeholdende data fra bloddonorer, har Allan E. Mast (2013) konkluderet at bloddonorer, der får udsat deres blodtapning på grund af lave hæmoglobinniveauer, i mindre grad vender tilbage for at donere blod. Det er især førstegangs-donorer, med udsat tapning, som ikke vender tilbage. Nedenstående figur 7.1 viser, hvor mange førstegangs- og flergangsbloddonorer, som vender tilbage for at donere blod inden for en treårig periode siden sidste eller første tapning. Første søjle angiver, at det kun er cirka 21 procent af førstegangsdonorerne med lavt hæmoglobinniveau, som vender tilbage for at donere blod. Anden søjle angiver, at cirka 70 procent af førstegangsdonorerne med normalt hæmoglobinniveau vender tilbage for at donere blod. Tredje søjle angiver, at cirka 64 procent af flergangsdonorerne med lavt hæmoglobinniveau vender tilbage for at donere blod. Sidste søjle angiver, at cirka 91 procent af flergangsdonorerne med normalt hæmoglobinniveau vender tilbage for at donere blod. Altså fremgår det, at donorer, som afvises på grund af lavt hæmoglobinniveau, i højere grad forlader donorkorpset. Side 46 af 53

48 Figur 7.1: Figuren viser antallet af tilbagevendende første- og flergangs bloddonorer med henholdsvist lavt hæmoglobinniveau (LH) og normalt hæmoglobinniveau (NH) (Mast, 2013 revideret) Det har endvidere vist sig, at jo længere pausen mellem donationer er, jo større er sandsynligheden for udsættelse af næste donation på grund af lavt hæmoglobinniveau. Udsættelse af tapning, som følger af lavt hæmoglobinniveau, er meget almindeligt, og på grund af dette forekommer der et stort tab af ellers frivillige donorer. (Mast, 2013) Hæmoglobinniveauet er meget forskelligt alt afhængigt af køn, etniske baggrund og alder. I forhold til kønsforskelle konstaterer han, at kvinder har 11 gange større risiko for at få udsat bloddonation på grund af lavt hæmoglobinniveau end mænd har. Endvidere ses det også, at risikoen for udsættelse hos mænd stiger med alderen - cirka 1,5 gange hver tiende år. Hos kvinder stiger den aldersbetingede udsættelse mindre, fordi risikoen for udsættelse er større blandt unge kvinder på grund af menstruation og blodtab i forbindelse med graviditet. Når kvinder kommer i menopausen, bliver den aldersbetingede risiko for udsættelse betragtet på samme måde som hos mænd. Risikoen for udsættelse hos kvinder falder med cirka 25 procent efter menopausen. Ved at behandle det lave hæmoglobinniveau medicinsk, ville man kunne undgå at miste eksisterende og potentielle donorer på baggrund af dette Opsamling på den kontekstuelle analyse Det er vigtigt at opretholde et stabilt bloddonorkorps, da blod er essentielt i mange sammenhænge indenfor sygehusvæsenet, og en utilstrækkelig mængde af blod, vil få mange negative konsekvenser for patienterne. Det er derfor centralt for blodbankerne at opretholde antallet af donorer og hverve nye donorer, da der er et årligt frafald på I og med at bloddonation i Danmark er frivillig, er det det enkelte individs motivation, som er afgørende for, om det vil være bloddonor. Da motivation er det egentlige grundlag for et individs Side 47 af 53