artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog

Transkript

1 December 2010 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog Version 1 24 Kvantitativ in vitro-diagnostik Til brug sammen med QIAsymphony SP/AS og Rotor-Gene Q-instrumenter DA QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R DA Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN prøve- og analyse-teknologier QIAGEN er den førende leverandør af innovative prøve- og analyseteknologier, der muliggør isolation og påvisning af indholdet i enhver biologisk prøve. Vore avancerede højkvalitetsprodukter og -service garanterer succes fra prøve til resultat. QIAGEN sætter standarder i: Oprensning af DNA, RNA og proteiner Nucleinsyre- og proteinanalyser microrna-undersøgelser og RNAi Automatisering af prøve- og analyse-teknologier Vor opgave er at bringe Dem i stand til at opnå enestående succes og gennembrud. For yderligere information, se

3 Indhold Kit-indhold 5 Symboler 5 Opbevaring 6 Anvendelse 6 Begrænsninger ved produktanvendelsen 6 Teknisk service 7 Sikkerhedsinformationer 7 Kvalitetskontrol 8 Indledning 9 Princip 9 Patogeninformation 9 Ydelsesegenskaber 10 Arbejdsgang 18 Udstyr og reagenser, som leveres af bruger 23 Vigtige bemærkninger 25 Almene forsigtighedsregler 25 Prøveindsamling, opbevaring og transport 25 Kom godt i gang med QIAsymphony SP/AS-instrumenter 27 Klargøring af prøvemateriale 30 Klargøring af carrier RNA (CARRIER) Buffer AVE (AVE) blandinger til plasmaprøver 30 Brug af en intern kontrol 30 Analysekontrolsæt og analyseparametersæt 32 Multianalysekørsler 33 Ydelser af nucleinsyrer 33 Opbevaring af nucleinsyrer 33 Indstilling af tærsklen for PCR-analysen 34 Kvantitering 34 Protokoller DNA-isolering på QIAsymphony SP 35 Analyseopsætning på QIAsymphony AS 43 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010 3

4 PCR og dataanalyse på Rotor-Gene Q 49 Fejlsøgning 60 Referencer 65 Bestillingsinformation 66 4 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

5 Kit-indhold artus CMV QS-RGQ Kit (24) Katalognr Antal reaktioner 24 Blå CMV RG Master 3 x 300 μl Gul CMV Mg-Sol* 600 μl Rød CMV QS 1 (1 x 10 4 kopier/μl)) 200 μl Rød CMV QS 2 (1 x 10 3 kopier/μl) 200 μl Rød CMV QS 3 (1 x 10 2 kopier/μl) 200 μl Rød CMV QS 4 (1 x 10 1 kopier/μl) 200 μl Grøn CMV IC 1000 μl Hvid Vand (PCR kvalitet) 1000 μl Håndbog 1 * Magnesium-opløsning. Kvantiteringsstandard. Intern kontrol. Symboler <N> Indeholder tilstrækkelige reagenser til <N> tests Holdbar indtil In vitro-diagnostisk medicinsk produkt Katalognummer Lot-nummer Materialenummer artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010 5

6 Komponenter Indeholder Antal Temperaturbegrænsninger Ansvarlig producent Læs brugsvejledningen Vigtig oplysning Opbevaring Komponenterne i artus CMV QS-RGQ-kit skal opbevares ved 20 C og er stabile indtil den udløbsdato, der er angivet på etiketten. Gentagne optøninger og genfrysninger (>2 x) bør undgås, da det kan reducere analysens nøjagtighed. Anvendelse artus CMV QS-RGQ-kit er en in vitro nucleinsyre-amplifikationstest til kvantitering af cytomegalovirus (CMV) DNA i humant EDTA-plasma eller humant EDTA-fuldblod. Dette diagnostiske test-kit udnytter polymerasekædereaktionen (PCR) og er konfigureret til brug sammen med QIAsymphony SP/AS og Rotor-Gene Q instrumenterne. artus CMV QS-RGQ-kit er beregnet til anvendelse i forbindelse med klinisk præsentation og andre laboratoriemarkører for sygdomsprognose. Begrænsninger ved produktanvendelsen Alle reagenser må udelukkende anvendes til in vitro-diagnostik. Produktet må kun anvendes af personale, som er specielt instrueret og uddannet i in vitro diagnostiske procedurer (EN375). Det er nødvendigt nøje at følge brugervejledningen for at opnå optimale PCRresultater. 6 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

7 Bemærk nøje udløbsdatoer, der er trykt på æsken og etiketterne til alle komponenter. Brug aldrig for gamle komponenter. Selv om det er sjældent, kan mutationer i de stærkt konserverede områder af det virale genom, der dækkes af kittets primere og/eller probe, resultere i underkvantitering eller manglende evne til at detektere tilstedeværlsen af viruset i disse tilfælde. Analysedesignets gyldighed og ydeevne revideres med jævne mellemrum. Teknisk service QIAGENs tekniske service leverer høj kvalitet og er altid til rådighed. De tekniske serviceafdelinger er bemandet med erfarne videnskabsfolk med omfattende praktisk og teoretisk erfaring inden for prøve- og analyseteknologier og i brugen af QIAGENs produkter. Kontakt os i tilfælde af spørgsmål eller vanskeligheder vedrørende artus CMV QS-RGQ-kit eller QIAGENs produkter generelt. QIAGENs kunder er en vigtig kilde til information om avancerede eller specialiserede anvendelser af vore produkter. Denne information er en hjælp for andre videnskabsfolk, såvel som for forskerne ved QIAGEN. Vi vil derfor opfordre dig til at kontakte os, hvis du har forslag omkring produktydeevne eller nye anvendelser og teknikker. For teknisk service og yderligere information henvises til vort tekniske supportcenter på eller henvendelse kan rettes til en af QIAGENs tekniske serviceafdelinger eller lokale forhandlere (se bagsiden eller besøg Sikkerhedsinformationer Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, éngangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Yderligere informationer findes i de relevante sikkerhedsdatablade (material safety data sheets, MSDS). De findes online i bekvemt og kompakt PDF-format på hvor sikkerhedsdatabladene for hvert QIAGEN-kit og hver kit-komponent kan læses og udskrives. Vedrørende sikkerhedsinformation for QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midikit, se QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Håndbogen. Se i QIAsymphony DNAhåndbogen for at få sikkerhedsoplysninger om QIAsymphony DNA Mini-kit. For sikkerhedsinformation vedrørende instrumenterne henvises til det pågældende instruments brugervejledning. Prøvepræparat- og analyseaffald bortskaffes ifølge de lokale sikkerhedsregler. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010 7

8 24-timers nødtelefon Her kan i nødstilfælde fås medicinske informationer hele døgnet rundt (på engelsk, fransk og tysk): Giftinformationscenter (Poison Information Center), Mainz, Tyskland Tlf.: Kvalitetskontrol I overensstemmelse med QIAGENs ISO-certificerede kvalitetsstyringssystem testes hvert lot af artus CMV QS-RGQ-kits efter fastlagte specifikationer for at sikre en ensartet produktkvalitet. 8 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

9 Indledning artus CMV QS-RGQ-kit udgør et brugsklart system til detekion af CMV DNA ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR) på Rotor-Gene Q-instrumenter med præveklargøring og analyseopsætning ved hjælp af QIAsymphony SP/ASinstrumenterne. CMV RG Master indeholder reagenser og enzymer til specifik amplifikation af en 105 bp region af CMV-genomet og til direkte detektion af det specifikke amplikon i fluorescenskanalen Cycling Green af Rotor-Gene Q. Desuden indeholder artus CMV QS-RGQ kit et ekstra heterologt amplifikationssystem til identifikation af mulig PCR-hæmning. Denne detekteres som en intern kontrol (IC) i fluorescenskanalen Cycling Yellow på Rotor- Gene Q. Detektionsgrænsen for den analytiske CMV PCR er ikke reduceret. Der leveres eksterne positive kontroller (CMV QS 1 4), der tillader bestemmelse af mængden af viralt DNA. For yderligere information, se Kvantitering, side 34. Princip Patogendetektion via polymerasekædereaktion (PCR) er baseret på amplifikation af specifikke områder a patogenets genom. Det amplificerede produkt detekteres i realtids-pcr via fluorescerende farver. Disse er i reglen knyttet til oligonucleotidprober, der bindes specifikt til det amplificerede produkt. Monitorering af fluorescensintensiteterne under PCR-kørslen (dvs. i realtid) muliggør detektion og kvantitering af det akkumulerede produkt, uden at man behøver genåbne reaktionsglassene efter PCR-kørslen.* Patogeninformation Hmant cytomegalovirus (CMV) findes hos inficerede personer i blod, væv og næsten alle sekretoriske væsker. Overførsel kan se oralt, seksuelt, via blodtransfusion eller organtransplantation, intrauterint er perinatalt. Infektion med CMV medfører hyppigt en asymptomatisk infecktion efterfulgt af en livslang forekomst af viruset i kroppen. Hvis der forekommer symptomer, hos teenagere eller voksne, minder de om symptomerne ved mononukleose med feber, svag hepatitis og generelt ubehag. Der er observeret flere forløb af CMVinfektion, især hos personer inficeret intrauterint og hos patienter med immundefekt. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010 9

10 Ydelsesegenskaber Analysefølsomhed plasma Den analytiske detektionsgrænse med hensyn til oprensningen (sensitivitetsgrænse) blev vurderet for artus CMV QS-RGQ-kit ved hjælp af CMV-positive kliniske prøver i kombination med ekstraktion på QIAsymphony SP. Analysefølsomheden for plasma med hensyn til oprensningen af artus CMV QS-RGQ-kit blev bestemt ved hjælp af en fortyndingsserie af CMVvirusmateriale fra 1000 til nominelt 0,316 CMV-kopier/ml tilsat i kliniske plasmaprøver. Disse blev underkastet DNA-ekstraktion ved hjælp af QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kit i kombination med Cellfree1000- protokollen (ekstraktionsvolumen: 1 ml, elueringsvolumen: 60 μl). Hver af de 10 fortyndinger blev analyseret med artus CMV QS-RG-kittet på 4 forskellige dage i 4 kørsler med hver 8 replika. Resultaterne blev bestemt med en probitanalyse. En grafisk illustration af probit-analysen er vist i Figur 1. Den analytiske detektionsgrænse med hensyn til oprensningen af artus CMV QS- RGQ-kittet i kombination med Rotor-Gene Q er 42,5 kopier/ml (p = 0,05). Det vil sige, at der er 95 % sandsynlighed for, at 42,5 kopier/ml vil blive detekteret % Proportioner Proportions , ~ 42, kopier/ml copies/ml (95%) (29,4 70,2 ( kopier/ml) copies/ml) log (dosis) (dose) Figur 1. Probit-analyse: plasma, CMV (Rotor-Gene Q). Analysefølsomheden med hensyn til oprensningen (plasma, vha. QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kit) af artus CMV QS- RGQ-kit på Rotor-Gene Q. 10 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

11 Specificitet plasma Specificiteten af artus CMV QS-RGQ-kittet sikres først og fremmest af valget af primere og prober samt valget af stringente reaktionsbetingelser. Primere og prober blev kontrolleret for mulige homologier med alle sekvenser, der er publiceret i genbanker efter sekvenssammenligningsanalyse. Detektérbarheden for alle relevante genotyper er således blevet sikret. Desuden blev specificiteten valideret med 100 forskellige CMV-negative plasmaprøver. Disse genererede ikke nogen signaler med CMV-specifikke primere og prober, som indgår i CMV RG Master. En mulig krydsreaktivitet af artus CMV QS-RGQ -kittet blev testet vha. kontrolgruppen angivet i Tabel 1 (nedenfor). Ingen af de testede patogener har været reaktive. Der vistes ingen krydsreaktiviteter med blandede infektioner. Tabel 1. Testning af kittets specificitet med potentielle krydsreaktive patogener Kontrolgruppe Human herpesvirus 1 (Herpes simplex virus 1) Human herpesvirus 2 (Herpes simplex virus 2) Human herpesvirus 3 (Varicellazoster virus) Human herpesvirus 4 (Epstein- Barr virus) CMV (Cycling Green) Intern kontrol (Cycling Yellow) Human herpesvirus 6A + Human herpesvirus 6B + Human herpesvirus 7 + Humant herpesvirus 8 (herpesvirus forbundet med Kaposi s sarkom) + Hepatitis A virus + Hepatitis B virus + Hepatitis C virus + Tabel fortsættes på næste side. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

12 Tabel 1. Fortsat Kontrolgruppe CMV (Cycling Green) Intern kontrol (Cycling Yellow) Human immundefektvirus 1 + Human T-celle-leukæmivirus 1 + Human T-celle-leukæmivirus 2 + West Nile-virus + Enterovirus + Parvovirus B19 + Lineært område plasma Det lineære område hvad angår oprensning af artus CMV QS-RGQ-kittet blev bestemt ved at analysere en fortyndingsserie af CMV-virusmateriale fra 1,00 x 10 8 kopier/ml til 3,16 x 10 1 kopier/ml i plasma. Oprensningen blev udført i replika (n = 4 for koncentrationer 1,00 x 10 7 kopier/ml; n = 8 for koncentrationer <1,00 x 10 7 kopier/ml) ved brug af QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kit i kombination med Cellfree1000 protokollen (ekstraktionsvolumen: 1 ml, elueringsvolumen: 60 μl). Hver enkelt af prøverne blev analyseret ved hjælp af artus CMV QS-RGQ-kittet. Det lineære område hvad angår oprensningen af artus CMV QS-RGQ-kittet er blevet bestemt at dække koncentrationer fra 7,94 x 10 1 kopier/ml til 1,00 x 10 8 kopier/ml for plasma (Figur 2, side 13). Robusthed plasma Verificeringen af robustheden muliggør bestemmelse af den samlede fejlrate for artus CMV QS-RGQ-kittet. For at verificere robustheden fik 100 CMV-negative plasmaprøver tilsat 130 kopier/ml CMV kontrol-dna (cirka tre gange koncentrationen af den analytiske sensitivitetsgrænse). Efter ekstraktion med QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kit i kombination med Cellfree1000_DSP-protokollen for plasma (ekstraktionsvolumen: 1 ml, elueringsvolumen: 60 μl), blev disse prøver analyseret med artus CMV QS- RGQ-kittet. Desuden blev robustheden af den interne kontrol vurderet ved oprensning og analyse af de 100 plasmaprøver med tilsætning. Der blev ikke observeret nogen hæmninger. Robustheden af artus CMV QS-RGQ-kit er således 99 %. 12 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

13 10 log 10 skønnet koncentration (kopier/ml) log 10 estimated concentration (copies/ml) y = 1,0521x x ,3653 R 2 = , log 10 log nominel 10 nominal koncentration concentration (kopier/ml) (copies/ml) Figur 2. Lineært område med artus CMV QS-RGQ-kittet (plasma). Beregning af det lineære område. Den lige linje blev bestemt ved en lineær regression af log 10 beregnede koncentrationer med log 10 nominelle koncentrationer. Regressionslinjens ligning er inkluderet i figuren. Analysefølsomhed fuldblod Den analytiske detektionsgrænse med hensyn til oprensningen (sensitivitetsgrænse) blev vurderet for artus CMV QS-RGQ-kit ved hjælp af CMV-positive kliniske prøver i kombination med ekstraktion på QIAsymphony SP. Analysefølsomheden for fuldblod med hensyn til oprensningen af artus CMV QS-RGQ-kittet blev bestemt ved hjælp af en fortyndingsserie af CMV-virusmateriale fra 1000 til nominelt 3,16 CMV-kopier/ml tilsat i humane fuldblodsprøver. Disse blev underkastet DNA-ekstraktion vha. QIAsymphony DNA Mini-kittet i kombination med VirusBlood200-protokollen (ekstraktionsvolumen: 200 μl, elueringsvolumen: 60 μl). Hver af de 8 fortyndinger blev analyseret med artus CMV QS-RG-kittet på 3 forskellige dage i 6 kørsler med hver 11 replika. Resultaterne blev bestemt med en probitanalyse. En grafisk illustration af probit-analysen er vist i Figur 3. Den analytiske detektionsgrænse med hensyn til oprensningen af artus CMV QS- RGQ-kittet i kombination med Rotor-Gene Q er 164,55 kopier/ml (p = 0,05). Det vil sige, at der er 95 % sandsynlighed for, at 164,55 kopier/ml vil blive detekteret. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

14 1.0 95% 0.8 Proportioner Proportions , ~ 164, copies/ml kopier/ml (95%) ( ,01 636,34 kopier/ml) copies/ml) log log (dosis) (dose) Figur 3. Probit-analyse: fuldblod, CMV (Rotor-Gene Q). Analysefølsomheden med hensyn til oprensningen (fuldblod, vha. QIAsymphony DNA Mini-kittet) af artus CMV QS-RGQ-kit på Rotor-Gene Q. Specificitet fuldblod Specificiteten af artus CMV QS-RGQ-kittet sikres først og fremmest af valget af primere og prober samt valget af stringente reaktionsbetingelser. Primere og prober blev kontrolleret for mulige homologier med alle sekvenser, der er publiceret i genbanker efter sekvenssammenligningsanalyse. Detektérbarheden for alle relevante genotyper er således blevet sikret. Desuden blev specificiteten valideret med 100 forskellige CMV-negative fuldblodsprøver. Disse genererede ikke nogen signaler med CMV-specifikke primere og prober, som indgår i CMV RG Master. En mulig krydsreaktivitet af artus CMV QS-RGQ-kittet blev testet vha. kontrolgruppen angivet i Tabel 1 (se side 11). Ingen af de testede patogener har været reaktive. Der vistes ingen krydsreaktiviteter med blandede infektioner. Lineært område fuldblod Det lineære område hvad angår oprensning af artus CMV QS-RGQ-kittet blev bestemt ved at analysere en fortyndingsserie af CMV-virusmateriale fra 5,00 x 10 7 til 1,00 x 10 2 i fuldblod. Oprensningen blev udført i replika (n = 4 for koncentrationer 1,00 x 10 7 kopier/ml; n = 8 for koncentrationer <1,00 x 10 7 kopier/ml) ved brug af QIAsymphony DNA Mini-kittet i kombination med VirusBlood-protokollen (ekstraktionsvolumen: 200 μl, elueringsvolumen: 60 μl). Hver enkelt af prøverne blev analyseret ved hjælp af 14 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

15 artus CMV QS-RGQ-kittet. Det lineære område hvad angår oprensningen af artus CMV QS-RGQ-kittet er blevet bestemt at dække koncentrationer fra 1,00 x 10 3 kopier/ml til 5,00 x 10 7 kopier/ml for fuldblod (Figur 4). log 10 skønnet koncentration (kopier/ml) log 10 estimated concentration (copies/ml) y y = = 1,0514x x 0, R 2 R= 2 = 0, log log 10 nominel 10 nominal koncentration concentration (kopier/ml) (copies/ml) Figur 4. Lineært område med artus CMV QS-RGQ-kittet (fuldblod). Beregning af det lineære område. Den lige linje blev bestemt ved en lineær regression af log 10 beregnede koncentrationer med log 10 nominelle koncentrationer. Regressionslinjens ligning er inkluderet i figuren. Robusthed fuldblod Verificeringen af robustheden muliggør bestemmelse af den samlede fejlrate for artus CMV QS-RGQ-kittet. For at verificere robustheden fik 100 CMV-negative fuldblodsprøver tilsat 500 kopier/ml CMV (cirka tre gange koncentrationen af den analytiske sensitivitetsgrænse). Efter ekstraktion vha. QIAsymphony DNA Mini-kittet i kombination med VirusBlood200-protokollen for fuldblod, blev disse prøver analyseret med artus CMV QS-RGQ-kittet. Desuden blev robustheden af den interne kontrol vurderet ved oprensning og analyse af de 100 fuldblodsprøver med tilsætning. Der blev ikke observeret nogen hæmninger. Robustheden af artus CMV QS-RGQ-kit er således 99 %. Præcision artus CMV QS-RGQ-kits præcisionsdata tillader bestemmelse af analysens totale varians. Den totale varians består af variabilitet inden for analysen (variabiliteten af flere resultater af prøver med samme koncentration inden for et eksperiment), variabiliteten mellem prøverne (variabiliteten af flere resultater af analysen genereret på forskellige instrumenter af samme type af forskellige artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

16 operatører inden for et laboratorium) og variabiliteten mellem batches (variabiliteten af flere resultater af analysen ved brug af forskellige batches). De opnåede data blev brugt til at bestemme standarddeviationen, variansen og variationskoefficienten for den patogenspecifikke og den interne kontrol-pcr. artus CMV QS-RGQ-kits analytiske præcisionsdata (uden hensyntagen til oprensningen) blev indsamlet ved hjælp af kvantiteringsstandarden for den laveste koncentration (QS 4; 10 kopier/μl). Testningen blev foretaget med 8 replika. Præcisionsdata blev beregnet på basis af C T værdierne af amplifikiationskurverne (C T : tærskelcyklus, se Tabel 2). Desuden blev præcisionsata for kvantitative resultater i kopier/μl bestemt ved hjælp af de tilsvarende CT-værdier (Tabel 3, side 18). Baseret på disse resultater er den samlede statistiske spredning af enhver given prøve med den nævnte koncentration 1,21% (C T ) eller 14,38% (koncentration) og 1,93% (C T ) for detektion af den interne kontrol. Disse værdier er baseret på den samlede mængde af alle enkelte værdier for de bestemte variabiliteter. 16 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

17 Tabel 2. Præcisionsdata på basis af C T værdierne Variabilitet inden for analysen: CMV QS 4 Variabilitet inden for analysen: Intern kontrol Variabilitet mellem analyser: CMV QS 4 Variabilitet mellem analyser: Intern kontrol Variabilitet mellem batches: CMV QS 4 Variabilitet mellem batches: Intern kontrol Total varians: CMV QS 4 Total varians: Intern kontrol Standardaf vigelse Varians Variationskoef ficient (%) 0,17 0,03 0,57 0,31 0,10 1,16 0,38 0,14 1,27 0,47 0,22 1,77 0,33 0,11 1,10 0,53 0,28 2,02 0,36 0,13 1,21 0,51 0,26 1,93 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

18 Tabel 3. Præcisionsdata på basis af de kvantitative resultater (i kopier/μl) Variabilitet inden for analysen: CMV QS 4 Variabilitet mellem analyser: CMV QS 4 Variabilitet mellem batches: CMV QS 4 Total varians: CMV QS 4 Standardaf vigelse Varians Variationskoef ficient (%) 1,34 1,80 13,30 1,54 2,38 15,25 1,46 2,12 14,41 1,45 2,11 14,38 Reproducérbarhed Reproducérbarhedsdata muliggør en jævnlig præstationsvurdering af artus CMV QS-RGQ-kit samt en effektivitetssammenligning med andre produkter. Disse data indhentes ved at deltage i etablerede færdighedsprogrammer. Krydskontamination Fravær af krydskontamination mellem prøverne for hele arbejdsgangen blev bevist ved korrekt detektion af alle kendte positive og negative prøver i skiftende positioner (skakbrætmønster) for et repræsentativt artus QS-RGQ-system. Arbejdsgang QIAsymphony RGQ-arbejdsgangen starter med oprensning af nucleinsyrer fra humane plasma- eller fuldblodsprøver på QIAsymphony SP-instrumentet. Eluaterne, der indeholder oprensede nucleinsyrer, fra prøveklargøringsproceduren overføres til QIAsymphony AS-modulet, som derefter gennemfører analyseopsætningen (Figur 5). Analyserne overføres derefter til Rotor-Gene Q med henblik på PCR og dataanalyse (Figur 6). En oversigt over arbejdsgangen kan ses på side For yderligere information henvises til de detaljerede protokoller i denne håndbog (side 35, 43 og 49). 18 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

19 Figur 5. Selvstændig automatisering på QIAsymphony SP/AS-instrumenter. Prøver, reagenser og forbrugsartikler lægges i de relevante skuffer. Prøveklargøring og analyseopsætning sker derefter fuldt automatisk på QIAsymphony SP/AS-instrumenterne. Figur 6. Overførsel af prøverne til Rotor-Gene Q. Efter prøveklargøring og analyseopsætning indføres reaktionerne i den 72-brøndes rotor på Rotor-Gene Q for realtids- PCR-analyse. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

20 QIAsymphony RGQ arbejdsgang oversigt QIAsymphony SP Fyld skuffen Waste. Anbring eluerings-racket i skuffen Eluate. Uafhængig funktion Integreret funktion Anbring eluerings-racket på plads 1. Anbring eluerings-rackets med adapter, inklusive overføringsrammen på plads 1. Indsæt skuffen Reagents and Consumables. Fyld skuffen Sample. Definér en kørsel/et batch ved hjælp af prøveklargøringens brugergrænseflade. Start protokollen. Når prøvebehandlingen er færdig, kan man enten tage eluerings-racket manuelt ud af skuffen Eluate (uafhængig funktion) eller foretage direkte overføring af eluerings-racket til QIAsymphony AS via overførselsmodulet (integreret funktion). Uafhængig funktion Integreret funktion Fjern elueringspladstildelingen på berøringsskærmen, åbn derefter skuffen Eluate og tag manuelt eluerings-racket ud. Tryk på Transfer for at overføre eluerings-racket fra QIAsymphony SP til QIAsymphony AS. Download QIAsymphony SP-resultatfilen. 20 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

21 QIAsymphony AS Skift til analyseopsætningens brugergrænseflade på berøringsskærmen. Start analysedefineringsprocessen. Uafhængig funktion Integreret funktion Tryk på "New". Der vises en meddelelse, hvor du bliver spurgt, om du vil bruge eluerings-racket som prøverack. Tryk på Yes for at bekræfte. Definér en analysekørsel. De skærmbilleder, der vises på berøringsskærmen vil lede dig gennem analysedefinitionsprocessen trin for trin. Fyld de aktuelle prøver, reagenser og forbrugsartikler i skufferne Eluate and Reagents (eluater og reagenser) og Assays (analyser). For detaljerede oplysninger om fyldning henvises til skærmen Loading Information (ilægningsinformation). Alternativt kan man trykke på Queue (kø) og downloade fyldningsinformationsfilen. Start analysekørslen. Når kørslen er færdig, fjernes analyserne. Det gøres ved at trykke på Remove (fjern) og dernæst manuelt fjerne analyseracket (s) fra skuffen Assays. Overfør analyseracket/ene til Rotor Gene Q. Download QIAsymphony AS-resultatfilen og behandlingsfilen. Overfør behandlingsfilen til Rotor Gene Q. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

22 Rotor-Gene Q Vælg eller opret en temperaturprofil. Klik på Start Run. Når kørslen er færdig, analyseres resultaterne. Vedligeholdelse Gennemfør de aktuelle vedligeholdelsesprocedurer for QIAsymphony SP/AS og Rotor-Gene Q i henhold til instrumenternes brugervejledninger. Se Afsnit 8 i Brugervejledningen til QIAsymphony SP/AS Generel Beskrivelse og Afsnit 9 i Brugervejledningen til Rotor-Gene Q for næremere oplysninger om de nødvendige daglige, jævnlige og ugentlige vedligeholdelsesprocedurer. 22 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

23 Udstyr og reagenser, som leveres af bruger Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, éngangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Der findes mere information i de tilhørende sikkerhedsdatablade (material safety data sheets, MSDSs), som kan fås hos den pågældende leverandør. Pipetter (justerbare)* og sterile pipettespidser med filtre Vortex-mixer* Bordcentrifuge* med rotor til 2 ml reagensglas, centrifugeringshastighed 6800 x g Til prøveklargøring QIAsymphony SP-instrument (kat. nr )* QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kit (kat. nr ) for plasmaprøver eller QIAsymphony DNA Mini-kit (kat. nr ) for fuldblodsprøver Adaptere til QIAsymphony SP: Eluerings-mikrorørs-rack QS (køleadapter, EMT, v2, Qsym, kat. nr ) Rørindsats 3B (indsats, 2,0 ml v2, prøveholder. (24), Qsym, kat. nr ) Forbrugsartikler til QIAsymphony SP: Prøveklarg. beholdere, 8-brøndes (kat. nr ) 8-stavs dæksler (kat. nr ) Filterspidser, 1500 μl (kat. nr ) Filterspidser, 200 μl (kat. nr ) Eluerings-mikrorør CL (kat. nr ) Spidsaffaldssække (kat. nr ) Mikrorør 2,0 ml Type H eller mikrorør 2,0 ml Type I (Sarstedt, kat. nr og , til anvendelse med prøver og interne kontroller * Sørg for at instrumenterne regelmæssigt kontrolleres og kalibreres efter producentens angivelser. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

24 Til analyseopsætning QIAsymphony AS-instrument (kat. nr )* Adaptere og reagensholdere til QIAsymphony AS: Reagensholder 1 QS (køleadapter, reagensholder 1, Qsym, kat. nr ) Reagensholder 2 QS (køleadapter, reagensholder 2, Qsym, kat. nr ) RG stri-rør 72 QS (køleadapter, RG strip-rør 72, Qsym, kat. nr ) Forbrugsartikler til QIAsymphony AS: Strip-rør og hætter, 0,1 ml (kat. nr ) Rør, koniske, 2 ml, Qsym AS (kat. nr ) eller mikrorør 2,0 ml Type I (Sarstedt, kat. nr , Rør, koniske, 5 ml, Qsym AS (kat. nr ) eller rør med flad basis fra PP (Sarstedt, kat. nr , Reagensglas, 30 ml, Qsym AS (kat. nr ) Eluerings-mikrorør CL (kat. nr ) Filterspidser, 1500 μl (kat. nr ) Filterspidser, 200 μl (kat. nr ) Filterspidser, 50 μl (kat. nr ) Spidsaffaldssække (kat. nr ) Til PCR Rotor-Gene Q 5plex HRM-instrument* Rotor-Gene Q software version 2.02, eller højere * Sørg for at instrumenterne regelmæssigt kontrolleres og kalibreres efter producentens angivelser. Spørg efter tilgængelighed. 24 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

25 Vigtige bemærkninger Almene forsigtighedsregler Du skal altid være opmærksom på følgende: Brug sterile pipettespidser med filtre. Hold om muligt rørene lukket under manuelle trin og undgå kontaminering. Optø alle komponenter og hyggeligt ved stuetemperatur (15 25 C) før start af en analyse. Efter optøning skal komponenterne blandes (ved at pipettere op og ned flere gange eller ved impuls-votex) og cntrifugeres kort. Sørg for, at der ikke er noget skum eller nogen bobler til stede i reagensglassene. Bland ikke komponenter fra kit med forskellige lotnumre. Sørg for, at de nødvendige adapterer forkøles til 2 8 C. Arbejd hurtigt og hold PCR- reagenserne på is eller i køleblok før påfyldning. Fortsæt kontinuerligt fra den ene del af arbejdsgangen til den næste. Overskrid ikke en times overførselstid mellem hvert modul (QIAsymphony SP til QIAsymphony AS til Rotor-Gene Q). Prøveindsamling, opbevaring og transport Alle prøver skal behandles som potentielt infektiøst materiale. Kun følgende prøvematerialer er tilladt, og følgende regler og specifikke vejledninger vedrørende indsamling, transport og opbevaring skal nøje overholdes. Den interne validering af artus CMV QS-RGQ-kit er blevet udført vha. humane EDTA-plasmaprøver og humane EDTA-fuldblodsprøver. Andre prøvematerialer er ikke valideret. Brug venligst kun det anbefalede DNA-isolations-kit (se Protokol: DNA-isolering på QIAsymphony SP, side 35) for prøveklargøring. 'Ved brug af visse prøvematerialernskal specifikke vejledninger vedrørende indsamling, transport og opbevaring skal nøje overholdes. Prøveudtagning Enhver blodprøve forårsager en skade påblodkar (arterier, vener, kapillærer). Der bør kun anvendes uskadeligt og sterilt materiale. Til udtagning af blodprøver findes der egnede engangsmaterialer. Ved venepunktur bør der ikke anvendes for fine kapillarrørsnåle. Udtagning af venøst blod skal ske i artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

26 passende dele af albuebøjningen, underarmen eller håndryggen. Blod skal udtages med standard prøverør (rød hætte, Sarstedt eller tilsvarende rør fra anden producent). Der skal udtages et volumen på 5 10 ml EDTA blod. Rørene skal blandes højt oppe direkte efter prøveudtagningen (8 x, må ikke omrystes). Prøver fra hepariniserede personer må ikke anvendes (se Interfererende stoffer plasma og Interfererende stoffer fuldblod, nedenfor). Opbevaring af prøver For plasma skal fuldblod skal separeres i plasma og cellulære komponenter ved centrifugering i 20 minutter ved x g inden for 6 timer. Det isolerede plasma skal overføres til sterile polypropylenrør. Analysens følsomhed kan reduceres, hvis prøverne rutinemæssigt fryses eller opbevares i længere tid. Transport af prøver Prøvemateriale skal principielt transporteres i en knusningssikker transportbeholder. Dermed kan en potentiel infektionsfare som følge af udlækkende prøvemateriale undgås. Prøverne skal transporteres i henhold til lokale og nationale vejledninger i transport af patogent materiale.* Prøverne skal afsendes inden for 6 timer. Det anbefales ikke at opbevare prøverne der, hvor de er indsamlet. Det er muligt at sende prøverne med post i henhold til de lovbefalede vejledninger i transport af patogent materiale. Vi anbefaler, at prøven transporteres med kurer. Blodprøverne skal sendes på køl (2 8 C) og separeret plasma i dybfrossen tilstand ( 15 til 30 C). Interfererende stoffer plasma Forhøjede niveauer af albumin ( 6 g/dl), bilirubin ( 30 mg/dl) og lipider ( 1 g/dl triglycerid) og hæmolytiske prøver ( 2 g/dl hæmoglobin) påvirker ikke systemet. Heparin påvirker PCR'en. Prøver, der er indsamlet i rør, der indeholder heparin som antikoagulant, bør ikke anvendes. Prøver fra hepariniserede patienter må heller ikke anvendes. * International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations (Regler vedrørende transport af farligt gods). 26 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

27 Interfererende stoffer fuldblod Forhøjede niveauer af bilirubin ( 30 mg/dl), lipider ( 1 g/dl triglycerid) og humant genomt DNA ( 3 μg/ml) påvirker ikke systemet. Heparin påvirker PCR'en. Prøver, der er indsamlet i rør, der indeholder heparin som antikoagulant, bør ikke anvendes. Prøver fra hepariniserede patienter må heller ikke anvendes. Kom godt i gang med QIAsymphony SP/AS-instrumenter Luk alle skuffer og hætter. Tænd for QIAsymphony SP/AS-instrumenterne og vent, til skærmen Sample Preparation (prøveklargøring) vises, og initieringsproceduren er færdig. Log på instrumentet (skuffernes lås vil åbnes). Indsætning af reagensbeholdere (RC) i skuffen Reagents and Consumables (reagenser og forbrugsartikler) Reagenser til nucleinsyreoprensning er indeholdt i en innovativ reagensbeholder (RC) (se Figur 7). Hver brønd i reagensbeholderen (RC) indeholder et specifikt reagens, såsom magnetiske partikler, lysisbuffer, vaskebuffer eller eluerings. Delvist brugte reagensbeholdere (RC) kan genlukkes med genbrugsforseglingsstrips med henblik på senere genbrug, hvilket medvirker til at undgå generering af affald på grund af rest-reagenser i slutningen af oprensningsproceduren. Gennembrydningslåg (PL) Enzym-rack (ER) Pladser til skruehætter fra enzymrør Genbrugsforseglings-strip Magnetisk partikel-brønd Ramme med reagens-brønde Holder til reagensbeholder Figur 7. QIAsymphony reagensbeholder (RC). Reagensbeholderen (RC) indeholder alle de reagenser, der kræves til oprensningsproceduren. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

28 Før proceduren startes, skal man sikre sig, at magnetpartiklerne er fuldt resuspenderede. Fjern magnetpartikelbrønden fra reagensbeholderrammen, hvirvl den kraftigt i mindst 3 minutter og sæt den i reagensbeholderrammen igen før første brug. Anbring reagensbeholderen (RC) i holderen til reagensbeholderen. Anbring enzyn-racket (ER) i holderen til reagensbeholderen. Før en reagensbeholder (RC) bruges første gang, anbringes låget (PL) oven på reagensbeholderen (RC) (Figur 8). Gennembrydningslåget (PL) er skarpt. Pas på, når det placeres på reagensbeholderen (RC). Sørg for at placere gennembrydningslåget (PL) på reagensbeholderen (RC), så det vender rigtigt. Når magnetpartikelbrøndens dæksel er fjernet, og enzym-rackglassene er åbnet (skruelågene kan gemmes i hertil hørende pladser, se Figur 5), sættes reagensbeholderen (RC) derefter i skuffen Reagents and Consumables. Gennembrydningslåg (PL) Figur 8. Nem opsætning af arbejdsbordet med reagensbeholdere (RC). Delvist brugte reagensbeholdere (RC) kan opbevares, til de skal bruges igen, se Opbevaring i QIAsymphony DSP Virus/Pathogen-håndbogen eller QIAsymphony DNA-håndbogen. Indsætning af plastmateriale i skuffen Reagents and Consumables Prøveklargøringsbeholdere, 8-stavs dæksler (begge i racks med enhedsbokse) og engangs-filterspidser (200 μl spidser leveret i blå racks, 1500 μl spidser leveret i sorte racks) er lagt i skuffen Reagents and Consumables. Kontrollér, at dækslerne til enhedsboksene er fjernet, før enhedsboksene sættes i skuffen Reagents and Consumables. 28 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

29 Spidserne er forsynet med filtre for hjælpe med til at forebygge krydskontamination. Spidsrack-pladserne på QIAsymphony SP arbejdsbord kan være fyldt med den eller den anden type spids-rack. QIAsymphony SP vil identificere, hvilken type spidser, der er isat, under indholdsscanningen. Genpåfyld ikke spids-racks eller enhedsbokse til prøveklargøringsbeholdere eller 8-stavs dæksler manuelt, før der påbegyndes en anden protokolkørsel. QIAsymphony SP kan bruge delvist brugte spids-racks og enhedsbokse. Fyldning af skuffen Waste Prøveklargøringsbeholdere og 8 stavdæksler, der anvendes under en kørsel, overføres til racks med tomme enhedsbokse i Waste -skuffen. Kontrollér, at Waste -skuffen indeholder tilstrækkeligt mange tomme enhedsbokse til plastafald, der genereres under protokolkørslen. Kontrollér, at dækslerne til enhedsboksene er fjernet, før enhedsboksene sættes i skuffen Waste. Hvis du bruger bokse til 8-stavs dæksler til indsamling af brugte prøveklargøringsbeholdere og 8-stavs dæksler, skal du sikre dig, at boksafstandsholderen er fjernet. Der skal være fastgjort en pose til brugte filterspidser til frontsiden af Waste - skuffen. Systemet kontrollerer ikke selv, om der er en affaldssæk til stede. Kontrollér, at affaldssækken er korrekt fastgjort, fåør der påbegyndes en ny protokolkørsel. For yderligere information henvises til de brugervejledninger, der følger med instrumentet. Tøm spidsposen efter at maksimalt 96 prøver er behandlet, for at undgå overfyldning af spidser. En affaldsbeholder opsamler flydende affald, der genereres under oprensningsproceduren. Skuffen Waste kan kun lukkes, hvis affaldsbeholderen er på plads. Bortskaf den flydende affald i overensstemmelse med de lokale sikkerheds- og miljøbestemmelser. Den fyldte affaldsflaske må ikke autoklaveres. Tøm affaldsflasken efter, at maksimalt 96 prøver er behandlet. Fyldning af skuffen Eluate Indsæt eluerings-racket i skuffen Eluate. Benyt Elution slot 1 sammen med den tilhørende køleadapter. For integreret drift placeres eluerings-racket med adapter inklusive overførselsrammen på plads 1. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

30 Indholdsscanning Før en kørsel startes kontrollerer instrumentet, at der er placeret keligt med forbrugsartikler til de(t) batch(es), der er i kø,i de tilhørende skuffer. Klargøring af prøvemateriale QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kittet er egnet til anvendelse med humane plasmaprøver og QIAsymphony DNA Mini-kittet er egnet til anvendelse med humane fuldblodsprøver. Forebyg dannelse af skum i eller på prøverne. Prøverne skal afbalanceres til stuetemperatur (15 25 C), før kørslen startes. Klargøring af carrier RNA (CARRIER) Buffer AVE (AVE) blandinger til plasmaprøver Carrier RNA (CARRIER) skal anvendes, når QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kittet anvendes. For at klargøre en bærer-rna (CARRIER) stamopløsning tilsættes 1350 μl buffer AVE (AVE) (leveres i 2 ml hætteglas) til det glas, der indeholder 1350 μg lyofilseret bærer-rna (CARRIER) for at opnå enopløsning på 1 μg/μl. Opløs bærer-rna (CARRIER) omhyggeligt, del det op i alikvoter af passende størrelse og opbevar det ved 2 8 C i op til 2 uger. Beregning af mængden af bærer-rna (CARRIER)-blanding per glas Minimumvolumen af bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blandingen skal indeholde tilstrækkeligt ekstra volumen til at tage højde for væsketab til pipettering og forsampning. Se Tabel 4 for hvilke volumener, der skal bruges til analyse med artus CMV QS-RGQ-kit. Rør indeholdende bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE) (og valgfri intern kontrol)-blandinger placeres i en rørholder. Rørholderen med bærer-rna (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blanding(er) skal placeres i plads A i prøveskuffen. Der kan bruges op til 8 rør af blandingen per batch, og der kan bruges op til 24 rør per kørsel med 4 batches. Brug af en intern kontrol Der leveres en intern kontrol (CMV IC) sammen med artus CMV QS-RGQ-kit. Dette giver brugeren mulighed for både at kontrollere DNAisoleringsproceduren og kontrollere for mulig PCR-hæmning. Hvis CMV og EBV skal analyseres i samme PCR-kørsel på Rotor-Gene Q (se Multianalysekørsler, side 33), skal CMV IC anvendes til alle prøver og ikke EBV RG IC, der var inkluderet i artus EBV QS-RGQ-kittet. Den samme CMV IC 30 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

31 skal også anvendes til analyseopsætning af PCR-kontrollerne (trin 13 i analyseopsætningsprotokollen, side 45). Brug af QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kittet eller QIAsymphony DNA Mini-kittet i kombination med artus CMV QS-RGQ-kittet kræver indføring af den interne kontrol (CMV IC) i oprensningsproceduren for at overvåge effektiviteten af prøveklargøringen og efterfølgende analyse. For plasmaprøver skal interne kontroller tilsættes ved carrier RNA (CARRIER) Buffer AVE (AVE)-blanding, og det samlede volumen af blandingen af intern kontrol og carrier RNA (CARRIER) Buffer AVE (AVE) -blanding forbliver 120 μl. For fuldblodsprøver skal interne kontroller fortyndes i Buffer ATE. En samlet volumen på 60 μl intern control Buffer ATE-blanding tilsættes pr. prøve. Til denne anvendelse tilsættes den interne kontrol til isolationen som vist i Tabel 4. Dette udgør tilsætning af intern kontrol til isolationen i et forhold på 0,1 μl per 1 μl elueringsvolumen. Vi anbefaler at klargøre friske blandinger for hver kørsel lige før brug. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

32 Tabel 4. Klargøring af intern kontrol bærer RNA (CARRIER) Plasmaprøver Fuldblodsprøver Komponent Volumen (μl) Volumen (μl) Stambærer-RNA (CARRIER) 5 0 Intern kontrol* 9 9 Buffer AVE Buffer AVE 0 51 Endelig volumen pr. prøve (eksklusive dødvolumen) Samlet volumen for n- prøver (n x 120) (n x 60) * Beregningen af mængden af intern kontrol er baseret på de initielle elueringsvolumener (90 μl). Ekstra tom-volumen afhænger af typen af den anvendte prøve. Fyld højst 1,92 ml (svarende til maksimum 13 eller 26 prøver; denne volumen er specifik for mikrorør 2,0 ml Type H og mikrorør 2,0 ml Type I, Sarstedt kat. nr og ). Intern kontrolblanding, der svarer til 3 yderligere prøver (dvs. 360 μl) er påkrævet. (Denne volumen er specifik for mikrorør 2,0 ml Type H og mikrorør 2,0 ml Type I, Sarstedt kat. nr og ). Intern kontrolblanding, der svarer til 4 yderligere prøver (dvs. 240 μl) er påkrævet. (Denne volumen er specifik for mikrorør 2,0 ml Type H og mikrorør 2,0 ml Type I, Sarstedt kat. nr og ). Analysekontrolsæt og analyseparametersæt Analysekontrolsæt er kombinationen af en protokol plus supplerende parametre, så som intern kontrol, til prøveoprensning på QIAsymphony SP. Der er på forhånd installeret et standard-analysekontrolsæt for hver protokol. Hvis CMV og EBV skal analyseres i samme PCR-kørsel på Rotor-Gene Q (se Multianalysekørsler, nedenfor), anvendes det relevante CMVanalysekontrolsæt til prøveoprensningen. Analyseparametersæt er kombinationen a en analysedefinition med supplerende parametre defineret, så som replikatælling og antal analtsestandarder, til analyseopsætning på QIAsymphony AS. 32 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

33 Multianalysekørsler I visse tilfælde er det muligt at analysere en enkelt prøve for mere end et patogen i samme PCR i QIAsymphony RGQ-arbejdsgangen. Dette kaldes en multianalysekørsel. Flere krav skal opfyldes for en multianalysekørsel. artus CMV QS-RGQ-kittet kan anvendes med artus EBV QS-RGQ-kittet (kat. nr ) i en multianalysekørsel, hvis følgende krav er opfyldt. Prøveklargøring på QIAsymphony SP Til oprensning af prøver, der skal testes for CMV og EBV vha. samme eluat, anvendes CMV IC til alle prøver og ikke EBV RG IC, der er inkluderet i artus EBV QS-RGQ-kittet. Anvend det relevante CMV-analysekontrolsæt til prøveoprensning. Analyseopsætning på QIAsymphony AS For behørig kvantitering samt en gyldig opysning givet af den interne kontrol, skal den interne kontrol til opsætning af begge analyser svare til den, der blev anvendt til prøveklargøringen (CMV IC). Anvend en CMV IC fra samme lot til både prøveklargøring og til analyseopsætning af PCR-kontrollerne (trin 13 i analyseopsætningsprotokollen, side 45). Der må ikke anvendes en CMV IC med et andet lotnummer. PCR på Rotor-Gene Q Pga. forskelle i fluorescensintensiteterne, når der anvendes 2 forskellige analyser i en multianalysekørsel, er det nødvendigt at foretage en gainkalibrering for hvert artus-detektionssystem separat før PCR-kørslen startes (trin 9 15 i PCR-protokollen, side 54 56). Ydelser af nucleinsyrer Eluater, der er klargjort med bærer-rna (CARRIER), kan indeholde meget mere bærer-rna (CARRIER) end target-nucleinsyrer. Vi anbefaler at bruge kvantitative amplifikationsmetoder til bestemmelse af ydelserne. Opbevaring af nucleinsyrer For korttidsopbevaring på op til 24 timer anbefaler vi at opbevare oprensede nucleinsyrer ved 2 8 ºC. For langtidsopbevaring på mere end 24 timer anbefaler vi opbevaring ved 20 ºC. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

34 Indstilling af tærsklen for PCR-analysen De optimale tærskelindstillinger for en given kombination af Rotor-Gene Q- instrumentet og artus QS-RGQ-kittet skal sættes empirisk ved at teste hver individuel kombination, eftersom det er en relativ værdi, afhængig af den generelle diagnostiske arbejdsgang. Som udgangspunkt kan tærsklen indstilles på en præliminær værdi på 0,04 til analysen af den første PCR-kørsel, men denne værdi skal finindstilles i en komparativ analyse af de næste kørsler af arbejdsgangen. Tærsklen skal indstilles manuelt lige over baggrundssignalet for de negative kontroller og negative prøver. Middeltærskelværdien, der er beregnet ud fra disse eksperimenter, vil højst sandsynligt fungere for størstedelen af fremtidige kørsler, men brugeren skulle ikke desto mindre gennemse den genererede tærskelværdi med regelmæssige mellemrum. Tærskelværdien vil sædvanligvis være inden for området 0,03 0,05 og skal rundes op til højst tre decimalpladser. Kvantitering Kvantiteringsstandarderne (CMV QS 1 4) i artus CMV QS-RGQ-kit behandles som tidligere oprensede prøver, og der anvendes samme volumen (20 μl). For at generere en standardkurve på Rotor-Gene Q-instrumenter bør alle 4 kvantiteringsstandarder bruges og defineres i dialogboksen Edit Samples (rediger prøver) på Rotor-Gene Q-instrumentet som standarder med de specificerede koncentrationer (se instrumentéts brugervejledningl). Kvantiteringsstandarderne defineres som kopier/μl. Følgende ligning skal anvendes for at konvertere værdierne, der er bestemt ved hjælp af standardkurven, til kopier/ml af prøvematerialet: Resultat (kopier/ml) = Resultat (kopier/μl) x Initielt elueringsvolumen (90 μl)* Prøvevolumen (ml) Principielt skal det initielle prøvevolumen indsættes i ligningen ovenfor. Dette skal der tages hensyn til, når prøvevolumenet er blevet ændret før nucleinsyreekstraktionen (f.eks. ved at reducere volumenet ved centrifugering eller ved at øge volumenet ved at øge det volumen, der kræves for isoleringen). * Beregningen er baseret på de initielle elueringsvolumener (90 μl). 34 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

35 Protokol: DNA-isolering på QIAsymphony SP QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kittet (QIAGEN, kat. nr ) er valideret til viral DNA-oprensning fra humant plasma og QIAsymphony DNA Mini-kittet (QIAGEN, kat. nr ) er valideret for DNA oprensning fra humant fuldblod til anvendelse med artus CMV QS-RGQ-kittet. Almen information om protokollerne er vist i Tabel 5. Tabel 5. Generel protokolinformation Kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit QIAsymphony DNA Mini Kit Prøvemateriale Plasma Fuldblod Prøvevolumen (inklusive overskydende volumen) 1200 μl 300 μl Protokolnavn Cellfree1000_V4_DSP* VirusBlood200_V4* Standard analysekontrolsæt ACS_Cellfree1000_V4_ DSP artus CMV* Elueringsvolumen 60 μl 60 μl Påkrævet software-version Version 3.1 eller højere ACS_VirusBlood200_V4_ artus_cmv* Version 3.5 eller højere * V4 eller højere, som påkrævet af den anvendte softwareversion. For en multianalysekørsel hvor både CMV og EBV vil blive analyseret i samme PCR, anvendes det behørige CMVanalysekontrolsæt til prøveoprensning. Vigtige anvisninger før start Sørg for, at du er bekendt med betjeningen af QIAsymphony SP/ASinstrumenterne. Se de betjeningsvejledning i de brugervejledninger, der leveres sammen med instrumenterne. Før proceduren påbegyndes, bør Vigtige bemærkninger, side gennemlæses. Før en reagensbeholder (RC) bruges første gang skal det kontrolleres, at bufferne QSL2 og QSB1 i beholderen (RC) ikke indeholder et præcipitat. Fjern om nødvendigt de brønde, der indeholder bufferne QSL2 og QSB1, fra reagensbeholderen (RC) og inkuber i 30 minutter ved 37 C med jævnlig omrystning for at opløse præcipitatet. Sørg for at sætte brøndene ind på de rigtige pladser igen. Hvis reagensbeholderen (RC) allerede er artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

36 gennembrudt, skal man sikre sig, at brøndene er forseglet med genbrugsforseglingstrips, derefter inkuberes hele reagensbeholderen (RC) i 30 minutter ved 37 C med jævnlig omrystning i vandbad.* Forsøg at undgå for voldsom omrystning af reagensbeholderen (RC), ellers kan der dannes skum, hvilket kan medføre problemer med detektion af væskestanden. Alle komponenter i QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kit har vist sig stabile i QIAsymphony SP/AS-instrumenter i mindst den normale tid, der kræves for at behandle 96 prøver. Ting, der skal gøres før start Klargør alle nødvendige blandinger, inklusive blandinger der indeholder bærer-rna (CARRIER) og interne kontroller lige før start. For yderligere oplysninger, se Klargøring af carrier RNA (CARRIER) Buffer AVE (AVE) blandinger til plasmaprøver, side 30, og Brug af en intern kontrol, side 30. Sørg for, at gennembrydningslåget (PL) placeres på reagensbeholderen (RC), og at låget til magnetpartikelbrønden er fjernet, eller - hvis der benyttes en delvist brugt reagensbeholder (RC) - sørg for, at genbrugsforseglingsstrips er fjernet. Før proceduren startes, skal man sikre sig, at magnetpartiklerne er fuldt resuspenderede. Hvirvl brønden med magnetpartiklerne kraftigt i mindst 3 minutter før første brug. Før reagensbeholderen (RC) isættes, fjernes dækslet fra brønsen, der indeholder magnetpartiklerne, og enzymglassene åbnes. Sørg for, at enzym-racket er afbalanceret til stuetemperatur (15 25 C). Sørg for, at gennembrydningslåget (PL) placeres på reagensbeholderen (RC), eller - hvis der benyttes en delvist brugt reagensbeholder - sørg for, at genbrugsforseglingsstrips er fjernet. Hvis prøverne er forsynet med stregkoder, vendes prøverne i rørholderen sådan, at stregkoderne vender mod stregkodelæseren i Sample -skuffen i venstre side af QIAsymphony SP. Procedure 1. Luk alle skuffer og hætter på QIAsymphony SP/AS-instrumenterne. 2. Tænd for instrumenterne og vent, til skærmen Sample Preparation (prøveklargøring) vises, og initieringsproceduren er færdig. Afbryderkontakten sidder i nederste venstre hjørne af QIAsymphony SP. * Sørg for, at instrumenterne regelmæssigt kontrolleres, vedligeholdes og kalibreres efter producentens vejledning. 36 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

37 3. Log ind på instrumenterne. 4. Sørg for, at Waste -skuffen er korrekt klargjort (se Tabel 6) og gennemfør en indholdsscanning af Waste -skuffen inklusive spidsskakt og flydende affald. Udskift om nødvendigt spidsaffaldsposen. Tabel 6. Klargøring af Waste -skuffen Enhedsboksholder 1 4 Affaldsposeholder Holder til flaske til flydende affald Tomme enhedsbokse Isæt affaldspose Tøm og indsæt flaske til flydende affald 5. Indsæt eluerings-racket i skuffen Eluate. Brug kun Elution slot 1 med den tiilhørende køleadapter (Cooling Adapter, EMT, v2, Qsym, kat. nr ). For integreret drift placeres eluerings-racket med adapter inklusive overførselsrammen på plads Indsæt de(n) nødvendige reagensbeholder(e) (RC) og forbrugsartikler i skuffen Reagents and Consumables (se Tabel 7 og 8). Antallet af angivne filterspidser kan afvige fra det antal, der vises på berøringsskærmen, afhængigt af indstillinger. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

38 Tabel 7. Klargøring af skuffen Reagents and Consumables RC position 1 og 2 Spids-rackholder position 1 4 Spids-rackholder position 5 18 Enhedsboksholder plads 1 3 Enhedsboksholder plads 4 Indsæt 1 reagensbeholder (RC) til op til 48 plasmaprøver eller 2 nye reagensbeholdere (RC) til op til 96 plasmaprøver vha. QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kittet Indlæs 1 reagensbeholder (RC) til op til 96 fuldblodsprøver vha. QIAsymphony DNA Mini-kittet Indsæt tilstrækkelige racks med engangsfilterspidser, 200 μl (se Tabel 8) Indsæt tilstrækkelige racks med engangsfilterspidser, 1500 μl (se Tabel 8) Indsæt 3 enhedsbokse med prøveklargøringsbeholdere Indsæt 1 enhedsboks med 8-stavs dæksler 38 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

39 Tabel 8. Nødvendige plastartikler til 1 4 prøvebatches Et batch, 24 prøver* To batches, 48 prøver* Tre batches, 72 prøver* Plasmaprøver (QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit) Éngangs filterspidser, 200 μl Éngangs filterspidser, 1500 μl Prøveklargøringsbeholdere Fire batches, 96 prøver* stavs dæksler Fuldblodsprøver (QIAsymphony DNA Mini Kit) Éngangs filterspidser, μl Éngangs filterspidser, 1500 μl Prøveklargøringsbeholdere stavs dæksler * Brug af mere end et rør med intern kontrol per batch og gennemførelse af mere end en indholdsscanning kræver ekstra engangsfilterspidser. Der er 32 filterspidser/spidsrack. Antal nødvendige filterspidser indeholder filterspidser til 1 indholdsscanning per reagensbeholder. Der er 28 prøveklargøringsbeholdere/enhedsboks. Der er tolv 8-stavs dæksler/enhedsboks. 7. Foretag en indholdsscanning af skuffen Reagents and Consumables. 8. Anbring prøverne i den aktuelle rørholder og sæt dem i Sample - skuffen (se Tabel 9). artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

40 Tabel 9. Indsætning af prøverne i skuffen Sample. Prøvetype Plasma Fuldblod Prøvevolumen (inklusive overskydende volumen) Prøverør 1200 μl 300 μl Mikrorør 2,0 ml Type H eller mikrorør 2,0 ml Type I (Sarstedt, kat. nr og ) Indsats Rør-indsats 3B (kat. nr ) 9. Anbring de(t) rør, der indeholder carrier RNA (CARRIER)-Buffer AVE (AVE)-blandingen (til plasmaprøver) eller Buffer ATE (til fuldblodsprøver), inklusive intern kontrol, i rørbæreren og sæt det/dem på plads A i skuffen Sample. For yderligere oplysninger, se Klargøring af carrier RNA (CARRIER) Buffer AVE (AVE) blandinger til plasmaprøver, side 30, og Brug af en intern kontrol, side 30. Hvis CMV og EBV skal analyseres i samme PCR-kørsel på Rotor-Gene Q (se Multianalysekørsler, side 33), skal CMV IC anvendes til alle prøver og ikke EBV RG IC, der var inkluderet i artus EBV QS-RGQkittet. 10. Brug berøringsskærmen til at indlæse de nødvendige oplysninger for hvert batch af prøver, der skal behandles. Indlæs følgende oplysninger: Prøveinformation Protokol, der skal køres (vælg analysekontrolsæt ACS_Cellfree1000_V4_DSP artus CMV * til plasma eller ACS_VirusBlood200_V4_artus_CMV * til fuldblod fra kategorien artus QS-RGQ ) Elueringsvolumen 60 μl (se Tabel 10) og udgangsposition slot 1 * V4 eller højere, som påkrævet af den anvendte softwareversion. For en multianalysekørsel hvor både CMV og EBV vil blive analyseret i samme PCR, anvendes det behørige CMV ICnavn. 40 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

41 Rør, der indeholder carrier RNA (CARRIER) Buffer AVE (AVE)- blandingen (til plasmaprøver) eller Buffer ATE (til fuldblodsprøver), herunder intern kontrol (vælg IC-navn ACS_Cellfree1000_V4_DSP artus CMV * til plasma eller ACS_VirusBlood200_V4_artus_CMV * til fuldblod) Efter at oplysninger om batch er indlæst, ændres status fra LOADED (indsat) til QUEUED (i kø). Så snart et batch er i kø, vises knappen Run. Tabel 10. Forvalgt elueringsvolumen Forvalgt elueringsvolumen (μl) Initielt elueringsvolumen (μl) Det elueringsvolumen, der er forvalgt for protokollen. Dette er det minimalt tilgængelige eluatvolume i det sidste elueringsrør. Det initielle volumen af elueringsopløsning, der skal til for at sikre, at det aktuelle eluatvolumen er det samme som det forvalgte volumen. 11. Tryk på Run -knappen for at starte oprensningsproceduren. Alle behandlingstrin er fuldt automatiserede. I slutningen af protokolkørslen ændres batchstatus fra RUNNING (i gang) til COMPLETED (færdigt). 12. Når prøvebehandlingen er færdig, kan man enten tage elueringsracket manuelt ud af skuffen Eluate (uafhængig funktion) eller foretage direkte overføring af eluerings-racket til QIAsymphony AS via overførselsmodulet (integreret funktion). For uafhængig funktion tages eluerings-racket væk fra pladsen på berøringsskærmen, åbn derefter skuffen Eluate og flyt manuelt eluerings-racket ud. For integreret funktion trykkes på Transfer for at overføre eluerings-racket fra plads 1 på QIAsymphony SP til plads 2 på QIAsymphony AS. Vi anbefaler, at man omgående ( 60 min) fortsætter med analyseopsætning på QIAsymphony AS, når kørslen er færdig. Afhængigt af temperatur og fugtighed kan eluater, der efterlades i QIAsymphony SP efter, at kørslen er færdig, blive udsat for kondensering eller fordampning. * V4 eller højere, som påkrævet af den anvendte softwareversion. For en multianalysekørsel hvor både CMV og EBV vil blive analyseret i samme PCR, anvendes det behørige CMV ICnavn. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

42 For korttidsopbevaring på op til 24 timer anbefaler vi at opbevare oprensede nucleinsyrer ved 2 8 ºC. For langtidsopbevaring på mere end 24 timer anbefaler vi opbevaring af oprensede nucleinsyrer ved 20 ºC. Der genereres resultatfiler for hvert elueringsrack. 13. Hvis en reagensbeholder (RC) kun anvendes delvist, skal den forsegles med de medfølgende genbrugsforseglingsstrips, og rør, der indeholder proteinase K, lukkes med skruehætter umiddelbart efter afslutningen af protokolkørslen for at undgå fordampning. For yderligere oplysninger om opbevaring af delvist brugte reagensbeholdere (RC), se Opbevaring i QIAsymphony DSP VIrus/Pathogen-håndbogen eller QIAsymphony DNA-håndbogen. 14. Kassér brugte prøveglas, plader og affald i henhold til de lokale sikkerhedsbestemmelser. Se QIAsymphony DSP Virus/Pathogen-håndbogen og QIAsymphony DNAhåndbogen for sikkerhedsinformation. 15. Luk instrumentets skuffer og fortsæt med analyseopsætningen på QIAsymphony AS (side 43). 16. Rengør QIAsymphony SP under analyseopsætningen på QIAsymphony AS eller senere. For integreret funktion rengøres alle instrumenter, når arbejdsgangen er afsluttet. Følg vedligeholdelsesvejledningen i Brugervejledningen til QIAsymphony SP/AS Generel beskrivelse. Sørg for at udføre vedligeholdelse jævnligt for at minimere risikoen for krydskontamination. 42 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

43 Protokol: Analyseopsætning på QIAsymphony AS QIAsymphony AS udfører analyseopsætning for reaktioner. Prøver behandlet på QIAsymphony SP kan overføres automatisk til QIAsymphony AS (integreret funktion). For ekstra fleksibilitet kan QIAsymphony SP og AS også betjenes uafhængigt af hinanden.* Detaljer vedrørende analysen vises i Tabel 11. Tabel 11. Analyseparametre ved brug af artus CMV QS-RGQ-kit Behandlingsinformation Indsat prøvemateriale Master-blandingsvolumen Skabelon-volumen Detaljer Eluat 30 μl 20 μl Antal reaktioner 6 24 Kørselstid Påkrævet software-version Til 6 reaktioner: Cirka 9 minutter Til 72 reaktioner: Cirka 35 minutter Version 3.1 eller højere For analyseopsætning for CMV kan der opsættes op til 216 (9 x 24) analyser i en kørsel på QIAsymphony AS. Analyser blev kørt med hver reaktion for sig (ingen replika), og master-blanding blev klargjort af instrumentet for en analysekørsel indeholdende en skabelon, 4 analysestandarder og en kontrol uden skabelon (NTC). Vigtige anvisninger før start Før proceduren påbegyndes, bør Vigtige bemærkninger, side gennemlæses. Reagensvolumenerne er optimeret til 24 reaktioner pr. kit pr. kørsel. Før hver brug skal alle reagenser tøs helt op, blandes (ved gentagen opog nedpipettering eller hurtig vortex-blanding) og centrifugeres i mindst 3 sek. ved 6800 x g. Undgå, at reagenserne danner skum. For en multianalysekørsel, hvor både CMV og EBV vil blive analyseret i samme PCR, skal der sørges for, at CMV IC, fra artus CMV QS-RGQ-kittet, blev anvendt i oprensningsprocessen. Anvend en CMV IC fra samme lot til både prøveklargøring og til analyseopsætning af PCR-kontrollerne (trin 13). Der må ikke anvendes en CMV IC med et andet lotnummer. * QIAsymphony SP og AS forbliver fysisk forbundne, selv om de fungerer hver for sig. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

44 Eluater fra prøveklargøringen og alle komponenter af artus CMV QS-RGQkittet har vist sig at være stabile på instrumentet i mindst den tid, der normalt kræves til prøveoprensning for 96 prøver og analyseopsætning af 216 analyser, inklusive op til 60 minutters overførselstid fra QIAsymphony SP til QIAsymphony AS og op til 60 minutters overførselstid fra QIAsymphony AS til Rotor-Gene Q. Arbejd hurtigt og hold PCR- reagenserne på is eller i køleblok før påfyldning. Procedure 1. Indsæt spidsskakten. 2. Kassér spidsaffaldsposen. 3. Indsæt en tom spidsaffaldspose. 4. Skift til analyseopsætnings-brugerinterface ved at trykke på Switch -knappen på statuslinjen. 5. Start analysedefineringsprocessen. For uafhængig funktion, tryk på New. For integreret funktion vises der en meddelelse, hvor du bliver spurgt, om du vil bruge eluerings-racket som prøverack. Tryk på Yes for at bekræfte. Skærmbillederne på berøringsskærmen leder brugeren gennem analysedefinitionsprocessen trin for trin. 6. Tildel prøve-racket en Sample -plads ved at vælge rack-fil fra den aktuelle kørsel på QIAsymphony SP. Hvis eluerings-racket er overført automatisk til QIAsymphony AS, vil rack-filen automatisk tildeles, og skærmen Sample Rack(s) i analyseopsætnings-brugerinterfacet vil allerede være udfyldt. 7. Markér prøve-rack for prøven, EC+ og EC positioner, prøve-id'er og volumener. 8. Vælg det analyseparametersæt, der skal bruges i kørslen (se Tabel 12). 44 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

45 Tabel 12. Analyseparametre ved brug af artus CMV QS-RGQ-kit Frigivelsesinformation Kategori Analyseparametersæt Detaljer artus QS-RGQ artus CMV QS-RGQ_V1* * V1 eller højere, som påkrævet af den anvendte softwareversion. For en multianalysekørsel, hvor både CMV og EBV vil blive analyseret i samme eluat i samme PCR, skal både artus EBV QS-RGQ_V1 og artus CMV QS-RGQ_V1 analyseparametersæt (V1 eller højere) tildeles til prøverne. 9. Tildel analyseparametersæt til prøverne. Analyseparametersættet definerer parametrene for analyseopsætningen. For en multianalysekørsel, hvor både CMV og EBV vil blive analyseret for samme eluat i samme PCR, skal både artus EBV QS-RGQ_V1 og artus CMV QS-RGQ_V1 analyseparametersæt tildeles til prøverne. 10. Definér analyse-rack(s). På dette stadium kan analyse-rack(s) indsættes på Assay -plads(er) (se Tabel 14). 11. Kontrollér temperaturen på kølepladserne. Når de tilsigtede køletemperaturer er nået, vil pladserne være grønne. 12. Kombinér alle rør i CMV RG Master i et enkelt kit i ét rør. Viskøse reagenser kan være svære at håndtere med manuelle pipetter. Sørg for at overføre hele volumenet af CMV RG Master i røret. 13. Fyld hvert reagensglas med den nødvendige mængde passende reagens i henhold til den fyldningsinformation, der er angivet i instrumentets software. Før hver brug skal alle reagenser tøs helt op, blandes (ved gentagen op- og nedpipettering eller hurtig vortex-blanding) og centrifugeres i mindst 3 sek. ved 6800 x g. Undgå bobler eller skum, som kan medføre detektionsfejl. Arbejd hurtigt og hold PCR-komponenterne på is eller i køleblok før påfyldning. For en multianalysekørsel, hvor både CMV og EBV vil blive analyseret i samme PCR, skal der sørges for, at CMV IC, fra artus CMV QS-RGQ-kittet, blev anvendt i oprensningsprocessen. Anvend en CMV IC fra samme lot til både prøveklargøring og til analyseopsætning af PCR-kontrollerne. Der må ikke anvendes en CMV IC med et andet lotnummer. V1 eller højere, som påkrævet af den anvendte softwareversion. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

46 14. Anbring reagensrørene uden låg i de rette positioner på forkølede adaptere til reagenser (se Tabel 13). Tabel 13. Forbrugsartikler Forbrugsartikler Strip-rør og hætter, 0,1 ml (250) Rør, koniske, 2 ml, Qsym AS (500)* Rør, konisk, 5 ml, Qsym AS (500)* Reagensglas, 30 ml, Qsym AS (50) Eluerings-mikrorør CL (24 x 96) Navn på berøringsskærm QIA# *StripTubes 0.1 QIA# *T2.0 ScrewSkirt QIA# *T5.0 ScrewSkirt QIA# *Bottle 30ml QIA#19588 * EMTR Til brug sammen med adapter/reagensholder RG strip-rør 72 QS Reagensholder 1 QS Reagensholder 2 QS Reagensholder 1 QS Reagensholder 2 QS Reagensholder 2 QS Eluerings-mikrorørs-rack QS * Til master-blandingskomponenter, system-klargjort master-blanding, analysestandarder og analysekontroller. Alternativt kan der bruges Sarstedt-rør, beskrevet på side 24. Suffikset (m) på berøringsskærmen angiver, at væskestandsberegningerne for det respektive rør er blevet optimeret til reagenser, der danner en konkav menisk. 15. Åbn skufferne Eluate and Reagents og Assays. 16. Sæt adapteren med det klargjorte reagens på den rette plads. Indlæs en kit-stregkode for analysen via List view (listeoversigt) på skærmen Loading Reagents (indsætning af reagenser). 17. Hvis det ikke allerede er gjort, anbringes Strip-rørene i den forkølede RG Strip Tubes 72 QS-adapter (se Tabel 14) og sættes på de(n) passende plads(er). 46 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

47 Tabel 14. Adaptere og reagensholdere Nødvendigt Rack/reagensholder Navn antal* Prøve-rack Eluerings-mikrorørs-rack QS 1 Reagensholdere Reagensholder 1 QS 1 Analyse-racks RG strip-rør 72 QS 1 * Beregnet for en analysekørsel med 72 reaktioner. 18. Hvis eluerings-racket ikke allerede er overført til QIAsymphony AS (se trin 12 i oprensningsprotokollen, side 41), anbringes Elution Microtubes CL (eluerings-mikrorør CL) i den forkølede adapter til Elution Microtube Rack QS (se Tabel 14), og den klargjorte adapter placeres på den angivne plads. For uafhængig drift fjernes eluerings-racket fra pladsen på berøringsskærmen, derefter åbnes skuffen Eluate på QIAsymphony SP, og eluerings-racket fjernes manuelt. 19. Læg engangsfilterspidser i skufferne Eluate and Reagents og Assays efter det nødvendige antal af hver spidstype (se Tabel 15 og 16). Indsæt spids-racks startende med spidspladserne 1, 2 og 3 i skuffen Eluate and Reagents drawer og indsæt dernæst spids-racks på spidsplads 7, 8 og 9 i skuffen Assays. Tabel 15. Filterspidser Forbrugsartikler Filterspidser, 1500 μl (1024) Filterspidser, 200 μl (1024) Filterspidser, 50 μl (1024) Navn på berøringsskærm 1500 μl 200 μl 50 μl artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

48 Tabel 16. Forbrugsartikler forbrug* Antal til 24 Antal til 72 Forbrugsartikel reaktioner reaktioner Filterspidser, 1500 μl 4 6 Filterspidser, 200 μl 10 9 Filterspidser, 50 μl Spidsaffaldsposer 1 1 * Denne tabel giver eksempel på reagensvolumenforbrug for en analysekørsel med følgende specifikationer: 19 eller 67 skabeloner, 4 analysestandarder, en ikkeskabelon-kontrol (NTC), prøver med intern kontrol (IC), master-blanding klargjort af instrumentet. Filterspidsforbrug kan påvirkes af visse processer på QIAsymphony AS (f.eks. detektion af væskestand). Et større antal spidser er påkrævet til en multianalysekørsel, hvor både CMV og EBV vil blive analyseret i samme PCR. 20. Luk skufferne Eluate and Reagents og Assays. 21. Når hver enkelt skuffe er lukket, trykkes på Yes for at starte indholdsscanningen for hver af skufferne. Indholdsscanningen kontrollerer pladser, adaptere, filterspidser og spidsskakt. Kontroller om nødvendigt, om der er nogen fejl. 22. Tryk på Queue. Overvågning af kølingen starter. 23. Ven til de tilsigtede køletemperaturer er nået. Når de tilsigtede køletemperaturer er nået, vil pladserne være grønne. 24. Tryk på Run for at starte kørslen. 25. Når kørslen er færdig, trykkes på Remove på analyseopsætningsskærmen Overview. Åbn skuffen Assays og tag analyse-racket/ene ud. 26. Download resultat- og cyklusfiler. 27. Gå videre til Protokol: PCR og dataanalyse på Rotor-Gene Q, side Gennemfør den regelmæssige vedligeholdelse af QIAsymphony AS under PCR-kørslen på Rotor-Gene Q eller senere. For integreret funktion rengøres alle instrumenter, når arbejdsgangen er afsluttet. Følg vedligeholdelsesvejledningen i Brugervejledningen til QIAsymphony SP/AS Generel beskrivelse. Sørg for at udføre vedligeholdelse jævnligt for at minimere risikoen for krydskontamination. 48 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

49 Protokol: PCR og dataanalyse på Rotor-Gene Q Vigtige anvisninger før start Før proceduren påbegyndes, bør Vigtige bemærkninger, side gennemlæses. Brug tid på at blive fortrolig med Rotor-Gene Q, før protokollen startes. Se instrumentets brugervejledning. sørg for, at alle 4 kvantiteringsstandarder samt mindst en negativ kontrol (vand, PCR-kvalitet) er med i hver PCR-kørsel. For at generere en standardkurve bruges alle 4 kvantiteringsstander, der medfølger (CMV QS 1 4) for hver PCR-kørsel. Procedure 1. Luk PCR-rørene og anbring dem i den 72 brøndes rorot på Rotor- Gene Q. Sørg for at overføre Rotor-Gene Q 4-strip rør i den rigtige retning, så positionen viser køleadapter og rotor-match. Sørg for, at låseringen (tilbehør til Rotor-Gene instrumentet) er placeret oven på rotoren for at forebygge utilsigtet åbning af rørene under kørslen. 2. Overfør cyklusfilen fra QIAsymphony AS til Rotor-Gene Q- computeren. 3. For detektion af CMV DNA oprettes en temperaturprofil i henhold til de følgende trin. Indstilling af generelle analyseparametre Figur 9 11 Indledende aktivering af hot-start enzymet Figur 12 Amplifikation af DNA'et (touchdown PCR) Figur 13 Justering af fluorescenskanalens følsomhed Figur Start af kørsel Figur 21 Alle specifikationer henviser til Rotor-Gene Q softwareversion Yderligere oplysninger om programmering af Rotor-Gene Q-instrumenter kan ses i instrumenmtets brugervejledning. I illustrationerne er disse ilustrationer indrammet med en fed, sort streg. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

50 4. Åbn først dialogboksen New Run Wizard (hjælp til ny kørsel) (Figur 9). Marker i feltet Locking Ring Attached (låsering vedhæftet) og klik på Next. Figur 9. Dialogboksen New Run Wizard. 5. Vælg 50 for PCR-reaktionsvolumen og klik på Next (Figur 10). Figur 10. Indstilling af generelle analyseparametre. 50 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

51 6. Klik på knappen Edit Profile (regiger profil) i den næste dialogboks New Run Wizard (Figur 11) og programmer temperaturprofilen som vist i Figur 11 13). Figur 11. Redigering af profilen. Figur 12. Indledende aktivering af hot-start enzymet. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

52 Figur 13. Amplifikation af DNA'et Sørg for at aktivere touchdown-funktionen for 10 cyklusser i hærdningstrinnet. 52 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

53 7. Detektionsområdet for fluorescenskanalerne skal bestemmes efter fluorescensintensiteterne i PCR-rørene. Klik på Gain-Optimisation i dialogboksen New Run Wizard (se Figur 11) for at åbne dialogboksen Auto-Gain Optimisation Setup. Indstil kalibreringstemperaturen til 65 for at matche amplifikationsprogrammets afhærdningstemperatur (Figur 14). 1 2 Figur 14. Justering af fluorescenskanalens følsomhed. 8. Hvis du udfører en analyseopsætning for en enkelt analyse, klikker du på Start (Figur 14) og fortsætter direkte med trin 16, side 57. For en multianalysekørsel, hvor både CMV og EBV skal analyseres i samme PCR, fortsættes til trin 9 for at justere fluorescenskanalintensiteterne manuelt. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

54 9. Klik på Edit (Figur 15) for at redigere fluorescenskanalerne. 1 Figur 15. Manuel justering af fluorescenskanalintensiteten for hver fluorescenskanal på forskellige rørpositioner for forskellige analyser (CMV og EBV). 10. Indstil rørpositionen for et rør for den første artus-analyse (f.eks. CMV). Indstil rørpositionen for alle fluorescenskanaler og klik på OK (Figur 16). 1 2 Figur 16. Indstilling af rørpositionen. 54 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

55 11. Klik på Start for at begynde gain-optimeringen for den første artus-analyse (Figur 17). 1 Figur 17. Start af gain-optimering. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

56 12. Et nyt vindue Running Auto-Gain Optimisation åbnes. Vent indtil Completed kommer til syne i dette vindue (Figur 18). Indtast de valgte gain-værdier for begge kanaler og klik dernæst på Close (Figur 18) Figur 18. Gain-optimering fuldført. Bemærk gain-værdier (i dette tilfælde 1,33 for begge fluorescenskanaler). 13. Gentag trin 9 12 for en rørposition for den anden artus-analyse (f.eks. EBV). 14. Klik på Edit Gain for at redigere gain-værdierne manuelt (Figur 19). 1 Figur 19. Redigering af gain-værdierne manuelt. 15. Vælg den laveste gain-værdi for Cycling Green beskrevet i trin 12 og indtast denne værdi manuelt i vinduet Gain for Green (Figur 20). 56 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

57 Vælg den laveste gain-værdi for Cycling Yellow beskrevet i trin 12 og indtast denne værdi manuelt i vinduet Gain for Yellow. 1 2 Figur 20. Manuel indtastning af de laveste gain-værdier. 16. Gain-værdierne, der bestemmes af kanalkalibreringen (eller tildeles manuelt), gemmes automatisk og angives i det sidste menuvindue af programmeringsproceduren (Figur 21). Klik på Start Run. Figur 21. Start af kørsel. 17. Når en kørsel er blevet startet, importeres informationen fra cyklusfilen ved at klikke på knappen ( Open ) eller ved at redigere prøverne manuelt. 18. Når kørslen er færdig, analyseres data. Følgende resultater (18a, 18b og 18c) er mulige. For en multianalysekørsel, hvor både CMV og EBV blev analyseret i samme PCR, skal der sørges for, at prøverne analyseres separat for CMV og EBV med tilsvarende kvantiteringsstandarder. Standarderne for forskellige artus PCR-systemer må ikke defineres samtidigt. Se artus EBV QS-RGQ-kit-håndbogen for en fortolkning af EBV-analyseresultater. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

58 Eksempler på positive og negative PCR-reaktions er givet i Figur 22 og Figur a. Der er detekteret et signal i fluorescenskanalen Cycling Green. Resultatet af analysen er positiv: Prøven indeholder CMV DNA. I så tilfælde er detektion af et signal i kanalen Cycling Yellow unødvendigt, idet høje initielle koncentrationer af CMV DNA (positivt signal i Cycling Green-kanalen) kan medføre reducedret eller manglende fluorescenssignal af den interne kontrol i Cycling Yellow-kanalen (konkurrence). 18b. Der er ikke detekteret noget signal i fluorescenskanalen Cycling Green. Samtidig vises et signal fra den interne kontrol i Cycling Yellow-kanalen. Intet CMV DNA kan detekteres i prøven. Den kan betragtes som negativ. I tilfælde af en negativ CMV PCR udelukker det detekterede signal af den interne kontrol muligheden for PCR-hæmning. Men hvis C T- værdien for den interne kontrol a en negativ prøve er mere end 3 cyklusser højere end C T- værdien for den interne kontrol af kontrollen uden skabelon i kørslen (C T IC prøve C T IC NTC >3), så skal prøven behandles som ugyldig. Der kan ikke udledes noget resultat. 18c. Intet signal detekteret i Cycling Green eller Cycling Yellowkanalerne. Der kan ikke udledes noget resultat. Information vedrørende fejlkilder og deres løsning kan findes i Fejlsøgning, side artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

59 Figur 22. Detektion af kvantiteringsstandarderne (CMV QS 1 4) i fluorescenskanalen Cycling Green. NTC: Ingen skabelonkontrol (negativ kontrol). Figur 23. Detektion af den interne kontrol (IC) i fluorescenskanalen Cycling Yellow med samtidig amplifikation af kvantiteringsstandarderne (CMV QS 1 4). NTC: Ingen skabelonkontrol (negativ kontrol). artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

60 Fejlsøgning Denne fejlfindingsguide kan være nyttig til at afhjælpe eventuelle problemer. For yderligere information henvises også til siden Frequently Asked Questions [Hyppigt stillede spørgsmål] hos vort Technical Support Center: Derudover svarer personalet fra QIAGENs tekniske service gerne på spørgsmål vedrørende enten informationen og protokollerne i denne håndbog eller prøve- og analyseteknologier (kontaktinformation:se bagsiden eller besøg Generel håndtering Fejlmeddelelse vist på berøringsskærmen Kommentarer og forslag Hvis der vises en fejlmeddelelse under en protokolkørsel, se da de brugervejledninger, der leveres sammen med instrumenterne. Præcipitat i reagensbeholderen med åbnet beholder i QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kittet eller QIAsymphony DNA Mini-kittet a) Bufferfordampning For stærk fordampning kan medføre øget saltkoncentration eller nedsatte alkoholkoncentrationer i buffere. Kasser reagensbeholderen (RC). Sørg for at forsegle bufferbeholderne med en delvist brugt reagensbeholder (RC) med genbrugsforseglingsstrips, hvis de ikke bruges til oprensning. b) Opbevaring af reagensbeholder (RC) Opbevaring af reagensbeholder (RC) under 15 C kan medføre dannelse af præcipitater. Fjern om nødvendigt de brønde, der indeholder bufferne QSL2 og QSB1, fra reagensbeholderen (RC) og inkuber i et vandbad i 30 minutter ved 37 C med jævnlig omrystning for at opløse præcipitatet. Sørg for at sætte brøndene ind på de rigtige pladser igen. Hvis reagensbeholderen (RC) allerede er gennembrudt, skal man sikre sig, at brøndene er genlukket med genbrugsforseglingstrips, derefter inkuberes hele reagensbeholderen (RC) i vandbad i 30 minutter ved 37 C med jævnlig omrystning. * Sørg for, at instrumenterne regelmæssigt kontrolleres, vedligeholdes og kalibreres efter producentens vejledning. 60 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

61 Lav ydelse af nucleinsyrer a) Magnetiske partikler blev ikke fuldstændigt resuspenderet Kommentarer og forslag Før proceduren startes, skal man sikre sig, at magnetpartiklerne er fuldt resuspenderede. Hvirvles i mindst 3 min. før brug. b) Nedfrosne prøver blev ikke opblandet korrekt efter optøning c) Bærer-RNA (CARRIER) ikke tilsat d) Nedbrudte nucleinsyrer e) Ufyldstændig prøvelyse f) Tilstopning af pipettespids på grund af uopløseligt materiale Optø frosne prøåver med let omrystning for at sikre omhyggelig blanding. Opbland bærer-rna (CARRIER) i Buffer AVE (AVE) som beskrevet i Klargøring af carrier RNA (CARRIER) Buffer AVE (AVE) blandinger til plasmaprøver startende på side 30. Gentag oprensningsproceduren med nye prøver. Prøverne blevopbevaret ukorrekt er udsat for for mange frysnings/optøningscyklusser. Gentag oprensningsproceduren med nye prøver. Kontroller før brug, at Buffer QSL2 og QSB1 ikke indeholder præcipitater. Fjern om nødvendigt de brønde, der indeholder bufferne QSL1 og QSB1, fra reagensbeholderen (RC) og inkuber i 30 minutter ved 37 C med jævnlig omrystning for at opløse præcipitatet. Hvis reagensbeholderen (RC) allerede er gennembrudt, skal man sikre sig, at brøndene er genlukket med genbrugsforseglingstrips, derefter inkuberes hele reagensbeholderen (RC) i 30 minutter ved 37 C med jævnlig omrystning i vandbad.* Uopløseligt materiale blev ikke fjernet fra prøven før starten på QIAsymphony oprensningsproceduren. For at fjerne uopløseligt materiale ved virale applikationer centrifugeres prøven ved 3000 x g for 1 min., og supernatanten overføres til et nyt prøveglas. * Sørg for, at instrumenterne regelmæssigt kontrolleres, vedligeholdes og kalibreres efter producentens vejledning. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

62 Kommentarer og forslag QIAsymphony AS detekterer utilstrækkeligt Master Ikke alt CMV RG Master overført til rør Kombinér alle rør i CMV RG Master i et enkelt kit i ét rør. Viskøse reagenser kan være svære at håndtere med manuelle pipetter. Sørg for at overføre hele volumenet af CMV RG Master i røret. For viskøse reagenser anbefaler vi at aspirere en ekstra volumen på 5 %, når der anvendes manuelle pipetter (f.eks. justér pipetten til 840 μl til en 800 μl volumen). Alternativt fjernes spidsen fra væsken, efter langsomt at have dispenseret væsken og udført en udblæsning af målrørets vægge, der gives slip på pipettestemplet, og der ventes yderligere 10 sekunder. Overskydende væske vil flyde ned ad spidsen og kan blæses ud ved at trykke på pipettestemplet endnu en gang. Anvendelsen af filterspidser af PCR-kvalitet mærket som lav tilbageholdelse kan forbedre udbyttet af væske. Intet signal ved positive kontroller (CMV QS 1 4) i fluorescenskanal Cycling Green a) Den valgte fluorescenskanal for PCR-dataanalyse stemmer ikke overens med protokollen Ved dataanalyse vælges fluorescenskanalen Cycling Green for analytisk CMV PCR, og fluorescenskanalen Cycling Yellow for intern kontrol PCR. b) Ukorrekt programmering af temperaturprofilen for Rotor-Gene-instrument c) Ukorrekt konfiguration af PCR Sammenlign temperaturprofilen med protokollen. Se Protokol: PCR og dataanalyse på Rotor-Gene Q, side 49. Sørg for, at analyseopsætningen er foretaget korrekt, og at der blev anvendt korrekt analyseparametersæt. Gentag om nødvendigt PCR. Se Protokol: Analyseopsætning på QIAsymphony AS, side artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

63 d) Opbevaringsbetingelserne for en eller flere kitkomponenter var ikke i overensstemmelse med de instruktioner, der er angivet i Opbevaring, (side 6) e) artus CMV QS-RGQ-kit er udløbet Kommentarer og forslag Kontroller opbevaringsbetingelserne og udløbsdatoen (se kit-etiketten) for reagenserne og brug om nødvendigt et nyt kit. Kontroller opbevaringsbetingelserne og udløbsdatoen (se kit-etiketten) for reagenserne og brug om nødvendigt et nyt kit. Svagt eller intet signal fra den interne kontrol af en negativ prøve underkastet oprensning med QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midikittet eller QIAsymphony DNA Mini-kittet i fluorescenskanalen Cycling Yellow og samtidigt fravær af signal i kanalen Cycling Green a) PCR-betingelserbne stemmer ikke overens med protokollen Kontroller PCR-betingelserne (se ovenfor) og gentag om nødvendigt PCR med korrigerede indstillinger. b) PCR blev hæmmet c) DNA gik tabt under ekstraktionen Sørg for, at du bruger den godkendte isoleringsmetode (se Protokol: DNA-isolering på QIAsymphony SP, side 35) og følg nøje vejledningen. Et fraværende signal fra den interne kontrol kan indikere tab af DNA under ekstraktion. Sørg for, at du bruger den godkendte isoleringsmetode (se Protokol: DNA-isolering på QIAsymphony SP, side 35) og følg nøje vejledningen. Se også Lav ydelse af nucleinsyrer ovenfor. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

64 d) Opbevaringsbetingelserne for en eller flere kitkomponenter var ikke i overensstemmelse med de instruktioner, der er angivet i Opbevaring, (side 6) e) artus CMV QS-RGQ-kit er udløbet Kommentarer og forslag Kontroller opbevaringsbetingelserne og udløbsdatoen (se kit-etiketten) for reagenserne og brug om nødvendigt et nyt kit. Kontroller opbevaringsbetingelserne og udløbsdatoen (se kit-etiketten) for reagenserne og brug om nødvendigt et nyt kit. Signaler med de negative kontroller i fluorescenskanal Cycling Green af det analytiske PCR a) Der forekom kontamination under klargøring af PCR Gentag PCR med nye reagenser i replika. Luk om muligt PCR-rørene direkte efter tilsætning af den prøve, der skal testes. Sørg for, at arbejdsområdet og instrumenterne dekontamineres med jævne mellemrum. b) Der forekom kontamination under ekstraktion Gentag ekstraktionen og PCR af den prøve, der skal testes, med nye reagenser. Sørg for, at arbejdsområdet og instrumenterne dekontamineres med jævne mellemrum. 64 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

65 Referencer QIAGEN opretholder en stor, opdateret online-database over videnskabelige publikationer, der benytter QIAGENs produkter. Omfattende søgemuligheder gør det nemt at finde de artikler, der er brug for, enten ved en enkel søgning på nøgleord eller ved at specificere anvendelse, forskningsområde, titel, etc. En fuldstændig referenceliste kan fås ved at besøge QIAGENs referencedatabase online på eller kontakte QIAGENs tekniske service eller den lokale forhandler. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

66 Bestillingsinformation Produkt Indhold Kat. nr. artus CMV QS-RGQ Kit (24) Til 24 reaktioner: Master, magnesiumopløsning, 4 kvantiteringsstandarder, intern kontrol, vand (PCR-kvalitet) QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi-kit for automatiseret oprensning af virale nucleinsyrer eller bakterie-dna fra 1 96 prøver QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (96) Til op til 96 klargøringer a 1000 μl: Indeholder 2 reagensbeholdere og enzym-racks samt tilbehør QIAsymphony DNA Mini-kit til automatiseret oprensning af DNA fra 1 96 prøver QIAsymphony DNA Mini Kit (192) QIAsymphony RGQ-system QIAsymphony RGQ, System Til op til 192 klargøringer a 200 μl: Indeholder 2 reagensbeholdere og enzym-racks samt tilbehør QIAsymphony SP, QIAsymphony AS, Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM, nødvendigt tilbehør og forbrugsartikler, installation og uddannelse QIAsymphony SP/AS instrumenter og tilbehør QIAsymphony SP QIAsymphony prøveklargøringsmodul, 1-års garanti på reservedele og arbejdskraft QIAsymphony AS Sample Prep Cartridges, 8-well (336) 8-Rod Covers (144) Cooling Adapter, EMT, v2, Qsym QIAsymphony analyseopsætningsmodul, 1-års garanti på reservedele og arbejdskraft 8-brøndes prøveklargøringsbeholdere til brug sammen med QIAsymphony SP 8-stavs dæksler til brug sammen med QIAsymphony SP Køleadapter til EMT-racks; til brug sammen med QIAsymphony SP/ASinstrumenter (softwareversion 3.1 eller højere) artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

67 Produkt Indhold Kat. nr. Reuse Seal Set (20) Genbrugsforseglingssæt til forsegling af delvist brugte QIAsymphony reagensbeholdere Insert, 2.0ml v2, samplecarr. (24), Qsym Elution Microtubes CL (24 x 96) Cooling Adapter, Reagent Holder 1, Qsym Cooling Adapter, Reagent Holder 2, Qsym Cooling Adapter, RG Strip Tubes 72, Qsym Tubes, conical, 2 ml, Qsym AS (500) * Spørg efter tilgængelighed. Sekundær røradapter (til 2 ml rør med skruehætter, rørindsats 3b) til brug sammen med QIAsymphony SP rørholder Usterile polypropylenrør (0,85 ml maksimumkapacitet, under 0,7 ml opbevaringskapacitet, 0,4 ml elueringskapacitet); 2304 i racks a 96; inkluderer hættestrips Adapter til at rumme 18 x 2 ml koniske rør og 6 x 5 ml koniske rør; til brug sammen med QIAsymphony SP/ASinstrumenter (softwareversion 3.1 eller højere) Adapter til at rumme 18 x 2 ml koniske rør og 2 x 5 ml koniske rør og 2 x reagensglas, 30 ml; til brug sammen med QIAsymphony SP/AS-instrumenter (softwareversion 3.1 eller højere) Køleadapter der rummer 18 strips med 4 rør; til brug sammen med QIAsymphony SP/AS-instrumenter (softwareversion 3.1 eller højere) Koniske rør (2 ml) til at rumme reagens; til brug sammen med QIAsymphony AS * artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

68 Produkt Indhold Kat. nr. Tube, conical, 5 ml, Qsym AS (500) Koniske rør (5 ml) til at rumme reagens; til brug sammen med QIAsymphony AS * Reagent Bottles, 30 ml, Qsym AS (50) Filter-Tips, 1500 μl (1024) Filter-Tips, 200 μl (1024) Reagensglas (30 ml) med låg; til brug sammen med QIAsymphony AS Engangsfilterspidser i rack (8 x 128). Til brug sammen med QIAsymphony SP Engangsfilterspidser i rack (8 x 128). Til brug sammen med QIAcube og QIAsymphony SP Filter-Tips, 50 μl (1024) Engangsfilterspidser i rack (8 x 128). Til brug sammen med QIAsymphony AS Tip Disposal Bags (15) Spidsaffaldsposer til brug sammen med QIAsymphony SP/AS-instrumenter Rotor-Gene Q og tilbehør Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Realtids-PCR-cycler og Højopløselig smelteanalysator med 5 kanaler (grøn, gul, orange, rød, violet) plus HRMkanal. bærbar computer, software, tilbehør, 1 års garanti på reservedele og arbejdskraft Spørg Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Rotor-Gene Q 5plex HRM System Realtids-PCR-cycler og Højopløselig smelteanalysator med 5 kanaler (grøn, gul, orange, rød, violet) plus HRMkanal, bærbar computer, software, tilbehør, 1 års garanti på reservedele og arbejdskraft; inkluderer installation og uddannelse Realtids-PCR-cycler og Højopløselig smelteanalysator med 5 kanaler (grøn, gul, orange, rød, violet) plus HRMkanal. bærbar computer, software, tilbehør, 1 års garanti på reservedele og arbejdskraft Spørg artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

69 Produkt Indhold Kat. nr. Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Realtids-PCR-cycler og Højopløselig smelteanalysator med 5 kanaler (grøn, gul, orange, rød, violet) plus HRMkanal, bærbar computer, software, tilbehør, 1 års garanti på reservedele og arbejdskraft; inkluderer installation og uddannelse Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) 250 strips a 4 rør óg høtter til 1000 reaktioner 10 x 250 strips a 4 rør óg høtter til reaktioner For opdateret licensinformation og produktspecifikke ansvarsfraskrivelser henvises til den aktuelle QIAGEN kit-håndbog eller brugervejledning. QIAGEN kit-håndbøger og brugervejledninger kan findes på eller kan rekvireres fra QIAGENs tekniske serviceafdeling eller den lokale leverandør. artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

70 Denne side er med vilje tom 70 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

71 Denne side er med vilje tom artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

72 Denne side er med vilje tom 72 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

73 Denne side er med vilje tom artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/

74 Denne side er med vilje tom 74 artus CMV QS-RGQ Kit-håndbog 12/2010

75 Ved købet af dette produkt erhverver brugeren tilladelse til at bruge det tiludførelse af diagnostiske serviceydelser til human in vitro-diagnostik. Derved gives intet generelt patent eller nogen anden tilladelse af nogen art ud over denne specifikke ret til anvendelse. Varemærker: QIAGEN, QIAsymphony, artus, Rotor-Gene (QIAGEN Group). artus CMV QS-RGQ-kit er et CE-mærke t diagnostic sk kit i overensstemmelse med EU's In Vitro Diagnostiske Direktive 98/79/EC. Íkke tilgængeligt i alle lande. Aftale om begrænset licens Brug af dette produkt betyder, at enhver køber eller bruger af artus CMV QS-RGQ-kittet accepterer følgende vilkår: 1. artus CMV QS-RGQ-kittet må kun bruges i overensstemmelse med artus CMV QS-RGQ-kit-håndbogen, og kun med de komponenter, der følger med kittet. QIAGEN giver ingen licens, under nogen intellektuel ejendomsret, til at bruge eller inkorporere komponenterne i dette kit med komponenter, der ikke er inkluderet i dette kit, undtagen som beskrevet i artus CMV QS-RGQ-kit-håndbogen og yderligere protokoller, som er tilgængelige på 2. Ud over de udtrykkeligt givne licenser giver QIAGEN ingen garanti for, at dette kit og/eller brugen af det, ikke overtræder tredjeparts rettigheder. 3. Dette kit og dens komponenter er under licens til engangsbrug og må ikke genbruges, genoprettes eller videresælges. 4. QIAGEN afviser specifikt alle andre licenser, udtrykte eller underforståede, end dem, der udtrykkeligt er angivet. 5. Køberen og brugeren af kittet indvilliger i ikke at tage, eller lade andre tage, skridt der kunne føre til, eller fremme, handlinger der forbydes ovenfor. QIAGEN kan håndhæve forbudene i denne begrænsede licensaftale i enhver ret, og vil inddrive alle undersøgelses- og retsomkostninger, herunder advokatsalærer, i ethvert søgsmål for at håndhæve denne begrænsede licensaftale samt alle deres intellektuelle ejendomsrettigheder i forbindelse med kittet og/eller komponenterne deri. For opdaterede licensbetingelser henvises til QIAGEN. Alle rettigheder forbeholdes

76 Australia Orders Fax Technical Austria Orders Fax Technical Belgium Orders Fax Technical Brazil Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical Mexico Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Spain Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) DA Sample & Assay Technologies