Deltagermateriale OGM. PCR-teknikker 1

Transkript

1 Deltagermateriale OGM PCR-teknikker 1

2 POLYMERASE KÆDE REAKTION (PCR) Indholdsfortegnelse 04/02 2 af 36

3 1. INDLEDNING... 4 DNA's opbygning... 5 DNA-replikation PCR METODEN PCR en oversigt PCR detaljeret beskrivelse PCR endnu en oversigt Reagenser til PCR Primer design Opbevaring af primere OPTIMERING AF PCR-FORSØGSBETINGELSERNE POLYMERASER FEJLFINDING FEJLKILDER VED ANVENDELSE AF PCR Sikkerhedsforanstaltninger ved arbejde med PCR ANVENDELSE AF PCR REALTIME PCR og KVANTITATIV PCR (QPCR) Detektion Kvantitativ PCR LITTERATUR FORSLAG... 36

4 POLYMERASE KÆDE REAKTION (PCR) 1. INDLEDNING PCR er en metode til enzymatisk kopiering (amplifikation) af DNA in vitro. Metoden blev opfundet af amerikaneren Kary Mullis i PCR står for Polymerase Chain Reaction (polymerase kæde reaktion). Som navnet siger foregår der en kædereaktion, hvorved mængden af DNA øges eksponentielt via bestemte temperaturpåvirkninger af DNA. Ved PCR kan man amplificere DNA udfra meget små mængder udgangsmateriale, i princippet et enkelt DNA molekyle. Fig 1 viser den eksponentielle syntese af DNA udfra 1 kopi, og således vil PCR i teorien forløbe. Fig 1: Eksponentiel syntese af DNA 04/02 4 af 36

5 DNA's opbygning DNA er det kemiske stof, som indeholder den genetiske information. DNA er normalt et dobbeltstrenget molekyle, hvor de 2 strenge danner en dobbeltspiral (en såkaldt dobbelt helix). DNA består af sukkerstoffet deoxyribose, fosfat samt af 4 forskellige baser adenin (A), guanin (G), thymin (T) og cytosin (C) (se figur 2) Figur 2 : DNA struktur S (deoxyribose), P (fosfat), A,T,G og C er de 4 baser. Deoxyribose er en pentose, dvs en sukkerart med 5 kulstofatomer. Kulstofatom nr.1 i pentosen binder en base, mens kulstofatom nr.3 og nr.5 binder fosfat. Kombinationen deoxyribose, fosfat og base kaldes et nukleotid (se figur 2 og 3). DNA består således af 4 forskellige nukleotider. Disse nukleotider er sammenkoblet til lange kæder ved hjælp af fosfor-diester bindinger, der danner bro mellem kulstofatom nr. 3 på pentosen i et nukleotid og kulstofatom nr.5 på pentosen i nabonukleotidet. Herved opbygges DNA af skiftevise fosfater og pentoser. Hver base er fasthæftet til pentosens kulstofatom nr. 1 næsten vinkelret herpå (se figur 2 og 3). 04/02 5 af 36

6 figur 3: Udsnit af DNA molekyle. Al genetisk information er indlejret i den lange, lineære sekvens af de 4 baser, som kombineres til en genetisk kode. De 2 strenge i DNA har deres 3'- 5' fosfor-diester bindinger orienteret modsat hinanden (se figur 2 og 3). Man siger derfor, at strengene i DNA er antiparallelle. Den ende, som slutter med en 5 fosfatgruppe, kaldes 5 mærke enden, 5 og den, der slutter med en 3 OH gruppe kaldes 3 mærke enden, 3. Strengene holdes sammen af hydrogenbindinger mellem baserne. Kun 2 former for baseparring er mulig, nemlig mellem adenin og thymin og mellem guanin og cytosin. Således vil antal A være lig antal T og antal G være lig antal C. De 2 strenge i et DNA molekyle kaldes komplementære, pga baseparringsreglen. A og T holdes sammen af 2 hydrogenbindinger, G og C af 3 hydrogenbindinger(se figur 2 og 3). 04/02 6 af 36

7 Da hydrogenbindingerne mellem baserne er relativt svage, kan de 2 strenge under bestemte betingelser denatureres (skilles ad) og renatureres (føjes sammen igen). Denne egenskab ved DNA benyttes i PCR-processen. Et eller flere lange, dobbeltstrengede DNA-molekyle(r), samt visse proteiner, udgør en organismens kromosom(er). På kromosomet findes generne, dvs de områder af DNA, som koder for cellens proteiner. En bakterie har relativt lidt arvemateriale sammenlignet med eukaryote celler. F.eks. har E.coli et enkelt, cirkulært kromosom, bestående af ca. 3.4 millioner basepar, indeholdende ca forskellige gener. Mennesket har 46 kromosomer (i hver celle!) og ca gener. DNA-replikation. Den enzymatiske syntese af DNA ved PCR er stort set den samme proces, som foregår i celler ved celledeling. Når en celle deler sig, skal alt dens arvemateriale, dvs DNA, kopieres. Ved denne DNA kopiering (kaldet replikationen), adskilles de 2 strenge i enkeltstrenge, som hver tjener som skabelon (template) for dannelsen af 2 nye komplementære strenge. Således dannes der 2 DNA molekyler, hvor der før var 1 molekyle (se figur 4). Figur 4 : DNA replikation Replikation katalyseres af DNA polymeraser; enzymer, som medvirker ved både kopiering og reparation af DNA. 04/02 7 af 36

8 DNA polymeraser kan ikke katalysere syntese af ny DNA streng udfra enkeltstrenget DNA; de kræver et dobbeltstrenget startsted med en fri 3 OH ende. I celler starter replikationen altid bestemte steder, ved såkaldte ori sites, hvor DNA strengen åbnes enzymatisk, og inden kopiering kan starte, bindes en kort nukleotidsekvens (en primer) til det enkeltstrengede DNA. Den åbnede DNA streng kaldes en replikationsgaffel. DNA polymerasers synteseretning er altid den samme, således at syntesen af den ny streng altid foregår i retning 5 mod 3. (Fig 5) Figur 5: replikationsgaffel (parent DNA er den oprindelige celles DNA, som er skabelon for syntesen) Byggestenene til replikationen kommer fra deoxynukleosid trifosfaterne datp, dttp, dgtp og dctp. Fraspaltning af en pyrofosfatgruppe og efterfølgende hydrolyse af denne leverer energien til DNA syntesen, mens damp, dtmp, dgmp og dcmp indbygges i den voksende DNA-streng. (Fig 6 og 7 ) Fig 6 : Dannelse af fosfodiester binding og fraspaltning af pyrofosfat 04/02 8 af 36

9 Fig 7: Syntese af DNA streng retning 5 mod 3 på den ny streng. Her indsættes næste nukleotid af DNA polymerase 04/02 9 af 36

10 2. PCR METODEN PCR en oversigt PCR bygger på, at man kan adskille DNA i enkeltstrenge ved opvarmning og samle dem igen, når temperaturen sænkes. PCR består af 3 trin, denaturering, annealing og polymerisering, som gentages gange. Der område, der kopieres er afgrænses af de 2 primere. Der henvises til fig 8. Fig 8: Trin i PCR Trin 1 : Denaturering. Reaktionsblandingen opvarmes til grader i 1-2 min, hvorved alt DNA i blandingen denatureres, dvs adskilles i enkeltstrenge. Opvarmningen bevirker, at hydrogenbindingerne mellem baserne i DNA dobbelthelix brydes, så der opstår 2 enkeltstrengede DNA molekyler. Trin 2 : Annealing. Efter denaturering sænkes temperaturen, så annealing (renaturering) bliver mulig. Annealing betyder, at komplementære, enkeltstrengede DNA molekyler samles til dobbelthelix, dvs hydrogenbindingerne reetableres. Formålet er at få de 2 primere bundet til template DNA i de komplementære områder. 04/02 10 af 36

11 Annealingstemperaturen bestemmes udfra den såkaldte smeltetemperatur Tm, som kan beregnes efter nedenstående formel: Tm = 4 x (antal G+C) + 2 x (antal A+T) Annealingstemperaturen afhænger således af længden af primeren (antal baser) og af forholdet mellem antal (G+C) og (A+T). Annealingstemperaturen er typisk grader og varigheden ca 30 sek. Trin 3. Polymerisering. Når primerne har bundet sig til template DNA ved annealing, hæves temperaturen til grader, som er optimumstemperatur for Taq-polymeraser. Under polymeriseringen katalyserer Taq polymerase syntesen af dobbeltstrenget DNA med enkeltstrenget template DNA som skabelon, og primernes fri 3`ender som startsted. PCR detaljeret beskrivelse Efter 1. cyklus er antallet af DNA strenge fordoblet, Ved en ny opvarmning til grader denatureres DNA strengene igen. Påny afkøles til annealingstemperaturen og primerne anneales. (fig 9) Fig 9: Primer annealing, 2. cyklus Der opvarmes til ca. 72 grader, så Taq polymerase kan katalysere polymeriseringen af de ny strenge (fig 10) 04/02 11 af 36

12 Fig 10: Polymerisering, 2. cyklus Efter 2. cyklus (denaturering, primer-annealing, polymerisering) er der ialt dannet 6 nye DNA-strenge, hvoraf de 2 strenge udelukkende består af target sekvensen, idet de er begrænset i begge ender af primere. (fig 11) Fig 11: Primer annealing, 3. cyklus 04/02 12 af 36

13 Fig 12: Polymerisering, 3. cyklus Efter 3. cyklus er der 8 kopier af target sekvensen (fig 12). Fig 13: Primer annealing, 4. cyklus Efter 20 cykler vil der teoretisk være 1 million kopier af target sekvensen (2 20 ), efter 30 cykler teoretisk 1 milliard (2 30 ) kopier af target sekvensen. 04/02 13 af 36

14 PCR endnu en oversigt 1. cyklus Template DNA denatureres ved ca 95 gr, og primerne anneales. Læg mærke til primernes orientering. Taq polymeraser starter altid syntesen af den ny streng ved primerens fri 3 OH gruppe. 2. cyklus Der denatureres påny, primerne anneales de 4 strenge og efter syntesen er der 8 strenge, hvor 2 har den ønskede længde, afgrænset af primerne. 3. cyklus Efter 2. cyklus er der 4 DNA dobbelt strenge. Efter denaturering i 3. cyklus er der nu 8 enkeltstrenge som template for ny syntese, og efter polymerisering er der 8 strenge af den ønskede længde. Fig 14: PCR - oversigt Bemærk, at der amplificeres 2 typer PCR produkter af forskellig længde. De længste PCR produkter fremkommer ved amplifikation med prøve DNA som template. De korte PCR produkter, som har samme længde som target DNA, fremkommer ved amplifikation med syntetiserede PCR produkter som template. De korte PCR 04/02 14 af 36

15 produkter amplificeres eksponentielt i de følgende cykler. Kun de korte ses på en agarose gel. Reagenser til PCR Processen kræver nedenstående reagenser for at kunne forløbe: Prøve-DNA, som er template (skabelon) ved kopieringen. Det består af dobbeltstrenget DNA, og indeholder det segment, som ønskes amplificeret. Primer-DNA, som er 2 oligonukleotider (enkeltstrengede DNA molekyler), ca 20 bp store. Primerne er komplementære til template DNA i ydergrænserne af det stykke, som ønskes amplificeret. Deoxynukleotider dntp (datp, dttp, dgtp, dctp). dntp har 2 funktioner i reaktionen: 1. dntp udgør byggestene i DNA, idet deoxynukleotider gennem esterbindinger forbinder sig med hinanden i dannelsen af DNA strengen. 2. dntp tilfører reaktionen energi, hvilket er nødvendigt, da syntese af DNA er en energikrævende proces. Der frigøres energi ved fraspaltning af de 2 yderste fosfatgrupper i dntp. (fig 6) Taq-polymerase, som er et varmestabilt enzym fra en termofil bakterie(oprindelig fra bakterien Thermus aquaticus).taq polymerase er en DNA polymerase, som katalyserer syntesen af DNA udfra en enkeltstrenget template streng med et dobbeltstrenget stykke som startsted (fig 7). Standard reaktionsblandinger til PCR Som udgangspunkt for sine PCR-reaktioner kan man benytte følgende reaktionsblanding : 1) Tris-HCl (ph 8,3) 10 mm (varieres ikke) 2) KCl 50 mm (er i reaktionsbuffer) (K-ionerne har betydning for annealing af primerne, og koncentrationen varieres ikke) 3) MgCl mm (varieres ved optimering) 4) dntp 200 μm af hver (varieres ved optimering) 5) Primere 0,5 μm af hver (varieres ved optimering) 04/02 15 af 36

16 6) stabiliserende stoffer for Taq-polymerasen ( er i reaktionsbuffer) 7) Taq-polymerase 2.5 units pr 100μl reaktionsmix (varieres ved optimering) Der tilsættes autoklaveret vand til et totalvolumen på fx μl, og reaktionsblandingen placeres i en DNA Thermal Cycler, en slags varmeblok, hvor temperaturen henholdsvis hæves og sænkes efter forprogrammerede værdier i et bestemt tidsinterval. Primer design Ved PCR-metoden amplificeres som nævnt en bestemt DNA-sekvens (target DNA) ved anvendelse af 2 primere, som er komplementære til de nukleotidsekvenser, der flankerer target-sekvensen. Man kan kun foretage en specifik DNA-amplifikation, hvis man er i stand til at konstruere primere, som binder specifikt til template. Når man designer primersættet til en PCR reaktion, skal man tage højde for følgende forhold : 1) Primerne bør være nukleotider lange med et GC-indhold på % For lange primere øger risikoen for primer-dimer dannelse (se nedenfor), mens for korte primere vil kunne binde uspecifikt. 2) Især 3'-enden af primerne skal baseparre korrekt til template-dna'et for at forhindre uspecifik amplifikation. Primernes 5'-ende, derimod, behøver ikke at baseparre korrekt. Man kan derfor vælge at indsætte non-komplementære basesekvenser, f.eks et restriktions-enzym genkendelsessted, i primerens 5'-ende og herved skabe et restriktionsenzym skæringssted i amplifikatet, således at dette efterfølgende kan klones i en vektor. 3) Undgå sekundærstrukturer i den enkelte primer. En sekundærstruktur (hairpin-loop) i primeren vil medføre, at primeren ikke bindes specifikt til template. 4) Undgå 3 ende komplementaritet mellem primerne og primer-dimer dannelse. Sørg for at de 2 primere ikke har komplementære 3'-ender, således at de binder sig til hinanden fremfor til template og igangsætter primer-dimer dannelse. 04/02 16 af 36

17 En primer-dimer amplifikation vil i givet fald ske på bekostning af amplifikationen af target og derfor lægge beslag på såvel enzym, dntp's og øvrige primere. Primer-dimer amplifikatet har en størrelse som de 2 primere tilsammen. Mekanismen, hvorved der sker primer-dimer amplifikation, er ikke helt klarlagt, men det menes, at Taq-polymerase og andre varmestabile DNA polymeraser har en særlig "forkærlighed" for de små "blunt ended" dobbeltmolekyler, som primerne kan danne, hvis de har komplementære 3' ender og derfor bindes til hinanden netop der. Fig 15 Dannelse af dobbeltstrenget DNA med blunt ends og primerforlængelse via 3 enderne, hvorved der dannes primer-dimere. Primer dimer dannelse kan ses på en agarosegel ved at der fremkommer ekstra bånd, som er mindre end det forventede produkt. Fig 16: Primer dimer amplifikation, vist på agarosegel Primer-dimer dannelse kan fx afsløres ved, at der fremkommer amplifikation i kontrol uden DNA (No Template Control) 04/02 17 af 36

18 5) Undgå polypurin (mange baser af typen A og G) eller polypyrimidin (mange baser af typen T og C) i primerne, fordi det vil føre til en "ujævn" basesammensætning i primerne og hermed give problemer med at finde en optimal annealingstemperatur (se nedenfor). De 2 primere skal helst konstrueres, så de har nogenlunde samme T m. ellers vil annelingstemperaturen være for høj for den ene primer og for lav for den anden. Man risiskerer så at der enten ikke fremkommer PCR produkt (for høj annealingstemperatur) eller at der sker uspecifik amplifikation (for lav annealingstemperatur). Opbevaring af primere Primere bør opbevares som koncentrerede stamopløsninger ved 20 grader, hvorfra der udtages den mængde, man skal bruge. Undgå gentagne optøninger/nedfrysninger af primerne. Den mængde primer, man skal anvende indenfor et kortere tidsrum, opbevares i køleskab. 04/02 18 af 36

19 3. OPTIMERING AF PCR-FORSØGSBETINGELSERNE Ved optimering af PCR vil man forsøge at påvirke sensitiviteten og specificiteten af PCR ved at ændre på opsætningen. Specificitet er et mål for, hvor præcis metoden er, så ved høj specificitet er sandsynligheden stor for, at det kun er target DNA, der amplificeres. Sensitivitet er et mål for, hvor følsom metoden er, så ved høj sensitivitet er sandsynligheden stor for, at der fremkommer et PCR produkt. Hvis man øger sensitiviteten kan man få amplifikation af PCR produkt ved mindre mængde template DNA i prøven. Optimeringen kan foretages på flere måder. 1)Ændring af koncentrationerne af komponenterne i forhold til standardprotokollen, dvs. ændring af Mg ++ -, template-, primer-, dntp-, og enzymkoncentrationerne. 2)Ændring af temperaturerne i forhold til standardprotokollen, dvs. ændring af denaturerings- annealings- og polymeriseringstemperaturerne. 3)Ændring af varigheden af denaturerings- annealings- og polymeriseringstrinnene, ændring af antal cykler samt evt. tilføje supplerende trin. Ad 1) Mg ++ koncentrationen Taq-polymerasens aktivitet afhænger af frie Mg-ioner, der fungerer som co-faktorer for enzymet. Dette gør Mg ++ koncentrationen til en af de kritiske parametre i PCR-reaktionen. Eftersom dntp molekylerne binder Mg ++ i forholdet 1:1, vil en ændring i dntp koncentrationen i reaktionsblandingen automatisk påvirke koncentrationen af frit Mg ++, som så igen påvirker enzymaktiviteten. En for lav MgCl 2 koncentration vil give et ringe eller intet udbytte af amplifikationen, mens en for høj MgCl 2 koncentration kan resultere i en uspecifik amplifikation eller en hæmning af polymerasen. MgCl 2 koncentrationen bør altid være mm højere end den totale dntp koncentration, således at der er frie Mg-ioner til rådighed for polymerasen i en passende koncentration.(hvis ens DNA er opløst i Tris-EDTA buffer skal man endvidere huske på, at EDTA binder Mg ++ ). MgCl 2 koncentrationen optimeres normalt mellem 0,8 og 5 mm. Template DNA koncentration 04/02 19 af 36

20 Som udgangspunkt er mellem 10 5 og 10 6 molekyler target-dna tilstrækkeligt til en PCR-reaktion (dette svarer til 10 ng E. coli DNA eller 1 mikrogram humant genomisk DNA). Primerkoncentration Der optimeres normalt indenfor μm af hver primer. For høje primer koncentrationer kan medføre annealing til de forkerte DNA sekvenser (samt fremme primer-dimer dannelse) og hermed forårsage en amplifikation af ikkespecifikke fragmenter. For lav en primerkoncentration giver et for lavt udbytte eller måske intet udbytte overhovedet. Ved optimering vælges den laveste koncentration, der giver et rimeligt udbytte. Polymerasekoncentration Taq-polymerasen optimeres normalt mellem 0.5 og 5 units pr 100 μl reaktionsmix. Vælg den laveste koncentration, der giver et rimeligt udbytte, også udfra økonomiske overvejelser. dntp koncentration Der optimeres typisk indenfor området μm af hver dntp. For høj dntp koncentration kan medføre, at polymerasen inkorporerer for mange fejl-baser udover enzymets "naturlige" fejlinkorporeringsfrekvens (bestemt for Taq til 1 ud af 400 baser ved 30 cykler, og kun gældende for de enzymer, som ikke har proof reading). En for lav dntp koncentration vil omvendt betyde, at PCR-udbyttet mindskes. De 4 nukleotider bør for øvrigt altid forefindes i reaktionsblandingen i samme koncentration for at mindske fejlinkorporering. Ved optimering vælges den laveste koncentration, der giver et rimeligt udbytte. Ad 2) Denaturering Denatureringen af DNA i PCR-reaktionens 1. trin foregår normalt ved 94 grader, men kan varieres mellem 92 og 97 grader alt efter arten af DNA-udgangsmaterialet (DNA med et højt G/C indhold kræver en relativ høj denatureringstemperatur). Hvis man øger temperaturen til over 95 grader, skal man imidlertid være opmærksom på, at enzymets levetid kan nedsættes markant. For lang en varmedenaturering kan endvidere beskadige DNA. Der findes enzymer, som er behandlede, så de skal opvarmes til en temperatur svarende til denatureringstemperaturen, før de har enzymaktivitet. Man kan således forhindre de uspecifikke primer/template og primer/primer komplekser, som dannes ved lave temperaturer under det første opvarmningstrin fra stuetemperatur (eller is) til denatureringstemperatur, og som forlænges af en aktiv polymerase (varmestabile DNA polymeraser har også enzymaktivitet ved temperaturer under stuetemperatur!). 04/02 20 af 36

21 Ved brug af disse enzymer tilføjes et ekstra programtrin, hot start, før selve PCR programmet startes. Som regel opvarmes til 95 grader i 5-15 min, hvilket også have den fordel, at andre enzymer, som måtte være i prøven, inaktiveres. Annealing Ved fastlæggelse af annealingstemperaturen for en given PCR opsætning kan man tage udgangspunkt i primernes smeltetemperatur Tm, som angiver den temperatur, hvor halvdelen af primermolekylerne er bundet til template og halvdelen denaturerede. Som tommelfingerregel kan man starte fastlæggelsen af annealings-temperaturen Ta ved at vælge 5 o C under Tm for primeren med den laveste Tm. Senere kan man ved forsøg hæve Ta indtil amplifikationen er tilfredstillende. For lav annealingstemperatur vil resultere i at den ene eller begge primere kan hæfte til andre sekvenser end target DNA, da mismatch eller partiel annealing her kan tolereres. Dette kan resultere i uspecifik amplifikation, hvor der kopieres andre sekvenser end target DNA. Ofte ses også en reduktion i udbyttet af det ønskede PCR produkt. (se figur 17) Fig 17: Optimering af annealingstemperatur med 2 forskellige enzymer. Hvis annealingstemperaturen er for høj, er sandsynligheden for at primerne annealer til template, reduceret, og det kan resultere i et for lavt udbytte, eller ingen amplfikation. Til gengæld er amplifikationen specifik, da mismatch eller partiel annealing ikke er sandsynlig. Annealing tager ikke lang tid, som regel er 30 sek tilstrækkeligt, med mindre primerne er meget lange eller Ta er meget tæt på Tm. Polymerisering Polymerasens optimumtemperatur ligger normalt mellem 70 og 80 grader, hvilket betyder at polymeriseringstemperaturen bør ligge indenfor dette temperaturområde. Som nævnt er mange af de varmestabile enzymer aktive til under stuetemperatur, hvilket man skal være opmærksom på. 04/02 21 af 36

22 Ad 3) Antal cykler Normalt bør man ikke anvende mere end PCR-cykler. Efter cykler ses typisk et plateau-niveau, hvor udbyttet af PCR-reaktionen falder drastisk, fordi der ikke længere sker en exponentiel DNA-amplifikation. Plateau-niveauet fremkommer som en kombination af faldende enzymaktivitet og stigende substratkoncentration (dvs amplificeret DNA, som skal danne template for yderligere DNA-amplifikation). Dette medfører, at ikke alle primer/template komplexer kan polymeriseres i løbet af en enkelt cyklus. Desuden vil noget af template-dna'et nå at binde sig til sig selv, inden der kan fasthæftes primer. 4. POLYMERASER Polymeraser er de enzymer, der påsætter nukleotider fra 3 OH enden af en primer i en af template bestemt retning. DNA polymeraser katalyserer syntesen af nye DNA strenge udfra DNA eller RNA, og RNA polymeraser katalyserer dannelsen af RNA udfra DNA En af de polymeraser, der benyttes af E. coli til replikation af genomet før celledeling, besidder 3 forskellige enzymaktiviteter a) 5 3 syntese aktivitet b) 5 3 exonuclease aktivitet c) 3 5 exonuclease aktivitet. Polymerasen kaldes også for E. coli DNA polymerase I. 5 3 syntese aktivitet Via denne synteseaktivitet sættes nukleotider på 3 OH enden af en primer i en af template bestemt retning. Hvis DNA er template, sættes en adenin ind, hvor der på template er thymin og omvendt, og guanin indsættes hvor der på template er en cytosin og omvendt. Under syntesen sker det at polymerasen indsætter forkerte baser. F.eks. indsætter E. coli DNA polymerase I 9 forkerte baser pr baser (error rate). 5 3 exonuclease aktivitet Denne enzymaktivitet er ansvarlig for at fjerne den RNA primer, som benyttes af cellen til at igangsætte replikationen. Den kan altså fjerne nukleotider, som måtte sidde i vejen for syntesen. 04/02 22 af 36

23 3 5 exonuclease aktivitet Via 3 5 exonucleaseaktiviteten fjernes forkert indsatte baser (kaldet proof reading) Herefter erstattes de forkerte baser med korrekte baser via enzymets 5-3 synteseaktivitet. Taq DNA polymerase var den første temperaturstabile DNA polymerase, man anvendte til PCR. Polymerasen er oprindeligt isoleret fra den termofile bakterie Thermus aquaticus. De Taq polymeraser, som forskellige firmaer forhandler i dag, er alle isoleret fra forskellige stammer af denne bakterie. Senere har man formået at isolere polymeraser fra andre bakterier og fremstille enzymerne ved gensplejsning. Man taler om High Fidelity termofile DNA polymeraser, hvilket er DNA polymeraser, der besidder 3-5 exonuclease aktivitet (proof reading). Enzymerne giver mindre udbytte, men danner færre fejl i amplifikaterne. Dette har betydning, hvor PCR produktet skal bruges til kloning og sekvensanalyse. Andre polymeraser har både 5 3 exonuclease aktivitet og en Mn 2+ afhængig reverse transcriptase aktivitet (dvs. syntetiserer DNA udfra RNA), hvilket betyder at den kan bruges til RT-PCR*. * note: RT-PCR er PCR baseret på RNA som template. 5. FEJLFINDING 1. Intet PCR produkt - en tom lane i gelen 1.1 Gentag eksperimentet mindst en gang til, for at se om alt er udført korrekt (at der ikke mangler en komponent). Tjek mikropipetten for præcision inden eksperimentet gentages. Kommer der stadig ikke noget produkt - overvej da følgende: 1.2 Polymerasen. Udfør en kontrolamplifikation med en kombination af kontrolprimere, kontroltemplate, buffer og cyklusprofil, der vides at virke. Hvis ikke kontrolamplifikationen giver resultat, kan det være enzymet, der er inaktivt. 1.3 Nukleotiderne. Er nukleotidkoncentrationen passende for reaktionen? Er nukleotiderne, som de skal være (nukleotider nedbrydes ved gentagne optøninger og nedfrysninger). Er nukleotiderne opløst efter nedfrysning. De skal mixes grundigt ved optøning. 04/02 23 af 36

24 Kontrolamplifikationen i 1.2 er også kontrol for, at nukleotiderne er i orden. 1.4 Bufferen. Er det den rigtige buffer? Bufferens sammensætning kan være en kritisk parameter i PCR. Prøv at optimere bufferen mht Mg 2+ koncentration og buffersammensætning i øvrigt. 1.5 DNA template. Er der hæmmende stoffer i DNA præparationen (f.eks rester af fenol og kloroform)? Er DNA et nedbrudt i større eller mindre grad? Er template koncentrationen for høj? Et for stort overskud af template vil kunne hæmme primerbinding. 1.6 Primerne. Tjek primernes koncentration ved absorbansmåling og kør en sekvensgel, for at se om de er rene. Tjek følgesedlen for at se, om basesammensætningen er som forventet. 1.7 Vand. Er bufferen fortyndet korrekt med vand? 1.8 Temperaturprofil. Er annealingstemperaturen for høj (for høj stringens) eller denatureringstemperaturen for lav? 1.9 Detektionsmetoden Prøv evt. at farve gelen i længere tid og brug længere eksponeringstid, når billedet tages. En anden mulighed er at benytte fluorescens-mærkede primere eller foretage hybridisering med mærket probe for at øge følsomheden Start forfra, lav friske opløsninger og få evt. en ny batch af enzymet hjem. 2. For mange bånd 2.1 Primerne. Det er muligt, at primerne ikke er specifikke nok, dvs at de kan anneale til flere forskellige sekvenser på template. 2.2 Annealingstemperaturen. 04/02 24 af 36

25 Annealingstemperaturen er for lav (for lav stringens) Prøv at hæve temperaturen, specielt i de første cykler. 2.3 Antallet af cykler. Prøv at gentage processen med færre cykler. Forsvinder de extra bånd? 2.4 Mg 2+, enzym, primer eller dntp koncentrationen. Prøv at nedsætte koncentrationen. 3. Primer dimer dannelse 3.1 Er 3 enden af de 2 primere komplementære? 3.2 Er primerkoncentrationen for høj? 4. Amplifikatet har en forkert størrelse. 4.1 Binder primerne forkert? 4.2 Er primerne homologe med repetitive sekvenser i genomet? 6. FEJLKILDER VED ANVENDELSE AF PCR Da DNA i princippet er alle vegne og tillige er svært at komme af med, når det først er tilstede, og eftersom PCR-metoden er en utrolig effektiv metode til at amplificere små DNA-mængder, må man udvise stor påpasselighed, når man arbejder med PCR. Det har vist sig, at DNA-kontaminering kan være et stort, praktisk problem, når man arbejder med PCR. Det kan være krydskontamination mellem prøver eller positive kontroller eller kontamination af amplifikat fra tidligere PCR-analyser. Kontaminering til efterfølgende prøver sker fx. via aerosoldannelse. Amplificeret DNA i stor mængde findes især i forbindelse med gel-elektroforese af PCR-produkter (særlig i elektroforese-bufferen). Sikkerhedsforanstaltninger ved arbejde med PCR. I nedenstående punkter skitseres det kort, hvorledes man bedst muligt sætter sine PCR-reaktioner op, således at man sikrer sig, at PCR-reaktionsbetingelserne er optimale, og at man arbejder med mindst mulig risiko for kontaminering. 04/02 25 af 36

26 Tilsidst er skitseret et forslag til, hvordan man kan indrette sine PCR laboratorier, så procedurerne bliver adskilt (Figur 18) a) Arbejd i en LAF-bænk udstyret med UV-lys, som vil nedbryde evt. forurenende DNA fra tidligere forsøg. Rengør evt. bordflader mv. med 1M HCl (nedbryder DNA). b) Autoklaver pipettespidser, centrifugerør, reagenser. Benyt autoklaverbare pipetter. Benyt forskellige pipetter til præparation af prøver og til fremstilling af mastermix. c) Benyt handsker og skift disse ofte. Skift hyppigt kittel. d) PAS PÅ aerosoldannelse ved diverse afpipetteringer. Foretag alle reagensfremstillinger til PCR i et lokale adskilt fra der, hvor PCR- og elektroforeseapparaturet er opstillet, og hvor der foregår præparation af prøver og evt. positive kontroller. e) Bland i forvejen de 4 nukleotider i små portioner og frys ned. Dette letter pipetteringsarbejdet og mindsker risikoen for kontaminering. Tø kun den mængde dntp op, der skal bruges, idet DNA dårligt tåler gentagne nedfrysninger og optøninger. f) Lav en frisk "master-mix" bestående af vand, buffer, dntp og evt. enzym. Master mixen opbevares i mindre portioner. Tilsæt dernæst primerne og template-dna. Hvis der er en risiko for, at reaktionsmix'en indeholder proteaser (fra template-dna'et) anvendes program med hot start. g) Sæt PCR-reaktionen op på is, da fx Taq-polymerasen kan fungere helt ned til 4 grader (omend med meget lav aktivitet) med risiko for en uspecifik opformering af DNA, hvis primerne er bundet uspecifikt. Alternativt anvendes en polymerase, som skal varmeaktiveres. h) Medtag 2 negative kontroller, en prøve med heterologt DNA (dvs DNA, som ikke har homologe sekvenser med primerne) for at checke primerspecificiteten og en reagenskontrol, indeholdende alle reagenser undtagen template-dna for at checke, at der ikke er sket en kontaminering. Medtag desuden en kontrol DNA-template med tilhørende kontrolprimere, som sikkerhed for, at reaktionsbetingelserne er i orden. i) dutp/ung systemet er et simpelt system til at forhindre forurening forårsaget af tidligere PCR produkter. Systemet er baseret på Uracil N- 04/02 26 af 36

27 Glycosylase (UNG), der enzymatisk nedbryder specifikke PCR produkter fra tidligere PCR amplifikationer, men ikke primerne eller det template DNA, der skal amplificeres. UNG katalyserer fjernelsen af uracil fra enkelt og dobbeltstrenget DNA, der er dannet under tilstedeværelse af dutp. Varme og alkaliske forhold kløver dernæst DNA et på de steder, hvor uracil er indsat. Ribouracil i RNA og dutp er ikke substrater for UNG, så de nedbrydes ikke. Fig 18 : Forslag til indretning af PCR laboratorier (Fra Dansk Veterinærtidsskrift 2003, 86, 5: Når styrken er svagheden) 7. ANVENDELSE AF PCR PCR teknikken kan anvendes inden for en lang række områder. Som eksempler kan nævnes: Det, at man på kort tid og med meget lidt udgangsmateriale er i stand til at kopiere DNA i stor målestok, åbner mange anvendelsesmuligheder for PCR-metoden. Diagnostik for patogener (bakterier, virus) 04/02 27 af 36

28 Retsmedicisk diagnostik (DNA profiler) Gensplejsning Diagnostik for arvelige sygdomme Påvisning af GMO i fødevarer Diagnostik for punktmutationer PCR metoden har vist sig værdifuld såvel indenfor den genetiske grundforskning som indenfor lægevidenskaben og mikrobiologien. Metoden kan anvendes til både prænatal diagnostik af arvelige sygdomme (fx. cystisk fibrose og blødersygdommen hæmofili), retsmedicinsk diagnostik i faderskabssager, voldtægtssager og mordsager. Endelig kan arvemassen hos planter, dyr og mennesker kortlægges via PCR-metoden og museers biologiske samlinger af uddøde dyr og planter sammenlignes med nulevende arter for herigennem at klarlægge slægtsskabsforhold, evolution etc. Et af de områder som er i stærk vækst mht. anvendelsen af PCR er diagnosticering af sygdomme, der skyldes patogene (sygdomsfremkaldende) mikroorganismer. Identifikationen af et givent patogen kan ske meget hurtigt, således at en eventuel sygdomsbehandling kan startes på et tidligt tidspunkt. Herved øges chancen for helbredelse. PCR-metoden benyttes i dag til at teste for bla. AIDS virus, hepatitis B virus (leverbetændelse), kønssygdommen Chlamydia og blodinfektionen borreliose, der skyldes en bakterieinfektion efter bid af skovflåt. Der henvises til litteraturlisten for uddybning. 04/02 28 af 36

29 8. REALTIME PCR og KVANTITATIV PCR (QPCR) Ved Realtime PCR følges DNA amplifikationen løbende i processen. Realtime PCR apparater har indbygget fluorescensdetektion, så amplifikation af DNA kan ses på en skærm. Fig 19: Skærmbillede fra Realtime PCR Realtime PCR giver mulighed for at amplifikationen kan detekteres i den eksponentielle fase, hvorimod man ved traditionel PCR detekterer PCR produktet ved slutningen med gelelektroforese. Detektion Fluorescensdetektionen er baseret på, at der anvendes enten DNA bindende farvestoffer som SYBR Green I eller prober som fx Taqman og Molecular Beacons. 04/02 29 af 36

30 SYBR Green I bindes uspecifikt til ds DNA (minor groove), så jo mere DNA der amplificeres, desto flere bindingsteder er der for SYBR Green I. Farvestoffet bindes ikke til enkeltstrenget DNA og i fri opløsning udsender SYBR Green I meget lidt flourescens. Der vil således udsendes lys proportionalt med syntesen af ds DNA ved PCR. Fig 20 : Binding af SYBR Green I til DNA En begrænsning ved anvendelse af SYBR Green er, at det bindes uspecifikt til DNA, så reaktionens specificitet er bestemt udelukkende af primerne. Som konsekvens deraf er det vigtigt, at primerne er konstrueret, så uspecifik binding og primer dimer dannelse undgås. For at kontrollere reaktionens specificitet, udføres en smeltekurve analyse af PCR produkterne efter endt kørsel. Den temperatur, hvor DNA smelter, er bestemt af molekylets længde, så hvis der er amplificeret flere længder af PCR produkter, vil det kunne ses på smeltekurven. Fig 21 viser et eksempel på en smeltekurve. Først opvarmes til 95 grader, så alle PCR produkter denatureres, dernæst sænkes temperaturen til 55 grader, så alle anneales. Ved efterfølgende gradvis opvarmning vil PCR produkterne smelte ved forskellig temperatur, afhængig af længden. I en optimeret reaktion bør de smelte ved samme temperatur. 04/02 30 af 36

31 Fig 21: Smeltekurve. Hvis man ønsker højere specificitet ved detektion af PCR produktet, kan dette opnås ved anvendelse af en intern probe, udover primerne. Proben er komplementær til en del af PCR produktet og er mærket med et fluorochrom (fluorescerende stof) og en Quencher, (et dæmpende stof). Hvis proben er fri i opløsningen, altså hvis der ikke er PCR produkt tilstede, vil proben ikke udsende fluorescerende signal, da quencher molekylet dæmper lysudsendelsen fra det fluorescerende stof Er der derimod PCR produkt produceret, vil proben bindes dertil og afstanden til quencher molekylet ændres, så lysudsendelse er mulig, og der vil udsendes et signal. Der henvises til figur 22, Molecular Beacons systemet. 04/02 31 af 36

32 Fig 22: Molecular Beacons systemet. Kvantitativ PCR Realtime PCR kan anvendes til kvantitativ PCR (QPCR), hvor det er muligt at bestemme en prøves indhold af DNA ved PCR reaktionens start. Metoden kan kombineres med RTPCR, så mængden af mrna i en prøve kan bestemmes. Fig 23 viser de forskellige faser i PCR. I de første cykler, hvor der er overskud af reagenser og ingen inaktivering af Taq polymerasen, foregår amplifikationen ekponentielt, så antallet af DNA molekyler fordobles for hver cyklus. Efterhånden som reagenserne slipper op og Taq polymerasens aktivitet nedsættes, vil amplifikationen aftage, og det vil ses som et plateau på kurven. 04/02 32 af 36

33 Fig 23: Faser i PCR program. I den eksponentielle fase vil man kunne korrelere det fluorescerende signal med DNA mængden ved reaktionens start, ved at der er sammenhæng mellem startkoncentrationen af template DNA og Ct, hvor Ct er den cyklus, hvor det fluorescerende signal er signifikant over baggrundssignalet. Ct er således omvendt proportional med logaritmen til mængden af DNA ved reaktionens start. Jo mere DNA der er ved reaktionens start, desto hurtigere nåes Ct. Se fig 24. Fig 24: Threshold cycle (Ct) 04/02 33 af 36

34 Ved absolut kvantitering anvendes en standard kurve, som er udarbejdet udfra en fortyndningsrække af template DNA med kendte koncentrationer. På fig 25 ses en amplifikation af forskellige standarder i 10 folds fortynding. Fig 25: Amplifikation af kendte standarder ved QPCR (y-akse viser fluorescens og x-akse viser cyklus nr.) Efterfølgende indtegnes en standardkurve, hvor y-aksen angiver Ct værdier og x- aksen log DNA koncentration ved start (måles ofte som antal DNA kopier) Se fig /02 34 af 36

35 Fig 26: Standardkurve (y-akse: Ct, x-akse: log antal DNA kopier) Samtidig med standardrækken er der kørt prøver med ukendt DNA indhold og Ct værdierne for prøverne er målt. Ved hjælp af standardkurven kan antallet af DNA kopier i prøverne bestemmes. Se fig 27. Fig 27: Aflæsning af prøvers indhold af DNA. (Ct på 22 svarer her til et DNA indhold på 10 5 kopier.) 04/02 35 af 36

36 9. LITTERATUR FORSLAG Dieffenbach, C.W. & Dveksler, G.S. (eds.): PCR primer - A Laboratory Manual (1995) Newton, C.R. & Graham, A: PCR (1997) Kielberg, V.(red): DNA og RNA- en håndbog, Gads forlag 2003 Brown, T.A. : Gene Cloning and DNA Analysis, Blackwell Publishing 04/02 36 af 36