artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog

Transkript

1 December 2010 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog Version 1 24 Kvantitativ in vitro-diagnostik Til brug sammen med QIAsymphony SP/AS og Rotor-Gene Q-instrumenter DA QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R DA Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN prøve- og analyse-teknologier QIAGEN er den førende leverandør af innovative prøve- og analyseteknologier, der muliggør isolation og påvisning af indholdet i enhver biologisk prøve. Vore avancerede højkvalitetsprodukter og -service garanterer succes fra prøve til resultat. QIAGEN sætter standarder i: Oprensning af DNA, RNA og proteiner Nucleinsyre- og proteinanalyser microrna-undersøgelser og RNAi Automatisering af prøve- og analyse-teknologier Vor opgave er at bringe Dem i stand til at opnå enestående succes og gennembrud. For yderligere information, se

3 Indhold Kit-indhold 5 Symboler 5 Opbevaring 6 Anvendelse 6 Begrænsninger ved produktanvendelsen 6 Teknisk service 7 Sikkerhedsinformationer 7 Kvalitetskontrol 8 Indledning 9 Princip 9 Patogeninformation 9 Ydelsesegenskaber 10 Arbejdsgang 18 Udstyr og reagenser, som leveres af bruger 23 Vigtige bemærkninger 25 Almene forsigtighedsregler 25 Prøveindsamling, opbevaring og transport 25 Kom godt i gang med QIAsymphony SP/AS-instrumenter 27 Klargøring af prøvemateriale 30 Klargøring af carrier RNA (CARRIER) Buffer AVE (AVE) blandinger til plasmaprøver 30 Brug af en intern kontrol 30 Analysekontrolsæt og analyseparametersæt 32 Multianalysekørsler 33 Ydelser af nucleinsyrer 33 Opbevaring af nucleinsyrer 33 Indstilling af tærsklen for PCR-analysen 34 Kvantitering 34 Protokoller DNA-isolering på QIAsymphony SP 35 Analyseopsætning på QIAsymphony AS 43 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010 3

4 PCR og dataanalyse på Rotor-Gene Q 49 Fejlsøgning 60 Referencer 65 Bestillingsinformation 66 4 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

5 Kit-indhold artus CMV QS-RGQ Kit (24) Katalognr Antal reaktioner 24 Blå CMV RG Master 3 x 300 μl Gul CMV Mg-Sol* 600 μl Rød CMV QS 1 (1 x 10 4 kopier/μl)) 200 μl Rød CMV QS 2 (1 x 10 3 kopier/μl) 200 μl Rød CMV QS 3 (1 x 10 2 kopier/μl) 200 μl Rød CMV QS 4 (1 x 10 1 kopier/μl) 200 μl Grøn CMV IC 1000 μl Hvid Vand (PCR kvalitet) 1000 μl Håndbog 1 * Magnesium-opløsning. Kvantiteringsstandard. Intern kontrol. Symboler <N> Indeholder tilstrækkelige reagenser til <N> tests Holdbar indtil In vitro-diagnostisk medicinsk produkt Katalognummer Lot-nummer Materialenummer artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010 5

6 Komponenter Indeholder Antal Temperaturbegrænsninger Ansvarlig producent Læs brugsvejledningen Vigtig oplysning Opbevaring Komponenterne i artus CMV QS-RGQ-kit skal opbevares ved 20 C og er stabile indtil den udløbsdato, der er angivet på etiketten. Gentagne optøninger og genfrysninger (>2 x) bør undgås, da det kan reducere analysens nøjagtighed. Anvendelse artus CMV QS-RGQ-kit er en in vitro nucleinsyre-amplifikationstest til kvantitering af cytomegalovirus (CMV) DNA i humant EDTA-plasma eller humant EDTA-fuldblod. Dette diagnostiske test-kit udnytter polymerasekædereaktionen (PCR) og er konfigureret til brug sammen med QIAsymphony SP/AS og Rotor-Gene Q instrumenterne. artus CMV QS-RGQ-kit er beregnet til anvendelse i forbindelse med klinisk præsentation og andre laboratoriemarkører for sygdomsprognose. Begrænsninger ved produktanvendelsen Alle reagenser må udelukkende anvendes til in vitro-diagnostik. Produktet må kun anvendes af personale, som er specielt instrueret og uddannet i in vitro diagnostiske procedurer (EN375). Det er nødvendigt nøje at følge brugervejledningen for at opnå optimale PCRresultater. 6 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

7 Bemærk nøje udløbsdatoer, der er trykt på æsken og etiketterne til alle komponenter. Brug aldrig for gamle komponenter. Selv om det er sjældent, kan mutationer i de stærkt konserverede områder af det virale genom, der dækkes af kittets primere og/eller probe, resultere i underkvantitering eller manglende evne til at detektere tilstedeværlsen af viruset i disse tilfælde. Analysedesignets gyldighed og ydeevne revideres med jævne mellemrum. Teknisk service QIAGENs tekniske service leverer høj kvalitet og er altid til rådighed. De tekniske serviceafdelinger er bemandet med erfarne videnskabsfolk med omfattende praktisk og teoretisk erfaring inden for prøve- og analyseteknologier og i brugen af QIAGENs produkter. Kontakt os i tilfælde af spørgsmål eller vanskeligheder vedrørende artus CMV QS-RGQ-kit eller QIAGENs produkter generelt. QIAGENs kunder er en vigtig kilde til information om avancerede eller specialiserede anvendelser af vore produkter. Denne information er en hjælp for andre videnskabsfolk, såvel som for forskerne ved QIAGEN. Vi vil derfor opfordre dig til at kontakte os, hvis du har forslag omkring produktydeevne eller nye anvendelser og teknikker. For teknisk service og yderligere information henvises til vort tekniske supportcenter på eller henvendelse kan rettes til en af QIAGENs tekniske serviceafdelinger eller lokale forhandlere (se bagsiden eller besøg Sikkerhedsinformationer Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, éngangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Yderligere informationer findes i de relevante sikkerhedsdatablade (material safety data sheets, MSDS). De findes online i bekvemt og kompakt PDF-format på hvor sikkerhedsdatabladene for hvert QIAGEN-kit og hver kit-komponent kan læses og udskrives. Vedrørende sikkerhedsinformation for QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midikit, se QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Håndbogen. Se i QIAsymphony DNAhåndbogen for at få sikkerhedsoplysninger om QIAsymphony DNA Mini-kit. For sikkerhedsinformation vedrørende instrumenterne henvises til det pågældende instruments brugervejledning. Prøvepræparat- og analyseaffald bortskaffes ifølge de lokale sikkerhedsregler. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010 7

8 24-timers nødtelefon Her kan i nødstilfælde fås medicinske informationer hele døgnet rundt (på engelsk, fransk og tysk): Giftinformationscenter (Poison Information Center), Mainz, Tyskland Tlf.: Kvalitetskontrol I overensstemmelse med QIAGENs ISO-certificerede kvalitetsstyringssystem testes hvert lot af artus CMV QS-RGQ-kits efter fastlagte specifikationer for at sikre en ensartet produktkvalitet. 8 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

9 Indledning artus CMV QS-RGQ-kit udgør et brugsklart system til detekion af CMV DNA ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR) på Rotor-Gene Q-instrumenter med præveklargøring og analyseopsætning ved hjælp af QIAsymphony SP/ASinstrumenterne. CMV RG Master indeholder reagenser og enzymer til specifik amplifikation af en 105 bp region af CMV-genomet og til direkte detektion af det specifikke amplikon i fluorescenskanalen Cycling Green af Rotor-Gene Q. Desuden indeholder artus CMV QS-RGQ kit et ekstra heterologt amplifikationssystem til identifikation af mulig PCR-hæmning. Denne detekteres som en intern kontrol (IC) i fluorescenskanalen Cycling Yellow på Rotor- Gene Q. Detektionsgrænsen for den analytiske CMV PCR er ikke reduceret. Der leveres eksterne positive kontroller (CMV QS 1 4), der tillader bestemmelse af mængden af viralt DNA. For yderligere information, se Kvantitering, side 34. Princip Patogendetektion via polymerasekædereaktion (PCR) er baseret på amplifikation af specifikke områder a patogenets genom. Det amplificerede produkt detekteres i realtids-pcr via fluorescerende farver. Disse er i reglen knyttet til oligonucleotidprober, der bindes specifikt til det amplificerede produkt. Monitorering af fluorescensintensiteterne under PCR-kørslen (dvs. i realtid) muliggør detektion og kvantitering af det akkumulerede produkt, uden at man behøver genåbne reaktionsglassene efter PCR-kørslen.* Patogeninformation Hmant cytomegalovirus (CMV) findes hos inficerede personer i blod, væv og næsten alle sekretoriske væsker. Overførsel kan se oralt, seksuelt, via blodtransfusion eller organtransplantation, intrauterint er perinatalt. Infektion med CMV medfører hyppigt en asymptomatisk infecktion efterfulgt af en livslang forekomst af viruset i kroppen. Hvis der forekommer symptomer, hos teenagere eller voksne, minder de om symptomerne ved mononukleose med feber, svag hepatitis og generelt ubehag. Der er observeret flere forløb af CMVinfektion, især hos personer inficeret intrauterint og hos patienter med immundefekt. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010 9

10 Ydelsesegenskaber Analysefølsomhed plasma Den analytiske detektionsgrænse med hensyn til oprensningen (sensitivitetsgrænse) blev vurderet for artus CMV QS-RGQ-kit ved hjælp af CMV-positive kliniske prøver i kombination med ekstraktion på QIAsymphony SP. Analysefølsomheden for plasma med hensyn til oprensningen af artus CMV QS-RGQ-kit blev bestemt ved hjælp af en fortyndingsserie af CMVvirusmateriale fra 1000 til nominelt 0,316 CMV-kopier/ml tilsat i kliniske plasmaprøver. Disse blev underkastet DNA-ekstraktion ved hjælp af QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kit i kombination med Cellfree1000- protokollen (ekstraktionsvolumen: 1 ml, elueringsvolumen: 60 μl). Hver af de 10 fortyndinger blev analyseret med artus CMV QS-RG-kittet på 4 forskellige dage i 4 kørsler med hver 8 replika. Resultaterne blev bestemt med en probitanalyse. En grafisk illustration af probit-analysen er vist i Figur 1. Den analytiske detektionsgrænse med hensyn til oprensningen af artus CMV QS- RGQ-kittet i kombination med Rotor-Gene Q er 42,5 kopier/ml (p = 0,05). Det vil sige, at der er 95 % sandsynlighed for, at 42,5 kopier/ml vil blive detekteret % Proportioner Proportions , ~ 42, kopier/ml copies/ml (95%) (29,4 70,2 ( kopier/ml) copies/ml) log (dosis) (dose) Figur 1. Probit-analyse: plasma, CMV (Rotor-Gene Q). Analysefølsomheden med hensyn til oprensningen (plasma, vha. QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kit) af artus CMV QS- RGQ-kit på Rotor-Gene Q. 10 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

11 Specificitet plasma Specificiteten af artus CMV QS-RGQ-kittet sikres først og fremmest af valget af primere og prober samt valget af stringente reaktionsbetingelser. Primere og prober blev kontrolleret for mulige homologier med alle sekvenser, der er publiceret i genbanker efter sekvenssammenligningsanalyse. Detektérbarheden for alle relevante genotyper er således blevet sikret. Desuden blev specificiteten valideret med 100 forskellige CMV-negative plasmaprøver. Disse genererede ikke nogen signaler med CMV-specifikke primere og prober, som indgår i CMV RG Master. En mulig krydsreaktivitet af artus CMV QS-RGQ -kittet blev testet vha. kontrolgruppen angivet i Tabel 1 (nedenfor). Ingen af de testede patogener har været reaktive. Der vistes ingen krydsreaktiviteter med blandede infektioner. Tabel 1. Testning af kittets specificitet med potentielle krydsreaktive patogener Kontrolgruppe Human herpesvirus 1 (Herpes simplex virus 1) Human herpesvirus 2 (Herpes simplex virus 2) Human herpesvirus 3 (Varicellazoster virus) Human herpesvirus 4 (Epstein- Barr virus) CMV (Cycling Green) Intern kontrol (Cycling Yellow) Human herpesvirus 6A + Human herpesvirus 6B + Human herpesvirus 7 + Humant herpesvirus 8 (herpesvirus forbundet med Kaposi s sarkom) + Hepatitis A virus + Hepatitis B virus + Hepatitis C virus + Tabel fortsættes på næste side. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

12 Tabel 1. Fortsat Kontrolgruppe CMV (Cycling Green) Intern kontrol (Cycling Yellow) Human immundefektvirus 1 + Human T-celle-leukæmivirus 1 + Human T-celle-leukæmivirus 2 + West Nile-virus + Enterovirus + Parvovirus B19 + Lineært område plasma Det lineære område hvad angår oprensning af artus CMV QS-RGQ-kittet blev bestemt ved at analysere en fortyndingsserie af CMV-virusmateriale fra 1,00 x 10 8 kopier/ml til 3,16 x 10 1 kopier/ml i plasma. Oprensningen blev udført i replika (n = 4 for koncentrationer 1,00 x 10 7 kopier/ml; n = 8 for koncentrationer <1,00 x 10 7 kopier/ml) ved brug af QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kit i kombination med Cellfree1000 protokollen (ekstraktionsvolumen: 1 ml, elueringsvolumen: 60 μl). Hver enkelt af prøverne blev analyseret ved hjælp af artus CMV QS-RGQ-kittet. Det lineære område hvad angår oprensningen af artus CMV QS-RGQ-kittet er blevet bestemt at dække koncentrationer fra 7,94 x 10 1 kopier/ml til 1,00 x 10 8 kopier/ml for plasma (Figur 2, side 13). Robusthed plasma Verificeringen af robustheden muliggør bestemmelse af den samlede fejlrate for artus CMV QS-RGQ-kittet. For at verificere robustheden fik 100 CMV-negative plasmaprøver tilsat 130 kopier/ml CMV kontrol-dna (cirka tre gange koncentrationen af den analytiske sensitivitetsgrænse). Efter ekstraktion med QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kit i kombination med Cellfree1000_DSP-protokollen for plasma (ekstraktionsvolumen: 1 ml, elueringsvolumen: 60 μl), blev disse prøver analyseret med artus CMV QS- RGQ-kittet. Desuden blev robustheden af den interne kontrol vurderet ved oprensning og analyse af de 100 plasmaprøver med tilsætning. Der blev ikke observeret nogen hæmninger. Robustheden af artus CMV QS-RGQ-kit er således 99 %. 12 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

13 10 log 10 skønnet koncentration (kopier/ml) log 10 estimated concentration (copies/ml) y = 1,0521x x ,3653 R 2 = , log 10 log nominel 10 nominal koncentration concentration (kopier/ml) (copies/ml) Figur 2. Lineært område med artus CMV QS-RGQ-kittet (plasma). Beregning af det lineære område. Den lige linje blev bestemt ved en lineær regression af log 10 beregnede koncentrationer med log 10 nominelle koncentrationer. Regressionslinjens ligning er inkluderet i figuren. Analysefølsomhed fuldblod Den analytiske detektionsgrænse med hensyn til oprensningen (sensitivitetsgrænse) blev vurderet for artus CMV QS-RGQ-kit ved hjælp af CMV-positive kliniske prøver i kombination med ekstraktion på QIAsymphony SP. Analysefølsomheden for fuldblod med hensyn til oprensningen af artus CMV QS-RGQ-kittet blev bestemt ved hjælp af en fortyndingsserie af CMV-virusmateriale fra 1000 til nominelt 3,16 CMV-kopier/ml tilsat i humane fuldblodsprøver. Disse blev underkastet DNA-ekstraktion vha. QIAsymphony DNA Mini-kittet i kombination med VirusBlood200-protokollen (ekstraktionsvolumen: 200 μl, elueringsvolumen: 60 μl). Hver af de 8 fortyndinger blev analyseret med artus CMV QS-RG-kittet på 3 forskellige dage i 6 kørsler med hver 11 replika. Resultaterne blev bestemt med en probitanalyse. En grafisk illustration af probit-analysen er vist i Figur 3. Den analytiske detektionsgrænse med hensyn til oprensningen af artus CMV QS- RGQ-kittet i kombination med Rotor-Gene Q er 164,55 kopier/ml (p = 0,05). Det vil sige, at der er 95 % sandsynlighed for, at 164,55 kopier/ml vil blive detekteret. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

14 1.0 95% 0.8 Proportioner Proportions , ~ 164, copies/ml kopier/ml (95%) ( ,01 636,34 kopier/ml) copies/ml) log log (dosis) (dose) Figur 3. Probit-analyse: fuldblod, CMV (Rotor-Gene Q). Analysefølsomheden med hensyn til oprensningen (fuldblod, vha. QIAsymphony DNA Mini-kittet) af artus CMV QS-RGQ-kit på Rotor-Gene Q. Specificitet fuldblod Specificiteten af artus CMV QS-RGQ-kittet sikres først og fremmest af valget af primere og prober samt valget af stringente reaktionsbetingelser. Primere og prober blev kontrolleret for mulige homologier med alle sekvenser, der er publiceret i genbanker efter sekvenssammenligningsanalyse. Detektérbarheden for alle relevante genotyper er således blevet sikret. Desuden blev specificiteten valideret med 100 forskellige CMV-negative fuldblodsprøver. Disse genererede ikke nogen signaler med CMV-specifikke primere og prober, som indgår i CMV RG Master. En mulig krydsreaktivitet af artus CMV QS-RGQ-kittet blev testet vha. kontrolgruppen angivet i Tabel 1 (se side 11). Ingen af de testede patogener har været reaktive. Der vistes ingen krydsreaktiviteter med blandede infektioner. Lineært område fuldblod Det lineære område hvad angår oprensning af artus CMV QS-RGQ-kittet blev bestemt ved at analysere en fortyndingsserie af CMV-virusmateriale fra 5,00 x 10 7 til 1,00 x 10 2 i fuldblod. Oprensningen blev udført i replika (n = 4 for koncentrationer 1,00 x 10 7 kopier/ml; n = 8 for koncentrationer <1,00 x 10 7 kopier/ml) ved brug af QIAsymphony DNA Mini-kittet i kombination med VirusBlood-protokollen (ekstraktionsvolumen: 200 μl, elueringsvolumen: 60 μl). Hver enkelt af prøverne blev analyseret ved hjælp af 14 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

15 artus CMV QS-RGQ-kittet. Det lineære område hvad angår oprensningen af artus CMV QS-RGQ-kittet er blevet bestemt at dække koncentrationer fra 1,00 x 10 3 kopier/ml til 5,00 x 10 7 kopier/ml for fuldblod (Figur 4). log 10 skønnet koncentration (kopier/ml) log 10 estimated concentration (copies/ml) y y = = 1,0514x x 0, R 2 R= 2 = 0, log log 10 nominel 10 nominal koncentration concentration (kopier/ml) (copies/ml) Figur 4. Lineært område med artus CMV QS-RGQ-kittet (fuldblod). Beregning af det lineære område. Den lige linje blev bestemt ved en lineær regression af log 10 beregnede koncentrationer med log 10 nominelle koncentrationer. Regressionslinjens ligning er inkluderet i figuren. Robusthed fuldblod Verificeringen af robustheden muliggør bestemmelse af den samlede fejlrate for artus CMV QS-RGQ-kittet. For at verificere robustheden fik 100 CMV-negative fuldblodsprøver tilsat 500 kopier/ml CMV (cirka tre gange koncentrationen af den analytiske sensitivitetsgrænse). Efter ekstraktion vha. QIAsymphony DNA Mini-kittet i kombination med VirusBlood200-protokollen for fuldblod, blev disse prøver analyseret med artus CMV QS-RGQ-kittet. Desuden blev robustheden af den interne kontrol vurderet ved oprensning og analyse af de 100 fuldblodsprøver med tilsætning. Der blev ikke observeret nogen hæmninger. Robustheden af artus CMV QS-RGQ-kit er således 99 %. Præcision artus CMV QS-RGQ-kits præcisionsdata tillader bestemmelse af analysens totale varians. Den totale varians består af variabilitet inden for analysen (variabiliteten af flere resultater af prøver med samme koncentration inden for et eksperiment), variabiliteten mellem prøverne (variabiliteten af flere resultater af analysen genereret på forskellige instrumenter af samme type af forskellige artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

16 operatører inden for et laboratorium) og variabiliteten mellem batches (variabiliteten af flere resultater af analysen ved brug af forskellige batches). De opnåede data blev brugt til at bestemme standarddeviationen, variansen og variationskoefficienten for den patogenspecifikke og den interne kontrol-pcr. artus CMV QS-RGQ-kits analytiske præcisionsdata (uden hensyntagen til oprensningen) blev indsamlet ved hjælp af kvantiteringsstandarden for den laveste koncentration (QS 4; 10 kopier/μl). Testningen blev foretaget med 8 replika. Præcisionsdata blev beregnet på basis af C T værdierne af amplifikiationskurverne (C T : tærskelcyklus, se Tabel 2). Desuden blev præcisionsata for kvantitative resultater i kopier/μl bestemt ved hjælp af de tilsvarende CT-værdier (Tabel 3, side 18). Baseret på disse resultater er den samlede statistiske spredning af enhver given prøve med den nævnte koncentration 1,21% (C T ) eller 14,38% (koncentration) og 1,93% (C T ) for detektion af den interne kontrol. Disse værdier er baseret på den samlede mængde af alle enkelte værdier for de bestemte variabiliteter. 16 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

17 Tabel 2. Præcisionsdata på basis af C T værdierne Variabilitet inden for analysen: CMV QS 4 Variabilitet inden for analysen: Intern kontrol Variabilitet mellem analyser: CMV QS 4 Variabilitet mellem analyser: Intern kontrol Variabilitet mellem batches: CMV QS 4 Variabilitet mellem batches: Intern kontrol Total varians: CMV QS 4 Total varians: Intern kontrol Standardaf vigelse Varians Variationskoef ficient (%) 0,17 0,03 0,57 0,31 0,10 1,16 0,38 0,14 1,27 0,47 0,22 1,77 0,33 0,11 1,10 0,53 0,28 2,02 0,36 0,13 1,21 0,51 0,26 1,93 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

18 Tabel 3. Præcisionsdata på basis af de kvantitative resultater (i kopier/μl) Variabilitet inden for analysen: CMV QS 4 Variabilitet mellem analyser: CMV QS 4 Variabilitet mellem batches: CMV QS 4 Total varians: CMV QS 4 Standardaf vigelse Varians Variationskoef ficient (%) 1,34 1,80 13,30 1,54 2,38 15,25 1,46 2,12 14,41 1,45 2,11 14,38 Reproducérbarhed Reproducérbarhedsdata muliggør en jævnlig præstationsvurdering af artus CMV QS-RGQ-kit samt en effektivitetssammenligning med andre produkter. Disse data indhentes ved at deltage i etablerede færdighedsprogrammer. Krydskontamination Fravær af krydskontamination mellem prøverne for hele arbejdsgangen blev bevist ved korrekt detektion af alle kendte positive og negative prøver i skiftende positioner (skakbrætmønster) for et repræsentativt artus QS-RGQ-system. Arbejdsgang QIAsymphony RGQ-arbejdsgangen starter med oprensning af nucleinsyrer fra humane plasma- eller fuldblodsprøver på QIAsymphony SP-instrumentet. Eluaterne, der indeholder oprensede nucleinsyrer, fra prøveklargøringsproceduren overføres til QIAsymphony AS-modulet, som derefter gennemfører analyseopsætningen (Figur 5). Analyserne overføres derefter til Rotor-Gene Q med henblik på PCR og dataanalyse (Figur 6). En oversigt over arbejdsgangen kan ses på side For yderligere information henvises til de detaljerede protokoller i denne håndbog (side 35, 43 og 49). 18 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

19 Figur 5. Selvstændig automatisering på QIAsymphony SP/AS-instrumenter. Prøver, reagenser og forbrugsartikler lægges i de relevante skuffer. Prøveklargøring og analyseopsætning sker derefter fuldt automatisk på QIAsymphony SP/AS-instrumenterne. Figur 6. Overførsel af prøverne til Rotor-Gene Q. Efter prøveklargøring og analyseopsætning indføres reaktionerne i den 72-brøndes rotor på Rotor-Gene Q for realtids- PCR-analyse. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

20 QIAsymphony RGQ arbejdsgang oversigt QIAsymphony SP Fyld skuffen Waste. Anbring eluerings-racket i skuffen Eluate. Uafhængig funktion Integreret funktion Anbring eluerings-racket på plads 1. Anbring eluerings-rackets med adapter, inklusive overføringsrammen på plads 1. Indsæt skuffen Reagents and Consumables. Fyld skuffen Sample. Definér en kørsel/et batch ved hjælp af prøveklargøringens brugergrænseflade. Start protokollen. Når prøvebehandlingen er færdig, kan man enten tage eluerings-racket manuelt ud af skuffen Eluate (uafhængig funktion) eller foretage direkte overføring af eluerings-racket til QIAsymphony AS via overførselsmodulet (integreret funktion). Uafhængig funktion Integreret funktion Fjern elueringspladstildelingen på berøringsskærmen, åbn derefter skuffen Eluate og tag manuelt eluerings-racket ud. Tryk på Transfer for at overføre eluerings-racket fra QIAsymphony SP til QIAsymphony AS. Download QIAsymphony SP-resultatfilen. 20 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

21 QIAsymphony AS Skift til analyseopsætningens brugergrænseflade på berøringsskærmen. Start analysedefineringsprocessen. Uafhængig funktion Integreret funktion Tryk på "New". Der vises en meddelelse, hvor du bliver spurgt, om du vil bruge eluerings-racket som prøverack. Tryk på Yes for at bekræfte. Definér en analysekørsel. De skærmbilleder, der vises på berøringsskærmen vil lede dig gennem analysedefinitionsprocessen trin for trin. Fyld de aktuelle prøver, reagenser og forbrugsartikler i skufferne Eluate and Reagents (eluater og reagenser) og Assays (analyser). For detaljerede oplysninger om fyldning henvises til skærmen Loading Information (ilægningsinformation). Alternativt kan man trykke på Queue (kø) og downloade fyldningsinformationsfilen. Start analysekørslen. Når kørslen er færdig, fjernes analyserne. Det gøres ved at trykke på Remove (fjern) og dernæst manuelt fjerne analyseracket (s) fra skuffen Assays. Overfør analyseracket/ene til Rotor Gene Q. Download QIAsymphony AS-resultatfilen og behandlingsfilen. Overfør behandlingsfilen til Rotor Gene Q. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

22 Rotor-Gene Q Vælg eller opret en temperaturprofil. Klik på Start Run. Når kørslen er færdig, analyseres resultaterne. Vedligeholdelse Gennemfør de aktuelle vedligeholdelsesprocedurer for QIAsymphony SP/AS og Rotor-Gene Q i henhold til instrumenternes brugervejledninger. Se Afsnit 8 i Brugervejledningen til QIAsymphony SP/AS Generel Beskrivelse og Afsnit 9 i Brugervejledningen til Rotor-Gene Q for næremere oplysninger om de nødvendige daglige, jævnlige og ugentlige vedligeholdelsesprocedurer. 22 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

23 Udstyr og reagenser, som leveres af bruger Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, éngangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Der findes mere information i de tilhørende sikkerhedsdatablade (material safety data sheets, MSDSs), som kan fås hos den pågældende leverandør. Pipetter (justerbare)* og sterile pipettespidser med filtre Vortex-mixer* Bordcentrifuge* med rotor til 2 ml reagensglas, centrifugeringshastighed 6800 x g Til prøveklargøring QIAsymphony SP-instrument (kat. nr )* QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kit (kat. nr ) for plasmaprøver eller QIAsymphony DNA Mini-kit (kat. nr ) for fuldblodsprøver Adaptere til QIAsymphony SP: Eluerings-mikrorørs-rack QS (køleadapter, EMT, v2, Qsym, kat. nr ) Rørindsats 3B (indsats, 2,0 ml v2, prøveholder. (24), Qsym, kat. nr ) Forbrugsartikler til QIAsymphony SP: Prøveklarg. beholdere, 8-brøndes (kat. nr ) 8-stavs dæksler (kat. nr ) Filterspidser, 1500 μl (kat. nr ) Filterspidser, 200 μl (kat. nr ) Eluerings-mikrorør CL (kat. nr ) Spidsaffaldssække (kat. nr ) Mikrorør 2,0 ml Type H eller mikrorør 2,0 ml Type I (Sarstedt, kat. nr og , til anvendelse med prøver og interne kontroller * Sørg for at instrumenterne regelmæssigt kontrolleres og kalibreres efter producentens angivelser. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

24 Til analyseopsætning QIAsymphony AS-instrument (kat. nr )* Adaptere og reagensholdere til QIAsymphony AS: Reagensholder 1 QS (køleadapter, reagensholder 1, Qsym, kat. nr ) Reagensholder 2 QS (køleadapter, reagensholder 2, Qsym, kat. nr ) RG stri-rør 72 QS (køleadapter, RG strip-rør 72, Qsym, kat. nr ) Forbrugsartikler til QIAsymphony AS: Strip-rør og hætter, 0,1 ml (kat. nr ) Rør, koniske, 2 ml, Qsym AS (kat. nr ) eller mikrorør 2,0 ml Type I (Sarstedt, kat. nr , Rør, koniske, 5 ml, Qsym AS (kat. nr ) eller rør med flad basis fra PP (Sarstedt, kat. nr , Reagensglas, 30 ml, Qsym AS (kat. nr ) Eluerings-mikrorør CL (kat. nr ) Filterspidser, 1500 μl (kat. nr ) Filterspidser, 200 μl (kat. nr ) Filterspidser, 50 μl (kat. nr ) Spidsaffaldssække (kat. nr ) Til PCR Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrument* Rotor-Gene Q software version 2.02, eller højere * Sørg for at instrumenterne regelmæssigt kontrolleres og kalibreres efter producentens angivelser. Spørg efter tilgængelighed. 24 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

25 Vigtige bemærkninger Almene forsigtighedsregler Du skal altid være opmærksom på følgende: Brug sterile pipettespidser med filtre. Hold om muligt rørene lukket under manuelle trin og undgå kontaminering. Optø alle komponenter og hyggeligt ved stuetemperatur (15 25 C) før start af en analyse. Efter optøning skal komponenterne blandes (ved at pipettere op og ned flere gange eller ved impuls-votex) og cntrifugeres kort. Sørg for, at der ikke er noget skum eller nogen bobler til stede i reagensglassene. Bland ikke komponenter fra kit med forskellige lotnumre. Sørg for, at de nødvendige adapterer forkøles til 2 8 C. Arbejd hurtigt og hold PCR- reagenserne på is eller i køleblok før påfyldning. Fortsæt kontinuerligt fra den ene del af arbejdsgangen til den næste. Overskrid ikke en times overførselstid mellem hvert modul (QIAsymphony SP til QIAsymphony AS til Rotor-Gene Q). Prøveindsamling, opbevaring og transport Alle prøver skal behandles som potentielt infektiøst materiale. Kun følgende prøvematerialer er tilladt, og følgende regler og specifikke vejledninger vedrørende indsamling, transport og opbevaring skal nøje overholdes. Den interne validering af artus CMV QS-RGQ-kit er blevet udført vha. humane EDTA-plasmaprøver og humane EDTA-fuldblodsprøver. Andre prøvematerialer er ikke valideret. Brug venligst kun det anbefalede DNA-isolations-kit (se Protokol: DNA-isolering på QIAsymphony SP, side 35) for prøveklargøring. 'Ved brug af visse prøvematerialernskal specifikke vejledninger vedrørende indsamling, transport og opbevaring skal nøje overholdes. Prøveudtagning Enhver blodprøve forårsager en skade påblodkar (arterier, vener, kapillærer). Der bør kun anvendes uskadeligt og sterilt materiale. Til udtagning af blodprøver findes der egnede engangsmaterialer. Ved venepunktur bør der ikke anvendes for fine kapillarrørsnåle. Udtagning af venøst blod skal ske i artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

26 passende dele af albuebøjningen, underarmen eller håndryggen. Blod skal udtages med standard prøverør (rød hætte, Sarstedt eller tilsvarende rør fra anden producent). Der skal udtages et volumen på 5 10 ml EDTA blod. Rørene skal blandes højt oppe direkte efter prøveudtagningen (8 x, må ikke omrystes). Prøver fra hepariniserede personer må ikke anvendes (se Interfererende stoffer plasma og Interfererende stoffer fuldblod, nedenfor). Opbevaring af prøver For plasma skal fuldblod skal separeres i plasma og cellulære komponenter ved centrifugering i 20 minutter ved x g inden for 6 timer. Det isolerede plasma skal overføres til sterile polypropylenrør. Analysens følsomhed kan reduceres, hvis prøverne rutinemæssigt fryses eller opbevares i længere tid. Transport af prøver Prøvemateriale skal principielt transporteres i en knusningssikker transportbeholder. Dermed kan en potentiel infektionsfare som følge af udlækkende prøvemateriale undgås. Prøverne skal transporteres i henhold til lokale og nationale vejledninger i transport af patogent materiale.* Prøverne skal afsendes inden for 6 timer. Det anbefales ikke at opbevare prøverne der, hvor de er indsamlet. Det er muligt at sende prøverne med post i henhold til de lovbefalede vejledninger i transport af patogent materiale. Vi anbefaler, at prøven transporteres med kurer. Blodprøverne skal sendes på køl (2 8 C) og separeret plasma i dybfrossen tilstand ( 15 til 30 C). Interfererende stoffer plasma Forhøjede niveauer af albumin ( 6 g/dl), bilirubin ( 30 mg/dl) og lipider ( 1 g/dl triglycerid) og hæmolytiske prøver ( 2 g/dl hæmoglobin) påvirker ikke systemet. Heparin påvirker PCR'en. Prøver, der er indsamlet i rør, der indeholder heparin som antikoagulant, bør ikke anvendes. Prøver fra hepariniserede patienter må heller ikke anvendes. * International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations (Regler vedrørende transport af farligt gods). 26 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

27 Interfererende stoffer fuldblod Forhøjede niveauer af bilirubin ( 30 mg/dl), lipider ( 1 g/dl triglycerid) og humant genomt DNA ( 3 μg/ml) påvirker ikke systemet. Heparin påvirker PCR'en. Prøver, der er indsamlet i rør, der indeholder heparin som antikoagulant, bør ikke anvendes. Prøver fra hepariniserede patienter må heller ikke anvendes. Kom godt i gang med QIAsymphony SP/AS-instrumenter Luk alle skuffer og hætter. Tænd for QIAsymphony SP/AS-instrumenterne og vent, til skærmen Sample Preparation (prøveklargøring) vises, og initieringsproceduren er færdig. Log på instrumentet (skuffernes lås vil åbnes). Indsætning af reagensbeholdere (RC) i skuffen Reagents and Consumables (reagenser og forbrugsartikler) Reagenser til nucleinsyreoprensning er indeholdt i en innovativ reagensbeholder (RC) (se Figur 7). Hver brønd i reagensbeholderen (RC) indeholder et specifikt reagens, såsom magnetiske partikler, lysisbuffer, vaskebuffer eller eluerings. Delvist brugte reagensbeholdere (RC) kan genlukkes med genbrugsforseglingsstrips med henblik på senere genbrug, hvilket medvirker til at undgå generering af affald på grund af rest-reagenser i slutningen af oprensningsproceduren. Gennembrydningslåg (PL) Enzym-rack (ER) Pladser til skruehætter fra enzymrør Genbrugsforseglings-strip Magnetisk partikel-brønd Ramme med reagens-brønde Holder til reagensbeholder Figur 7. QIAsymphony reagensbeholder (RC). Reagensbeholderen (RC) indeholder alle de reagenser, der kræves til oprensningsproceduren. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

28 Før proceduren startes, skal man sikre sig, at magnetpartiklerne er fuldt resuspenderede. Fjern magnetpartikelbrønden fra reagensbeholderrammen, hvirvl den kraftigt i mindst 3 minutter og sæt den i reagensbeholderrammen igen før første brug. Anbring reagensbeholderen (RC) i holderen til reagensbeholderen. Anbring enzyn-racket (ER) i holderen til reagensbeholderen. Før en reagensbeholder (RC) bruges første gang, anbringes låget (PL) oven på reagensbeholderen (RC) (Figur 8). Gennembrydningslåget (PL) er skarpt. Pas på, når det placeres på reagensbeholderen (RC). Sørg for at placere gennembrydningslåget (PL) på reagensbeholderen (RC), så det vender rigtigt. Når magnetpartikelbrøndens dæksel er fjernet, og enzym-rackglassene er åbnet (skruelågene kan gemmes i hertil hørende pladser, se Figur 5), sættes reagensbeholderen (RC) derefter i skuffen Reagents and Consumables. Gennembrydningslåg (PL) Figur 8. Nem opsætning af arbejdsbordet med reagensbeholdere (RC). Delvist brugte reagensbeholdere (RC) kan opbevares, til de skal bruges igen, se Opbevaring i QIAsymphony DSP Virus/Pathogen-håndbogen eller QIAsymphony DNA-håndbogen. Indsætning af plastmateriale i skuffen Reagents and Consumables Prøveklargøringsbeholdere, 8-stavs dæksler (begge i racks med enhedsbokse) og engangs-filterspidser (200 μl spidser leveret i blå racks, 1500 μl spidser leveret i sorte racks) er lagt i skuffen Reagents and Consumables. Kontrollér, at dækslerne til enhedsboksene er fjernet, før enhedsboksene sættes i skuffen Reagents and Consumables. 28 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

29 Spidserne er forsynet med filtre for hjælpe med til at forebygge krydskontamination. Spidsrack-pladserne på QIAsymphony SP arbejdsbord kan være fyldt med den eller den anden type spids-rack. QIAsymphony SP vil identificere, hvilken type spidser, der er isat, under indholdsscanningen. Genpåfyld ikke spids-racks eller enhedsbokse til prøveklargøringsbeholdere eller 8-stavs dæksler manuelt, før der påbegyndes en anden protokolkørsel. QIAsymphony SP kan bruge delvist brugte spids-racks og enhedsbokse. Fyldning af skuffen Waste Prøveklargøringsbeholdere og 8 stavdæksler, der anvendes under en kørsel, overføres til racks med tomme enhedsbokse i Waste -skuffen. Kontrollér, at Waste -skuffen indeholder tilstrækkeligt mange tomme enhedsbokse til plastafald, der genereres under protokolkørslen. Kontrollér, at dækslerne til enhedsboksene er fjernet, før enhedsboksene sættes i skuffen Waste. Hvis du bruger bokse til 8-stavs dæksler til indsamling af brugte prøveklargøringsbeholdere og 8-stavs dæksler, skal du sikre dig, at boksafstandsholderen er fjernet. Der skal være fastgjort en pose til brugte filterspidser til frontsiden af Waste - skuffen. Systemet kontrollerer ikke selv, om der er en affaldssæk til stede. Kontrollér, at affaldssækken er korrekt fastgjort, fåør der påbegyndes en ny protokolkørsel. For yderligere information henvises til de brugervejledninger, der følger med instrumentet. Tøm spidsposen efter at maksimalt 96 prøver er behandlet, for at undgå overfyldning af spidser. En affaldsbeholder opsamler flydende affald, der genereres under oprensningsproceduren. Skuffen Waste kan kun lukkes, hvis affaldsbeholderen er på plads. Bortskaf den flydende affald i overensstemmelse med de lokale sikkerheds- og miljøbestemmelser. Den fyldte affaldsflaske må ikke autoklaveres. Tøm affaldsflasken efter, at maksimalt 96 prøver er behandlet. Fyldning af skuffen Eluate Indsæt eluerings-racket i skuffen Eluate. Benyt Elution slot 1 sammen med den tilhørende køleadapter. For integreret drift placeres eluerings-racket med adapter inklusive overførselsrammen på plads 1. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

30 Indholdsscanning Før en kørsel startes kontrollerer instrumentet, at der er placeret keligt med forbrugsartikler til de(t) batch(es), der er i kø,i de tilhørende skuffer. Klargøring af prøvemateriale QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kittet er egnet til anvendelse med humane plasmaprøver og QIAsymphony DNA Mini-kittet er egnet til anvendelse med humane fuldblodsprøver. Forebyg dannelse af skum i eller på prøverne. Prøverne skal afbalanceres til stuetemperatur (15 25 C), før kørslen startes. Klargøring af carrier RNA (CARRIER) Buffer AVE (AVE) blandinger til plasmaprøver Carrier RNA (CARRIER) skal anvendes, når QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kittet anvendes. For at klargøre en bærer-rna (CARRIER) stamopløsning tilsættes 1350 μl buffer AVE (AVE) (leveres i 2 ml hætteglas) til det glas, der indeholder 1350 μg lyofilseret bærer-rna (CARRIER) for at opnå enopløsning på 1 μg/μl. Opløs bærer-rna (CARRIER) omhyggeligt, del det op i alikvoter af passende størrelse og opbevar det ved 2 8 C i op til 2 uger. Beregning af mængden af bærer-rna (CARRIER)-blanding per glas Minimumvolumen af bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blandingen skal indeholde tilstrækkeligt ekstra volumen til at tage højde for væsketab til pipettering og forsampning. Se Tabel 4 for hvilke volumener, der skal bruges til analyse med artus CMV QS-RGQ-kit. Rør indeholdende bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE) (og valgfri intern kontrol)-blandinger placeres i en rørholder. Rørholderen med bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blanding(er) skal placeres i plads A i prøveskuffen. Der kan bruges op til 8 rør af blandingen per batch, og der kan bruges op til 24 rør per kørsel med 4 batches. Brug af en intern kontrol Der leveres en intern kontrol (CMV IC) sammen med artus CMV QS-RGQ-kit. Dette giver brugeren mulighed for både at kontrollere DNAisoleringsproceduren og kontrollere for mulig PCR-hæmning. Hvis CMV og EBV skal analyseres i samme PCR-kørsel på Rotor-Gene Q (se Multianalysekørsler, side 33), skal CMV IC anvendes til alle prøver og ikke EBV RG IC, der var inkluderet i artus EBV QS-RGQ-kittet. Den samme CMV IC 30 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

31 skal også anvendes til analyseopsætning af PCR-kontrollerne (trin 13 i analyseopsætningsprotokollen, side 45). Brug af QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kittet eller QIAsymphony DNA Mini-kittet i kombination med artus CMV QS-RGQ-kittet kræver indføring af den interne kontrol (CMV IC) i oprensningsproceduren for at overvåge effektiviteten af prøveklargøringen og efterfølgende analyse. For plasmaprøver skal interne kontroller tilsættes ved carrier RNA (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blanding, og det samlede volumen af blandingen af intern kontrol og carrier RNA (CARRIER) Buffer AVE (AVE) -blanding forbliver 120 μl. For fuldblodsprøver skal interne kontroller fortyndes i Buffer ATE. En samlet volumen på 60 μl intern control Buffer ATE-blanding tilsættes pr. prøve. Til denne anvendelse tilsættes den interne kontrol til isolationen som vist i Tabel 4. Dette udgør tilsætning af intern kontrol til isolationen i et forhold på 0,1 μl per 1 μl elueringsvolumen. Vi anbefaler at klargøre friske blandinger for hver kørsel lige før brug. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

32 Tabel 4. Klargøring af intern kontrol bærer RNA (CARRIER) Plasmaprøver Fuldblodsprøver Komponent Volumen (μl) Volumen (μl) Stambærer-RNA (CARRIER) 5 0 Intern kontrol* 9 9 Buffer AVE Buffer AVE 0 51 Endelig volumen pr. prøve (eksklusive dødvolumen) Samlet volumen for n- prøver (n x 120) (n x 60) * Beregningen af mængden af intern kontrol er baseret på de initielle elueringsvolumener (90 μl). Ekstra tom-volumen afhænger af typen af den anvendte prøve. Fyld højst 1,92 ml (svarende til maksimum 13 eller 26 prøver; denne volumen er specifik for mikrorør 2,0 ml Type H og mikrorør 2,0 ml Type I, Sarstedt kat. nr og ). Intern kontrolblanding, der svarer til 3 yderligere prøver (dvs. 360 μl) er påkrævet. (Denne volumen er specifik for mikrorør 2,0 ml Type H og mikrorør 2,0 ml Type I, Sarstedt kat. nr og ). Intern kontrolblanding, der svarer til 4 yderligere prøver (dvs. 240 μl) er påkrævet. (Denne volumen er specifik for mikrorør 2,0 ml Type H og mikrorør 2,0 ml Type I, Sarstedt kat. nr og ). Analysekontrolsæt og analyseparametersæt Analysekontrolsæt er kombinationen af en protokol plus supplerende parametre, så som intern kontrol, til prøveoprensning på QIAsymphony SP. Der er på forhånd installeret et standard-analysekontrolsæt for hver protokol. Hvis CMV og EBV skal analyseres i samme PCR-kørsel på Rotor-Gene Q (se Multianalysekørsler, nedenfor), anvendes det relevante CMVanalysekontrolsæt til prøveoprensningen. Analyseparametersæt er kombinationen a en analysedefinition med supplerende parametre defineret, så som replikatælling og antal analtsestandarder, til analyseopsætning på QIAsymphony AS. 32 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

33 Multianalysekørsler I visse tilfælde er det muligt at analysere en enkelt prøve for mere end et patogen i samme PCR i QIAsymphony RGQ-arbejdsgangen. Dette kaldes en multianalysekørsel. Flere krav skal opfyldes for en multianalysekørsel. artus CMV QS-RGQ-kittet kan anvendes med artus EBV QS-RGQ-kittet (kat. nr ) i en multianalysekørsel, hvis følgende krav er opfyldt. Prøveklargøring på QIAsymphony SP Til oprensning af prøver, der skal testes for CMV og EBV vha. samme eluat, anvendes CMV IC til alle prøver og ikke EBV RG IC, der er inkluderet i artus EBV QS-RGQ-kittet. Anvend det relevante CMV-analysekontrolsæt til prøveoprensning. Analyseopsætning på QIAsymphony AS For behørig kvantitering samt en gyldig opysning givet af den interne kontrol, skal den interne kontrol til opsætning af begge analyser svare til den, der blev anvendt til prøveklargøringen (CMV IC). Anvend en CMV IC fra samme lot til både prøveklargøring og til analyseopsætning af PCR-kontrollerne (trin 13 i analyseopsætningsprotokollen, side 45). Der må ikke anvendes en CMV IC med et andet lotnummer. PCR på Rotor-Gene Q Pga. forskelle i fluorescensintensiteterne, når der anvendes 2 forskellige analyser i en multianalysekørsel, er det nødvendigt at foretage en gainkalibrering for hvert artus-detektionssystem separat før PCR-kørslen startes (trin 9 15 i PCR-protokollen, side 54 56). Ydelser af nucleinsyrer Eluater, der er klargjort med bærer-rna (CARRIER), kan indeholde meget mere bærer-rna (CARRIER) end target-nucleinsyrer. Vi anbefaler at bruge kvantitative amplifikationsmetoder til bestemmelse af ydelserne. Opbevaring af nucleinsyrer For korttidsopbevaring på op til 24 timer anbefaler vi at opbevare oprensede nucleinsyrer ved 2 8 ºC. For langtidsopbevaring på mere end 24 timer anbefaler vi opbevaring ved 20 ºC. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

34 Indstilling af tærsklen for PCR-analysen De optimale tærskelindstillinger for en given kombination af Rotor-Gene Q- instrumentet og artus QS-RGQ-kittet skal sættes empirisk ved at teste hver individuel kombination, eftersom det er en relativ værdi, afhængig af den generelle diagnostiske arbejdsgang. Som udgangspunkt kan tærsklen indstilles på en præliminær værdi på 0,04 til analysen af den første PCR-kørsel, men denne værdi skal finindstilles i en komparativ analyse af de næste kørsler af arbejdsgangen. Tærsklen skal indstilles manuelt lige over baggrundssignalet for de negative kontroller og negative prøver. Middeltærskelværdien, der er beregnet ud fra disse eksperimenter, vil højst sandsynligt fungere for størstedelen af fremtidige kørsler, men brugeren skulle ikke desto mindre gennemse den genererede tærskelværdi med regelmæssige mellemrum. Tærskelværdien vil sædvanligvis være inden for området 0,03 0,05 og skal rundes op til højst tre decimalpladser. Kvantitering Kvantiteringsstandarderne (CMV QS 1 4) i artus CMV QS-RGQ-kit behandles som tidligere oprensede prøver, og der anvendes samme volumen (20 μl). For at generere en standardkurve på Rotor-Gene Q-instrumenter bør alle 4 kvantiteringsstandarder bruges og defineres i dialogboksen Edit Samples (rediger prøver) på Rotor-Gene Q-instrumentet som standarder med de specificerede koncentrationer (se instrumentéts brugervejledningl). Kvantiteringsstandarderne defineres som kopier/μl. Følgende ligning skal anvendes for at konvertere værdierne, der er bestemt ved hjælp af standardkurven, til kopier/ml af prøvematerialet: Resultat (kopier/ml) = Resultat (kopier/μl) x Initielt elueringsvolumen (90 μl)* Prøvevolumen (ml) Principielt skal det initielle prøvevolumen indsættes i ligningen ovenfor. Dette skal der tages hensyn til, når prøvevolumenet er blevet ændret før nucleinsyreekstraktionen (f.eks. ved at reducere volumenet ved centrifugering eller ved at øge volumenet ved at øge det volumen, der kræves for isoleringen). * Beregningen er baseret på de initielle elueringsvolumener (90 μl). 34 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

35 Protokol: DNA-isolering på QIAsymphony SP QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kittet (QIAGEN, kat. nr ) er valideret til viral DNA-oprensning fra humant plasma og QIAsymphony DNA Mini-kittet (QIAGEN, kat. nr ) er valideret for DNA oprensning fra humant fuldblod til anvendelse med artus CMV QS-RGQ-kittet. Almen information om protokollerne er vist i Tabel 5. Tabel 5. Generel protokolinformation Kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit QIAsymphony DNA Mini Kit Prøvemateriale Plasma Fuldblod Prøvevolumen (inklusive overskydende volumen) 1200 μl 300 μl Protokolnavn Cellfree1000_V4_DSP* VirusBlood200_V4* Standard analysekontrolsæt ACS_Cellfree1000_V4_ DSP artus CMV* Elueringsvolumen 60 μl 60 μl Påkrævet software-version Version 3.1 eller højere ACS_VirusBlood200_V4_ artus_cmv* Version 3.5 eller højere * V4 eller højere, som påkrævet af den anvendte softwareversion. For en multianalysekørsel hvor både CMV og EBV vil blive analyseret i samme PCR, anvendes det behørige CMVanalysekontrolsæt til prøveoprensning. Vigtige anvisninger før start Sørg for, at du er bekendt med betjeningen af QIAsymphony SP/ASinstrumenterne. Se de betjeningsvejledning i de brugervejledninger, der leveres sammen med instrumenterne. Før proceduren påbegyndes, bør Vigtige bemærkninger, side gennemlæses. Før en reagensbeholder (RC) bruges første gang skal det kontrolleres, at bufferne QSL2 og QSB1 i beholderen (RC) ikke indeholder et præcipitat. Fjern om nødvendigt de brønde, der indeholder bufferne QSL2 og QSB1, fra reagensbeholderen (RC) og inkuber i 30 minutter ved 37 C med jævnlig omrystning for at opløse præcipitatet. Sørg for at sætte brøndene ind på de rigtige pladser igen. Hvis reagensbeholderen (RC) allerede er artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

36 gennembrudt, skal man sikre sig, at brøndene er forseglet med genbrugsforseglingstrips, derefter inkuberes hele reagensbeholderen (RC) i 30 minutter ved 37 C med jævnlig omrystning i vandbad.* Forsøg at undgå for voldsom omrystning af reagensbeholderen (RC), ellers kan der dannes skum, hvilket kan medføre problemer med detektion af væskestanden. Alle komponenter i QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kit har vist sig stabile i QIAsymphony SP/AS-instrumenter i mindst den normale tid, der kræves for at behandle 96 prøver. Ting, der skal gøres før start Klargør alle nødvendige blandinger, inklusive blandinger der indeholder bærer-rna (CARRIER) og interne kontroller lige før start. For yderligere oplysninger, se Klargøring af carrier RNA (CARRIER) Buffer AVE (AVE) blandinger til plasmaprøver, side 30, og Brug af en intern kontrol, side 30. Sørg for, at gennembrydningslåget (PL) placeres på reagensbeholderen (RC), og at låget til magnetpartikelbrønden er fjernet, eller - hvis der benyttes en delvist brugt reagensbeholder (RC) - sørg for, at genbrugsforseglingsstrips er fjernet. Før proceduren startes, skal man sikre sig, at magnetpartiklerne er fuldt resuspenderede. Hvirvl brønden med magnetpartiklerne kraftigt i mindst 3 minutter før første brug. Før reagensbeholderen (RC) isættes, fjernes dækslet fra brønsen, der indeholder magnetpartiklerne, og enzymglassene åbnes. Sørg for, at enzym-racket er afbalanceret til stuetemperatur (15 25 C). Sørg for, at gennembrydningslåget (PL) placeres på reagensbeholderen (RC), eller - hvis der benyttes en delvist brugt reagensbeholder - sørg for, at genbrugsforseglingsstrips er fjernet. Hvis prøverne er forsynet med stregkoder, vendes prøverne i rørholderen sådan, at stregkoderne vender mod stregkodelæseren i Sample -skuffen i venstre side af QIAsymphony SP. Procedure 1. Luk alle skuffer og hætter på QIAsymphony SP/AS-instrumenterne. 2. Tænd for instrumenterne og vent, til skærmen Sample Preparation (prøveklargøring) vises, og initieringsproceduren er færdig. Afbryderkontakten sidder i nederste venstre hjørne af QIAsymphony SP. * Sørg for, at instrumenterne regelmæssigt kontrolleres, vedligeholdes og kalibreres efter producentens vejledning. 36 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

37 3. Log ind på instrumenterne. 4. Sørg for, at Waste -skuffen er korrekt klargjort (se Tabel 6) og gennemfør en indholdsscanning af Waste -skuffen inklusive spidsskakt og flydende affald. Udskift om nødvendigt spidsaffaldsposen. Tabel 6. Klargøring af Waste -skuffen Enhedsboksholder 1 4 Affaldsposeholder Holder til flaske til flydende affald Tomme enhedsbokse Isæt affaldspose Tøm og indsæt flaske til flydende affald 5. Indsæt eluerings-racket i skuffen Eluate. Brug kun Elution slot 1 med den tiilhørende køleadapter (Cooling Adapter, EMT, v2, Qsym, kat. nr ). For integreret drift placeres eluerings-racket med adapter inklusive overførselsrammen på plads Indsæt de(n) nødvendige reagensbeholder(e) (RC) og forbrugsartikler i skuffen Reagents and Consumables (se Tabel 7 og 8). Antallet af angivne filterspidser kan afvige fra det antal, der vises på berøringsskærmen, afhængigt af indstillinger. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/