1 INDHOLD. Aalborg universitet Bioteknologi 2.semester

Transkript

1 1 INDHOLD 2 Indledning Teori Blodets sammensætning og funktion i kroppen Immunglobulin-antigen interaktion Forskellen mellem agglutination og hæmolyse Fra genotype til fænotype Blodtypesystemerne AB0 og Rhesus Genetisk variation af Rhesus proteinet Problemstilling Forsøgsteori Fænotypisk bestemmelse af RhD-blodtypen ved eldonkort Isolering af human DNA Koncentrationsbestemmelse af DNA ved brug af spektrofotometri Polymerase Chain Reaction - PCR Adskillelse af DNA-fragmenter ved gelelektroforese PCR-RFLP Forsøgsdesign Materialer og metoder Resultater Fænotypisk bestemmelse af blodtyperne AB0 og Rhesus Detektion af prøvernes DNA koncentrationer efter DNA-oprensning Koncentrationsbestemmelse af DNA i prøve Detektion af Rhesus bokse efter PCR Diskussion Konklusion Kontekst analyse Litteraturliste Figuroversigt Tabeloversigt Bilagsoversigt Side 1 af 96

2 Side 2 af 96

3 2 INDLEDNING I dag er det muligt at kortlægge det humane genom, hvilket gør os i stand til at identificere specifikke gener fænotypisk og genotypisk. Nogle gener kan forårsage komplikationer hos individet. Et af de områder, som har lidt under komplikationerne, er gravide Rhesus(RhD)- negative kvinder med RhD-positive fostre. Komplikationer, som hæmolyse (hæmo: blod, lyse: opløsning), kan opstå, hvis kvindens og fosterets blodtype ikke er kompatibel. Under første fødsel blandes kvindens og fosterets blod, hvor kvinden kan danne antistoffer mod fosterets RhD-antigener. Ved anden graviditet opstår komplikationen, da kvindens dannede antistoffer fra første fødsel, genkender fosterets RhD-antigener. Her vil kvindens krop være i stand til at bekæmpe RhD-antigenet med fatale følger for fosteret under graviditeten (Martini, Nath et al. 2012). Denne immunisering kan aktiveres allerede ved cirka 100 µl blødning fra fosteret (Varming 2014). RhD-genet danner baggrund for et blodtypesystem, som anvendes, sammen med AB0- systemet, til at bestemme et individs blodtype. Begge blodtypesystemer indeholder specifikke antigener, der sidder på overfladen af de røde blodlegemer i blodet. Det er derfor vigtigt, at blodbanker holder styr på identifikationen af blodposerne efter tapning af de cirka donorer i Nordjylland, som blandt andet Aalborg blodbank er med til at tappe årligt (Varming 2014). Selvom blodforbruget er faldet med 20 %, og vil fortsætte med at falde med årene, beholder man de mange donorer for at opretholde et overskud af blod til blandt andet de RhDnegative individer, fordi disse er i undertal (Varming 2014). RhD-genet er resultatet af genetisk variation og varierer mellem individer på verdensplan, men de fleste individer har genet tilfælles. Derfor har RhD-negative kvinder mellem % risiko for at vente et RhD-positivt foster. Her kommer kendskab til et individs arvemateriale til nytte, da man kan forudsige risikoen for, at der opstår komplikationer ved kvindens graviditet. Der kan udføres to tests, den ene hvor fosterets blod undersøges for RhD-antigenets tilstedeværelse fænotypisk, og den anden hvor faderens Deoxyribo nucleic acid (DNA) undersøges for RhD-genets tilstedeværelse genotypisk. Ved genets tilstedeværelse vil der være behandlinger, som kan hjælpe kvinden med at gennemføre graviditeten. Ved en genotypisk bestemmelse anvender Wagner, Moulds og Flegel, i deres artikel, viden om RhD-genets placering og udseende. To sekvenser på cirka basepar (bp) er placeret foran Side 3 af 96

4 og bagved RhD-genet, som er cirka bp langt, under fællesbetegnelsen RhD-bokse. Der findes tre RhD-bokse; upstream, downstream og hybridboks. Upstream boksen er placeret før selve RhD-genet, downstream er placeret efter RhD-genet og hybridboksen er et resultat af en mutation, der kombinerer upstream og downstream, derfor mangler RhD-genet. Mangel på RhDgenet skyldes en skæv overkrydsning af kromosomerne mellem de to RhD-bokse, hvilket resulterer i RhD-genets forsvinden, hvorefter kun én hybrid RhD-boks er tilbage (Wagner, Moulds et al. 2005). Da det er muligt at identificere RhD-genets tilstedeværelse ved hjælp af disse RhDbokse, er det muligt at bestemme om faderen er RhD-homozygot eller heterozygot og derved forudsige, om der vil være risiko for, at fosteret vil blive ramt af hæmolytiske komplikationer grundet moderens anti-rhd (Wagner, Moulds et al. 2005). Side 4 af 96

5 3 TEORI 3.1 BLODETS SAMMENSÆTNING OG FUNKTION I KROPPEN Blod bringer næring, ilt og hormoner ud til kroppens celler via et kompleks system af blodkar og organer, hvor det også sørger for at fjerne de metaboliske affaldsstoffer, der udskilles under cellernes forbrænding (Martini, Nath et al. 2012). Blod består hovedsageligt af røde blodlegemer (erytrocytter), hvide blodlegemer (leukocytter), blodplader (trombocytter), plasma, proteiner og vand. Blod har fem gange højere viskositet end vand, hvilket skyldes de mange interaktioner, der sker mellem de opløste proteiner, de dannede elementer og vandmolekylerne i blodbanen. Blod har en temperatur på cirka 38 o C og en ph på gennemsnitlig 7,4 (Martini, Nath et al. 2012). Det er kroppens størrelse, som bestemmer mængden af blod i systemet, der er også forskel på mængden af blod mellem kønnene. Mænd har cirka fem til seks liter blod i kroppen og kvinder har cirka fire til fem liter (Martini, Nath et al. 2012). Derudover findes der forskellige blodtyper, som kan adskilles fra hinanden ved hjælp af AB0- og Rhesus-systemerne. Blodets sammensætning giver det mange andre egenskaber: Regulerer ph ved at absorbere og neutralisere syre, som dannes under aktiviteten i vævet. Forhindrer tab af blod ved skader på kroppen via enzymer og proteiner, som kan få blodet til at størkne. Blodet transporterer hvide blodlegemer og antistoffer rundt, som beskytter kroppen imod patogene mikroorganismer og toksiner. Stabiliserer kropstemperaturen ved at absorbere varmen genereret i skeletmusklerne og omfordeler det i vævet. (Martini, Nath et al. 2012). Side 5 af 96

6 Hæmatokrit er den varierende mængde af erytrocytter i fuldblod. Hæmatokritværdi beskriver mængden af erytrocytter i blodet og kan variere med 5 % i løbet af et døgn (Saltin 2000). Fuldblod består af alle blodets komponenter, herunder også plasmaet, som omgiver dem. Komponenterne i fuldblod er følgende; plasma, plasmaproteiner, vand, trombocytter, erytrocytter, lymfocytter og andre opløste stoffer. Plasma udgør grundbestanddelen i fuldblod og fylder mellem % af volumen (Martini, Nath et al. 2012). Plasma består overordnet af tre slags proteiner (albuminer, fibrinogener og globuliner), organiske næringsstoffer, bicarbonat, mælkesyre, organiske restprodukter og ioner som; natrium, magnesium og calcium. Blodceller og cellefragmenter er i plasmaet og udgør % af det samlede fuldblods volumen (Martini, Nath et al. 2012). Bloddannelsesprocessen sker gennem to forskellige populationer af stamceller; myeloide og lymfoide stamceller. Centrifugeres fuldblod, vil plasma placere sig øverst og nederst findes de tre typer blodceller. Vand og erytrocytter er de to hovedkomponenter i fuldblod, da de henholdsvis fylder 92 % og 99,9 %. Plasmaproteinerne har et volumen i plasmaet på 7 %, andre opløste stoffer fylder 1 %, trombocytter og leukocytter fylder mindre end 0,1 % (Martini, Nath et al. 2012). Erytrocytter transporterer ilt fra lungerne til blodet. De er små skiveformede celler uden cellekerne. De er cirka 7 µm i diameter, har en maksimal tykkelse på cirka 2 µm, og en minimal tykkelse på 0,8 µm i centrum, se figur 1 (Martini, Nath et al. 2012). Figur 1 En erytrocyts form (Fontana, Trnka et al. 2013). En erytrocyt indeholder hæmoglobin. Blodets røde farve skyldes hæmoglobins jernindhold. Hæmoglobin er et transportprotein, hvis funktion er at transportere ilt fra lungerne og ud i vævet, samt optage kulilte og føre det tilbage til lungerne, hvor det udåndes. Denne proces er vigtig, fordi ilt indgår i kropscellernes stofskifte, hvor kulilte er processens affaldsstof. En voksen mand har 4,5-6,3 millioner erytrocytter per 1 µl blod, kvinder har 4,2-6,3 millioner erytrocytter per 1 µl Side 6 af 96

7 blod. I gennemsnit er der 25 trillioner erytrocytter i et voksent menneske, hvilket svarer til cirka 1/3 af alle celler i menneskekroppen (Martini, Nath et al. 2012). Den røde knoglemarv findes i specifikke knogler hos et voksent individ. Inde i disse knogler er der et hulrum, som består af porøst knoglevæv. De pågældende knogler er rørknogler som femur (lårknogle), samt andre store knogler som ilium (bækken) og sternum (brystben) (Martini, Nath et al. 2012). Der er homeostase mellem rød og gul marv, hvor den gule marv består af fedtceller. I den røde knoglemarv findes der stamceller, ud fra hvilke erytrocytter, trombocytter og leukocytter dannes, forstadier til nydannede celler vil også være til stede. Cellerne i knoglemarven modtager ilt fra transportproteinet, myoglobin, som transporterer det fra blodet ind i knoglerne. Udsættes kroppen for stress, som ved tab af blod, skabes en øget signalering til den røde knoglemarv. Den gule knoglemarv omdannes derfor til rød for at øge produktionen af nye erytrocytter til blodbanen (Martini, Nath et al. 2012). Det tager syv dage for en stamcelle at differentiere sig til en funktionsdygtig erytrocyt, som illustreret på figur 2 (Martini, Nath et al. 2012). Under dannelsen af en erytrocyt gennemgår cellen en række stadier. Den multipotente stamcelle, ud fra hvilken alle blodceller har deres ophav, deler sig først. Denne type stamcelle er selvfornyende og står for den daglige produktion af blodceller. Under denne celledeling dannes der nye multipotente celler, samt to andre typer stamceller. Den ene type stamcelle står for dannelsen af de lymfoide celletyper, herunder Thymusdependent lymphocytes (T-lymfocytter), Bonemarrow derived lymphocytes (B-lymfocytter) og Natural Killer lymphocytes (NKlymfocytter). En lymfocyt er en celletype i kroppen, der er en del af kroppens immunforsvar, som kan genkende, huske og destruerer fremmede indtrængende organismer. Den anden type stamcelle står for dannelse af de myeloide celletyper, hvilket er betegnelsen for dannelse af enhver blodcelle, som ikke er en lymfocyt (Agger, Nilsen et al. 2011). Stadierne Erytrocytten er umoden indtil den har udskudt sin kerne. Erytocytten danner blodtypebestemmende antigener inden den har udskudt sin kerne. Dag 1: Den myeloide celletype er dannet (proerytroblast), cytoplasma er svagt basofilt (blåt grundet hæmoglobin) og mangler endoplasmatisk reticulum (ER) og golgiapparat, med tiden kommer tiltagende ribosomer. Side 7 af 96

8 Dag 2: Stamcellen har polifereret til dattercellen basofil erytroblast, som er mindre i størrelsen. Cytoplasma er mere basofilt, kernen er mindre og indeholder mange polyribosomer. Dag 3: Cellen har differentieret sig til polykromatofil erytroblast, hvor kernen er endnu mindre, cytoplasma er grumset, da hæmoglobinen er ved at blive syntetiseret. Dag 4: Cellen har udviklet sig til en normalblast, hvor cellen er meget lille og basofil. Dag 5-7: Erytrocytten fortsætter ud i blodbanen, hvorved dens kerne bliver udskudt (Martini, Nath et al. 2012). Figur 2 Dannelsen af erytrocytter. Erytrocytten udvikles i rygmarven. Den udvikler sig fra en basofil proerytroblast til en moden erytrocyt på syv dage. Efter fire dage udskyder cellen, der nu kaldes en normalblast, sin kerne. Når erytrocytten er moden, kommer den ud i blodbanen (Inspiration (Martini, Nath et al. 2012)). Immunforsvaret er en central funktion, som sørger for, at udefrakommende fremmedlegemer som bakterier, vira, parasitter, svamp eller proteiner, bekæmpes når de trænger ind i kroppen, eller når de kommer i kontakt med kroppens ydre overflade. Det sørger også for, at inficerede, skadede eller abnorme celler destrueres, inden disse forårsager skade. Immunforsvaret består af en række forskellige celler under den fælles betegnelse, leukocytter, samt to typer proteiner; immunglobuliner (antistoffer) og komplementsystemet (Martini, Nath et al. 2012). Der er overordnet tale om et medfødt (uspecifikt) og et adaptivt (specifikt) immunsystem (Berg, Tymoczko et al. 2012). Det medfødte immunsystem består af en række celler (fagocytter) samt komplementsystemet. Komplementsystemet består af elleve proteiner. Disse proteiner indgår i destruktionsprocessen af fremmedlegemer. Dette sker gennem en serie af reaktioner, hvor ét komplementært protein interagerer med et andet komplementært protein Side 8 af 96

9 indtil fremmedlegemet destrueres. Der findes to veje, hvorpå komplementsystemet aktiveres. Den første og mest effektive aktiveringsvej sker ved, at et bestemt komplementært protein (C1) bindes til et immunglobulin, der i forvejen er bundet til et fremmed antigen. Den anden aktiveringsvej er mindre effektiv og kræver, at flere af komplementsystemets proteiner interagerer ved tilstedeværelse af et fremmed antigen uden antistoffer. Begge aktiveringsveje ender med, at det inaktiverede C3 protein bliver til et aktiveret C3b protein, dette resulterer i huldannelse på legemets overflade, forbedret fagocytering og øget udskillelse af histamin (Martini, Nath et al. 2012). Fælles for fagocytter og komplementsystemet er, at der ikke skelnes mellem den ene eller den anden slags legeme, derfor betegnes det som uspecifikt. Den immunreaktion, der kommer til udtryk, når forskellige blodtyper agglutinerer, skyldes hovedsageligt det adaptive immunsystem (Martini, Nath et al. 2012). Det adaptive immunsystem består af en bestemt slags leukocytter, kaldet lymfocytter. Der findes tre slags lymfocytter; B- lymfocytter, T-lymfocytter og NK-celler. Sidstnævnte tilhører også det medfødte immunsystem, da NK-lymfocytter genkender og destruerer alle inficerede, skadede eller abnorme celler, lige meget hvordan antigenet adskiller sig fra de normale (Martini, Nath et al. 2012). T-lymfocytterne er ansvarlige for det celle-medierede immunforsvar. Dette vil sige, at de bekæmper celler, der er fremmede for kroppen, samt aktiverer og regulerer aktiviteten af andre af immunforsvarets celler herunder B-lymfocytterne. Der findes en række forskellige slags T- lymfocytter: T-dræberceller, som ved kontakt destruerer specifikke patogener. T-hjælpeceller og T-supressorcells står for regulering af signalstoffer ved en immunreaktion. T-huskeceller er celler, som arkiverer information fra fremmedlegemer, kroppen udsættes for. Udsættes kroppen for det samme fremmedlegeme igen, vil kroppen hurtigere kunne bekæmpe infektionen. T-inflammationsceller tiltrækker, ved inflammation, andre celler til det inficerede område (Martini, Nath et al. 2012). B-lymfocytterne er ansvarlige for det humorale immunforsvar, hvilket betyder, at denne del af immunforsvaret finder sted i kropsvæsken. B-lymfocytterne kommer ikke selv i kontakt med Side 9 af 96

10 fremmedlegemer, men er i stand til at udvikle sig til plasmaceller, der udskiller immunglobuliner. Det er immunglobulinerne, der gør systemet humoralt, de driver rundt i blodplasmaet og reagerer med fremmede antigener (Martini, Nath et al. 2012). Det adaptive immunsystem har en række egenskaber, som det medfødte ikke har. Først og fremmest er det specifikt, hvilket vil sige, at B- og T-lymfocytterne kun vil reagere med ét bestemt antigen, mens andre antigener vil blive ignoreret. Derudover er det alsidigt, hvilket betyder, at der findes et meget stort antal forskellige B- og T-lymfocytter, der alle genkender ét specifikt antigen. Første gang kroppen udsættes for et antigen, vil nogle af B- og T-lymfocytterne udvikle sig til huskeceller. Hvis kroppen udsættes for det samme antigen, for anden gang, vil netop disse B- og T-huskeceller poliferere og gå til angreb eller producere antistoffer imod det pågældende antigen. Denne funktion viser dermed, hvorledes det adaptive immunsystems B- og T-huskeceller har en effektiv hukommelse. Det adaptive immunsystem er tolerant, da det ikke angriber andre antigener, end dem som det er specialiseret imod (Martini, Nath et al. 2012). Ved en immunreaktion optages et antigen af cellen, som derefter udstiller et fragment af dette fremmede antigen, på et særligt membransiddende glykoprotein kaldt major histocompability complex (MHC) (Hansen, Hansen et al. 1999). Dette protein varierer fra person til person, men generelt findes der for hvert individ to slag; klasse I MHC og klasse II MHC. Klasse I MHC-proteinet findes på alle celler i kroppen, der har en cellekerne. Udstilles et fragment fra et intracellulært antigen, betyder det, at cellen er syg. T-lymfocytterne aktiveres og cellen destrueres af immunsystemet. Klasse II MHC-proteiner sidder kun på et udvalg af celler, herunder B- lymfocytter og antigen præsenterende celler fra det medfødte immunsystem, som eksempelvis makrofager (se figur 3). Når fragmenter fra et ekstracellulært antigen udstilles på dette kompleks betyder det, at antigenet er fremmed. Dette igangsætter T-lymfocytterne fra det adaptive immunsystem (Martini, Nath et al. 2012, Hansen, Hansen et al. 1999). Hver B-lymfocyt har sit helt eget specifikke immunglobulin til at sidde på membranen. Når det reagerer med det tilhørende antigen, vil antigenet først blive transporteret ind i cellen, hvorefter det som nævnt vil blive udstillet på MHC II komplekset. Herefter genkender de aktiverede T-hjælpeceller det udstillede MHC II kompleks og cytokiner stimulerer B-lymfocytten til poliferering (Hansen, Hansen et al. 1999). Side 10 af 96

11 Figur 3 Makrofagen udstiller et antigen på sin membran, som T-hjælpeceller genkender. T-hjælpecellen aktiverer B-lymfocytter, som differentierer sig til en plasmacelle, der danner specifikke antistoffer i mod antigenet (Martini, Nath et al. 2012). 3.2 IMMUNGLOBULIN-ANTIGEN INTERAKTION Ethvert materiale som kan inducere en specifik immunrespons er et antigen (Agger, Nilsen et al. 2011). Da menneskets immunsystem har en høj selvtolerance, vil det være materiale, som ikke tilhører kroppen, som der vil reageres immunlogisk imod. Derfor er der ingen grænser for, hvad der vil kunne fungere som antigener. Proteiner, kulhydrater, lipider, nukleinsyrer, organiske og uorganiske forbindelser kan alle inducere immunreaktioner. Dette er sandsynligvis konsekvensen af den evolutionære udvikling af et adaptivt immunsystem, som er i stand til at reagere på overraskende store mængder antigener af forskellig oprindelse (Agger, Nilsen et al. 2011). På overfladen af kropscellernes plasmamembraner sidder der også antigener, men disse inducerer ikke en immunologisk reaktion, da kroppen accepterer disse som sine egne. Når et fremmed antigen derimod opdages i kroppen, giver det anledning til et immunrespons, hvilket kan være en antistofreaktion eller gennem cellulær immunitet. De immunologiske komponenter vil reagere specifikt med det inducerende antigen. Dette fænomen udnyttes både in vivo (ved vaccinationer) og in vitro (i diagnostiske teknikker). Ved eksponering af et nyt antigen vil det adaptive immunsystem finde den bedst mulige måde, hvorpå dette kan ødelægges. Derfor gennemgår leukocytterne en afprøve- og fejlperiode, hvor det inducerende antigens svagheder klarlægges. Når den bedste immunreaktion på det specifikke antigen er bestemt, bliver den lagret i hukommelsescellerne og kroppen er nu klar til at kunne aktivere et hurtigt immunrespons, hvis den udsættes for samme antigen igen (Agger, Nilsen et al. 2011). Side 11 af 96

12 Immunglobuliner er proteiner, der kan binde sig til et særligt sted (epitoper) på et givent antigen under en immunreaktion. I sin grundlæggende form er proteinet Y-formet og består af to tunge kæder (H(heavy)-kæder) og to lette kæder (L(light)-kæder), der gennem en disulfidbinding er kovalent bundet til hinanden (se figur 4). Hver L-kæde er bundet til en af H- kæderne, mens de to H-kæder er bundet til hinanden (Berg, Tymoczko et al. 2012). Da kroppen skal indeholde et stort udvalg af forskellige immunglobuliner, betyder det, at proteinernes aminosyresekvens må være forskellige fra hinanden, men det er kun en lille del af immunglobulinets aminosyresekvens, der er varierende. Et immunglobulin består af i alt tolv domæner, når det er i sin enkelte Y-form, men visse immunglobuliner er sammensatte af flere Y- formede proteiner (se figur 4), (Berg, Tymoczko et al. 2012). Et domæne er en større del af et protein, der har en særlig funktion for det samlede protein. De to arme betegnes fragment antigen binding (Fab), mens stammen af proteinet betegnes fragment crystalized (Fc). De to L- kæder består begge af to domæner; et varierende på den N-terminale ende af kæden og et konstant på den C-terminale ende af kæden. Hver H-kæde består af fire til fem domæner, afhængigt af hvilken immunglobulinklasse, der er tale om, hvor det ligeledes er domænet på kædens N-terminale ende, der varierer, mens de resterende domæner er konstante. Samlet bliver armene på det Y-formede protein den del, der varierer, og fungerer derfor som den antigen reagerende del (Berg, Tymoczko et al. 2012). Figur 4 Et immunglobulin er normalt opbygget af tolv domæner, hvilket på denne figur vises som de ovale figurer. Domænerne er på figuren navngivet med et bogstav, C, der står for constant eller V, der står for variabel, et nedsænket bogstav, H der står for heavy chain eller L, der står for light chain. C-domænerne er yderligere nummereret. Immunglobulinets to arme betegnes fragment binding (F ab), og yderst på disse er H-kædens yderste domæne farvet lilla, og den lette kæde orange, hvilket viser, at disse domæner er de varierende, mens de resterende domæner (blå og gule) er konstante. Disulfidbindinger, der forekommer mellem de to H- kæder samt mellem L-kæde og H-kæde, er markeret som grønne linjer (Berg, Tymoczko et al. 2012). Side 12 af 96

13 Der findes fem forskellige immunglobulinklasser. De fem klasser er navngivet med præfikset immunglobulin (Ig), efterfulgt af suffikset, G, M, E, D eller A. For hver af de fem klasser kan L- kæden variere mellem en κ- og λ-kæde. H-kæden består for hver af klasserne i ovenstående rækkefølge af en γ-, μ-, ε-, δ- eller α-kæde (Berg, Tymoczko et al. 2012). Det er H-kæden, der afgører, hvilken klasse et givent immunglobulin tilhører. Det variable domæne på H-kæden har ikke indflydelse på klassificeringen af immunglobulinet. Det er derfor kun de konstante domæner af H-kæden, der afgører om immunglobulinet er af den ene eller den anden slags. Derved adskiller IgG sig eksempelvis fra IgE på grund af forskelle ved hver af de to immunglobuliners konstante domæner på H-kæden, men ikke deres variable domæner på Fab (Berg, Tymoczko et al. 2012). I alle immunglobulinklasserne er det helt særlige strukturelle egenskaber, der gør, at immunglobulinets reagerende del (paratop) reagerer effektivt med det specifikke antigens epitop. Immunglobulinets sidste del af H-kæden har tre områder i aminosyresekvensen, der varierer meget fra det ene immunglobulin til det andet. Disse sekvenser strækker sig fra syv til tolv aminosyrer og kaldes for immunglobulinets hypervariable regioner (Berg, Tymoczko et al. 2012). Disse områder er særlige ved, at de udgøres af loops mellem antiparallelle β-foldeblade. Disse loops kaldes også for complementarity-determining regions (CDR). Sammen med yderligere tre CDR fra L-kædens N-terminal, er immunglobulinets paratop i stand til at binde sig dens tilsvarende epitop, gennem en række forskellige intermolekylære interaktioner som hydrogenbindinger, elektrostatisk interaktion, londonbindinger og hydrofobisk interaktion (Berg, Tymoczko et al. 2012). Et stort antigenmolekyle binder sig stærkere til immunglobulinets paratop end et lille antigenmolekyle, fordi der ved en interaktion mellem et lille antigen og immunglobulinet dannes bindinger til færre af de seks hypervariable loops end ved de store antigenmolekyler (Berg, Tymoczko et al. 2012). I forbindelse med blodtypesystemerne AB0 og Rhesus er de to centrale immunglobuliner IgM og IgG. IgG er det immunglobulin, der findes mest af i blodet, hvor det driver rundt i blodets plasma. Det består af to H-kæder af fire domæner hver og to L-kæder af to domæner hver (figur 5A). Derved består IgG samlet af tolv domæner, hvoraf fire domæner; L-kædernes og H- kædernes N-terminale domæner, udgør proteinets to paratoper på Fab. IgG er et irregulært immunglobulin, fordi det ikke findes i kroppen i forvejen og er dermed fraværende, når kroppen udsættes for et fremmedlegeme for første gang. Inden det specificerede IgG udskilles, må Side 13 af 96

14 kroppens immunforsvar identificere det fremmede antigen. Det andet blodtypespecifikke immunglobulin, IgM, adskiller sig på flere måder fra IgG. For det første er IgM en pentamer, hvis fem monomerer er bundet sammen af disulfidbroer, mens IgG er en monomer. Strukturmæssigt er IgM stjerneformet med de C-terminale Fc inderst og de N-terminale Fab yderst. I modsætning til IgG, består IgM s H-kæde ikke af fire domæner, men fem, hvoraf det femte og nye domæne betegnes Cμ2. Derudover findes der en såkaldt J-kæde, der udgør endnu et domæne. Denne kædes egenskab er at sammenfatte pentameren, så immunglobulinet opnår sin stjerneform (figur 5B). Tilsammen udgøres IgM derfor af 71 domæner (Perkins, Nealis et al. 2010), (Czajkowsky, Shao 2009). IgM er altid det første immunglobulin, der udskilles, når kroppen udsættes for et antigen første gang. Det er derfor ikke antigenspecifikt, men fungerer som en midlertidig løsning, inden det specifikke IgG bliver udskilt. Derfor betegnes IgM som et regulært immunglobulin (Martini, Nath et al. 2012). Figur 5: A) Et IgG immunglobulin, hvor den tunge kæde er vist i blå farve, og den lette kæde er vist i gul. Læg her mærke til, hvordan proteinets tolv domæner er afgrænset fra hinanden (Berg, Tymoczko et al. 2012), B) IgM pentameren indeholder to ekstra domæner for hver monomer, samt en såkaldt J-kæde, som ses i bunden af den inderste røde ring. Selve J-domænet er ikke rødt (Perkins, Nealis et al. 2010) Side 14 af 96

15 3.3 Forskellen mellem agglutination og hæmolyse I tilfælde af, at en donors blodtype ikke er kompatibel med patientens blodtype, vil der ske en krydsreaktion, hvor patientens erytrocytter klumper sig sammen og/eller ødelægges ved hæmolyse. Denne reaktion, hvorpå erytrocytter klumper sammen, kaldes agglutination og er illustreret på figur 6. Figur 6: Agglutination af erytrocytter Erytrocytter (RBC-Red Blood Cell) og deres specifikke overflade antigener kommer i kontakt med fremmede antistoffer. Dette fører til, at erytrocytter agglutinere/klumper sig sammen og til sidst destrueres ved hæmolyse (inspiration (Martini, Nath et al. 2012)). Ved krydsreaktion vil agglutinationen danne en tyk masse, som vil binde sig til nærliggende blodkar i nyrer, lunger, hjerte og/eller hjerne og derved beskadige eller ødelægge disse. Dette kan medføre åreforkalkning og blodpropper, og er en af årsagerne til, at alle individer, som skal modtage blod, modtager en kompatibel blodtype (Martini, Nath et al. 2012). Hæmolyse er et begreb, der beskriver nedbrydning af erytrocytter. Her ødelægges erytrocytternes membran, så indholdet i cytoplasmaet, heriblandt hæmoglobin og andre interne komponenter, frigives (Martini, Nath et al. 2012). Der skelnes mellem to typer af hæmolyse: In vivo hæmolyse, som kan skyldes patologiske tilstande, såsom autoimmun hæmolytisk anæmi eller krydsreaktion. In vitro hæmolyse kan opstå, hvis udtagning eller behandling af prøve foretages forkert (Arzoumanian 2003). 3.4 FRA GENOTYPE TIL FÆNOTYPE Genotypen er kombinationen af alleler i en organisme, som bestemmer dens genetiske sammensætning (Martin, Hine 2008). DNA fungerer som cellens arkiv fuld af information, der kan blive videregivet fra generation til generation. DNA er et makromolekyle og består af to lineære polymerer, hvor hver polymer er sat sammen af en lang række monomerer. Hver monomer kaldes et nukleotid og udgøres af en fosforbro, et sukker, kaldet deoxyribose, samt én ud af fire baser. Fosforbroen er bundet til et deoxyriboses femte kulstofatom og et andet Side 15 af 96

16 deoxyriboses tredje kulstofatom, hvilket angiver retningen, hvorfra DNA læses; fra 5 -enden mod 3 -enden. På deoxyriboses første kulstofatom sidder basen bundet ved en kovalent binding mellem nitrogen fra basen og kulstofatomet fra deoxyribose. Der findes fire baser, som sidder parvis sammen via hydrogenbindinger; Guanin (G) som sidder overfor cytosin (C), og adenin (A) der sidder overfor thymin (T) (Berg, Tymoczko et al. 2012). DNA har form som en dobbelt spiral, med baseparrene vendt indad, hvor de to DNA-strenge er antiparallelle (se figur 7) (Attwood, Campbell et al. 2006). Figur 7 Et DNA molekyle består af to lineære polymerer opbygget af nukleotider med én ud af fire baser (inspiration (Martini, Nath et al. 2012)). Inde i cellekernen, der er omgivet af en cellemembran, findes kernelegemet og kromatin. Kernelegemet står for dannelsen af ribosomer og arbejder tæt sammen med DNA i forhold til proteinsyntesen. Kromatin er et stof, bestående af protein og lineære DNA-strenge, der udgør en struktur kendt som et kromosom. Menneskets celler indeholder 46 kromosomer med undtagelse af kønscellerne, der indeholder det halve antal. De 46 kromosomer sidder parvis og danner tilsammen 23 kromosompar. Da kromosomerne består af DNA, betyder det, at størstedelen af individets gener, er fordelt over de 23 kromosompar. Da et individ har to næsten ens kromosomer for mindst 22 af kromosomparrene betyder det, at begge kromosomer fra hvert Side 16 af 96

17 kromosompar bærer gener, der kontrollerer samme arvelige karakteristika (se figur 8) (Reece, Urry et al. 2009). Figur 8 Menneskets 22 kromosompar inkl. Kønskromosomer (X og Y) (inspiration (Reece, Urry et al. 2009). Gener er specifikke DNA-sekvenser, kodende for proteiner som opretholder funktioner i kroppen og kan komme til udtryk fænotypisk (Attwood, Campbell et al. 2006). De fleste celler i kroppen indeholder et næsten identisk genom. Det der gør cellerne unikke er det udsnit af genomet de udtrykker (Reece, Urry et al. 2009). Under proteinsyntesen afkodes DNA til proteiner og er forbindelsen mellem genotypen og fænotypen (Reece, Urry et al. 2009). Fænotypen er det, som kommer til udtryk i et individs fysiske fremtoning og egenskaber via genotypen (Martin, Hine 2008). Side 17 af 96

18 Det centrale dogme er informationsoverførslen fra DNA til protein, som sker ved proteinsyntesen inde i cellens ribosomer. Det centrale dogme består af tre processer; transkription, translation og proteinsyntesen (Berg, Tymoczko et al. 2012). På grund af hydrogenbindingerne mellem de to DNA-polymerer, kan disse lettere adskilles. Dette er hensigtsmæssigt, da DNA skal kunne deles, kopieres, aflæses og afkodes. Efter de to DNAstrenge er skilt, kan der ske enten DNA-replikation eller DNA-transkription. Ved DNA-replikation binder DNA-polymeraser sig til hver af DNA-strengene, hvorefter de katalyserer processen, hvormed en komplementær DNA-streng dannes fra 5 -enden mod 3 -enden. På den måde dannes der komplette kopier af cellens DNA. Ved DNA-transkription er det ribonucleic acid (RNA)- polymeraser, der påbegynder dannelsen af en RNA-streng fra 5 -enden mod 3 -enden (se figur 9). Figur 9: DNA transkription, hvor DNA adskilles, RNA-polymerase binder til template strengen, og der dannes en RNA-streng modsatrettet fra 5 - mod 3 -enden (Clark 2013). Den nye RNA-streng er en næsten identisk kopi af den kodende DNA-streng og er dannet ud fra en skabelonstreng. Når DNA strengene skilles, vil én af strengene fungere som den kodende streng, mens den anden vil fungere som skabelonstreng. Derfor minder processen meget om DNA-replikation, bare med den undtagelse, at det er RNA, der bliver dannet og ikke DNA. RNA adskiller sig fra DNA ved, at thymin (T) er udskiftet med uracil (U), og deoxyribose er udskiftet med et andet sukker, ribose. Tre former for RNA er vigtige for proteinsyntesen; messenger-rna (mrna), ribosomal-rna (rrna) og transporter-rna (trna). Når et RNA er blevet fuldt transkripteret, gennemgår det en proces, hvor sekvenser, kaldet introns, der ikke er kodende for et protein, bliver fraklippet. De kodende sekvenser, der kaldes exons, bliver da sat sammen af særlige enzymer, den nye RNA-mosaik er det færdige mrna. Dette mrna bliver da sendt ud til Side 18 af 96

19 ribosomerne, som fungerer som fabrikker, der syntetiserer proteiner og er komplekser sammensat af rrna og protein. Der findes både frie ribosomer og ribosomer bundet til det ER. Den del af ER, som ribosomer er bundet til, kaldes det ru ER. mrna binder sig til ribosomerne, hvor trna aflæser de tilstedeværende kodons, der er tre baser, som koder for én af de tyve mulige aminosyre på mrna, og oversætter disse til aminosyrer. For hvert kodon bliver der således hentet en aminosyre og gennem peptidbindinger bliver de hentede aminosyrer sat sammen til proteinkæder (se figur 10) (Berg, Tymoczko et al. 2012). Skal proteinerne bruges inde i cellen, bliver disse syntetiseret i de frie ribosomer, mens proteiner, der skal ud af cellen eller sidde på cellemembranen syntetiseres i ribosomerne på det ru ER (Berg, Tymoczko et al. 2012). Inde i det ru ER bliver de nysyntetiserede proteiner foldet, så de får den rette tredimensionelle struktur og nogle proteiner bliver sammenkoblet med N-bundet carbonhydrater (Berg, Tymoczko et al. 2012). De transporteres videre i vesikler til Golgiapparatet. Golgiapparatet består af en række flade membranvesikler og er opdelt i tre områder; cis-, medial- og transregionen. I Golgiapparatet findes der enzymer, der modificerer proteinerne, så de enten er egnede til sekretion eller til membranbinding (Lodish, Berk et al. 2004). Figur 10: Et ribosom under translation (Inspiration (Cnx Biology 2014)). Det, der bestemmer, hvornår RNA translationen skal begynde og slutte, er også særlige kodons. Der findes én startskodon, der også koder for methionin (AUG) og tre slutskodon (UAA, UAG og UGA). Det centrale dogmes samlede funktion er vist på figur 11. Ifølge Mendel vil forskellige genotyper resultere i forskellige fænotyper (Reece, Urry et al. 2009). Dette kan medføre Side 19 af 96

20 variationer fra individ til individ på grund af mutationer, hvilket resulterer i forskellige fænotyper blandt individer (Reece, Urry et al. 2009). Men det vides nu, at der kan forekomme flere kodons for den samme fænotype (Berg, Tymoczko et al. 2012). Figur 11: Det centrale dogme (inspiration (NCBI. 2007)). En evolutionær ændring sker som følge af tilfældige mutationer, hvoraf de mest hensigtsmæssige bliver selekteret. Den evolutionære ændring fremkommer således af en ny genotype. Grundstenen i den evolutionære proces er, at organismer er forskellige, da der er en genetisk variation (Sørensen 2013). Ifølge Mendel er to forskellige gener uafhængige af hinanden, men dette er ikke tilfældet for RhD-generne, da RhD og RHCE befinder sig på samme gen (Reece, Urry et al. 2009, Wagner, Moulds et al. 2005). Der kan ske ændringer i generne, uden ydre påvirkninger, grundet spontan mutation. Mutationer kan skyldes fejl i cellens processer og er helt naturlige. En mutation er en ændring i en eller flere baser i DNA-arvematerialet og kan medføre en ubetydelig, en fordelagtig eller en uhensigtsmæssig ændring i gener hos et individ. Disse ændringer i basesekvensen kan forekomme ved fejl i DNA-replikationen. De to skabeloner får indsat nukleotider af DNA-polymerase og det er her mutationer kan opstå, hvis der indsættes forkerte nukleotider (Biotech Academy 2013). Mutationer kan forekomme som punktmutationer, frame-shift mutationer, deletioner, insertioner eller inversioner. Punktmutationer er, hvor ét basepar bliver substitueret og der Side 20 af 96

21 indsættes et forkert basepar i DNA-sekvensen under replikationen. Når det ændrede mrna skal translateres, kan dette medføre, at en anden aminosyre indsættes i proteinet. Mutationer kan også forekomme steder i sekvensen, som ikke bliver translateret. Der findes fire former for punktmutationer: Silent, missense, nonsense og splice site (se figur 12). Figur 12 De tre former for punktmutationer: Silent, missense og nonsense til venstre, samt den normale DNA replikation (Wild type) til højre (Biotech Academy 2013). Silent mutation sker, hvis mutationen ikke ændrer aminosyren i det protein, som genet koder for. Missense mutation sker når mutationen ændrer aminosyren i det protein, genet koder for. Ofte reducerer denne form for mutation proteinets effektivitet, men kan også forbedre den eller give alvorlige konsekvenser. Nonsense mutationer medfører, at translationen stopper for tidligt, da der ved mutationen fremkommer et stopkodon i sekvensen. Dette vil resultere i et forkortet protein eller et fuldstændigt inaktivt protein. Splice site (exon-intron junction) mutation forårsager fejl i splejsning af mrna, der springes et exon over og derfor ændres aminosyresekvensen, hvilket fører til tab af proteinets funktion eller udtryk (Biotech Academy 2013). Side 21 af 96

22 Frame-shift mutationer forekommer også, når der indsættes eller fjernes baser, der ændrer læserammen i DNA-sekvensen. Dette betegnes som deletion og insertion, hvor begge defineres som en frame-shift mutation. DNA-sekvensen bliver afkodet i blokke af tre basepar, hvilket medfører, at der er tre måder at aflæse en enkelt DNA-streng på, disse tre måder kaldes for læserammer. Læserammen gives efter startkodon er valgt og de tre første baser er aflæst. Peptidkæder dannes på denne måde, hvor deres funktion afhænger af, hvilken af de tre baser der startes med. Startes der ved den fjerde base vil det give samme resultat som i den første læseramme, men den første aminosyre vil mangle. Der findes i alt seks forskellige læserammer tre på hver streng i er dobbeltstrenget DNA molekyle. Heraf kommer navnet frame-shift, da der dannes en ny læseramme ved indsættelse eller fjernelse af baser. Mutationen medfører ofte, at proteinet mister sin funktion, men hvis enden af peptidkæden ikke er af betydning, kan der være chance for, at proteinet kan fungere alligevel (Biotech Academy 2013). Større deletioner kan forårsage arvelige ændringer og medvirker til, at et individs arvemasse mangler et stykke DNA. Deletioner kan ske ved skæv overkrydsning af kromosomerne under genetisk rekombination. En skæv overkrydsning mellem to næsten ens kromosomer, som vil resultere i at det ene kromosom vil miste en DNA sekvens og det andet kromosom vil have den pågældende DNA sekvens duplikeret (se figur 13). Hvis denne DNA sekvens indeholder et gen, vil chancen for overkrydsning være forøget, da overkrydsning sker ved baseparring mellem DNAenkeltstrenge. Dette betyder, at gener for proteiner, som er nært beslægtede og er duplikeret, vil være i øget risiko for skæv overkrydsning (Prentø, Jensen 2003). Figur 13: To kromosomer, der danner en duplikation, deletion og normal variant af et gen ved en skæv overkrydsning (Egebo A. L. 2003). Side 22 af 96

23 Insertioner er mutationer, hvor der indsættes nye basepar i DNAet et nyt sted (se figur 14). Disse sker ofte grundet aktiviteten af de løse segmenter af DNA, som spontant kan bevæge sig mellem kromosomerne og flytte til ny lokation i et kromosom. Disse segmenter kan være mellem 100 og 1000 basepar lange, hvilket medfører en ændring i genet, som kan ændre genproduktet (Griffiths, Miller et al. 2000). Figur 14: Eksempel på insertion af ny basesekvens TGG (Griffiths, Miller et al. 2000). Inversioner er omarrangeret kromosomer, hvor et segment placeres omvendt i DNA sekvensen ved at blive roteret 180 grader, inden det genindsættes. Derfor mister individet ikke DNA, da det er den lineære gensekvens rækkefølge, som bliver ændret på. Heterozygote inversioner, hvor et kromosom har standard sekvensen og et andet har inversionen, danner et inversionsloop, da det ene kromosom vil sno sig en gang ved enderne af inversionen for, at baserne kan passe med det andet kromosom i meiosen (se figur 15) (Griffiths, Miller et al. 2000). Figur 15 Kromosomerne i en heterozygot inversion, som danner en loop ved meiosen, hvor hvert kromosom er søsterkromatider (Griffiths, Miller et al. 2000). 3.5 BLODTYPESYSTEMERNE AB0 OG RHESUS Blodtypen er genetisk bestemt ved tilstedeværelsen af eller mangel på specifikke overfladeantigener, som sidder i cellemembranen hos erytrocytter. De to vigtigste blodsystemer er AB0- og Rhesus-systemet. Udover AB0- og Rhesus-systemerne, findes der mindst 48 andre blodtypesystemer, der skal tages hensyn til ved arbejde med blodtyper (Martini, Nath et al. 2012)). AB0-systemet opdeles i fire blodtyper; A, B, AB og 0. Hvert antigen er opbygget af glycoproteiner, som cellen anvender til at kommunikere med. Glycoproteiner består af en eller flere poly- eller oligosaccharider, som er bundet til et protein eller lipid i cellemembranen. Ikke fuldt udviklede erytrocytter optager disse oligosaccharider (Stilling 2004). Basisenheden i alle Side 23 af 96

24 AB0-blodtypeantigener er H-antigen, som sidder i cellemembranen hos erytrocytter, blodtypen 0 udtrykker kun H-antigen, hvorimod: Blodtypen A danner enzymet α-1-3-n-acetylgalaktosaminyltransferase. Dette enzym sætter N-acetylgalaktosamin på H-antigenet. Blodtypen B danner enzymet α-1-3-galaktosyltransferase. Dette enzym påsætter galaktose på H-anigenet (se figur 16). Figur 16: Erytrocyt med antigener kodende for A, B, AB og 0. Blodtype 0 har kun H-antigen. Blodtype A dannes ved påsætning af N-galaktoseamin via enzym α-1-3-n-acetylgalaktosaminyltransferase. Blodtype B dannes ved påsætning af galaktose via enzym α-1-3-galaktosyltransferase. Blodtype AB er når begge enzymer påsætter både galaktose og N-galaktoseamin på den samme erytrocyt (inspiration (Egebo A. L. 2003)). AB0-blodtypernes karakteristika findes i forskellene i de ende stillede kulhydratkæder i cellemembranens glycoproteiner; blodtype A har N-acetylgalaktosamin som yderste led, blodtype B har galaktose og blodtype 0 har basisenheden H-antigen. Disse forskelle skyldes en genetisk variation i de enzymer, der katalyserer opbygningen af kulhydratkæder. I blodplasma vil der, afhængigt af blodtypen, være IgM imod de A- eller B-antigener, som individet ikke udtrykker. Ved blodtype 0 er der IgM imod både A- og B-antigener, mens IgM er fraværende hos blodtype Side 24 af 96

25 AB. Årsagen til, at IgM vil være tolerant over for kroppens eget blodtypeantigen og ikke over for udefra kommende antigener med lignende struktur, er stadig uvist (Spalter, Srini et al. 1999). I Rhesus-systemet skelnes der imellem RhD-negativ og RhD-positiv. Når individet er RhDpositiv indikeres det, at antigenet D er til stede på overfladen af erytrocyttens cellemembran. RhD-antigenet fungerer muligvis som et transport-protein, men dets specifikke funktion kendes endnu ikke (Agger, Nilsen et al. 2011). Rhesus-systemet danner som udgangspunkt ikke immunglobuliner imod RhD-antigenet. Det er kun i situationer, hvor et RhD-negativt individ udsættes for RhD-positive erytrocytter, at kroppen vil danne IgG imod RhD-antigenet. Reaktionen, hvor IgG binder sig til RhD-positive erytrocytter, adskiller sig fra agglutinationsreaktionen, der sker ved AB0-systemet. IgG er ikke en pentamer som IgM. Et IgG er derfor ikke i stand til at binde lige så mange antistoffer som IgM. IgG ændrer derimod form, når det binder sig til et antigen. Dette gør det muligt for komplementsystemet at binde sig til IgG og destruere den RhD-positive erytrocyt. Hæmolysen øger behovet for nye erytrocytter. Når produktionen af erytrocytter ikke er tilstrækkelig, vil der fra knoglemarven blive udskilt umodne erytrocytter. Ydermere volder de ødelagte erytrocytter skade på organer som blandt andet nyre og hjerte. Bliver den fremmede erytrocyt ikke destrueret af komplementsystemet, bliver den fagocyteret af en makrofag, da komplementproteinerne også fungerer ved at tiltrække fagocytter (Martini, Nath et al. 2012). Ligesom i AB0-systemet er RhDantigenet genetisk betinget. 85 % af den danske befolkning er RhD-positive, hvilket gør RhDnegative bloddonorer eftertragtede i blodbanken (Agger, Nilsen et al. 2011). Det humane Rhlocus, hvilket er det specifikke sted genet er placeret, findes på det første kromosom. På de korte arme befinder Rh-locus sig og består af to gener; D og CE. D er det mest immunogene Rh-antigen og det dominante ved nedarvning. Når et individ har genet, som koder for RhD på et af sine to kromosomer, vil disse være heterozygot og betegnes RhD-positiv. Er et individ RhD-negativ vil det betyde, at i stedet for genet, som koder for RhD, vil der være placeret en deletion (lille d) af RhD-genet på begge kromosomer, hvilket betegnes som homozygot RhD-negativ (Agger, Nilsen et al. 2011). Side 25 af 96

26 3.6 GENETISK VARIATION AF RHESUS PROTEINET Rhesus-systemet er det vigtigste blodtypesystem, blandt de 50 som vi kender til, næst efter AB0, som også er af stor betydning i den kliniske verden (Varming 2014). De fleste pattedyr har kun et RhD-gen, som ligner det humane RHCE-gen. RhD-genet opstod ved en duplikation af det nedarvede RHCE-gen under evolutionen hos pattedyr for mere end 8 millioner år siden. Det var først herefter, at RhD-deletionen indtrådte i homonidets evolution, hvilket er grunden til, at nogle mennesker i dag, mangler RhD-proteinet og har fået de to homozygote haplotyper, som begge koder for RHCE-proteinet og RhD-deletionen. RhD-deletionen kommer af RhD-alleler, som indeholder splice-site, missense, nonsens og inversion mutationer eller nukleotid indsættelse samt større deletioner. Disse mutationer er skyld i alle RhD-negative individer på verdensplan (Avent, Madgett et al. 2006). Den genetiske variation ses i om RhD-antigen er til stede eller ej, samt de undergrupper af D-antiproteinet som erytrocytten kan præsentere på ydersiden af membranen. RhD-proteinerne RhD og RHCE er meget ens, på aminosyreniveau, da kun 36 ud af 417 aminosyrer er forskellige, men dette betyder nødvendigvis ikke, at basesekvensen vil være ens (Flegel A. W. 2007, Berg, Tymoczko et al. 2012). Begge har tolv segmenter i erytrocytmembranen og seks ekstracellulære loops, derudover har de tilfælles at både N- terminalen og C-terminalen er placeret inden i cellen (Se figur 17). RhD-proteinet krydser erytrocytmembranen flere gange, og lader kun en lille del af proteinet være udsat på overfladen. Hvis en aminosyre bliver erstattet i den del af RhD-proteinet, som er placeret på den ydre overflade af membranen, kan enkelte epitoper af D-antigenet gå tabt eller nye antigener kan opstå (Flegel A. W. 2007). Side 26 af 96

27 Figur 17: RhD-proteinets placering i erytrocyttens membran. De 417 aminosyrer er vist som cirkler. Færdigudviklede proteiner i membranen mangler den første aminosyrer. De gule cirkler repræsenterer aminosyre substitutioner, som adskiller RhD og RHCEproteiner, de grønne cirkler repræsenterer de fire aminosyre, som koder for C-antigenet og de sorte cirkler koder for E-antigen. De enkelte aminosyrer substitutioner, som koder for partial D er de blå cirkler, dem som koder for weak D er røde og mutationer identificeret af Ulm gruppen er i lyseblå og orange (Flegel A. W. 2007). Ved duplikation af generne, grundet en skæv overkrydsning af kromosomerne, er der opstået RHCE- og RHD-gener på det samme kromosom, hos nogle individer er der fremkommet en RhDdeletion, hvor D-anti-proteinet nu ikke længere er til stede. Overkrydsningen resulterer herved i strukturelle kromosomafvigelser, som forandrer de enkelte kromosomer. I dette tilfælde er der tale om et tab af et stykke af kromosomet (RhD-deletion) og et stykke kromosom materiale for meget (duplikation, RhD-proteinet) (Flegel A. W. 2007). Duplikationen skaber et andet modsatrettet RhD-gen. Ved indsætningspunkterne før og efter RhD-genet befinder der sig et DNA segment, som er omkring 9000 bp langt. I den RhD-postive haplotype, vil RhD-genet kunne mistes igen, gennem en fejl under rekombination (se figur 18), hvor en hybrid RhD-boks opstår i stedet (Flegel A. W. 2007). Side 27 af 96

28 Figur 18: Deletionen af RhD-genet. Rekombination mellem en upstream og en downstream RhD-boks på to forskellige kromosomer resulterer i deletion af RhD-genet, og beskrives som en skæv overkrydsning. Når de to krydsede strenge (vist som A og B) separeres, vil kromosomet mangle RhD-genet (C) (Flegel A. W. 2007)). RhD-alleler kan grupperes som følge af deres molekylære strukturer. For det meste viser disse grupper punktmutationer, hvilket skyldes missense, nonsense, frame-shift og splice-site mutationer. RhD-CE-D hybride alleler er ofte opstået ved genkonvertering. Ved genkonvertering sker der en udveksling mellem to eller flere homologe gener, hvorved en bestemt nukleotid sekvens på et gen, erstattes af en anden sekvens fra et gen, som er placeret på samme kromosom. Bortset fra mangel på RhD-gen, skyldes den RhD-negative fænotype hovedsagelig en serie af ændringer i RhD-genet, hvilket på skift ændrer fænotypen. Afhængig af fænotypen og dens molekylære struktur, bliver disse RhD-alleler klassificeret som enten partial D, weak D eller DEL. Disse molekylære forandringer i RhD-alleler og korrelation med fænotyperne for RhDantigenet (se tabel 1). Side 28 af 96

29 Tabel 1 Eksempler på molekylær forandring og deres effekt på D-antigenet viser hvordan D-antigenets fænotype korrelere med den molekylære struktur. Den D-negative fænotype skyldes hovedsageligt en række af disse ændringer som på skift ændre D- antigenets struktur (Flegel A. W. 2007)). Side 29 af 96

30 4 PROBLEMSTILLING Der kan forekomme variationer i det humane genom gennem mutationer, hvor nogle individer mister RhD-genet. På hver side af RhD-genet er der en RhD-boks, der kan anvendes til at detektere RhD-genets tilstedeværelse. Det mistede gen kan skyldes en skæv overkrydsning af kromosomerne, hvorefter en hybridboks er dannet. På baggrund af dette vil der blive foretaget en fænotypisk bestemmelse af RhD-blodtypen ved brug af eldonkort. Yderligere vil der foretages en genotypisk bestemmelse af RhD-blodtypen ved anvendelse af PCR-RFLP, for at kunne determinere om forsøgspersonen er homo- eller heterozygot. Bestemmelsen af denne kan eventuelt forebygge komplikationer, som immunisering, af RhD-negative kvinder med RhD-positive fostre. Nytteetiske aspekter af dette vil blive diskuteret. Side 30 af 96

31 5 FORSØGSTEORI 5.1 FÆNOTYPISK BESTEMMELSE AF RHD-BLODTYPEN VED ELDONKORT Blodtyper kan bestemmes fænotypisk ved brug af eldonkort. Eldonkort udnytter antigeners evne til at agglutinere ved interaktion med korresponderende antistoffer. På et eldonkort er der fire cirkulære felter, tre af felterne indeholder antistof-a, -B og -D, det fjerde er et kontrolfelt uden antistoffer. Ved bestemmelse af RhD-blodtypen, skal tilstedeværelsen af RhD-antigen undersøges. Indeholder en blodprøve antigen-d, vil den betegnes som RhD-positiv, hvis ikke vil den være RhD-negativ (Se figur 19) (Eldon Biologicals A/S 2008). Figur 19 Et eldonkort, som viser den fænotypiske bestemmelse af et individs blodtype. Det ses tydeligt, at individet er A+, da der sker en agglutination i felterne anti-a og anti-d, men ingen agglutination i anti-b (B228, 2014). 5.2 ISOLERING AF HUMAN DNA Formålet med denne metode er at isolerer DNA fra eukaryote celler. For at frigøre DNA, skal cellen lyseres. Ved lysering frigøres også DNAser, hvilket er enzymer der spalter DNA i mindre stykker. For at beskytte DNA imod DNAser, denatures disse (Bjerg 1976). Isolering af DNA udføres ved fire step (se figur 20). Ved første step lyseres cellerne ved anvendelse af proteinase K, ATL buffer, der indeholder natriumdodecylsulfat, AL buffer og ethanol. Proteinase K er varmestabil og nedbryder DNAser, celleorganeller og histoner, som er proteiner bundet til DNA. Natriumdodecylsulfat spalter membranerne gennem en forsæbningsproces, hvor lipider hydrolyseres til glycerol og fedtsyre, hvorved DNA frigives. AL buffer indeholder guanidinhydrochlorid, som er et salt, der medvirker til, at DNA bindes til silikapartikler. Derudover er guanidinhydrochlorid i stand til at lysere cellernes membraner, samt denaturere DNAser ved at ødelægge deres tertiære struktur. Guanidinhydrochlorid frigiver DNA ved at denaturere de tæt pakkede proteinstrukturer, hvorved Side 31 af 96

32 der dannes tilfældigt foldede proteiner. Dermed beskyttes DNA, da enzymet DNAse ikke længere fungerer (Bjerg 1976). Forskellen mellem guanidinhydrochlorid og proteinase K er, at guanidinhydrochlorid denaturerer hele proteinet, hvorimod proteinase K nedbryder selve den primære struktur ved at nedbryde peptidbindingerne i proteinet (González-Rábade et al., 2011) (QIAamp DNA Investigator Handbook. 2012). Derudover fungerer guanidinhydrochlorid også ved, at dets tilstedeværelse sikrer, at DNA strengene bindes til silikapartiklerne i spin kolonnens membran. Både silikapartiklerne og DNA er negativt ladede molekyler, og grundet hydrogenbindinger med vand vil de to molekyler ikke tiltrække hinanden ved elektrostatiske interaktioner. Ved tilførsel af guanidiniumhydrochlorid, vil der dannes bindinger mellem vand og saltet. Saltet opløses i vandet, og guanidiniumhydrochlorid har en positivt ladet NH-gruppe, der kan hydrogenbindes med vand. Dermed dehydreres DNA molekylerne og silikapartiklerne og gennem interaktion med saltets kation, som danner en bro, kan DNA bindes til silikamembranen (Biopolymer Isolation Technologies 2014). Ved andet step bindes DNA til en kunstig silikamembran ved tilsætning af AW1 og AL buffer, der også indeholder guanidiniumhydrochlorid. Resterende materiale samt kontamineringer vil igen blive denatureret og vasket ud af prøven gennem membranen. For at fjerne saltet anvendes AW2 buffer, som indeholder 70 % ethanol, der kan opløse det (QIAamp DNA Investigator Handbook. 2012). Tredje step er vask, hvor kontaminationer vaskes ud gennem membranen. Til dette anvendes ethanol, som centrifugeres gennem membranen. DNA forbliver bundet til membranen, mens alt andet løber igennem og smides ud (QIAamp DNA Investigator Handbook. 2012). Ved fjerde step frigives DNA fra membranen ved tilførsel af ATE buffer, som opløser bindingen mellem silikamembran og DNAet. DNAet elueres ved centrifugering. Handbook. 2012). (QIAamp DNA Investigator Figur 20 Procedure for oprensning af DNA fra QIAamp DNA Investigator Handbook (QIAamp DNA Investigator Handbook. 2012) Side 32 af 96

33 5.3 KONCENTRATIONSBESTEMMELSE AF DNA VED BRUG AF SPEKTROFOTOMETRI. Princippet bag spektrofotometri er at udsende lys ved en bestemt bølgelængde, samt aflæse hvor meget af lyset, der absorberes af prøvens materiale. Absorbansen er et udtryk for forholdet mellem den lysintensitet, der slipper igennem en blank prøve og den lysintensitet, der slipper gennem prøven, der testes. Absorbansen, der indgår i Lambert Beers lov, er defineret ved: Absorbans = log [ intensitet blindprøve intensitet prøve ](Simonsen 2006). Absorbansen kan bruges til at beregne et bestemt stofs koncentration via Lambert Beers lov: A A = k c l <=> c = l k Hvor c er koncentration i ng/µl af stoffet, der analyseres, A er absorbansen, k er en konstant i μl ng cm, absorbansindekset og l er lysvejen i cm (Simonsen 2006). DNA absorberer mest lys ved 260 nm, kontamineringen, organiske restprodukter, absorberer mest lys ved 230 nm og proteinerne ved 280 nm (Luebbehusen 2004). Det er derfor vigtigt at måle absorbans ved alle tre bølgelængder, for at kunne udregne, hvor høj koncentrationen af DNA der findes i prøven. Da en prøve indeholder alle tre dele, undersøges forholdene mellem dem. En optimal prøve indeholder hovedsagelig mest DNA i forhold til kontaminering og proteiner. Forholdet mellem absorbanserne ved 260 nm og 280 nm bør være cirka 1,8 (Shahriar, Haque et al. 2011). Forholdet mellem absorbanserne ved 260 nm og 230 nm bør være mellem 1,8 2,2 (NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer V1.0 User Manual. 2009). For en prøve med meget DNA bør absorbans være højeste ved 260 nm. For at udregne prøvens renhed benyttes nedenstående formel: DNA renhed = A260 A280 (NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer V1.0 User Manual. 2009) 5.4 POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR PCR-metoden anvendes til at amplificere en specifik DNA-sekvens. Til PCR anvendes DNApolymerase, som ved gentagne cyklusser kan opformere en bestemt DNA-sekvens. For at DNApolymerasen kan kopiere templaten, skal der være en primer til stede. Primere er korte DNAsekvenser fra omkring nukleotider, som bindes til templaten de steder, hvor kopieringen skal begynde. Der findes to typer af primer; forward primer og reverse primer. Forward primeren Side 33 af 96

34 er komplementær til 3 enden og læses mod 5 enden af templaten. Reverse primeren er komplementær til skabelon strengen og læses modsat. Primere designes efter deres specificitet, som er afhængig af længden af sekvensen. Med to Mg 2+ -ioner bundet mellem to aspartat molekyler fra DNA-polymerasen, kan enzymet med dets ene Mg 2+ -ion binde sig til primerens 3 - hydroxygruppe på deoxyribose-delen og med begge Mg 2+ -ionerne, binde sig til en trifosfatbro fra et deoxyribonucleotide triphosphate (dntp). DNA-polymerasen vil ved denne interaktion katalysere formationen mellem dntp og primeren, således et nyt nukleotid bliver sat på primeren og to fosfat er blevet fraspaltet (Berg, Tymoczko et al. 2012). Der skal være to primere til stede for, at kopieringen kan påbegyndes i begge retninger. Begge primere har et bindested, hvorfra de sammen med DNA-polymerasen kopier DNA-strengen til dens ende (se figur 21) (Biotech Academy 2013). Amplifikation af DNA er delt op i tre faser, som har hver deres varighed og optimumtemperatur (se figur 22) (Stilling 2004). Figur 21 Princippet om hvordan den ønskede DNA-sekvens opnås ved PCR. De to templates er vist i grå, hvor DNA-polymerase kopierer den komplimentære streng langs templaten, vist i blå. I sidste duplikering er den ønskede DNA-sekvens fremkommet, da primerne, der er vist i rød og gul, nu er overfor hinanden (inspiration (Biotech Academy 2013)). I første fase denatureres brintbindingerne i DNA-strengen ved opvarmning. I anden fase, annealeres de to primere og binder sig til hver deres komplementære DNA-streng. I tredje fase udføres elongering, hvor temperaturen hæves for at opnå et temperaturoptimum for DNApolymerasen. Dette fører til katalysering af nye komplementære DNA-strenge (Stilling 2004). PCR amplificering af den specifikke DNA-sekvens foregår eksponentielt og kan stoppes ved ændring i temperaturen (Biotech Academy 2013). Side 34 af 96

35 Figur 22 De tre faser i en PCR cyklus; opvarmning, annealing og elongering (extension) (inspiration (Biotech Academy 2013)). 5.5 ADSKILLELSE AF DNA-FRAGMENTER VED GELELEKTROFORESE PCR produktet kan herefter anvendes til gelelektroforese, når der ønskes en genotypisk bestemmelse af DNA-prøven. DNA-molekyler tiltrækkes af den positive ende af et gelkar. Et gelkar er opbygget af en katode i den ene ende og en anode i den anden, som udgør et elektrisk felt. Dette princip kaldes elektroforese. Molekylernes vandringshastighed og adskillelse afhænger af gelens viskositet og DNA-fragmentets størrelse. Hastigheden for molekylerne er bestemt ved: v = E z f Hvor strømstyrken betegnes som E, molekylets ladning som z og friktionskoefficienten af mediet som f. Friktionskoefficienten afhænger af gelens viskositet (Berg, Tymoczko et al. 2012). Ved molekyler, der er ensartede og under konstant strømstyrke, vil hastigheden afhænge af friktionskoefficienten. DNA indeholder en negativt ladet fosfordiester for hvert DNA og vil derfor vandre mod anoden. Ved analyse af DNA fra omkring kilobase (kb) i længde benytter man sig af en gel, der indeholder agarose og buffer med lav ionstyrke (Berg, Tymoczko et al. 2012, Stilling 2004). Agarosegelen er et porøst medium, der tillader DNA at kunne vandre. Forholdene, under hvilke gelelektroforesen foretages, er stærkt denaturerende, hvilket vil sige, at det Side 35 af 96

36 dobbeltstrengede DNA denatureres til enkeltstrenget. Ved tilsætning af en DNA-markør med DNA fragmenter af kendt længde, kan de egentlige DNA-prøvers fragmentlængder bestemmes ved sammenligning med denne. Da det kan være svært at se båndende, tilføres der ethidiumbromid, som kan binde sig til DNA og kan ses ved UV-belysning (Stilling 2004). 5.6 PCR-RFLP Restriction-fragment-length polymorfism (RFLP) er betegnelsen for mutationer som; single-, double- eller triple-nukleotid-polymorfismer, der sker de steder i DNA, hvor konsekvensen bliver en ændring i DNA fragmenters længde, produceret af de rette restriktionsenzymer (Berg, Tymoczko et al. 2012). Denne metode anvendes til at detektere RhD-hybridboksen, som via deletion og insertion mutationer har mistet RhD-genet og dannet SNP som restriktionsenzymerne klipper ved. Under PCR-RFLP metodens første trin amplificeres det DNA, der ønskes undersøgt. Under andet trin udsættes det amplificerede DNA for de(t) rette restriktionsenzym(er). Sammenlignes to prøver; én hvor DNA ikke klippes og én hvor en SNP resulterer i, at DNA klippes, vil der være en prøve med to DNA fragmenter af mindre længde og en anden prøve med ét langt DNA fragment (Rasmussen 2006). 5.7 FORSØGSDESIGN Forsøget er designet efter princippet som beskrevet i Genetic mechanisms of Rhesus box variation af Wagner, Moulds og Flegel fra Forsøget udføres for at bestemme RhD genotypisk ved anvendelse af PCR til at isolere RhD-gensekvenser, som koder for de tre RhDbokse; upstream-, downstream- og hybridbokse (se figur 23, A og B) PCR amplificerer en del af downstream RhD-boksen, hvilket er et fragment på omkring 3100 bp. Upstream RhD-boksen vil ikke blive amplificeret, fordi reverse primeren, kun vil binde sig til downstream DNA-fragmenter og hybridboks fragmenter (Wagner, Moulds et al. 2005). Reverse primeren vil ikke binde sig til upstream, da sekvensen, hvor primeren vil binde sig, mangler fire basepar. Forward primeren binder sig til alle tre RhD-bokse (Wagner, Moulds et al. 2005). Mangel på RhD-genet detekteres ved hybridboksen, som er sammensat af upstream og downstream fragmenter, ved brug af PCR- RLFP. Der vil blive tilført restriktionsenzym, Pst1, der har tre skæringssites i hybridboksen, to skæringssites i downstream og tre skæringssites i upstream (se figur 23) (Wagner, Moulds et al. 2005). Side 36 af 96

37 Figur 23 Basesekvensen for de DNA-fragmenter af RhD-boksene, der amplificeres, samt det tilsvarende DNA-fragment fra upstream RhD-boksen, der ikke bliver amplificeret. Øverste streng viser downstream RhD-fragmentet, strengen i midten viser upstream RhD-fragmentet og den nederste streng viser Hybrid RhD-fragmentet. Forward primeren (FP) passer med alle tre fragmenter, mens reverse primeren (RP) kun passer med hybrid- og downstream RhD-fragmenter. Skæringsites er vist med sorte lodrette streger på RhD-fragmenterne. [ ] tages ud og kigges nærmere på, hvor basesekvensen er vist (inspiration (Wagner, Moulds et al. 2005)). Upstream RhD-boksen har en SNP, der adskiller den fra downstream RhD-boksen. Denne SNP er en enkelt adenin i stedet for guanin, som medfører til endnu et skæringssite for Pst1. På den måde fås der fragmenter af forskellige størrelser af hybridboksen og downstream boksen (Se figur 24). Figur 24 Billedet A illusterer RhD-genet på bp, hvorpå upstream boks er rød og downstream boks er blå. RHCE-genet er modsatrettet og SMP1 adskiller generne. Upstream og downstream boksen er 9000bp lange. Billedet viser, hvor en forward primer (FP) og reverse primer (RP) binder til upstream og downstream boksene. Billede B viser en hybridboks, der er sammensat af dele fra upstream og downstream bokse, samt hvor primerne binder sig. (Wagner, Moulds et al. 2005). Side 37 af 96

38 Fragmenterne separeres ved gelelektroforese afhængigt af RhD-genotype. Ved RhD-negativ genotype vil prøven indeholde to hybrid RhD-bokse, som begge vil vise fire bånd; 1888 bp, 564 bp, 397 bp og 179 bp. Ved RhD-positiv homozygot genotype vil prøven indeholde to downstream RhD-bokse, der begge vil vise tre bånd; 1888 bp, 744 bp og 397 bp. Ved RhD + /RhD - heterozygot genotype vil en downstream og en hybrid RhD-boks være til stede, disse vil vise fem bånd; 1888 bp, 744 bp, 564 bp, 397 bp og 179 bp, da det er en kombination af de to bokses fragmenter (se figur 25) (Wagner, Moulds et al. 2005). Figur 25 Separation af de amplificerede RhD-fragmenter ved gelelektroforese. Under gelen er de forskellige genotyper vist. Lille d er betegnelsen for manglen på RhD-genet. Store D er betegnelsen for RhD-genets tilstedeværelse. Store C og E, samt lille c og e er betegnelsen for forskellige variationer af RHCE-genet. Prøverne i brønd 1 til 3 er RhD negative homozygote, da der ses et lille d i hver allel samt fragmenter på 564 bp og 179 bp, som er synlige i stedet for ét stort på 744 bp. Brønd 4, 5 og 6 viser RhD+/RhDheterozygot genotype, da alle nævnte fragmenter er synlige og har både lille d og store D i hver allel. Brønd 7, 8 og 9 viser RhD positiv homozygot genotype, da der optræder et fragment på 744 bp, men ingen fragmenter på 564 bp eller 179 bp og har store D i hver allel. Yderste brønd til venstre viser DNA-markøren, hvor to bånd på henholdsvis 800 bp og 100 bp er vist (Wagner, Moulds et al. 2005). Side 38 af 96

39 6 MATERIALER OG METODER Der blev anvendt eldonkort til at bestemme blodtypen af fem forsøgspersoner. Forsøgene blev udført som beskrevet i producentenes manual. Eldonkortene kom fra kittet: Eldon school kit, SKS (se bilag 1). DNA oprensning blev foretaget ved brug af mundskrab udtaget med swab-vatpind. Producentens manual blev fulgt. Prøven blev lyseret med proteinase K og ATL-buffer (39,1w/v %), hvor proteinase K s slutkoncentration var 8 mau. Prøven blev centrifugeret mellem hvert step ved 6000xG bortset fra sidste step hvor der anvendtes xG. Først blev prøven inkuberet ved 56 o C i en time. AL-buffer (39,1w/v %) blev tilført og prøven opvarmet ved 70 o C i 10 min og tilført 70 % ethanol. AW1- og AW2-buffer blev tilført for at binde DNA og prøven vakses ved tilførsel af 70 % ethanol. I sidste step elueres prøven ved tilførslen af ATE-buffer og inkuberet ved roomtemperatur (RT) (se bilag 1.2). Der blev støbt en 1 % agarosegel til gelelektroforese. DNA-prøverne tilsættes DNA-loading buffer, som indeholder et fluorescerende reagens. Gelen blev placeret i et gelelektroforesekar, hvor DNA-prøver og 1 kb DNA markør SM0313 fra thermo scientific blev tilsat. Der anvendtes 90 V i cirka 45 minutter og et UV-billede af gelen blev taget (se bilag 1). Koncentrationen af DNA blev bestemt med nanodropspektrofotometer og prøver triplebestemmes. Nulprøver blev foretaget med milliq vand og med ATE-buffer (se bilag 1). Der blev udført PCR, hvor kittet Long PCR enzyme mix K0181 anvendes. Der tilføjes rez7 og rnb31 primer samt et mastermix bestående af Long PCR buffer med 15mM MgCl, 2mM dntp mix og 2,5u Long PCR enzyme mix, hvor der indgik Fermentas Taq DNA polymerase og en varmestabil DNA polymerase. Hver prøve havde en primer-slutkoncentration på 14 µm. PCR-apparatur var indstillet til at anvende følgende program, dette varede 2 timer og 13 minutter (Se tabel 2) (se bilag 1). Side 39 af 96

40 Tabel 2: PCR-program brugt til amplificering af RhD-genet. Temperatur Tid Cyklusser 94⁰C 3 min 1 95⁰C 20 sec 60⁰C 30 sec 10 68⁰C 135 sec (45 sec / kb) 95⁰C 20 sec 60⁰C 30 sec 68⁰C 135 sec (45 sec / kb) +2*s 20 /cycle 68⁰C 10 min 1 4⁰C Pause Side 40 af 96

41 7 RESULTATER 7.1 FÆNOTYPISK BESTEMMELSE AF BLODTYPERNE AB0 OG RHESUS Blodtyper er bestemt ved eldonkort. På figur 26 ses fem eldonkort, hvor nummer 1, 2,3 og 4 blev udvalgt til senere DNA oprensning. Nummer 1 er B+, nummer 2 er A+, nummer 3 er O- og nummer 4 er O+. Eldonkort nummer 5 var for utydelige til at kunne aflæses. Figur 26 Eldonkort 1 viser agglutination i felterne anti-b og anti-d. Eldonkort 2 viser agglutination i anti-a og anti-d. Eldonkort 3 viser ingen agglutination i anti-a, B eller D. Eldonkort 4 viser ingen agglutination i anti-a og B, men agglutinerer i anti-d. Eldonkort 5 kan ikke bestemmes. 7.2 DETEKTION AF PRØVERNES DNA KONCENTRATIONER EFTER DNA-OPRENSNING Det var nødvendigt at undersøge prøverne for tilstedeværelse af DNA. Dette blev gjort ved agarose gelelektroforese. Ud fra UV-billedet af gelen (se figur 27) fremgår det, at prøve 4 indeholder mere DNA end prøve 1 og prøve 2, men prøve 3 har den højeste koncentration af DNA af de fire prøver. Deraf kan det udledes, at alle fire prøver indeholdt genomisk DNA, men med forskellig DNA koncentration. Side 41 af 96

42 Figur 27 UV-billede af gel: Placeringen af prøverne 1, 2 3 og 4 efter DNA-oprensningen fra mundskrab. Alle prøver indeholder DNA og kan ses som bånd, som bevæger sig igennem gelen. Den første brønd fra venstre indeholder 1kb DNA-markør. 7.3 KONCENTRATIONSBESTEMMELSE AF DNA I PRØVE Koncentrationsbestemmelse af DNA blev udført ved spektrofotometri og der var et total volumen på 50 µl i hver prøve. Der blev foretaget en triplebestemmelse af DNA koncentrationen for hver prøve og gennemsnittet blev anvendt til grafisk illustration. Da standardafvigelserne var meget lave, er disse ikke medtaget på graferne. Prøve 1 indeholdt totalt ng DNA efter DNA oprensningen. Der blev detekteret et lavere niveau af kontaminering og proteiner i forhold til DNA. Efter PCR indeholdt prøve 1 totalt ng DNA, hvilket er cirka 145 gange så meget DNA som før og der blev igen detekteret et lavere niveau af kontaminering og proteiner i forhold til DNA. Prøve 2 indeholdt totalt ng DNA efter DNA oprensningen, der blev detekteret et højere niveau af kontaminering og lavere niveau af proteiner i forhold til DNA. Efter PCR indeholdt prøve 2 totalt ng DNA, hvilket er cirka 40 gange så meget DNA som før og nu blev der detekteret et lavere niveau af kontaminering og proteiner i forhold til DNA. Prøve 3 indeholdt totalt ng DNA efter DNA oprensningen, der blev igen detekteret et højere niveau af kontaminering og lavere niveau af proteiner i forhold til DNA. Efter PCR indeholdt prøve 3 totalt ng DNA, hvilket er cirka 34 gange mere DNA end før og der nu blev detekteret et lavere niveau af kontaminering og proteiner i forhold til DNA. Prøve 4 indeholdt totalt ng DNA efter DNA oprensningen og der blev detekteret et lavere niveau af kontaminering og proteiner i forhold til DNA. Efter PCR indeholdt prøve 4 totalt ng DNA, hvilket er cirka Side 42 af 96

43 109 gange mere DNA end før og der blev igen detekteret et lavere niveau af kontaminering og proteiner i forhold til DNA. I tabel 3 nedenfor kan resultaterne for DNA koncentration, absorbans og forhold ses for hver prøve. Tabel 3 Koncentration og renhedsforhold for oprenset og amplificeret DNA fra fire forskellige prøver. Der er lavet grafer over hver prøves absorptionsspektrum, som kan ses i bilag 4. Som eksempel er der her givet to grafer for prøve 3. Den ene efter oprensning af DNA (se figur 28) og den anden efter PCR (se figur 29). Figur 28 viser tydeligt en top ved 230 nm, hvilket betyder prøven indeholder meget kontamination i forhold til figur 29, som topper ved 260 nm, hvilket betyder at der nu er mest DNA i prøven. Side 43 af 96

44 10mm lysvej ABS 10mm lysvej ABS Aalborg universitet 9 8 Prøve 3 2µl oprenset DNA opløsning koncentrationsbestemt ved spektrofotometri. Absorbans spektrum nm. Gennemsnit af triplebestemmelse Figur 28 Graf over prøve 3 efter oprensning af DNA. nm 80 Prøve 3 - efter PCR 2µl amplificeret DNA opløsning koncentrationsbestemt ved spektrofotometri. Absorbans spektrum nm. Gennemsnit af triplebestemmelse Figur 29 Graf over prøve 3 efter PCR. nm Side 44 af 96

45 7.4 DETEKTION AF RHESUS BOKSE EFTER PCR Ved gelelektroforese vil vi identificere RhD-bokse kvalitativt for hver prøve. Dette gøres ved detektion af RhD-boksene efter PCR, hvor UV-billede af gelen på figur 30 kan vise de ønskede DNA fragmenters sekvens, hvis de er tilstede. Desværre var der ingen ønskede bånd at se og al DNA ligger i sidste bånd på gelen. Dette skyldes sandsynligvis den høje mængde primer, som blev tilsat prøven inden PCR ved en fejltagelse (Sønderkær 2014). Havde der været brugbare resultater, ville gelelektroforesen afhængigt af genotype have vist ét, to eller tre bånd for hver prøve. De tre mulige bånd ville indikere henholdsvis upstream RhD-boks (1942 bp), downstream RhD-boks (1945 bp) eller hybrid RhD-boks. En heterozygot genotype vil vise tre bånd, en homozygot negativ genotype vil vise ét bånd og en homozygot positiv genotype vil vise to bånd (Wagner, Moulds et al. 2005). Figur 30 UV billede af gel efter PCR, hvor prøve 1, 3, 4 og DNA-markøren fremgår. Prøve 2 mangler da den blev tilført forkert. Side 45 af 96

46 8 DISKUSSION Blodtype blev bestemt ved eldonkort, DNA blev oprenset, men identifikation af RhD-bokse ved PCR mislykkedes. Eldonkort fungerede ikke i første forsøg og blev gentaget. Det kan skyldes at eldonkortene var tæt på deres udløbsdato og at der blev tilført for meget blod på de fire felter i første forsøg. For meget blod kan have indflydelse på agglutinationen. I andet forsøg blev der tilført mindre blod på kortet, hvilket gav brugbare resultater. I resultaterne er der to prøver, der har højere koncentration end de andre. Forskellen i koncentrationen mellem prøverne kan skyldes at prøverne, med de laveste koncentrationer, fik tilført ATL-buffer før proteinase K. Dette kunne medføre, at cellemembranerne blev nedbrudt og DNAser havde mulighed for at denaturere DNA i 3 minutter, inden proteinase K blev tilsat. Det oprensede DNA skulle have stået ved -20 C, men inden det blev stillet i fryseren, stod det en time ved stuetemperatur. Det har derfor været muligt, at noget af DNA fra prøverne har været nedbrudt. Kvaliteten af oprenset DNA kan påvirke effektiviteten af PCR. Den høje koncentration af DNA og blank prøven efter PCR kunne skyldes, at primer koncentrationen var 14 gange så høj som anbefalet, grundet en beregningsfejl. Dette har kunnet medføre, at primerne har virket som inhibitorer for PCRen. Primerne kunne binde sig til hinanden, hvorved der opstår primer dimere, eller til specifikke og uønskede steder på templaten (Carracedo 2005). For at opnå bedre resultater i PCRen, ville det have været hensigtsmæssigt at optimere på en række faktorer. En af faktorerne der kunne have indflydelse på PCR, er koncentrationen af DNA template. For meget template kan føre til enten uønsket PCR produkt eller uspecifik binding af primer på template og dermed få synteseret uønsket eller intet PCR-produkt (Carracedo 2005). Andre faktorer, der kunne påvirke kvaliteten af PCR, er primer og Mg 2+ ion koncentrationen. Da der efterfølgende blev lavet tilsvarende forsøg med justeret koncentrationen af primer og en kombination af tre koncentrationer Mg 2+ (1,5mM, 4mM, 6 mm), 2U DNA-polymerase og to template koncentrationer (220ng, 22ng), førte dette heller ikke brugbare resultater og det er derfor sandsynligt, at det ikke har været Mg 2+ - eller template-koncentrationer, der har været grunden til de manglende resultater. En mulighed er at justere på koncentrationen af dntp. Hvis dntp koncentrationen er for høj, vil dette medføre at Mg 2+ -ionerne, der fungerer som cofaktorer for DNA-polymeraserne, bliver opbrugt for hurtigt, mens en for lav koncentration af dntp vil reducere PCR produkterne, da der hurtigt vil blive mangel på nukleotider til opbygning af nyt Side 46 af 96

47 DNA. I begge tilfælde vil DNA-syntesen hurtigt ophøre (Rad 2013). Hvis koncentrationen af DNA polymerase har været for lav, ville dette resultere i et slutprodukt, der ligeledes er for lavt, da der er alt for lidt af prøvernes DNA, der bliver replikeret. Kontaminering i det oprensede DNA produkt har ligeledes kunnet være en faktor for det dårlige resultat, da kontaminering kan fungere som inhibitor for DNA polymerasen. Det er også muligt, at de primers, der blev benyttet, ikke har været designet rigtigt til de DNA fragmenter, der skulle amplificeres. Er primerne ikke i stand til at binde til det rigtige sted på DNA-fragmentet, vil det ønskede DNA fragment ikke kunne amplificeres. Det vil således resultere i en stor mængde løse primere og en lille mængde DNA. Dermed vil gelelektroforesen vise en masse fragmenter ved anoden. En yderligere parameter, der kunne have en indflydelse ved vores resultater af PCR, er længden af primere. Specificiteten af primere er afhængig af længden af sekvensen, som typisk ligger mellem nukleotider, for primere anvendelig til PCR (Stock 2009). Forsøget var lavet efter inspiration af Wagner, Moulds og Flegel, men adskilte sig på visse punkter fra det forsøg, de havde foretaget. Først bestod deres prøver af blod fra bloddonorer, hvor dette forsøgs prøver var taget ved mundskrab. Dette har ikke været årsagen til vores manglende resultater, fordi der er det samme DNA i celler fra munden som celler fra blodet (Reece, Urry et al. 2009). Wagner, Moulds og Flegel, udførte en PCR RFLP, hvor denatureringstemperaturen var på 94 C, mens der i vores forsøg blev udført en PCR med en denatureringstemperatur på 92 C. Yderligere havde Wagner, Moulds og Flegel en annealingstempertur på 65 C, hvor annealingstemperaturen i vores forsøg blev udført ved 60 C. Hvis annealingstemperaturen er for lav, binder primerne uspecifikt til templaten, hvilket vil føre til, at det ønskede fragment ikke bliver amplificeret. Derudover har Wagner, Moulds og Flegel, udeladt mange informationer om tidstagning på PCR steps, reagenser og template- og primerkoncentrationer. Heraf er det muligt, at deres forsøg har adskilt sig fra vores forsøg på flere måder end beskrevet ovenfor. En mulighed for et nyt forsøg indebærer nye primerdesigns. Herunder skal der tages højde for en række forskellige parametre som primerens længde, smelte temperatur og basesekvens (Premier Biosoft ). I dette forsøg kunne det blandt andet være af interesse at reducere amplikonets længde. Dette amplikon skal indeholde det varierende skæringsite for Pst1. De nye primere skal derfor amplificere DNA sekvenser fra de samme bokse som før. Der er fundet en ny Side 47 af 96

48 sekvens, hvor det er muligt for en reverse primer at binde til DNA. Amplikonets længde reduceres med omkring 1100 bp (se figur 31). Figur 31 Sekvensen hvor en ny reverse primer kan binde sig til downstream og hybrid RhD-boks-templates (indenfor den blå firekant) (Wagner, Moulds et al. 2005)). Da man ved primerdesign skal undgå gentagelser på mere end fire baser, vil der her kunne opstå komplikationer, da der er fire efterfølgende thymin baser i sekvensen (Premier Biosoft ). Den mest hensigtsmæssige måde at udføre vores forsøg på, kunne have være at amplificere en DNA-sekvens, hvori kun det specifikke skæringssite indgår. Årsagen til dette ikke kan lade sig gøre er, at der ikke findes steder på en sådan sekvens, hvor forward eller reverse primer kan binde sig til downstream- og hybrid RhD-boksen, kan de ønskede DNA-sekvenser ikke amplificeres (Premier Biosoft ). Side 48 af 96

49 9 KONKLUSION Formålet med forsøgene var først at bestemme RhD-blodtypen fænotypisk og derefter genotypisk, ved hjælp eldonkort og PCR-RFLP. Første gang forsøgspersonernes fænotype blev bestemt, virkede eldonkortene ikke, så forsøget blev gentaget. Ved andet forsøg blev alle forsøgspersoners fænotype bestemt. Den genotypiske bestemmelse af forsøgspersonerne mislykkedes. Dette kunne skyldes at koncentrationen af primere og kontaminering i prøven var for høj. Forslag til optimeringen af den genotypiske bestemmelse af RhD-blodtypen fremgår i diskussionen. Side 49 af 96

50 10 KONTEKST ANALYSE Der er altid risici forbundet med graviditet, ved % af alle graviditeter aborterer kvinden naturligt eller en dødsfødsel forekommer (Bergholt 2013). Ud over de sædvanlige risici under graviditet og fødsel har RhD-negative kvinder, der føder RhD-positive børn, en ekstra risiko. Under den første fødsel vil der være 2-16 % risiko for, at den RhD-negativ kvinde bliver immuniseret (Bergholt 2014). Immunisering kan klassificeres forskelligt afhængig af hvordan det er opstået. Immuniseringen, der kan forekomme mellem en RhD-negativ mor og et RhD-positiv foster kaldes aktiv immunisering. Aktiv immunisering kan opstå når kroppen første gang bliver udsat for fremmede antigener og danner antistoffer mod dem. Næste gang kroppen udsættes for samme antigener, vil kroppen via immunforsvaret gå til angreb på antigenerne (Martini, Nath et al. 2012). Det vil skabe komplikationer for kvinden, hvis hun igen føder et RhD-positivt barn. Under fødslen af første barn, kan risikoen for immunisering opstå når moderens og fosters blandes. Efter fødslen kan moderen havde udviklet antistoffer mod det positive RhD-gen. Under anden graviditet med et RhD-positivt barn, hvis immunisering er opstået, vil fosteret og moderens blod blandes allerede i livmoderen. Moderens antigener vil angribe barnets erytrocytter, hvilket vil tvinge fostret til at omdanne knoglemarv til erytrocytter, hvilke risikeres at blive sendt i blodbanen, før de er færdigudviklede. Når kvindens immunforsvar går til angreb på barnet, på den måde, kan det risikere at dø grundet hæmolytisk anæmi. Ved hæmolytiske tilstande opstår blodmangel, da der ikke dannes tilstrækkelige mængde erytrocytter og nye erytrocytter ikke dannes hurtigt nok for barnets system kan følge med. (Martini, Nath et al. 2012, Rasmussen 2006). I Danmark tilbydes alle gravide RhD-negative kvinder, som venter et RhD-positivt barn, at blive behandlet med antistof-d for at forebygge immunisering. Behandlingen er en indsprøjtning med mg antistof-d i graviditetens 29. uge og yderligere 72 timer efter fødslen. Behandlingen med antistof-d virker kun for én graviditet af gangen, bliver kvinden gravid igen, gentages behandlingen (Johnson, 2006). Antistofindsprøjtningen tilbydes også til RhD-negative kvinder, der har fået enten en spontan eller provokeret abort efter ottende uge. Forekommer en alvorlig immunisering, hvor barnet viser tegn på hæmolytisk anæmi, vil der blive foretaget et kejsersnit (Bergholt 2014). Side 50 af 96

51 I et interview med en anonym kvinde, på 29 år fra Nordjylland, fås et indblik i hendes tanker om komplikationerne ved at være RhD-negativ og ønsket om børn. Kvindes blodtype er 0 - og har prøvet at blive gravid i 4 år, hun har modtaget fertilitetsbehandlinger, som førte til en graviditet udenfor livmoderen, dette ledte til en provokeret abort, hvor hun derefter blev behandlet med anti-d. Hendes erfaring med behandling og lægens formidling af informationer vedrørende hendes situation, var tilfredsstillende. Kvinden fik givet en indsprøjtning med anti-d efter sin abort, dette følte hun var tilstrækkeligt på det pågældende tidspunkt. Det var nok, i denne situation, for kvinden at vide, hvad det var hun fik indsprøjtet i kroppen og hvad grunden var til, at hun skulle stikkes. Kvinden blev ikke psykisk påvirket af at få at vide, at behandlingen vil være nødvendig ved fremtidige graviditeter. Selvfølgelig skabte det et ønske om at være som RhDpositive gravide, som ikke har det samme behov for behandling. Det er ikke noget hun græder over, men i ny og næ når kvinden tænker på børn er det en nedslående tanke. Hun mener selv, at årsagen til hendes reaktion og tanker omkring eventuel fremtidig graviditet, afhænger af, at hun ikke kender alle komplikationer, som kan opstå i forbindelse med graviditeten. Dette har dog ikke indflydelse på hendes lyst til at få børn. Kvindes største bekymring er ikke den mulige immunisering, som fører til hæmolytisk anæmi. Kvinden bekymrer sig mest over, at skulle få et handicappet barn, som ikke er sundt og raskt. I stedet for at se komplikationerne ved immunisering som en ulempe, ser hun det som en beroligende faktor. Hun føler der vil være mere opmærksomhed omkring hendes graviditet end ved en graviditet hos en RhD-positiv gravid kvinde. RhD-negative gravide tilbydes i cirka 25. uge at få taget en blodprøve, hvorfra det er muligt at bestemme fostrets RhD-blodtype. Både kvinden og hendes kæreste mener, at det er alt for lang ventetid, der burde udarbejdes en metode, hvorpå fosteret blodtype kan identificeres på et meget tidligere tidspunkt. Som hun siger: Man går jo med tanker, så jo tidligere jo bedre for kvinden. Da komplikationer kan være alvorlige, kan der være behov for støtte i hverdagen. Kvinden mener, at hun har behov for støtte, i form af at kunne diskuterer emnet frit, at hendes partner viser anderkendelse af, at de går igennem det sammen og trygheden i at vide, at komplikationer ikke vil påvirke deres forhold. Kvindens partner tager det stille og roligt, og mener at de tager det som det kommer. Han har ikke behov for at blæse det op til noget stort, da han mener det jo også kunne være ham der var noget galt med. For at forebygge komplikationerne, vil kvinden som det første forhøre sig hos lægen, få samtaler med sagkyndige og information Side 51 af 96

52 omkring svangerskabsforløbet, hvilket hun mener, er det vigtigste i forbindelse med en eventuel fremtidig graviditet (Kvinde 2014). Ud fra debatindlæg på diverse debatsider for gravide; min-mave.dk, babyklar.dk, netsundhedsplejerske.dk og lignede, er det tydeligt, at det ikke er alle RhD-negative kvinder, der føler, at de får den nødvendige information omkring deres situation. Der er flere kvinder, der virker usikre omkring forløbet; hvorfor de får anti-d indsprøjtninger, hvornår de skal have dem og hvor længe de virker. Flere af kvinderne beretter, at de er utrygge eller kede af det, efter at have forladt lægen, fordi de er bange for, at der sker deres barn noget. Flere af kvinderne får at vide, at de antistoffer, der kan være dannet i deres krop under den første graviditet, ikke påvirker dem, men ikke alle får at vide, at de skal have behandling igen ved kommende graviditeter. Kvinderne, der deltager i disse debatter, virker ikke informeret om de generelle elementer i forbindelse med deres graviditet. Størstedelen af de kvinder, der deltager i debatterne, men allerede har født fortæller, at de ikke har oplevet nogen komplikationer efter den første graviditet og behandling. Der er få, der beretter om, at behandlingen ikke virkede for dem, og at de endte med et meget sygt barn, men det er et mindretal, der har oplevet dette. De gravide RhD-negative kvinder i januar 2010 fik udleveret et brev, efter de havde fået taget blodprøver i 25. uge. Det er den blodprøve, der tages for at bestemme barnets blodtype (Sundhedsstyrelsen 2010). Dette brev beskriver behandlingsforløbet, og hvorfor kvinderne bliver tilbudt behandlingen. Omkring 15 % af alle gravide i Danmark er RhD-negative og har omkring 60 % risiko for, at barnet er RhD-positivt (Wienecke 2013). I 2013 blev der født børn i Danmark (Danmarks Statistik 2014), ses der bort fra flerfødsler, vil 15 % af de børn i princippet være født af en RhD-negativ mor. Herudaf er cirka kvinder RhD-negative, cirka af dem vil føde et RhD-positivt barn. 101 til 805 af disse kvinder risikerer at være blevet immuniseret efter fødsel. Antallet af kvinder, der bliver immuniseret, ligger tættere på de føromtalte 2 % end de 16 %. Det kan give komplikationer ved andengangsfødsel af et RhD-positivt barn. I Danmark forekommer der omkring 100 tilfælde om året, hvoraf kun 10 af dem er alvorlige (Bergholt, 2013). Altså vil omkring 100 familier årligt risikerer komplikationer i forbindelse med anden graviditet, hvis der ikke bruges penge på behandling. Tages der udgangspunkt i tallene fra før og det faktum, at alle Side 52 af 96

53 RhD-negative gravide får tilbudt behandling, blev omkring flere kvinder, end der var behov for, behandlet med antistof-d i I 2010 blev RhD-negative gravide kvinder tilbudt en analyse af fosterets blodtype i 25. uge (Sundhedsstyrelsen 2013). På grund af teknologien til rådighed betød det, at kvinden skal dukke op på hospitalet. Da ordningen trådte i kræft blev der brugt 5,9 millioner kroner på udstyr til blodtypebestemmelser. Desuden bruges der hvert år 3,9 millioner til driften af blodtypebestemmelserne og 4,4 millioner til det administrative. Altså er 14,2 millioner, blevet brugt på henholdsvis at forebygge og behandle omkring kvinder, hvoraf 100 reelt havde behov for det. Udgifterne stopper ikke der, da der i de efterfølgende år bruges 8,3 millioner på at opretholde ordningen (Tidsskrift for Jordemødre 2014). Kigges der nytteetisk på problemet, kan der stilles spørgsmål ved om ikke pengene, der er brugt på at overbehandle omkring RhD-negative kvinder, ikke kunne være blevet brugt bedre. Deles de 14,2 millioner mellem de cirka kvinder, der i teorien modtager behandling, blev der brugt cirka kroner på hver af de cirka kvinder i 2010 (Tidsskrift for Jordemødre 2014). Året efter blev der brugt omkring kroner per kvinde, da udstyret til behandlingen allerede var købt i 2010 (Sundhedsstyrelsen 2010). Der bruges dermed omkring 40 % færre penge på behandlingen af kvinderne allerede på andet år af ordningen. Selvom der bruges færre penge på behandling af kvinderne, bruges der stadigvæk en del penge på overbehandling, hvilket efterlader rum til forbedring (Tidsskrift for Jordemødre 2014). Det sker årligt, at nogle tusinde kvinder behandles for noget, hverken de eller deres børn påvirkes af. Kunne pengene tænkes at gøre mere gavn i forskning indenfor for eksempel kræft, når hver tredje dansker får kræft (Dreier 2013). Omvendt er det muligt, at antallet af immuniseringer er så lavt, fordi der tages forholdsregler i form af behandling med antistof-d. Det fremgår tydeligt af debatsiderne, at der er behov for bedre formidling omkring komplikationer ved immunisering og behandling tidligt i forløbet. Den tilsyneladende eneste dokumentation de får fra lægen til deres bopæl er et brev, som indeholder de overordnede og vigtige informationer, hvilket kan være grunden til, at kvinder, der er mindre end 25 uger henne, Side 53 af 96

54 stiller spørgsmål på de omtalte debatsider. Den manglende information kan gøre dem desperate efter svar, hvilket kan medføre, at de rådgiver hinanden forkert i debatterne. I interviewet med kvinden fremgår det, at hun mener, at der ved provokeret abort informeres tilstrækkeligt og føler sig bevidst om, at hun har behov for hjælp for at kunne gennemføre en graviditet. I interviewet beskriver kvinden, hvad hun har brug for i hverdagen for at føle sig sikker ved situationen. Hun har behov for støtte fra sin partner, samt information fra lægen om forløbet under en eventuel fremtidig graviditet. Ud fra hendes kommentar til den nye ordning, som startede i 2010, er 25 uger for langt ventetid for at få bestemt sit fosters blodtype. For at forbedre hendes psykiske udfordringer under en eventuel graviditet, kunne der udarbejdes en metode, hvorpå blodtypen kan bestemmes tidligere i forløbet. Kvindes mener, at en forbedring til hendes forløb efter den provokerede abort kunne have været, at lægen havde henvist hende til en specialist, bog eller hjemmeside, hvor hun selv kunne have fundet mere information omkring hendes situation. Side 54 af 96

55 11 LITTERATURLISTE QIAamp DNA Investigator Handbook NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer V1.0 User Manual Wilmington, U.S.A: Thermo Fisher Scientific Inc. AGGER, R., NILSEN, H.C., LESLIE, G. and AASTED, B., Immunologi. 1.udgave edn. København: Munksgaard Danmark. ARZOUMANIAN, L., Tech Talk - What are the causes? What is hemolysis. 2(2),. ATTWOOD, T.K., CAMPBELL, P.N., PARISH, J.H., SMITH, A.D., STIRLING, J.L. and VELLA, F., Oxford dictionary of Biochemistry and Molecular Biologi. 2 edn. Oxford: Oxford university Press. AVENT, N.D., MADGETT, T.E., LEE, Z.E., HEAD, D.J., MADDOCKS, D.G. and SKINNER, L.H., Molecular biology of Rh proteins and relevance to molecular medicine. Expert Reviews in Molecular Medicine, 8(13), pp BERG, J.M., TYMOCZKO, J.L. and STRYER, L., Biochemistry. 7 edn. New York: W. H. Freeman & company. BERG, J.M., TYMOCZKO, J.L. and STRYER, L., The Immune System. Biochemistry. 7. edn. USA: W. H. Freeman & Company, pp BERGHOLT, T., 2014-last update, Rhesus immunisering i graviditeten. Available: [05-15, 2014]. BERGHOLT, T., 2013-last update, At miste en graviditet i andet trimester. Available: [05-15, 2014]. BIOPOLYMER ISOLATION TECHNOLOGIES, L., 2014-last update, Silica Membrane Spin Columns. Available: [05-19, 2014]. BIOTECH ACADEMY, 2013-last update, Evolution blandt bakterier. Available: [04-06, 2014]. BIOTECH ACADEMY, 2013-last update, PCR (Polymerase Chain Reaction). Available: [05-04, 2014]. Side 55 af 96

56 BJERG, M., DNA oprensning fra FFPE væv med NucliSens metoden, København Professionshøjskolen Metropol. CARRACEDO, A., DNA Typing Methods. In: R.B. WEISBERG, ed, Forensic DNA Typing Protocols. Totowa, New Jersey: Humana Press Inc., pp. 5. CLARK, J., 2013-last update, Figur 9. Available: [03-03, 2014]. CNX BIOLOGY, 2014-last update, Figur 10. Available: [05-20, 2014]. CZAJKOWSKY, D.M. and SHAO, Z., The human IgM pentamer is a mushroomshaped molecule with a flexural bias. PNAS, 106, pp DANMARKS STATISTIK, 2014-last update, Befolkning og valg. Available: [05-11, 2014]. DREIER, J., 2013-last update, Nøgletal. Available: [05-11, 2014]. EGEBO A. L., Genetikbogen - genetik, genteknologi og evolution. 1.udgave edn. Nucleus. ELDON BIOLOGICALS A/S, Manual - Eldon schoolkit. FLEGEL A. W., The Genetics of the Rhesus Blood Group System. FONTANA, J., TRNKA, J., MADA, P., IVAK, P., LAVRIKOVA, P., NOVAKOVA, L., PAVELKA, M. and ŠAJDÍKOVE, M., 2013-last update, Figur 1. Available: [03-10, 2014]. GRIFFITHS, J.F.A., MILLER, H.J., SUZUKI, T.D., LEWONTIN, C.R. and GELBART, M.W., Introduction to Genetic Analysis. 7 edn. W. H. Freeman. HANSEN, B.L., HANSEN, G.N. and THOMSEN, A.R., Immunsystemet - vort indre forsvar. 3 edn. København: Gads forlag. KVINDE, A., Interview over telefon. AAU Aalborg:. LODISH, H., BERK, A., MATSUDAIRA, P., KAISER, C.A., KRIEGER, M., SCOTT, M.P., ZIPURSKY, L. and DARNELL, J., Molecular Cell Biology. 5 edn. W. H. Freeman and company. LUEBBEHUSEN, H., The Significance of the 260/230 Ratio in Determining Nucleic Acid Purity. MARTIN, E. and HINE, R., A Dictionary of Biology. 6 edn. Oxford Univeristy Press. Side 56 af 96

57 MARTINI, F.H., NATH, J., L. and BARTHOLOMEW, E., F., Fundamentals of anatomy & Physiology. 9th edition edn. San Francisco, USA: Pearson Education, Inc. NCBI., 2007-last update, Figur 11. Available: [22-04, 2014]. PERKINS, S.J., NEALIS, A.S., SUTTON, B.J. and FEINSTEIN, A., 2010-last update, Solution structure of human Immunoglobulin M. Available: [03-18, 2014]. PREMIER BIOSOFT,, PCR Primer Design Guidelines. Available: [05-19, 2014]. PRENTØ, P. and JENSEN, V.P., Cellebiologi - cellens organisation og livsprocesser. 2 edn. Gad. RAD, B., 2013-last update, PCR Troubleshooting. Available: [05-06, 2014]. RASMUSSEN, J., 2006-last update, Hæmolytisk anæmi - Blodmangel pga. nedbrydning af de røde blodlegemer. Available: [04-19, 2014]. REECE, J.B., URRY, L.A., CAIN, M.L., WASSERMAN, S.A., MINORSKY, P.V. and JACKSON, R.B., Biology. 9 edn. St. San Francisco: Campbell. SALTIN, B., Hæmatokrit -hvad er det? SHAHRIAR, M., HAQUE, R., KABIR, S., DEWAN, I. and BHUYIAN, A., Effect of Proteinase-K on Genomic DNA Extraction from Gram-positive Strains. SIMONSEN, F., Analyseteknik Instrumentalering og metoder. 2 edn. København: Nyt Teknisk forlag. SØNDERKÆR, M., Aalborg Universitet: Mads Sønderkær. SØRENSEN, G.J., 2013-last update, Biologisk evolution. Available: [06-04, 2014]. SPALTER, S.H., SRINI, K.V., BONNINE, E., MANI, J., CARTRON, J. and KAZATCHKINE, M.D., Normal Human Serum Contains Natural Antibodies Reactive With Autologous AB0 Blood Group Antigens. Transfusion Medicine,. STILLING, B., Biokemi og bioteknologi. 2. edn. København: Nyt teknisk forlag. Side 57 af 96

58 STOCK, S.P., PCR and virus-specific primer development. Insect Pathogens: Molecular Approaches and Techniques. pp. 21. SUNDHEDSSTYRELSEN, 2013-last update, Antenatal rhesus (RhD) profylakse. Available: [05-19, 2014]. SUNDHEDSSTYRELSEN, Til dig, der er gravid og har en rhesus negativ blodtype. TIDSSKRIFT FOR JORDEMØDRE, ( ),. VARMING, K., Urbansgade 32: Aalborg Syghus Nord. WAGNER, F.F., MOULDS, J.M. and FLEGEL, W.A., Genetic mechanisms of Rhesus box variation. Transfusion, 45(3), pp WIENECKE, L., 2013-last update, Rhesus negativ og Anti-D. Available: +Obstetrisk+Afdeling/Graviditet+og+foedsel/Graviditeten/Rhesus+negativ+og+anti- D.htm?siu=true; [05-14, 2014]. Side 58 af 96

59 12 FIGUROVERSIGT Figur 1 En erytrocyts form Figur 2 Dannelsen af erytrocytter Figur 3 Makrofagen udstiller et antigen på sin membran Figur 4 Et immunglobulin Figur 5: A) Et IgG immunglobulin og B) Et IgM immunglobulin Figur 6: Agglutination af erytrocytter Figur 7 Et DNA molekyle Figur 8 Menneskets 22 kromosompar Figur 9: DNA transkription Figur 10: Et ribosom under translation Figur 11: Det centrale dogme Figur 12 De tre former for punktmutationer Figur 13: To kromosomer, der danner en duplikation, deletion og normal variant af et gen ved en skæv overkrydsning Figur 14: Eksempel på insertion af ny basesekvens TGG Figur 15 Kromosomerne i en heterozygot inversion Figur 16: Erytrocyt med antigener kodende for A, B, AB og Figur 17: RhD-proteinets placering i erytrocyttens membran Figur 18: Deletionen af RhD-genet Figur 19 Et eldonkort Figur 20 Procedure for oprensning af DNA fra QIAamp DNA Investigator Handbook Figur 21 Princippet om hvordan den ønskede DNA-sekvens opnås ved PCR Figur 22 De tre faser i en PCR cyklus Figur 23 Basesekvensen for de DNA-fragmenter af RhD-boksene, der amplificeres Figur 24 Billedet A illusterer RhD-genet og Billede B viser en hybridboks Figur 25 Separation af de amplificerede RhD-fragmenter ved gelelektroforese Figur 26 Eldonkort resultat Figur 27 UV-billede af gel resultat Figur 28 Graf over prøve 3 efter oprensning af DNA Figur 29 Graf over prøve 3 efter PCR Figur 30 UV billede af gel efter PCR, hvor prøve 1, 3, 4 og DNA-markøren fremgår Figur 31 Sekvensen hvor en ny reverse primer kan binde sig til downstream og hybrid RhD-bokstemplates Side 59 af 96

60 13 TABELOVERSIGT Tabel 1 Eksempler på molekylær forandring og deres effekt på D-antigenet Tabel 2: PCR-program brugt til amplificering af RhD-genet Tabel 3 Koncentration og renhedsforhold for oprenset og amplificeret Side 60 af 96

61 14 BILAGSOVERSIGT Bilag 1: Journaler Bilag 2: Arbjedspladsbrugsanvsning (APB) Bilag 3: Material saftey data sheet (MSDS) oprensning af DNA Bilag 4: Rådata Bilag 5: Telefon interview Side 61 af 96

62 Bilag 1: Journaler Blodtypebestemmelse ved eldonkort Formål: Eldonkort anvendes for at bestemme den fænotypiske blodtype, d.15/ Materialer Eldonkort kit. SKS ref lot , modtaget d.19/4-12 Vand, Spritserviet, Nål og steril pind Blod fra 5 forsøgspersoner Sikkerhed: Man må kun arbejde med sit eget blod Affaldshåndtering: Gruppe H, må smides i skraldespanden Fremgangsmåde: 1. Finger tørres af med spritserviet dråbe vand dryppes på alle felterne og der ventes nogle minutter. 3. Efter at havde stukket sig i fingeren, dryppes blod på eldonkortet, det tværes ud med sterilpind og der ventes ca. 5min. 4. Kortet aflæses. Resultater: Udført 1.gang: Forsøgperson nummer Blodtype resultat 1 fejl 2 A+ 3 fejl 4 fejl 5 fejl Udført 2.gang: Forsøgperson nummer Blodtype resultat 1 B+ 2 A+ 3 O- 4 O+ 5 fejl Observationer: Eldonkort var tæt på udløbsdato. Der kom for meget blod på kortene. Side 62 af 96

63 DNA oprensning fra mundskrab Formål: Frigøre og isolere DNA fra mundskrab, d.15/ Materialer/Apparaturer: QIAamp DNA Investigator Kit cat.no Bomuldsswabs cat.no. A43 E40P00 udløbsdato 2015/10 Varmeblok (56 o C og 70 o C) QIAamp MinElute kolonne Mikrocentrifugerør og rør fra kit (1,5-2 ml) Vortexmixer Centrifuge Finpipetter (20 µl 1000µL) Termometer Fryser -20 o C Kemikalier/reagenser Proteinase K Buffer ATL Buffer AL % ethanol Buffer AW1 Buffer AW2 Buffer ATE (ækvalibreret) Sikkerhed: Handsker, kittel. Affaldshåndtering: Alt må komme i vasken. Vær opmærksom på dette når der arbejdes: Forsigtig overfør prøve til kolonne, uden af ramme kanten Skift spids mellem hver overførsel Undgå at ramme kolonnens membran med spidsen Efter puls-vortexing, centrifuger 6000xg kort efter. Åben kun en kolonne af gangen, undgå at lave bobler! Flow-through må IKKE røre kolonnen, vær obs. På centrifugeringen! Forberedelse af buffer ATL- og AL buffer: Tjek om der er bundfald i bufferen. Hvis det er nødvendigt opløs ved opvarmning ved 70 o C. AW1 buffer: Tilfør 25 ml ethanol til 19 ml buffer AW1 koncentrat. Ryst før brug. Sæt kryds på flaskens mærkat. Efter fortynding, kan bufferen holde sig 1 år ved RT. AW2 buffer: Tilføj 30 ml ethanol til 13 ml buffer AW2 koncentrat. Ryst før brug. Efter fortynding kan bufferen holde sig 1 år ved RT. ATE buffer: Buffer ækvalibreres til RT før brug. Side 63 af 96

64 Fremgangsmåde 1.Step- Lysis: Prøve lyseres ved denaturerede forhold med Proteinase K Klip bomuldshovedet af, placer skrab i 2 ml kit rør. Tilfør 20 µl proteinase K og 400 µl ATL-buffer. Luk låg og mix ved puls vortexing i 10 sek. Placer 2 ml kit røret i varmeblok ved 56 o C i 1 time. For hvert 10. minut vortex prøven i 10 sek. Kort centrifuger (8000rpm) 2 ml kit røret. (tjek låg) Tilføj 400 µl AL buffer. Luk låg, og mix ved puls vortexing i 15 sek. Placer 2 ml kit røret i varmeblok 70 o C i 10 min. For hvert 3. minut vortex i 10 sek. Kort centrifuger 2 ml kit røret. (tjek låg) Tilfør 200 µl ethanol. Luk låg og mix ved puls vortexing i 10 sek. Kort centrifuger 2 ml kit røret. (tjek låg) 2.step- Bind: DNA bindes til membranen og kontamineringer løber igennem Overfør forsigtigt lysat fra punkt 9 til QIMinElute kolonne. Luk låget og centrifuger ved 6000xg i 1 minut. (Hvis ikke alt lysatet er drevet gennem membranen efter centrifugering, foretages der endnu en centrifugering ved højere hastighed.) Dette gøres indtil kolonnen er tømt for lysat. Herefter overføres kolonnen til et nyt rent 2 ml kit rør, og smid det forrige 2 ml rør ud (indeholdende væske efter centrifugering). Tilfør 500 µl AW1 buffer til kolonne. Luk låget og centrifuger ved 6000xg i 1 minut. Herefter overføres kolonnen til et nyt rent 2 ml kit rør (smid det forrige 2 ml rør ud, indeholdende væske efter centrifugering) Tilfør 700 µl AW2 buffer. Luk låget og centrifuger ved 6000xg i 1 minut. Herefter overføres kolonnen til et nyt rent 2 ml kit rør (smid det forrige 2 ml rør ud indeholdende væske efter centrifugering). 3.Step- Vask: Rest kontaminationer vaskes væk: Tilfør 700 µl ethanol. Luk låget og centrifuger ved 6000xg i 1 minut. Herefter overføres kolonnen til et nyt rent 2 ml kit rør. (smid det forrige 2mL rør ud indeholdende væske efter centrifugering). Centrifuger ved fuld hastighed ( rpm) i 3 min. Overfør kolonne til et rent 1,5 ml centrifugerør. (smid det forrige 2mL rør ud indeholdende væske efter centrifugering). Åben forsigtigt låget til kolonnen og inkuber ved RT i 10 min 4.Step- Opløs: Rent koncentreret DNA frigøres fra membranen Tilfør 50 µl ATE buffer til centeret af membranen. Luk låget og inkuber ved RT i 5 min. Centrifuger ved fuld hastighed ( rpm) i 1 minut. Observationer: Oprenset DNA prøver stod i 60 min. I RT før de fryses Der blev tilsat ATL buffer efter swab til prøve 1 og 2 og swab prøver stod i rør ca. 3 min før lysis. Buffer AW1 og 2 var forberedt på forhånd Side 64 af 96

65 Bilag 3: Støbning af 1 % agarose gel Formål: Formålet ved dette eksperiment er at fremstille en gel. Apparatur/Materialer: 2 x gelkar 250mL Bluecap-flaske Mikrobølgeovn Analysevægt Kemikalier/Reagenser 70 % Ethanol 1,00 g afvejet Agarose (Lonza cat.no.50004) 100 ml 1xTEA-buffer (AppliChem cat.no.a1691) 1 dråbe 0,07% Etidium bromid opløsning Sikkerhed: Nitrilhansker, kittel og stinkskab. Affaldshåndtering: Gel skal i skraldespand, affaldsgruppe H. Forberedelse: Fortynd 50xTEA buffer til 1x TEAbuffer Eksempel: 1ml op i 50ml eller, 2 ml op i 100 ml. Fremgangsmåde: 1. 2 gelkar rengøres og tilhørende kamme med 70 % Ethanol, og karet samles 2. Find 250 ml Bluecap-flaske og vej 1,00 g Agarose i flasken 3. Tilsæt 100 ml 1xTEA-buffer i flasken 4. Kom flasken med løstsiddende låg i en microbølgeovn. Tænd for microbølgeovnen og hold øje med, hvornår opløsningen kommer i kog. 5. Tag flasken ud og tjek om agarosen er gået i opløsning, den rystes og sættes ind igen yderligere 2 gange. 6. Tilsæt 1 dråbe EtBr-opløsning i Bluecap-flasken indeholdende de 100 ml opløst agarose og der virvles. 7. Køl Bluecap-flasken indeholdende gelopløsningen i 5 min ved RT 8. Blandingen hældes op i gelkar og undgå luftbobler! (ca. 50 ml per gel). 9. Kammen køres igennem for at fjerne bobler. 10. Kom kammen i toppen af gelen og lad den størkne i min Observationer: Gelen kom i mikrobølgeovnen 3 gange før agarosen var opløst. Side 65 af 96

66 Koncentrationsbestemmelse af isoleret DNA Formål: At bestemme DNA koncentrationen i vores prøver, d.15/ Kemikalier: MiliQ H2O Elueringsbuffer (ATE buffer fra QIAamp DNA Investigator Kit cat.no ) Oprenset DNA prøve Apparatur/materiale: Nanodrop Klenex Sikkerhed: Nitrilhandsker og kittel Affaldshåndtering: Reagenser må smides i vask/skraldespand: affaldsgruppe H Bestem koncentrationen vha. nanodrop: 1. Rengør nanodrop hovedet med filterpapir/klenex. 2. Åbn programmet og vælg nucleic acid 3. Load 2 µl milliq H2O til nanodrop hovedet og luk stemplet ned 4. Tryk OK 5. Vælg DNA 6. Rengør nanodrop hovedet med filterpapir/klenex. 7. Load 2 µl elueringsbuffer og tryk blank 8. Rengør nanodrop hovedet med filterpapir/klenex. 9. Load 2 µl prøve og tryk start 10. Afsætning af prøver på nanodrop 11. Noter din prøves koncentration og forhold mellem 260/230 og 260/ Rengør nanodrop hovedet med filterpapir/klenex. PCR Formål: Amplificerer en bestemt gensekvens i isoleret DNA for at bestemme det specifikke RhD-gen ved brug af PCR, d.16/ Apparatur/materialer: PCR maskine Pipetter (5-60µl) PCR rør/eppendorf rør Isbad Kemikalier/reagenser: DNA DNAse frit vand cat.no. R0581, lot Forward primer Reverse primer Side 66 af 96

67 Mastermix bestående af: Long PCR buffer med 15mM MgCl cas.no. K0181 dntp mix Long PCR enzym cas.no. K0181 Sikkerhed: Nitril handsker og kittel Håndtering: Alt må komme i vasken: affaldsgruppe H Fremgangsmåde: Start med at tænde PCR maskinen og anvend følgende program. (Anne - > Nr. 13 RHD long ). Temperatur Tid Cyklusser 94⁰C 3 min 1 95⁰C 20 sec 60⁰C 30 sec 10 68⁰C 135 sec (45 sec / kb) 95⁰C 20 sec 60⁰C 30 sec 20 68⁰C 135 sec (45 sec / kb) +2*s /cycle 68⁰C 10 min 1 4⁰C Pause Fortynd DNA til en koncentration på 10 ng/µl. med DNAse frit vand. Beregnet: Prøve Koncentration i ng/µl µl prøve µl DNAse frit vand 1 25,6 7,8 18,7 2 94,2 2,1 24, ,2 1,8 24,7 4 34,2 5,8 20,7 Tilsat: Prøve µl prøve µl DNAse fri vand 1 7,5 18, , , ,5 1. Sæt PCR rør på is. 2. Tilsæt til hvert rør (prøve) 3. 7 µl 100 pmol/µl forward primer 4. 7 µl 100 pmol/µl reverse primer µl genomisk DNA (med 10 ng /µl). 6. 6,5 µl DNAsefrit vand (skal evt. ikke tilsætte se 2). 7. Lav et mastermix bestående af (pr. Prøve): 8. 5 µl 10X Long PCR buffer with 15 mm MgCl 9. 4 µl dntp Mix, 2 mm each Side 67 af 96

68 10. 0,5 µl Long PCR Enzyme Mix (2,5 u) 11. Tilsæt 9,5 µl mastermix til hvert rør(prøve) 12. Sæt hurtigt dine prøver i og luk PCR maskinen. Det tager 2.13 time. Observationer: Mastermix blev lavet i et samlet rør hvor der var nok til 10 prøver. Som negativ prøve blev DNAse frit vand anvendt. Bilag 2: Arbjedspladsbrugsanvsning (APB) Analyse: Støbning af 1% Agarose gel samt gelelektroforese Reagenser der indgår i analysen: A. 50x TEA buffer B. Agarose-gel C. DNA loadingbuffer Reagens Stof Formel Koncentration i reagens i vægt % A) 50xTEAbuffer Cas henvisnings nummer 2M Tris C4H11NO3 2M M Iseddikesyre C2H4O2 1M ml EDTA C10H16N2O8 0,5 M og Vand H2O B) 1% Agarose Gel C) DNA- Loading- Buffer Agarose - 1 % xTEA-buffer EtBr (Ethidium C21H20N3-Br 0,07 % bromid) 5ml 100% Glycerol C3H8O3 100% mg til 30 ml C19H10Br4O5S 0,7mg/mL Bromphenol-blå 600µl X 50xTEA buffer 30 ml Steril milliq vand 3. Sikkerhed i forbindelse med fremstilling af reagenserne - Vi arbejder her med de rene og koncentrerede stoffer Henvisnings Klassificering H-sætninger P-sætninger Affaldsgruppe nummer Acute Tox.4 H302: Farlig P280, P : H (oral) + Eye Irrit.2 + Skin ved indtagelse H319: VED KONTAKT MED HUDEN Vask med rigeligt sæbe og vand. Side 68 af 96

69 Irrit.2 + STOT SE 3 Advarsel Forårsager alvorlig øjenirritation H315: Forårsager hudirritation H335:Kan forårsage irritation af luftvejene. P : VED INDÅNDING Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at vedkommende hviler i en stilling, som letter vejrtrækningen P305+P351+P338 VED KONTAKT MED ØJNENE Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning Flam. Liq. 3 Skin Corr. 1A H226: Brandfarlig væske og damp H314: Forårsager svære forbrændinger af huden og øjenskader. P210, P280, P , P C Fare Eye irrit. 2 H319 P280, P H Advarsel H H Acute Tox.2 H330: Livsfarlig B (Inhale), ved indånding Acute Tox.4 H302:Farlig ved (Oral), indtagelse Muta.2 H341:Mistænkt for at forårsage genetiske defekter P261, P280, P : VED eksponering eller mistanke om eksponering Søg lægehjælp P : I TILFÆLDE AF INDTAGELSE Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller en læge Side 69 af 96

70 Fare H Aquatic H410: P273: Undgå udledning til miljøet B Acute 1. Meget giftig Aquatic med langvarige Chronic 1. virkninger for vandlevende organismer. Advarsel 4. Anvendelse af personlige værnemidler og særlige forholdsregler ved fremstilling af de enkelte reagenser. Reagens Værnemiddel/handsketype/forholdsregler A: 1xTEA-buffer Nitril-handsker B: EtBr Nitril-handsker/stinkskab +Briller anbefales C: DNA-Loading-Buffer Nitril-handsker, briller 5. Sikkerhed i forbindelse med anvendelse af reagenser Vi er nu ovre i de fortyndede opløsninger altså ikke rene og koncentrerede kemikalier Reagens Klassificering H- P-sætninger Affaldsgruppe Opbevaring sætninger A) 50xTAEbuffer ingen - - H Tætlukket under ventilation B) EtBr 0,07% ingen - - H Håndtering af gel: Da gelen består af meget lave koncentrationer af de farlige stoffer/reagenser, kan denne kategoriseres som affaldsgruppe H. 6. Anvendelse af personlige værnemidler og særlige forholdsregler ved brug af de enkelte reagenser. Reagens Værnemiddel/handsketype/forholdsregler A: Nitril-handsker B: Nitril-handsker C. Nitril-handsker Side 70 af 96

71 Semester/gruppe nr. B228 Dato. 15/ Navn: Lee-Ann, Marie, Jacob, Søren, Mahdi og Stine Projekt laborant: Vejleder: Mads Sønderkær Analyse: PCR Reagenser der indgår i analysen: A. Genomisk DNA B. DreamTaq buffer (5x) C. dntp mix D. PCR reaktion mix E. Exon 6 primer mix F. Exon 7 primer mix 2. Navn, formel og koncentration for de kemiske stoffer, der indgår i de enkelte reagenser: Reagens Stof Formel Koncentration i reagens Cas og henvisnings nummer i vægt/vol % DNAse DNAH 2O A DNA - - Vand H 2O - - Kaliumchlorid KCl B Ammoniumsulfat (NH 4) 2SO Deoxyadenosin triphosphat (datp) C 10H 16N 5O 12P 3 25 % Deoxycytidine triphosphat (dctp) C 9H 16N 3O 13P 3 25% C D Deoxyguanosine triphosphat (dgtp) C 10H 16N 5O 13P 3 25% Deoxythymidine triphosphat (dttp) C 10H 17N 2O 14P 3 25% DNAse DNAH 2O 46,90% DreamTaq buffer - 20% - (x5) Magnesiumchlorid MgCl 2 9,09% dntp mix DreamTaq polymerase 16,36% - Frie nukleotider Enzym 7,63% - 3. Sikkerhed i forbindelse med fremstilling af reagenserne Side 71 af 96

72 . Vi arbejder her med de rene og koncentrerede stoffer Henvisning s nummer Klassificering H-sætninger P-sætninger Affaldsgrupp e Fare H334: Kan forårsage allergieller astmasymptome r eller åndedrætsbesvæ r ved indånding. H317: Kan forårsage allergisk hudreaktion. P261: Undgå indånding af støv. P262: Må ikke komme i kontakt med øjne, hud eller tøj. P280: Bær beskyttelseshandsker/øjenbeskyttels e. P : VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning X X X H H Eye Irrit. 2 STOT SE 3 Skin Irrit Eye Irrit. 2 STOT SE 3 Skin Irrit. 2 H319; H335; H315 H319; H335; H315 Forsigtigt! Stoffet ikke endnu fuldstændig undersøgt. P280: Bær handsker-/øjenbeskyttelse P : Ved indhånding: flyt personen til et sted med frisk luft og sørge for at vejrtrækning lettes. P : VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. Forsigtigt! Stoffet ikke endnu fuldstændig undersøgt. 4. Anvendelse af personlige værnemidler og særlige forholdsregler ved fremstilling af de enkelte reagenser. Reagens Værnemiddel/handsketype/forholdsregler A: Nitrilhandsker, blandes i stinkskab, sikkerhedsbriller B: Nitrilhandsker C: Nitrilhandsker D: Nitrilhandsker H H H Side 72 af 96

73 5. Sikkerhed i forbindelse med anvendelse af reagenser Vi er nu ovre i de fortyndede opløsninger altså ikke rene og koncentrerede kemikalier Reagens Klassificering H-sætninger P-sætninger Affaldsgruppe Opbevaring A) Genomisk H - DNA ingen B) Dream Taq Ingen - - H - Buffer - - C) dntp-mix Ingen -- H - D) PCR- Reaktions- Mix E) Exon 6 Primers mix F) Exon 7 Primer mix ingen H ingen - - H - ingen - - H - 6. Anvendelse af personlige værnemidler og særlige forholdsregler ved brug af de enkelte reagenser. Reagens Værnemiddel/handsketype/forholdsregler A: Nitrilhandsker grundet arbejde med DNA B: C: D: Semester/gruppe nr.b228 Dato. 16/ Navn: Lee-Ann, Marie, Jacob, Søren, Mahdi og Stine Projekt laborant: Vejleder: Mads Sønderkær Side 73 af 96

74 Bilag 3 Material saftey data sheet (MSDS) oprensning af DNA Proteinase K Side 74 af 96

75 Side 75 af 96

76 Side 76 af 96

77 ATL-buffer Side 77 af 96

78 Side 78 af 96

79 Side 79 af 96

80 Side 80 af 96

81 AL-buffer Side 81 af 96

82 Side 82 af 96

83 Side 83 af 96

84 AW1-buffer Side 84 af 96

85 Side 85 af 96

86 Side 86 af 96

87 Side 87 af 96

88 Side 88 af 96