Cellient Hologic overfor plasma-trombin metoden, i forhold til fremstilling af koageler fra serøse væsker.

Transkript

1 Cellient Hologic overfor plasma-trombin metoden, i forhold til fremstilling af koageler fra serøse væsker. VEJLEDERE: Susanne Wahl, Lektor, det sundhedsfaglige og teknologiske fakultet institut for teknologi. Camilla Christine Qvist, Bioanalytikerunderviser, patologiafdelingen rigshospitalet Julie Højris Petersen 27/06/1993. Stud nr Modul 14. Bioanalytikeruddannelsen. Patologiafdelingen rigshospitalet, Blegdamsvej & Professionshøjskolen Metropol. Projekt periode: Oktober til Januar Antal tegn:

2 2 Forord Bachelorprojektet er blevet udarbejdet på Rigshospitalets Patologiafdeling. Målgruppen for projektet er ansatte på en patologiafdeling, med primært fokus på cytologi og immunhistokemi. Jeg vil gerne takke bioanalytikerunderviser Camilla Christine Qvist for at have hjulpet mig i det praktiske forløb og for, vejledning gennem hele projektet. Susanne Wahl, Lektor, på det sundhedsfaglige og teknologiske fakultet institut for teknologi, takkes for at have vejledt mig gennem den skriftelige del af projektet. Derudover takkes Unni Hansen, bioanalytiker med speciale i cytologi, immunspecialist Pernille Frederiksen og Overlæge Lotte Nedergaard Larsen med speciale i gynækologi, for at have hjulpet mig både praktisk og teoretisk gennem projektet. Til sidst takkes Rigshospitalets Patologiafdeling for, at have kunne stille materialer og apparaturer til rådighed til projektforløbet. Det gøres opmærksom på, at Vancover standarden er anvendt til angivelse af referencer og litteraturliste. Projektet er udarbejdet af; Julie Højris Petersen Abstract Objective: The Plasma Trombin(PTM) method is a way to make cellblock preparations and is routinely used at Patologiafdelingen(PA) on Rigshospaltiet(RH). Another method is an automated cell block system, Cellient, which has been available to validate against PTM with 30 effusion specimens. The validation included Immunohistochemical staining, HE-staining, cellularity, celland cytoplasmic morphology, background, diagnostic quality and lastly a medicinal technology evaluation(mtv). Materials and methods: The method PTM used routinized procedures on RH PA for preparation and IHC and Cellient used procedures from Hologic. Both methods used the RH PA s procedure for cutting and HE-staining. To score the samples, 4 scoring systems have been made. In addition, statistical analysis was performed using matching t-test and percentage

3 3 distribution. Results: Cellient showed to be superior in all cell parameters except cellularity. The matching t-test showed, (P < 0,05), statistically significant difference in all cell parameters except cellularity. Cellient showed the best results in HE-staining and diagnostic quality, but PTM also showed results that were acceptable for diagnosing and the results for the methods were almost equally as good for diagnostic quality. IHC showed the best results in the control material for PTM, however IHC showed to be excellent with those patient samples that were accepted. The MTV showed that PTM is cheaper than Cellient, but Cellient is better for the environment, staff and diagnosing. Conclusion: Cellient showed better results in most parameters, but is comparable with the PTM. Cellient has potential for replacing PTM, but IHC must be validated and Cellient demands habituation for the pathologists when they are diagnosing the samples. At last Cellient needs some small adjustments, but they do however seem to provide better results than PTM.

4 4 Indholdsfortegnelse Forord... 2 Abstract Forkortelser Begrebsdefinitioner Problembaggrund: Problemformulering Problemuddybning Metodevalg: Plasma Trombin Metoden Cellient Hologic Valg af prøvemateriale og antal: Valg af Immunhistokemiske analyser: scoring og vurdering: Valg at databehandling Teori: Serøse væsker Cystevæsker Plasma trombin metoden CytoLyt Solution Preservcyt solution Cellient Al-hæmatoxylin/Eosin farvning: Immunhistokemiske analyser; Ventana Benchmark ultra(vbu) analyseprincip Antistoffer Materialer og metode Materialer: Andre materialer: Metode Skæring af celleblok og farvning af glas Fremstilling af celleblok efter PTM tabel Fremstilling af celleblok på Cellient Hologic klargøring af glas scoring af HE- og IHC-snit Resultat vurdering Statistiske beregninger Resultater Resultater af diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet, ved Cellient og PTM opsamling af resultater Resultater for HE-farvning af Cellient vs. PTM Resultater af den diagnostiske kvalitet på Cellient vs. PTM Resultater; Immunhistokemiske analyser Resultater af MTV ved metoderne

5 Diskussion Diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet ved HE-farvede prøver Delkonklusion af vurdering af diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet HE-farvning delkonklusion HE-farvning Diagnostisk kvalitet delkonklusion: diagnostisk kvalitet Immunhistokemiske analyser Delkonklusion af immunhistokemiske analyser Diagnostisk kvalitet, udtalelse fra Overlæge Lotte Nedergaard Delkonklusion: Diagnostisk kvalitet udtalelse overlæge Lotte Nedergaard Delvis medicinsk teknologivurdering med fokus på økonomi og apparatur Delkonklusion, Delvis medicinsk teknologivurdering med fokus på økonomi og apparatur Konklusion Perspektivering: Litteraturliste Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag

6 6 1.0 Forkortelser Patologiafdelingen: PA Rigshospitalet: RH Cytologisk laboratorie: CLAB Hæmatoxylin/Eosin: HE Immunhistokemiske analyser: IHC Plasma trombin metoden: PTM Cellient Hologic : Cellient preservcyt soulution: PS Ventana Benchmark ultra: VBU Kroner: kr Versus: VS RTU: Ready to use 2.0 Begrebsdefinitioner Cellient Hologic : Celleblokpræpareringsmaskine [1]. Serøse væsker: væske i lungesækkende, hjertehulen og bughulen [2]. Plasma-trombin metode: omdannelse af cellemateriale til kunstigt histologisk materiale [3]. Medicinsk teknologivurdering: systematisk vurdering af forudsætningerne for og konsekvenserne af anvendelse af medicinsk teknologi [4].

7 7 3.0 Problembaggrund: På rigshospitalet(rh) patologiafdelingen(pa), cytologisklaboratorie(clab), farves udstrygninger af serøse væsker med en May-Grünwald-Giemsa farvning. Der laves derudover altid en celleblok af det resterende materiale [5]. En celleblok fremstilles ved, at supernatanten fra en celleprøve blandes med plasma og trombin, der får cellematerialet til at koagulere [3]. Derefter kan materialet præpareres på samme måde, som ved histologisk materiale; fiksering, dehydrering, klaring, paraffininfiltration, indstøbning og til sidst skæring af celleblokken [6]. Ved proceduren for serøse væsker laves en oversigtsfarvning Hematoxylin-Eosin(HE), og om nødvendigt immunhistokemiske analyser(ihc) med et panel bestående, af op til 11 antistofmarkører, der kan være aktive ved de sygdomme som man undersøger serøse væsker for [7]. Det er muligt at lave IHC, PCR-teknikker og molekylære test på udstrygningerne, men da RH PA s procedurevejledninger for ovennævnte teknikker er lavet til histologisk materiale er det nødvendigt, at lave materialet om til en celleblok [5]. Ulempen ved, at lave cytologisk materiale om til celleblokke er, at processen tager minimum et døgn da prøven skal formalinfikseres og paraffininfiltreres på vævspræpareringsmaskinen natten over, og derefter skal materialet indstøbes manuelt. Dette medfører længere patientsvartid og ekstra arbejdstid for bioanalytikerne. Da RH PA synes, at det ville være til gavn for både personalet og patienten at have en kortere svartid og som det vigtigste en lige så god eller bedre diagnostik ønskes det, at finde en metode der måske kan resultere i, at patologerne kan give hurtigere svar til patienterne, en lige så god eller bedre diagnostisk kvalitet som plasma trombin metoden(ptm) og samtidig, at metoden kan være med til, at minimere arbejdstiden for det personale der fremstiller celleblokke [5]. Hvis en hurtigere, smartere og bedre eller mindst lige så god metode er tilgængelig, vil patologerne have mulighed for at mikroskopere samme dag som cellematerialet modtages, og eksempelvis IHC vil kunne bestilles hurtigere. Målet er derfor, at finde en metode der skal kunne komme patienterne, personalet og den diagnostiske kvalitet til gode. Det er stadig vigtigt, at metoden fremstiller celleblokkene med et lige så godt eller bedre resultat forstået ved, at diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet, IHC og HE-farvning er optimalt, som den nuværende PTM er. Derfor synes jeg, at det kunne være aktuelt, at finde en metode eller et apparatur der kan leve op til det ønskede mål.

8 8 En automatiseret celleblokpræpareringens maskine, Cellient Hologic â (Cellient), er på en prøveperiode på afdelingen, i 6 uger, hvor jeg ville benytte den til projektet. Cellient kan fremstille en celleblok på 45 minutter eksklusiv forbehandling. Ifølge Hologic er morfologi og diagnostisk kvalitet ofte er forbedret i forhold til celleudstrygninger [1]. Derfor er det interessant, at undersøge om apparaturet kan fungere som en erstatning for den traditionelle PTM. Hologic hævder, at Cellient kan fremstille bedre celleblokke end PTM, og at den diagnostiske kvalitet er bedre [1]. Da Cellient kan fremstille celleblokke på 45 minutter [1], kan det fjerne en hel arbejdsdag og dermed være til gavn for både patientsvartid og for personalets arbejdstid i forhold til, at Cellient har et apparatur som kan indstøbe koagelet automatisk. Jeg finder det derfor også interessant at undersøge ud fra en delvis medicinsk teknologivurdering(mtv) med fokus på økonomi og teknologi, om Cellient kan erstatte den traditionelle PTM. Derudover vil jeg lave en metodevalidering i forhold til farvning, diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet samt IHC og holde mine resultater op mod hinanden. 4.0 Problemformulering Hvordan påvirkes præparaters farve- og diagnostiske kvalitet ved automatisering af præpareringsteknikken ved brug af Cellient Hologic på serøse væsker, sammenlignet med plasma-trombin metoden? Derudover laves en medicinsk teknologivurdering med fokus på økonomi og teknologi i forhold til Cellient Hologic vs. Plasma-trombin metoden 4.1 Problemuddybning Den diagnostiske kvalitet vurderes på følgende måde: diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet, herunder: Celletæthed, baggrundsdebri, kernemorfologi, cytoplasma morfologi og cellemorfologi vurderet ud fra en HE-farvning. Farveintensiteten af HE-farvningen. Farveintensitet på IHC-kontrolsnittende.

9 9 IHC vurderes i prøvematerialet til at være positiv eller negativ Farveintensitet på IHC og HE-farvningerne samt diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet sammenholdt. Udvalgte IHC farvninger er: Anti-CA125 Anti-CK20 Anti-EP4 Anti-ER Anti-p53 Anti-p16 Anti-CALRET Anti-CK7 Anti-WT1 Anti-CDX2 5.0 Metodevalg: 5.1 Plasma Trombin Metoden Jeg har valgt, at bruge afdelingens rutinemæssige procedure for den traditionelle PTM. Derudover bruges afdelingens protokoller i forhold til fiksering, vævspræparering, indstøbning, skæring og farvning. Dette er valgt på baggrund af, at afdelingen og jeg ikke ønsker at ændre på procedurer, når der er mulighed for at bibeholde de nuværende procedurevejledninger [8]. 5.2 Cellient Hologic

10 10 Jeg har valgt at anvende Cellient til projektet. Dette er valgt på baggrund af, at jeg gerne vil undersøge om Cellient måske resulterer i en bedre diagnostisk kvalitet på celleblokke end PTM. Jeg har valgt at bruge Hologic s procedurevejledning for forbehandling, præparering, indstøbning samt skæring, da det er det firmaet anbefaler og fordi det vil give mest mening da Hologic har procedurevejledninger beregnet til Cellient som skal følges for, at opnå et optimalt resultat [9]. Til farvning af HE-snit har jeg valgt at benytte afdelingens procedure vejledninger [8], da Hologic ikke anbefaler at gøre det efter nogle bestemte procedurer [1], [9]. 5.3 Valg af prøvemateriale og antal: Det er valgt at bruge serøse væsker, da der kommer flest prøver, på RH PA, af serøse væsker [10]. Der kan også benyttes cystevæsker, da de præpareres på samme måde og da der forekommer nogle af de samme diagnostisk relevante celler som ved serøse væsker [5]. Det er hensigtsmæssigt at bruge serøse væsker da de ofte indeholder meget væske, og prøven skal deles i to så der kan laves en split sample sammenligning af metoderne. Split sample sammenligning laves da det er nødvendigt, at prøven kommer fra samme patient, samme sted og samme udtagning. Dermed sagt at prøvematerialet er det samme ved hver metode. Prøvematerialet kan være malignt og benignt da det indsamles kontinuerligt. Det er en fordel at have maligne og benigne prøver, da der så vil være flere prøver tilgængelige, og da jeg skal lave IHC vil det også kræve at der er maligne prøver. Prøve materialet bliver ikke blindet, da jeg mener at der kan ses forskel på, om celleblokken er lavet ved PTM eller Cellient. Det kunne ellers være optimalt at gøre, da det vil gøre projektet mere objektivt. Til projektet bliver indsamlet 30 patientprøver kontinuerligt, da det er det realistiske antal inden for tidsperioden [5]. 5.4 Valg af Immunhistokemiske analyser: Ved serøse væsker laves et bestemt panel ved IHC. Panelet består af 11 antistoffer, anti-ca125, anti-calret, anti-ck7, anti-ck20, anti-ep4, anti-er, anti-p16, anti-p53, anti-pax8, anti-cdx2 og anti-wt1. Panelet kan sammensættes med en eller flere antistofmarkører, alt efter hvilken serøs væske der bliver undersøgt, og hvilken sygdom patienten mistænkes for at have [11]. Til projektet

11 11 er alle antistofmarkørerne valgt undtagen PAX8, da specialist i cytologi Annette W. Hamminga [12], som jeg har fået farveprotokoller af, ikke har lavet en protokol til IHC for PAX8. Alle prøver bliver præpareret på Cellient og PTM og fortyndes efter afdelingens rutinemæssige protokoller [13], da farveprotokollerne fra Annette W. Hamminga [12] ikke nævner forholdene i deres fortyndinger og også bruger antistof kits som er ready to use (RTU), som RH PA også gør med nogle af antistofferne [13]. Både prøver fra PTM og Cellient får IHC på Benchmark ULTRA Ventana [13]. Der vil kun blive lavet IHC på Cellient prøver, hvis der er lavet IHC ved PTM. Dette skyldes at det ikke vil give mening, at lave IHC på patientprøver der ikke kræver IHC. Der vil være positive kontroller på hver prøve der skal have IHC. Dette gøres for at undgå et falsk positivt/negativt svar. 5.5 scoring og vurdering: Til at vurdere farveresultaterne af HE-snittene og IHC bruges 2 scoringsskemaer som fremgår af punkt 9.0, tabel 12 og 13. Til at vurdere diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet og den diagnostiske kvalitet bruges 2 scoringssystemer som fremgår af punkt 9 tabel, 9, 10 og 11. Jeg vil i samarbejde med bioanalytikerunderviser Camilla Christine Qvist score farveresultaterne for HEsnittene og kontrol snittene på IHC. Derudover vil vi score de diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet samt den diagnostiske kvalitet og vurdere, om IHC patientprøverne er positive eller negative. Overlæge Lotte Nedergaard Larsen vil komme med en samlet overordnet vurdering af den diagnostiske kvalitet. 5.6 Valg at databehandling. I projektet vil der indgå statistik som har til formål, at vurdere om der er statistisk signifikant forskel mellem metoderne. Det er hensigtsmæssigt for at kunne sammenligne metoderne statistisk, at lave en parret t-test. Dette kan gøres da der bliver indsamlet 2 sæt observationer som i dette tilfælde, vil være en score fra 0-3 for hver prøve ved hvert apparatur. På den måde kan jeg få svar på følgende; hvor stor er den observerede forskel? er den statistisk signifikant? og er den klinisk interessant? [14]. Derudover laves søjle- og cirkeldiagrammer, som har til formål at illustrere hvor mange procent af prøverne for hver metode, der har fået en score 0, 1, 2 og 3.

12 Teori: 6.1 Serøse væsker Serøse væsker dannes i 4 serøse kaviteter; 2 af dem er lungesækkende, derudover er der bug- og hjertehulen. Et normalt fungerende kavitet vil indeholde få ml serøs væske som har til funktion at nedsætte gnidningsmodstanden mellem organerne. Ved ophobning af væske i kavitetet er der tale om effusion. Effusionen har navn efter hvor den er lokaliseret i organerne. - Pleuravæske: øget væske i pleura hulen. - Peritonealvæske: øget væske i peritoneal hulen. - Perikardievæske: øget væske i perikadiehulen [2]. I et cellebillede af serøse væsker kan mikroskopisk ses mesothelceller. Mesothelcellen vil i gennemsnit være 10-25µm i diameter, og have en rund kerne som enten ligger i midten af cytoplasmaet eller perifert. Kernerne vil have granuleret kromatin og en velafgrænset membran. Kernestørrelsen kan variere og der kan også forekomme tokernede celler. Cellekernerne må gerne være store uden at det skyldes en malign tilstand. Hvis cytoplasmaet er tilsvarende kernen i volumen, vil cellen forekomme normal. Derudover vil der kunne ses makrofager, måske et par lymfocytter og en proteinrig baggrund [2]. Figur 1 - mesothelceller, med en HE-farvning [15].

13 13 I et sygt cellebillede af serøse væsker ses der også mesothelceller dog vil der ved en akut inflammation også ses mange neutrofile granulocytter, pus, bakterier, få makrofager og lymfocytter i cellebilledet. Et malignt mesoteliom som er en primær tumor, der er udgået fra mesothelet er meget sjælden. Det maligne mesotheliom vil ligne en reaktiv mesothel celle, blandt andet derfor kan diagnosen være svær at stille. Den serøse væske vil være cellerig, og der vil ofte være lejringer af cellegrupper på ofte flere end 6 kerner pr. gruppe, ændret kerne/cytoplasma ratio, kernepolymorfi, kerner centreret i grupper og lyse cellemembraner [2]. Ved et adenokarcinom der er en metastase, vil ses uregelmæssige grupper af celler med store, mørke, polymorfe og perifert liggende kerner. Det er karakteristisk i et cellebillede med et adenokarcinom, at se tredimensionale uregelmæssige tumorcellegrupper, perifert liggende kerner, tumorbolde, acinære kirtel-, papillære-, og tubulære formationer, enkelt liggende tumorceller, ændret kerne/cytoplasma ratio, kernepolymorfi, slim eller glykogen vakuoler [2]. Figur 2 - adenokarcinom [16]. Et planocellulært karcinom er også en metastase, dog udgået fra lunge og larynx. Der vil ses store enkeltliggende tumorceller, runde kerner med kraftigt cytoplasma, parakeratose, dyskeraktose, keratindannelse og mange neutrofile granulocytter [2].

14 14 Figur 3. Planocellulært karcinom [2]. Tabel 1. Nedenfor beskrives cytologiske kriterier for hvordan et cellebillede kan se ud.

15 Cystevæsker Ovarie cyster dannes på ovarierne og kan både være maligne og benigne [18]. I et cellebillede med cystevæsker vil ses plade- og kirtel epithel celler med en lille rund kerne og klart afgrænset cytoplasma. Der kan også forekomme mesothel celler i cellebilledet. Celleafgrænsninger kan være utydelige, hvis cellerne ikke er optimalt bevarede. Derudover er der også cilier på cellen, makrofager og lymfocytter i cellebilledet. Baggrunden vil være uden slim og blod [18]. 6.3 Plasma trombin metoden PTM er en cytologisk koaguleringsmetode som bruges til, at omdanne cellemateriale til kunstigt histologisk materiale ved brug af plasma og trombin. Ved metoden dilueres materialet ikke, plasma, trombin og supernatanten fra prøvematerialet blandes og koagulerer i glasset. Derefter overføres materialet til en filterpose, som placeres i en kassette og sættes på vævpræpareringsmaskinen [3]. På vævspræpareringsmaskinen bliver prøvematerialet fikseret med formalin hvor der dannes methenbrorer mellem proteinerne for, at bevare proteinets oprindelige struktur [19]. Til sidst skal materialet støbes til en paraffinblok, hvor der kan skæres snit til HE-farvning og IHC hvis det er nødvendigt [3]. se figur 4.

16 16 Figur 4, plasma trombin metoden [3]. 6.4 CytoLyt Solution CytoLyt opløsning er methanolbaseret og bruges til at vaske cellerne. Opløsningen indeholder lyserende enzymer der nedbryder erytrocytter og forebygger protein udfældning, fjerner slim og bevarer morfologien i cytologiske prøver. Opløsningen bruges som forbehandling til f.eks. præparering på Cellient. Firmaet Cytic Corporation giver ikke informationer, om hvad opløsningen er sammensat af det nævnes kun, at sammensætningen er en methanolbaseret stødpudeopløsning til cellevask [20]. 6.5 Preservcyt solution

17 17 preservcyt soulution(ps) er en methanolbaseret buffer opløsning som er designet til, at være transportmedium og forberede celler til at blive præpareret på ThinPrep 2000 eller Cellient. PS indeholder ingen aktive reagenser og skal opbevares ved mellem C, og kan holde sig i 6 uger. Da PS er methanolbasereret, fungerer den også som et koagulerende fikseringsmiddel for celler. Da Cytic corporation, der laver PS, ikke har oplyst forholdet og den præcise opløsning, er der ingen informationer omkring dette [21]. 6.6 Cellient Cellient er et automatiseret celleblokpræpareringssystem, som på 45 minutter kan fremstille cytologisk cellemateriale til en færdig præpareret celleblok. Cellematerialet bliver filtreret gennem et filter, ved hjælp af vacum, hvor efter cellerne kan blive infiltreret med reagenserne; Eosin, 2- prophanol, Xylen og til sidst paraffin [9]. Først bliver Eosinen tilført for, at kunne visualisere cellelaget ved skæring af blokken [22]. Derefter fikseres cellerne med 2-propanol. Efterfølgende bliver prøvematerialet ført igennem en klarings proces ved hjælp af Xylen. Til sidst gennemgår prøvematerialet en paraffin infiltrering. Celleblokken bliver færdig indstøbt, på en afsluttende station som indkapsler celleblokken i paraffin hvorefter, blokken er klar til skæring [9]. Se figur 5.

18 18 Figur 5 Cellient procedure [3]. 6.7 Al-hæmatoxylin/Eosin farvning: HE-farvningen er en oversigtsfarvning der bruges til, at give et overblik over morfologien i vævet. Ved denne farvning bliver kernerne blå, og proteinerne bliver røde i mange forskellige nuancer. Erytrocytterne vil ofte forekomme røde, hvor kollagen vil få en svag lyserød farve. HE-farvningen er den mest brugte oversigtsfarvning. Farvningen består af to farvestoffer; Eosin som er et anion farvestof og Al-hæmatoxylin som er et metalkomlpeksfarvestof. Al-hæmatoxylin bindes til kernerne og efter en blåning farves kernerne blå, da det er et positivt ladet farvestof som tiltrækker negativt ladede vævskomponenter; fosfatrygraden i nukleinsyre, DNA og RNA i kernerne. Eosin Y er negativt ladet, og bindes til positivt ladede vævskomponenter; proteiner i og udenfor cellerne og farver dem røde [23].

19 Immunhistokemiske analyser; Ventana Benchmark ultra(vbu) analyseprincip VBU er en automatiseret maskine der kan lave IHC på prøvematerialet. VBU har følgende trin; afparrafinering, med EZ prep, varmeinduceret epitop demaskering(hier), blokering af endogen aktivitet med DAB inhibitor samt tilførsel af primært antistof som er mono- eller polyklonalt [13]. Derudover bruger VBU 3-lagsteknik hvor der tilføres et primært, sekundært og et tertiært antistof som gør metoden mere sensitiv [7]. Kernerne farves med Meyers sure hæmatoxylin [13]. Under hele processen er der skylleprocedurer for, at fjerne overskydende antistof [7]. 6.9 Antistoffer Anti-Ca-125 Ca-125 er et glycoprotein der fungerer som cancer antigen ved ovarie cancer. Anti-Ca-125 er monoklonalt og vil lave en antistof-antigen reaktion med Ca-125 antigenet hvis det er til stede [24]. Reaktionen vil blive positiv i epithelcellernes membran. På RH PA bruges salpinx som kontrol og der, vil den være positiv i epithelcellernes membran [25]. Anti-P53 Antigenet P53, er et tumorsupressor protein. Anti-P53 er monoklonalt, og vil lave en antistofantigenreaktion med P53, som er positiv i b-cellernes kerne. Mere end 20 procent af b-cellernes kerner skal være positive i en kontrol med tonsil, for at kunne sikre at den er positiv [26]. Anti-CK20 CK20 er et protein som findes i slimproducerende epithelceller. Anti-CK20 er monoklonalt og bruges til at undersøge om CK20 antigenet er positivt i en antistof-antigen reaktion. CK20 er positiv i epithelcellernes cytoplasma. Kontrollen på RH PA, vil være positiv i overflade epithelcellers cytoplasma i appendix [27].

20 20 Anti-ER: Østrogen receptorer, er et protein som tilhører steroid familien. Antistof-antigen reaktionen vil være positiv i epithelcellernes kerner. På RH PA, vil kontrollen indeholdende livmoder være moderat positiv epithelcellernes kerner. Anti-ER er monoklonalt [28]. Anti-EP4 Anti-EP4, er monoklonal og vil ved antistof-antigenreaktionen være positiv i alle epithelcellers cellemembran. På RH PA er Kontrollen positiv i adenokarcinomer, epithelceller og tarm [29]. Anti-CK7 CK7 er et type II keratin, der findes i bryst, lunge og urothel [30]. Anti-CK7 vil i antistof-antigen reakationen være i positiv epithelcellers cytoplasma [31]. På RH PA vil kontrollen være positiv i tonsil [11]. Anti-P16 P16 er et tumorsupressor protein, som er med til at forhindre cancer udvikling. Anti-p16 er monoklonalt og vil i antistof-antigenreaktion være positiv i epithel-, og neoplastiskecellers, kerne og cytoplasma [32]. På RH PA vil kontrollen være positiv i pancreas, tonsil og cervix karcinomer [33]. Anti-WT1 Anti-WT1 bruges til identifikation af WT1 protein, som er udtrykt i mesotheliomer og ovarie karcinomer. Anti-WT1, er monoklonal og vil i antistof-antigen reaktionen være positiv i cellekerner på hæmatopoetiske stamceller [34]. På RH PA vil kontrollen være positiv i kernerne, i nyre, testikel og maligne mesotheliomer [35]. Anti-CDX2: CDX2 er en transskriptionsfaktor, som hos voksne er i tarmen. Anti-CDX2 vil i antistof-antigen reaktionen være en positiv kernereaktion i epithel celler [36]. På RH PA, vil kontrollen være positiv i tarm [37]. Anti-CALRET:

21 21 Anti-CALRET er monoklonal, og rettet mod calcium bindende proteiner, calretinin og bliver brugt til at identificere mesotheliomer. Antistof-antigen reaktionen er positiv i kerne og cytoplasma i mesothel- og epitelceller. Kontrollen på RH PA er positiv i mesothel, maligne mesotheliomer og appendix [38]. 7.0 Materialer og metode 7.1 Materialer: tabel 2. Nedenfor, ses prøvematerialer og kontroller. Tabel 3 nedenfor, fremgår apparatur. Navn Producent Cellient Peloris (vævspræpareringsmaskine) Benchmark ULTRA, Ventana Histostar (indstøbningsmaskine) Dako CoverStainer (HE-farvemaskine) Hologicâ Leica Roche Thermo Scientific DAKO

22 22 Tissue-Tekâ Filmâ (dækglasmaskine) Heraus (varmeskab) Universal 320 (Centrifuge) Vortex Genie 2 Sakura Thermo Scientific Hettich zentrifugen Scientific Industries Lysfeltmikroskop Tabel 4. Nedenfor angives reagenser. Navn Producent Lot nummer/bestillings nummer Anti-CA125 Novocastra Anti-CK20 Monoklonal mouse-anti human Dako Anti-P53 Monoklonal mouse-anti human Dako s Anti-EP4 Roche C Anti-ER Roche F02583 Envision TM flex antibody diluent Tissue-Tekâ Tissueclearâ DAKO Sakura (klarringsmiddel) Neutral formalinbuffer 10% Hounisen

23 23 Ethanol 70%, 96% og 99% (dehydrering og redhydrerings middel) Hæmatoxylin Mayer Apotek Merck Eosin 0,1% i walpoles acetat buffer Xylene (organisk opløsningsmiddel) 1. EZ prep concentrate (fjerner paraffin) [39]. Apotek Eosin G Merck Prolabo Bestillings nr: Roche ULTRA LCS predilute (olie) [40]. Roche XSSC (Buffer) [41]. Roche Reaction buffer(10x) (buffer) Roche Ultra cell conditioning solution (ULTRA CCL) (opløsning som bringer cellerne i god stand) [42]. Roche G Conditioning solution CC2 (forbehandling) [43]. Roche G01193 H 2 O

24 24 PreservCyt Solution Vial Hologic 6216BA 2-propanol VWR Prolabo Chemicals Paraplast X-tra SIGMA-ALDRICH SLBM3317V Xylene Prolabo Chemicals 16E Cytolyt Solution Hologic Thinprep 6165EA Plasma Tilsendt fra blodbanken Intet lotnummer Trombin Biofac A/S Betchnr: Frysespray Select-sport Anti-CK7 Roche Anti-WT1 Roche Anti-CDX2 Roche Anti-p16 Roche Anti-CALRET Roche Andre materialer: tabel 5, nedenfor viser andre materialer.

25 Metode Prøver indgået i projektet, er serøse- og cystevæsker. Det fremgår af bilag 5, at der er bedt om lov til, at få en ekstra prøve når der udtages serøse-, eller cystevæsker fra patientenerne på gynækologisk afdeling RH. På den måde er der en prøve der indgår i afdelingens rutine, og en der kan præpares på Cellient, dog af samme prøvemateriale og samme indstik på patienten. Derudover har personalet som arbejder på RH PA, CLAB fået informationer om, at hvis der kommer en serøs-, eller cystevæske fra andre afdelinger end gynækologisk afdeling RH, så må personalet gerne dele den i to, hvis der er nok prøve materiale sådan, at jeg kan præparere den ene halvdel af prøven på Cellient, og den anden halvdel bliver præpareret i rutinen efter PTM, se bilag 1 og 2. Metoden for Cellient og PTM er udførligt beskrevet nedenfor. 8.1 Skæring af celleblok og farvning af glas. Fælles for begge prøver er, at snit fra den færdige celleblok bliver skåret på en seriemikrotom eller på slædemikrotom. Snittene skæres med en tykkelse på 1,5my. Skæring af snit følger RH PA s procedurevejledning for skæring [8]. Der skæres ét HE-snit pr. prøve og hvis der bliver skåret IHCsnit ved prøven for PTM, skæres der tilsvarende snit for de prøver der er præpareret på Cellient. For Cellient prøver gælder, at på de coatede glas til IHC skrives rekvisitionsnummer, antistof og initaler på. på superfrostglasset skrives HE, rekvisitionsnummer og initialer. Alle snit skal stå og tørre i en halv time inden de paraffineres i varmeskab, hvor de skal stå i en time. Efterfølgende kan de farves [12]. Efter at alle snit er skåret sættes dem, som skal have en HE-farvning over på Dako CoverStainer [8]. De snit der skal have IHC og er præpareret på Cellient, får et clearoverlag henover det område, hvor rekvisitionsnummer, antistof og initialer står. Derefter printes labels for hvert antistof der har sin egen protokol. De ud printede labels klistres på clearoverlaget, og derefter sættes glassene på den VBU der er indstillet til, at køre med Cellient s protokoller for IHC. Når prøverne er færdige på

26 26 VBU påsættes dækglas på Tissue-Tek Film. Efter at dækglas er påsat, er prøverne klar til at blive mikroskoperet. De snit der er præpareret ved PTM metoden og skal have IHC, gennemgår afdelingens rutinemæssige procedure for IHC, og bliver farvet efter de protokoller som er udarbejdet til PTM [13]. 8.2 Fremstilling af celleblok efter PTM tabel Procedure for kunstige koageler. Efter at have modtaget en serøs væske fra gynækologisk afdeling RH, laves et kunstigt koagel udført efter RH PA, CLAB procedurevejledning for kunstige koageler [5]. 8.4 Vævpræparering. Når der er fremstillet et kunstigt koagel skal koagelt vævpræpareres på 4 timers programmet på Peloris Leica og her følges RH PA's procedurevejledning for vævspræparering af koageler [5]. 8.5 Indstøbning Efter at koagelet er blevet vævspræpareret, skal det indstøbes manuelt på Thermo Scientific s histostar, hvor RH PA s procedurevejledning for indstøbning [8] følges. Efter indstøbning vil den færdige celleblok være klar til skæring og farvning se punkt, Fremstilling af celleblok på Cellient Hologic

27 27 Tabel 7. Nedenfor beskrives proceduren for forbehandling af serøsevæsker, der skal præpareres på Cellient. Forbehandlingsprocedure Serøsevæsker og BAL-væsker i Cytolyt og PreservCyt 1 Indsamling af serøsevæsker Den afsatte prøve til projektet modtages ufikseret, og alt prøvematerialet anvendes til præparering. Prøvematerialet deles ligeligt i to beholdere á 50 ml med blå låg. (én til Thinprep og én til Cellient) 2 Prøvematerialet centrifugeres ved 2000 omdr/min i 5 min. 3 Supernatanten hældes fra og resuspender cellepellet med engangspipette. 4 Vask med cytolytopløsning Restbundfaldet i beholderen tilsættes 30 ml Cytolytopløsning og omrystes i 5 min.

28 28 Cellepellet med Cytolytopløsning centrifugeres ved 2000 omdr/min i 5 min. Supernatanten hældes fra. Imens fjernes låget fra PS-beholderen. Der fjernes 5 ml fra PS-beholderen tilhørende Cellient. 5 Vurder cellepelletens udseende. Hvis cellepellet indeholder synligt blod, tilsættes 30 ml Cytolytopløsning og proceduren gentages fra punkt 2 6 Supernatanten hældes fra, og de sidste dråber på indersiden af beholderens åbning tørres forsigtigt med et filterpapir. Resuspender evt cellepellet med en engangspipette anvend evt en smule PS således at alt prøvemateriale medtages. Tilsæt cellepellet til PS-beholderen og bland godt. 7 Lad beholderen med prøvemateriale henstå i 15 min. ved stuetemperatur [44].

29 29 Tabel 8. Procedurevejlednig for fremstilling af celleblokke på Cellient er beskrevet, nedenfor. Procedurevejledning til Cellient Hologic 1. Kassette og Filter: Først presses filteret forsigtigt ind i kassettehullet. Den farvede side på filteret skal vende opad. 2. Før celleblokken kan User Preferences Tab præpareres, skal ID kontrolleres. Dette gøres ved at vælge User Preferences vælg derefter Accession ID on/off. Vælg on hvis ID skal indtastes manuelt eller ved brug af en barcode scanner. Vælg off hvis ID ikke skal indtastes. 3. På skærmen vælges om prøven Processing Screen Tab er manuel = pellet eller prøvefragmenter bliver overført til kassetten af operatøren eller automatiseret = prøven bliver taget direkte fra PS, over i kassetten automatiseret. 4. På skærmen vælges om der Processing Screen Tab Select Accession ID Off On Select Manual or Auto Sample Dispense Manual Auto Select Eosin Stain Off On Figure 3-6 Select Eosin Stain On or Off Mode skal tilføjes Eosin til celleblokken eller ej. Hvis der måske skal laves FISH på prøven, fravælges Eosin.

30 30 5. KLARGØRING Åben lågen på maskinen, i den side hvor der ikke er væsker. Tag tre pipetter, PS med prøvemateriale og kassetten med filter. Til brug i efterfølgerne trin. 6. Place the Uncapped Place Sample Pipette Tip Placér PS med prøvemateriale, PreservCyt Solution Vial in the Vial Holder i prøveholder og placér derefter en pipettespids i pipetteholderen ved siden af prøveholderen. 7. Åben kassetteholderen ved at Load the Cassette/Filter Assembly into the Cassette Holder. Load the Assembly with the Filter Side Down. P U R G E V I A L P I P E T T E in the Pipette Holder Securely Latch the Cassette Holder by Pressing Straight down. OPERATION The amber light at the top of the sample level sensor is on when the cassette holder is in the closed position and a cassette is in place. It is off when a cassette is absent in the holder or if the holder is open. If the light is red, the sensor might be clogged or obstructed. See Clean Sample Level Sensor on page 4.7. presse lige ned på knappen til kassetteholderen. Placér kassetten i kassetteholderen. Filtersiden skal vende nedad. OBS! Kassetten må først placeres i kassetteholderen kort før processen startes. Hvis kassetten sidder i kassetteholderen i længere end 10 minutter kan resultatet blive dårligt. 8. Lyset på sensoren, må ikke Sample Level Sensor Status Indicator lyse rødt da det kan skyldes en blokering eller lignende. Her henvises til den engelske Cellient manual. Figure 3-9 Sample Level Sensor (Closed Position) Load Two Pipette Tips into the Paraffin Pipette Tip Holders

31 into the Paraffin Pipette Tip Holders Julie Højris Petersen, Professionshøjskolen metropol modul 14, Bachelorprojekt Placér de 2 andre pipetter, i paraffin pipettespidsholderne. 10. Luk alle døre på maskinen og OPERATION tryk på Proces knappen. If Accession ID is selected as On, a keyboard will be displayed, for entry of an accession number. See Figure OPERATION 11. Hvis Acession ID er slået til, Type in Accession ID or scan bar code. or to accept to cancel Process Cancel Button vil et tastatur poppe op. Her skal ID-nummer indtastes og der trykkes på den grønne knap. Er ID-nummeret tastet forkert trykkes på den røde knap. 12. Progress Bar Hvis dette skærmbillede dukker op, trykkes der på den grønne knap hvis alle materialer og væsker er fyldt op og placeret korrekt. Hvis ikke, trykkes på den røde knap og manglende materialer og Figure sample vial. væsker fyldes op. If these items are already loaded, press the OK button to proceed. The doors will lock. 13. Hvis det er valgt, at prøven er 3.8 Cellient System Operator s Manual Figure 3-11 Accession ID Entry Display An ID number may be entered manually by touching the correct letters and numbers on the display, or a barcode scanner may be used. Note: OPERATION Backspace Button Clear All Characters button The bar code scanner is another manufacturer s product. Please refer to the documents that came with it for specifications, operation, safety and maintenance. Process Estimated Time Remaining The accession ID may be 0 to 32 characters long, alpha-numeric. Bar Code 128 symbology will be accepted if a scanner is being used. Progress Bar The accession number is stored in the history log with any other information the processor Figure may 3-13 record about Processing that cell Screen block. (Refer to page 3.17, history log.) After an accession number has been entered, press the OK button to proceed. Manual Sample Dispense Mode To cancel the Accession ID screen press the cancel button to return to the If Manual Dispense mode has been selected, the processor will pause and Main screen display. unlock the doors. A message Manually load selected sample into cassette well, Figure A message 3-12 prompt Load displays: Consumables Please load consumables: Message then replace the vial into the holder and click the OK button is tips, displayed. cassette See and If these items are not loaded, open the doors and load items into the process compartment. Pretest Accession ID Process Step Title If a bar code scanner is used, scan the accession ID now. Dispense Sample manuel vil der poppe en tekst op på skærmen, som fortæller når prøven skal overføres til After pressing the Process button, the processor will perform a pretest of the kassetten. Når dette er gjort system. Figure 3-14 Load Sample Manually Message trykkes på den grønne knap, It This will prompts scan for the operator the presence to place the of sample pellet or tissue and fragments paraffin into pipette the well tips of and a the cassette assembly and place the PreservCyt Solution vial into the vial sample vial. holder. The cassette holder may be opened while placing the sample fragments in the cassette well. Once the sample fragments are placed in the cassette well, It will monitor that there are sufficient quantities of isopropanol, xylene re-close the holder and press the OK button to proceed. The doors will lock and eosin to process a cell block. Checks of the main system functions are made. Cellient System Operator s Manual A waste cycle will run, to empty the waste chamber.

32 32 og celleblok præpareringen vil forløbe automatiseret til processen er færdig. 14. Efter cirka 30 minutter vil processen være færdig og blokken skal fjernes fra kassetteholderen. SECTION F Figure 3-20 Remove Completed Block 15. når kassetten med den færdige 21 Use Freeze Spray to Chill the C Lift Off Filter and Discard blok er fjernet fra kassetteholderen, fjernes filteret med det samme. Dette gøres ved at bruge en frysespray. Der sprayes på metal siden (den farvede side) af filtreres 2-5 cm fra overfladen. Dette gøres i 3-5 sekunder. Derefter fjernes filteret forsigtigt, ved at lirke og dreje. 16. Til sidst skal den færdige In Process Complete PREHEAT CYCLE CANCEL celleblok, laves til en skæreklar blok ved at tilføre mere paraffin. Indstøbningsmaskinen tændes 10 minutter før prøven på Cellient er færdig. På den måde er det sikret at paraffin

33 33 er smeltet og prøven kan laves færdig med det samme. 17. Fjern paraffin blokken fra plastikholderen, og placér den i metalholderen. ic 18. Placér metalholderen med paraffin på indstøbningsmaskinen, og tryk på preheat knappen, så paraffinen kan smelte. Låget skal være lukket. Når paraffinen er smeltet vil indstøbningsmaskinen sige en biplyd. Der trykkes på preheat igen hvis paraffinen ikke er smeltet. 19. Placér nu kassetten med prøven, oven på metalholderen med den smeltede paraffin. Figure 3-26 Place Cassette in Embedding Mold Luk lågen og tryk på Cycle knappen. Når prøven er færdig indstøb vil et COMPLETE LED lyse og der vil være en biplyd på 10 sekunder. Derefter kan kassetten fjerens

34 34 og celleblokken er færdig og klar til skæring [9]. 8.7 klargøring af glas Inden der skæres snit af celleblokken, skal glas laves klar. De antistoffer der skal bruges til IHC har en kontrol, som skal sættes på immunglassene inden blokken skæres. Anti-CA125 og anti-er har sin egen kontrol. Anti-CK20, anti-ck7, anti-p16 og anti-p53 har kontrollen, multiblok 1 og anti- EP4, anti-cdx2 og anti-calret har kontrollen multiblok 1a. WT1 har kontrollen multiblok 5. Se punkt 8.1 for skæring af celleblok og farvning af snit [11]. 8.8 scoring af HE- og IHC-snit Alle HE-farvede snit for PTM og Cellient scores efter diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet og farvning. Skemaerne fremgår af punkt 9.0, tabel 9, 10, 11 og 12. Kontrollen scores som det første inden snittet med prøvemateriale. Alle IHC-snit for PTM og Cellient scores efter farveresultatet i kontrol materialet og vurderes til at være positiv eller negativ i patientmaterialet. Scoringsskemaet fremgår af punkt 9.0, tabel Resultat vurdering Tabel 9. Nedenfor beskrives scoringsværdierne for diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet ved HE-farvede snit.

35 35 Beskrivelse af kategorierne som indgår i vurdering af Diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet; Diagnostisk relevante celler = Tumorceller, lymfocytter, makrofager og mesothel celler. Celletæthed = Beskriver om der er nok diagnostisk relevante celler i cellebilledet. Hvis cellebilledet er fyldt med ikke relevante celler, blod, bakterier m.m. eller hvis der ikke er nogle diagnostiske relevante celler, vil scoren på tabel 9 være 0. Hvis der er rigeligt med diagnostisk relevante celler og at der kan skelnes mellem cellerne, vil scoren på tabel 9 være 3. Scoren 1 og 2 gives efter egen vurdering, i forhold til hvor tæt cellebilledet er på henholdsvis score 0 og 3. Baggrunds debri = Beskriver om der er blod, slim, autolyserede celler og proteinudfældningerne i cellebilledet. Proteinudfældning kan ikke undgås og det gør ikke så meget hvis det ikke forstyrre cellebilledet. Cellemorfologi = Beskriver om de diagnostiske relevante celler er velbevarede, hvordan afgrænses kerne og cytoplasma og kan der skelnes mellem dem. Observeres der autolyse og kan der ikke skelnes mellem cellerne, kerne og cytoplasma gives en score på 0. Observeres der derimod celler der er velbevarede, ingen autolyse eller skrump og er det nemt, at skelne mellem cellerne gives en score på 3. Scoren 1 og 2 gives efter egen vurdering i forhold til hvor tæt cellebilledet er på henholdsvis score 0 og 3. Kernemorfologi: Beskriver om det er tydeligt, at se de diagnostiske relevante cellers kerne struktur, nukleoler og kromatinstruktur.

36 36 Cytoplasma morfologi: beskriver om cytoplasmaet i de diagnostiske relevante celler, er afgrænset tydeligt. Tabel 10, nedenfor viser skema for diagnostiske relevante komponenter i cellebilledet, for HEfarvede snit.

37 37 Tabel 11, nedenfor viser samlet scoringsresultat ved den diagnostiske kvalitet på HE-farvede snit.

38 38 Tabel 12, nedenfor viser scoringsskema for HE-farvning, hvor der fokuseres på farveintensitet for kerner og cytoplasma. Score (farveintensitet) Beskrivelse Kommentar (3) Optimal farvning eller næsten optimal farvning af kerner og cytoplasma. Farves intenst blå/violet i kerner og kraftigt pink cytoplasma. (2) Acceptabel farvning: Næsten alle vævskomponenter er farvet blå/violet i kernerne og cytoplasma er pink/rosa, der kan være små afgivelser. (1) På grænsen. Kerner og cytoplasma, er farvet utilstrækkeligt. Farvningen er meget svag og kernerne er ikke intenst blå/violette. (0) Dårlig farvning: flere vævskomponenter er ikke farvet, det er svært at orientere sig og skelne mellem vævskomponenterne. Så utilstrækkeligt farvet at der

39 39 ikke kan stilles diagnose. Tabel 13, nedenfor viser skemaet for scoring af IHC kontroller udarbejdet af NordicQC [45], dog med en variation sådan, at skemaet passer sammen med de andre scoringsskemaer. Alle patient prøver bliver scoret som positive = der er en antistof-antigen reaktion eller negative = der er ingen antistof-antigen reaktion. Score Beskrivelse Kommentar (3) Optimal farvning: Der er ikke noget uspecifikt der er farvet. Hvis der skal være en positiv reaktion med antistof markøren er vævskomponenterne farvet tydeligt. Farvningen vurderes dermed til at være Optimal. (2) God farvning. Farvningen kan være en smule svag. Der er en positiv reaktion i de vævskomponenter som skal reagere med antistofmarkøren. Der kan være tale om lidt uspecifik farvning. Vurderet til at være fuldt accepteret/god,

40 40 på alt inkluderet væv. (1) På grænsen. Farvning er vurderet til at være utilstrækkelig. Dette kan skyldes for svag farvning, eller at der er nogle vævskomponenter der ikke er blevet farvet. (0) Dårlig farvning. Farvningen er vurderet meget uacceptabel, som kan skyldes falsk negativ farvning på flere inkluderede vævskomponenter. Eller falsk positiv farve reaktion. Visualisering af hvad der farves i en kontrol med pågældende antistoffer, er beskrevet nedenfor. Figur 6 antistofreaktion i kontrolmateriale for CA125; salpinx. Membran farvning i epithelceller. [46]

41 41 Figur 7, CDX2 i kontrolsnit med apendix. Anistof reaktion i epithelcellernes kerner. [47] Figur 8, CK7 i kontrolsnit med nyre og reaktion i epithelcellernes cytoplasma. [48] Figur 9, CK20 i kontrolsnit med apendix og reaktion i cytoplasma i epithelceller. [49]

42 42 Figur 10, EP4 i et kontrolsnit med nyre, med positiv reaktion i epithelcellernes cellemembran. [50] Figur 11, ER i kontrolsnit indeholdende livmoder med reaktion i kerner i epithelceller, til venstre og brystvæv, med reaktion i kerner i neoplastiske celler, til højre [51]. Figur 12, P53 i kontrolsnit med tonsil, med reaktion i kerner i b-lymfocytter [52].

43 43 Figur 13, P16 i kontrolsnit med tonsil. Reaktion i Kerne- og cytoplasma i makrofager [53]. Figur 14, WT1 i kontrolsnit med nyre, reaktion i kerner i podocytter til venstre og reaktion i kerner i epithel til højre [54]. Figur 15, CALRET i kontrolsnit af appendix, cytoplasma og kernereaktion [55].

44 Statistiske beregninger. Beregning af middelværdi: (x1+x2/n) x1 = alle værdier for metode 1. x2 = alle værdier for metode 2. n = antal prøver [14]. procentberegning: x/n*100 x = andel af resultaterne man gerne vil finde ud af hvor stor en procentdel den er af de 100 procent. n = antal prøver [56]. Til at lave en parret T-test, som afslører forskelle i metoderne, skal nedenstående formler bruges for at udføre testen. Den parrede T-test udføres således: forskellen mellem x1 og x2(prøve et og 2) i metode et og to, trækkes fra hinanden. d=x1-x2. Dette gøres for hvert resultat. Derefter beregnes middelværdien og standarddeviationen, som ovenfor. Middelfejl på middelværdi(se- d ) beregnes ved, SD/ n (n er antal resultater). Derfra kan t-værdien beregnes ved, t =!/SE- d, derefter findes p- værdi i t-tabellen ud fra antal frihedsgrader. Hvis p-værdien er mindre end t-værdien, forkastes H 0, hvis ikke bekræftes den, ud fra et signifikansniveau. Signifikansniveauet kan sættes fra 0,5, 0,1, 0,05, 0,02, 0,01 og 0,001 [14]. I projektet er sat et signifikans niveau på 0,05, da det er det der sædvanligvis gøres [57]. H0 hypotesen: Der er ikke statistisk signifikant forskel mellem de to parametre, og forskellen skyldes tilfældige fejl. H1: Der er statistisk signifikant forskel og forskellen skyldes ikke tilfældigheder [57] Resultater Alle resultater er blevet bearbejdet og fremgår af nedenstående afsnit. Resultaterne er beregnet på baggrund af nedenstående tabel og scoreskemaerne som fremgår af punkt 9.0. derudover fremgår alle beregningsmetoder også i punkt 9.0.

45 45 Tabel 14, viser prøverne opdelt i forskellige kategorier Resultater af diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet, ved Cellient og PTM. Nedenstående figurer viser fordelingen af score 0, 1, 2 og 3 fordelt i procent ved henholdsvis Cellient og PTM. cellient score 1; 6, ; 7% cellient score 2 ; 10; 10% Cellient score 0; 13, ; 13% CELLETÆTHED; CELLIENT B cellient score 3; 70; 70% PTM score 1 7% PTM score 2 3% PTM score 0 7% CELLETÆTHED; PTM. B PTM score 3 83% Figur 16. Procentvis fordeling over score i celletæthed. cellient score 1 17% cellient score 2 43% cellient score 0 7% BAGGRUNDSDEBRI:CELLIENT A cellient score 3 33% score 0 PTM 13% score 1 PTM 53% score 3 PTM 7% BAGGRUNDSDEBRI:PTM B score 2 PTM 27% Figur 17. procentvis fordeling over score i baggrundsdebri.

46 46 cellient score 1 7% cellient score 0 7% CELLEMORFOLOGI:CELLIENT A ptm score 1 37% ptm score 0 0% CELLEMORFOLOGI:PTM ptm B score 3 0% cellient score 2 36% Cellient score3 50% ptm score 2 63% Figur 18. procentvis fordeling over score i cellemorfologi ved Cellient. cellient score 1 0% KERNEMORFOLOGI: CELLIENT cellient A score 0 7% ptm score 1 7% KERNEMORFOLOGI: PTM ptm B score 0 0% cellient score 2 6% ptm score 3 30% cellient score 3 87% ptm score 2 63% Figur 19. procentvis fordeling over score i kernemorfologi. cellient score 1 23% cellient score 2 20% CYTOPLASMA MORFOLOGI: CELLIENT cellient A score 0 7% cellient score 3 50% ptm score 1 43% ptm score 0 0% CYTOPLASMAMORFOLOGI:PTM B ptm score 3 0% ptm score 2 57% Figur 20. procentvis fordeling over score i cytoplasmamorfologi.

47 opsamling af resultater Cellient har den højeste procentmæssige score ved alle parametre ved diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet undtagen celletæthed, i score 3. Celletæthed: 70% af Cellient prøver og 83% af PTM prøver har fået score 3. Celle-, og cytoplasmamorfologi: 50% procent af Cellient prøver og 0% af PTM prøverne, har fået score 3. Kernemorfologi: 87% af Cellient prøver og 30% af PTM har fået score 3. Baggrundsdebri: 33% af Cellient prøver og 7% af PTM prøver har fået en score 3. Tabel 15 nedenfor. Der er lavet en parret t-test, for hver diagnostisk relevant komponent i cellebilledet. Der er statistisksignifikant forskel mellem Cellient og PTM ved alle parametre undtagen celletæthed. H1 = der er statistisk signifikant forskel mellem parametrene og forskellen skyldes ikke tilfældige fejl. H0 = der er ikke statistisk signifikant forskel og forskellen skyldes tilfældige fejl. Figur 21 nedenfor, viser forskellen i den samme prøve, som er præpareret 2 gange. Den første prøve indeholder Cellient koagelet markeret med mørkeblå i figur 22. Den anden prøve indeholder et

48 48 naturligt koagel som ikke kunne præpareres, med den serøse væske, markeret med lyseblå. Derfor er der lavet en ekstra celleblok, da der var et naturligt koagel til stede. Der ses en forskel på scoren i baggrundsdebri ved prøve 4, 21 og 24. Cellient koagelet har fået bedre score i baggrundsdebri ved 2 ud af 4 prøver. Ved prøve nr. 21 har det naturlige koagel fået en bedre score. De resterende parametre for diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet fremgår ikke af resultaterne, da der ikke forekom nogen forskel i resultaterne. 2, , , cellient koagel cellient naturligt koagel Figur 21. x-asken viser prøvenummeret og y-asken viser scoren for baggrundsdebri.

49 Resultater for HE-farvning af Cellient vs. PTM. figur 22 og 23 viser farvescoren fordelt i procent fra score 0-3, for Cellient og PTM. 90% Cellient af prøverne har fået en score 3 og 23,3% PTM prøverne. 10% af Cellient prøver har fået en score 2 og 73,3% af PTM prøverne. Ingen af metoderne har prøver som har fået en score 1 eller 0. farvescore i procent: Cellient cellient score 3 cellient score 2 cellient score 1 cellient score 0 Figur 22. x-aksen viser scoren og y-aksen viser procent. Farvescore i PTM ,3 23,3 3,3 0 ptm score 3 ptm score 2 ptm score 1 ptm score 0 Figur 23. x-aksen viser scoren. y-aksen viser procent.

50 50 Søjlediagrammet figur 24 viser resultatet af samme prøve, men hvor der er lavet en ekstra celleblok da der var et naturlig koagel til stede i prøven. Der er ikke nogen forskel på farvescoren ved de 2 Cellient koageler. HE-farvescore på samme prøve, præpareret på Cellient cellient koagel cellient naturligt koagel Figur 24. x-aksen viser prøvenummeret. y-aksen viser farvescoren.

51 Resultater af den diagnostiske kvalitet på Cellient vs. PTM. Figur 25 viser resultaterne for den diagnostiske kvalitet, sammensat af farvescoren og scoren af diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet, på Cellient vs. PTM. Cellient har fået højest score ved 9 ud af 30 prøver hvor PTM har fået højest score ved 3 ud af 30 prøver. Ved 14 prøver har metoderne fået den samme score. Diagnostisk kvalitet for Plasma-trombin og Cellient 2, , , plasma-trombin cellient Figur 25 resultater af den diagnostiske kvalitet, scoret fra 0-2. X-asken viser prøvenummeret og y-aksen viser scoren.

52 52 Figur 26 og 27 nedenfor viser i procent fordelingen over hvor mange af prøverne, der har fået score 0, 1 og 2 i diagnostisk kvalitet, for henholdsvis Cellient og PTM. Cellient prøver har fået en score 2 ved 70% af prøverne og PTM 54%. Cellient prøver der har fået en score 1 er 20% og 33% for PTM. Til sidst er der 10% af Cellient prøverne der har fået en score 0 og 13% af PTM prøverne cellient score 0 10% DIAGNOSTISK KVALITET cellient score 1 20% cellient score 2 70% Figur 26. Den procentvise fordeling af den diagnostiske kvalitet for Cellient. PTM score 0 13% DIAGNOSTISK KVALITET PTM score 1 33% PTM score 2 54% Figur 27. Den procentvise fordeling af den diagnostiske kvalitet for PTM.

53 53 Tabel 16, viser hvilke prøver der har fået en score 0 og ikke kan bruges til at stille en diagnose på. 3 prøver fra Cellient og 4 prøver fra PTM er af dårlig diagnostisk kvalitet Resultater; Immunhistokemiske analyser Tabel 17. Nedenfor ses skemaet der viser de prøver der er blevet lavet IHC på, og hvilke antistoffer de er blevet testet med. Prøve 4 og 21 har et ekstra naturligt koagel som der også er lavet IHC på. Dette er markeret med *.

54 54 Tabel 18. Nedenfor ses alle IHC-kontroller beregnet i procent for hver score. Tabel 19 nedenfor viser, hvor der er observeret en forskel i om antistof-antigenreaktion er positiv eller negativ. 16% udgør en forskel mellem positiv og negativ baseret på 37 antistofantigenreaktioner.

55 Resultater af MTV ved metoderne. Tabel 20 nedenfor redegør for priser, laboratoriearbejde, materialer, størrelse og vægt for Cellient og PTM. Laboratorie arbejde samt præparering. PTM Størrelse: Ingen størrelse på fremstilling af koagel. Leica peloris bruges ved præparering og måler: 86 cm i bredden, 72 cm i dybden og 150 cm i højden. Vægt: ingen vægt på koagel. Leica peloris vejer uden reagenser: 331 kg. Med reagenser 430 kg. Pris for præpareringsmaskine: Cirka kr for peloris (er indkøbt) Cellient Størrelse: Cellient processor: 76,2 cm i bredden, 58,42 cm i dybden og 58,42 cm i højden. Cellient finishing station: 15,2 cm i bredden, 35,50 cm i dybden og 15,24 cm i højden. Vægt: Cellient processor vejer 63,50 kg og finishing station vejer 6,3 kg. I alt 70 kg. Pris for Cellient: kr (er ikke indkøbt). Pris pr. koagel: 21,64 kr Programmer: 2 timers xylenfri natkørsel. 4 timers xylenfri natkørsel. 8 timers xylenfri natkørsel. 12 timers xylenfri natkørsel. Der er mulighed for at tilføje andre programmer. Pris pr. koagel: 68,2 kr. Programmer: Cellient processor program 30 min. Cellient finishing station 15 min. Der er ikke mulighed for at køre andre programmer eller natkørsel.

56 56 Reagenser: Formalin, isopropanol og ethanol. Reagenser: Isopropanol, Xylen og Eosin Y. Peloris software giver ikke en melding inden start om der mangler reagenser på apparaturet. Meddelelsen kommer først, når præpareringen er i gang. Fremstilling af celleblok fra væske til færdigindstøbt blok: Cellient software gennemgår væsker inden start og meddeler hvis nye reagenser skal påfyldes. Fremstilling af celleblok fra væske til færdigindstøbt blok: Cirka 15 minutters laboratorie arbejde, 2 timers præparering samt 5 minutters indstøbning. Samlet tid: 2 timer og 20 minutter. (da koageler kun præpareres en gang dagligt skal tillægges ventetid på cirka timer). Antal kapsler: 432 kapsler pr. 2 kamre. Pr. kørsel Fremstilling af koagel: Manuelt Indstøbning af koagel: Manuelt Oprensning af prøver: ingen Fiksering af prøvemateriale: Efter præparering af prøven = 15 minutter efter [5]. Cirka 30 minutters laboratorie arbejde samt 45 minutter på Cellient. Samlet tid: 1 time og 15 minutter. Antal kapsler: 1 kapsel pr. kørsel Fremstilling af koagel: Automatisk Indstøbning af koagel: Automatisk Oprensning af prøver: fjerne blod, proteinrester og slim fra prøven Fiksering af prøvemateriale: Straks efter modtagelse [12].

57 Diskussion I diskussionsafsnittet vil diagnostiske relevante komponenter i cellebilledet, HE-farvning, diagnostisk kvalitet og IHC blive diskuteret i henhold til Cellient og PTM. Relevante artikler og teori vil indgå og blive sammenholdt med metoderne. Til sidst vil fremgå en delvis MTV, med fokus på apparatur og økonomi, som bliver diskuteret i henhold til metoderne Diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet ved HE-farvede prøver Cellient har fået bedst resultater, ved score 3, ved alle diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet undtagen celletæthed. En grund til at celletætheden er dårligere ved Cellient end PTM kan skyldes, at bioanalytikerne i CLAB ikke har fået delt prøvematerialet ligeligt mellem PTM og Cellient ved kun, at hælde lidt prøvemateriale over i et spidsglas til Cellient og beholde det meste af prøvematerialet til PTM. Dermed risikeres det, at der ikke er nogle eller få celler i det prøvemateriale til Cellient, og at alt prøve materialet er i den prøve til PTM. Derfor er det vigtigt at blande prøvematerialet godt og lave en præcis ligelig fordeling, når to metoder skal valideres overfor hinanden. Med det sagt kan den ikke ligelige fordeling eller manglende blanding af prøvemateriale betyde, at der næsten ikke vil forekomme nogle diagnostisk relevante celler i cellebilledet, og prøven vil så få en dårligere score ved celletæthed. Dog er Cellient prøverne kun 13% dårligere ved celletæthed end PTM, se figur 16. Det var ikke forventet at der ville være en forskel i celletæthed, da jeg havde regnet med, at prøverne blev ligeligt fordelt og blandet godt. Cellient er et nyt apparatur, der ikke er afprøvet på RH PA før, og derfor var det svært at forstille sig hvordan resultaterne ville blive. Derudover kan det tænkes, at prøvematerialet kunne blive delt sådan, at PTM fik en prøve med mere cellemateriale end Cellient, da det er PTM der indgår i diagnostikken. Det kan være at bioanalytikerne har ville sikre sig, at PTM prøverne havde nok prøvemateriale til at stille en diagnose på, sådan at prøvematerialet til Cellient er blevet nedprioriteret, fordi det er vigtigst, at den metode som indgår i diagnostikken har nok prøvemateriale. Ingen af artiklerne [58], [59] har nævnt hvorfor, celletætheden var bedre/dårligere ved metoderne. Det kan skyldes, at undersøgelserne [58], [59] har valgt at ligge fokus et andet sted ved, at give et mere overordnet resultat af metoderne. Hologic [1] nævner ikke noget om, at celletætheden kan være dårligere ved Cellient end ved PTM hvilket er oplagt, da det er tænkeligt at Hologic ikke ønsker at fremstille deres apparatur dårligere end andre metoder. Den parrede t-test

58 58 viste heller ikke statistisk signifikant forskel ved celletæthed, og derfor kan det skyldes tilfældige fejl, som at prøvematerialet ikke er delt ligeligt mellem metoderne eller, at det ikke har været blandet godt nok. Det er til Cellient s fordel at forskellen skyldes tilfældige fejl, da det ud fra 30 prøver siger noget om, at metoden alligevel kan være lige så god som PTM ved celletæthed. Da projektet kun opererer med 30 prøver er det stadig en mulighed, at PTM er bedre til at bevare cellemateriale end Cellient. Det er dog tvivlsomt, eftersom PTM cellematerialet står uden fiksering i 15 minutter, som det fremgår af tabel 20, og på den tid kan cellerne nå at autolysere, og det vil påvirke celletætheden. Cellient prøverne bliver fiskeret med det samme, og dermed er det mindre sandsynligt at cellerne autolysere. Derfor burde cellerne blive bevaret bedst ved Cellient. Det mest sandsynlige er, at prøvematerialet ikke er blevet delt ligeligt eller blandet godt nok. Det er under prøveindsamlingsperioden også observeret, at bioanalytikere har haft meget tilgængeligt prøvemateriale og kun frataget et lille spidsglas til Cellient. Indkøbes Cellient på afdelingen er det sandsynligt, at der ikke vil være problemer med celletætheden, i samme omfang, da alt prøvematerielet vil blive brugt. Det, at der er statistisk signifikant forskel mellem metoderne ved 4 ud af 5 parametre viser, at Cellient har en tendens til at bevare morfologien og undgår baggrundsdebri bedre end PTM. En mulig grund til at Cellient bevarer morfologien bedre kan være, at cellerne bliver fikseret med det samme, så de ikke har mulighed for at autolysere. En anden grund kan være, at ingen baggrundsdebri er vurderet som et godt resultat ved mit projekt. Dog kan baggrundebrien bruges til, at pege sig ind på en cancerform hvis der observeres tumordiatese [2], så nogle læger vil nok mene, at baggrundsdebri kan være til gavn. Dog har Wagner DG, et al., [58] ikke fundet statistisk signifikant forskel mellem de samme metoder, ved morfologi, vurderet på 35 prøver. Ved de 35 prøver er 22 af dem serøse væsker, som ved mit projekt. Kun ved kromatinstruktur er PTM lidt bedre end Cellient. Det er ikke oplevet ved mit projekt, at kromatinstrukturen er bedre ved PTM. Cellient har ved 87%- og PTM ved 30% af prøverne fået score 3. Dette skyldes at kromatinstrukturen blev tydeligere ved Cellient, se figur 28 og 29. Wagner DG, et al., [58] gør ikke opmærksom på, hvad det kan skyldes, at metoderne er lige gode. Artiklen er fra 2010 og væskerne og apparaturet kan være blevet optimeret, hvis Hologic har oplevet de samme problemer med celleblokkene som Wagner DG, et al., [58] En anden grund til at Wagner DG, et al., [58] har konkluderet, at metoderne er lige gode kan være, at lægerne i

59 59 undersøgelen sandsynligvis er vant til at se på PTM men ikke på Cellient og derfor ses nogle af ændringerne i cellebilledet, som dårligt eller lægerne kan synes, at det gør det svære at diagnosticere prøverne. Det fremgår tydeligt af figur 28 og 29 nedenfor, at der er meget forskel på hvilken metode der benyttes. Kromatinstruktur, kerner, cytoplasma afgrænsning og baggrund er tydeligere og mere afgrænset ved Cellient. Ved baggrundsdebri har 33% af Cellient s prøver og 7% af PTM s fået en score 3. Cellient er 26% bedre ved baggrundsdebri. Det kan skyldes, at Cellient prøverne bliver forbehandlet og vaskes i cytolytopløsning for at nedbryde erytrocytter, forebygge protein udfældning og fjerne slim, som fremgår af teorien punkt 6.5. På den måde vil der ikke være så meget baggrundsdebri i cellebilledet, når alt overskydende er fjernet. Ved PTM er der ikke forbehandling som kan vaske materielt for slim, blod m.m., og derfor kan der godt forekomme meget baggrundsdebri i cellebilledet, som kan gøre det sværere, at diagnosticere prøven. Dog kan baggrundsdebri godt bruges til, at diagnosticere på hvis der er tumordiatese til stede. Det kan derfor også være et dårligt element, at Cellient fjerner baggrundsdebri som nævnt tidligere. Men da scoresystemet er udarbejdet på sådan en måde, at baggrundsdebri er dårligt, så har Cellient generelt fået den bedste score set ud fra stikprøven. Skal Cellient indkøbes på afdelingen, er det vigtigt at forholde sig til, at baggrundsdebri bliver fjernet og derfor kan det ikke længere bruges som et led i diagnosticeringen på samme måde, som det gøres ved PTM. Prendeville S, et al., [59] en undersøgelse fra 2014, har fundet at 17% af deres i alt 29 maligne prøver, med 20 serøse væsker og 9 finnåls aspirater, har fået moderat eller høj score i cellemorfologi ved PTM, hvorimod Cellient prøverne har fået 62% med moderat eller høj score ved de i alt 29 maligne prøver. Ved mine resultater for cellemorfologi, har Cellient ved 50% af prøverne en score 3, både maligne og benigne prøver og PTM har fået 0% med en score 3. En grund til, at der er forskel i resultaterne ved Prendeville S, et al., [59] og mine kan være, at Prendeville S, et al., [59], har brugt scoringssystemet UKNEQAS [60], hvor jeg har udarbejdet mit, ved hjælp af teori, se punkt 6.1. Men generelt scores Prendeville S, et al., [59] celleblokke ved, at vurdere de samme komponenter i cellebilledet, som ved mit projekt. Det kan også ses, at cellemorfologien er en del bedre ved Cellient prøverne både, ved mine og Prendeville S, et al., [59] resultater. Prendeville S, et al., [59] pointerer også, at kerne- og kromatin struktur er tydeligere ved Cellient, Cellient CBs showed consistent superiority in overall preservation and nuclear chromatin detail [59]. Under

60 60 scoringsprocessen af prøverne i mit projekt, skyldes scoring på 3 ved 50% af Cellient prøverne også, at kromatin struktur, kerne- og celleafgrænsninger var markant bedre end ved PTM. Der var tænkt over, at Cellient måske ville bevare morfologien bedre, da Hologic gør meget ud af at pointere, at Cellient giver optimal bevarelse af cellemorfologien [1]. Samtidig var det ikke noget der var forventet, da firmaer vil fremhæve sit apparatur som det bedste. Derudover har Cellient prøverne vist sig at være bedre end PTM, når prøverne vurderes ud fra cellekriterierne, som fremgår af teorien 6.1, se også figur 28 og 29 nedenfor. Det gør det nemmere at se cellerne og vurdere kerne/cytoplasma ratio, når cytoplasma ikke flyder ud med baggrunden, som det gør på figur 29. Det er også vigtigt at kunne se kromatinet, da det også bruges til, at vurdere om cellerne er benigne eller maligne. Teori beretter, at kromatin i kernerne kan blive nedbrudt og ændret ved autolyse [61]. Hvis cellerne i PTM autolyserer en smule, inden de bliver fikseret, så vil kromatinet ikke være lige så godt velbevaret, som hvis cellerne bliver fikseret med det samme, hvilket de gør ved Cellient. DNA og RNA bliver også en smule ekstraheret ved formalinfiksering, derfor er der mere kromatin til stede ved alkoholfiksering, hvor DNA og RNA ikke bliver ekstraheret [62]. Det kan derfor også være en af grundene til at kromatinet er tydeligere ved Cellient. Figur 28. HE-farvning prøve nr. 20 Cellient. 400xforstørrelse.

61 61 Figur 29. He-farvning, prøve nr. 20. PTM. 400xforstørrelse. Dog har Prendeville S, et al., [59] ikke scoret nogle af de benigne prøver til moderat eller høj score ved Cellient eller PTM. Prøve 1, 4 og 9, præpareret på Cellient, i mit projekt har fået en cellemorfologi score på 0, 1 og 1. Prøve nr. 4 malign, så der er ikke observeret at det gør en forskel ved cellemorfologien, under mit projekt. Prendeville S, et al., [59] nævner ikke hvad der kan skyldes, at de maligne prøver får en bedre cellemorfologi score end de benigne, men det tænkes, at da det er forholdsvis subjektivt, at score de diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet, farvning og diagnostisk kvalitet i og med, at der sidder én person og vurderer prøverne. En anden grund kan være, at det ofte er lettere at vurdere prøver der er maligne, da kromatin strukturen bliver farvet meget stærkere, da der er mere af den i maligne prøver, som fremgår af teorien, punkt 6.1, tabel 1. At der ikke er oplevet en forskel på maligne og benigne prøver i mit projekt kan skyldes, at jeg ikke har diagnosticeret prøverne, men udelukkende vurdere de diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet ud fra scoringsskemaerne. Skulle jeg diagnosticere prøverne kunne det være, at jeg havde oplevet den samme tendens. Under projektet oplevede jeg dog, at det ofte var nemmere at score prøver med maligne celler, da nogle af de diagnostiske relevante komponenter i cellebilledet blev tydeligere. Det er et problem, at de maligne prøver kan være nemmere at vurdere, da de benigne prøver er lige så vigtige.

62 Delkonklusion af vurdering af diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet På baggrund af alle resultaterne ved alle diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet og andre undersøgelser [58], [59] konkluderes det, at Cellient viser en tendens til at bevare de diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet bedre eller lige så godt, som PTM. Cellient viser tendens til, at fjerne baggrundsdebri bedre end PTM og det kan der både være fordele og ulemper ved i forhold til, at bruge baggrundsdebri som led i diagnostikken. Det er et problem for begge metoder, at det kan være nemmere at diagnosticere på maligne celler, end benigne, da alle prøver er lige vigtige HE-farvning Ved HE-farvescoren har 90% af Cellient- og 23,3 % af PTM prøverne fået en score 3. Dog har 73,3% af PTM- og 10% af Cellient prøverne fået score 2, som også er en acceptabel farvescore. Grunden til at Cellient har fået en bedre score ved næsten alle prøverne kan skyldes, at den giver en intens pink farve i cytoplasma. PTM er lilla i cytoplasmaet, se figur 30 nedenfor. Figur 30. til venstre HE-farvning af prøve nr. 20 med PTM og til højre Cellient. 200xforstørrelse. Derudover fjerner PTM ikke baggrundsdebri, og derfor bliver det også farvet af Eosinen. Ved PTM bliver cytoplasma lilla, og dermed fremtones Eosinen ikke så nuanceret i farve intensiteten ved cellekomponenterne. Dette kan gøre det svært at skelne mellem cytoplasma og baggrund ved PTM, og det kan have betydning for lægen, når de skal diagnosticere i og med, at det kan være forstyrrende. Derfor er det en fordel at Cellient prøverne bliver vasket i Cytolyt opløsning, som

63 63 nævnt i punkt 6.4, da det meste baggrundsdebri fjernes. Grunden til at Eosinen ikke farver så kraftigt ved PTM kan være, at når der fikseres med formalin, dannes der methenbroer mellem formalin og proteinernes aminogrupper. Eosinens carboxylsyregruppe binder sig til proteinernes aminogrupper, og det kan være problematisk når der også er dannet methenbroer, mellem formaldehyd og proteinernes aminogrupper [19]. Derfor er det en fordel, at Cellient bruger methanol til fiksering, så der ikke dannes methenbroer der kan skabe problemer for farvningen. Ulempen er, at lægerne ikke er vant til at se på snit der er alkoholfiksret, og det vil kræve oplæring og tilvænning. Kruger AM, et al., [63] fandt, at der var statistisk signifikant forskel mellem Cellient og agar metoden. Kruger AM, et al., [63] mener også, at det er nemmere at vurdere de diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet, ud fra HE-farvningen, på Cellient end på den anden metode. Kruger AM, et al., [63] forklarer ikke hvorfor, at deres undersøgelse giver et bedre resultat, men da agar metoden også bruger formalinfiksering [63] kan det tænktes at det skyldes samme parametre, som jeg er nået frem til. Resultaterne af prøve 4, 21, 24 og 30 hvor der har været et naturligt koagel til stede i prøven, og derfor er lavet to celleblokke på Cellient af samme prøvemateriale viser, at der ikke er nogen forskel i farveresultatet, som det kan ses i punkt 10.3 figur % af Cellient prøverne har fået score 3 i farvning, og prøve 4, 21, 24 og 30 har også fået score 3 ved det ekstra naturlige koagel. Alt nævnt ovenfor viser en tendens til at reproducérbarheden, ved farvningen, af Cellient prøver er forholdsvis høj, vurderet på 30 prøver. Ud fra de 4 prøver, 4, 21, 24 og 30 kan man se, at reppetébarheden, dog konkluderet på 4 prøver, muligvis også er god da prøverne bliver farvet lige godt hver gang delkonklusion HE-farvning Det kan konkluderes ud fra de 30 prøver, plus en dobbeltbestemmelse på Cellient med 4 prøver, at Cellient viser tendens til, at gøre HE-farvningen mere optimal end PTM. Dette kan sandsynligvis skyldes formalinfiskeringen, og at der ikke er forbehandling ved PTM som fjerner baggrundsdebri. Kruger AM, et al., [63] fandt også, at farvningen var bedre med Cellient ved deres undersøgelse.

64 Diagnostisk kvalitet Cellient giver den bedste diagnostiske kvalitet ved, at 9 ud af 30 Cellient prøver har fået end bedre score end PTM. Ved PTM er er der kun 3 ud af 30 prøver med en bedre diagnostisk kvalitet end Cellient. Dog har 14 prøver, ved begge metoder, fået den samme score, som giver mening da PTM er godkendt til diagnosticering på afdelingen. Det ville være mærkeligt hvis de fleste af PTM prøverne havde fået en score 0, for så havde afdelingen brugt en metode som ikke er diagnostisk anvendelig. Derfor var det også forventet, at PTM ville få en score 1 eller 2 ved samlet diagnostisk kvalitet for de fleste af prøverne. Ses der på den procentvise fordeling har 70% af Cellient prøverne og 54% af PTM prøverne, fået en score 2. Den diagnostiske kvalitet er en samlet vurdering af diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet og farveresultat, derfor giver det mening, at Cellient har fået de bedste resultater ved den diagnostiske kvalitet, når metoden har fået det ved de andre parametre. Prøve 1, 3 og 28 præpareret på Cellient har fået en score 0 og er dermed ikke diagnostisk anvendelige, hvor prøve 3 og 28 er diagnostisk anvendelige ved PTM. Dette kan skyldes at prøve 1, 3 og 28 er noteret til ikke, at have modtaget Eosin ved celleblokpræpareringen på Cellient. Ifølge specialist i cytologi, Anette W. Hamminga [12], er den manglende Eosin et resultat af, at der ikke har været så meget cellemateriale tilgængeligt. Hvis der kun er lidt cellemateriale i prøven, så vil Cellient måske ikke påføre prøven særlig meget Eosin, da den farver cellerne for at visualisere, hvor på celleblokken der er prøvemateriale [22]. Den manglende Eosin er et problem, da det er svært at skære en celleblok, når det ikke vides hvor cellerne er på blokken. På den måde kan bioanalytikeren komme til, at skære noget vigtigt eller alt prøvematerialet væk. Eller omvendt komme til, at skære for lidt og dermed ikke dybt nok ind i celleblokken. Det er især vigtigt at det visualiseres hvor cellerne er henne, når der ikke er særlig meget cellemateriale tilgængeligt, så der ikke er noget som går tabt. Det er også oplevet ved andre prøver, hvor der har været problemer med Eosinen, at det lykkedes at præparere en ny celleblok, da Cellient ikke altid tager alt cellematerialet i brug. Men hvis der ikke er så meget prøvemateriale tilgængeligt, bruger Cellient det hele og det er ikke muligt at præparere en ny. Det kan undgås, at Cellient bruger alt prøvematerialet hvis der kun tages halvdelen af

65 65 prøvematerialet, til præpareringen, når der er mistanke om at materialet er cellefattigt. Hvis prøven ikke har modtaget Eosin efter første præparering kan der laves en ny, hvor der måske vil blive påført Eosin. Dette kan dog medføre, at halvdelen af det cellemateriale eksempelvis ikke indeholder maligne celler, men at der faktisk er maligne celler, dog i den halvdel der ikke er præpareret. Andre prøver hvor der manglede Eosin og var cellemateriale tilbage er blevet præpareret igen, hvor der blev påført Eosin anden gang. Grunden til at disse prøver fik Eosin anden gang skyldtes formegentlig, at Eosinen var for gammel, da den ser ud til at udfælde når den står i varme. Der er blevet taget højde for at det ikke er grunden til, at prøve 1, 3 og 28 ikke har fået Eosin, ved at Eosinen er blevet skiftet få dage inden prøve 1, 3 og 28 blev præpareret. Det er ikke nævnt i nogle andre undersøgeler, [58], [59] og [63], at Eosinen kan være et problem. Hologic s hjemmeside [1] nævner heller ikke, at der kan være problemer med Eosinen hvilket er mærkeligt når det er sket flere gange ved mit projekt, selvom der blev kørt væske kontrol og skiftet Eosin. Teori beretter dog, at Eosin bør opbevares køligt med ventilation [64]. Det er ikke muligt at opbevare Eosinen køligt på Cellient, da den står i maskinen hvor der er varmt og ingen ventilation. Dette er er betydeligt problem ved maskinen da der skal bruges tid og ressoucer på, at skifte Eosinen hver 10 dag cirka, som blev erfaret under det praktiske forløb. En mulighed er, at personalet kan stille Eosinen i køleskab hver dag når arbejdsdagen er slut, så den ikke står og fælder ud inde i det varme apparatur. Ulempen er, at det kræver tid at skulle flytte Eosinen af og på, hver dag, og der åbnes for det rum i apparaturet hvor Xylenen også er, som er sundhedsskadelig for personalet at indånde [65]. Prøve 1, 12, 15 og 17 er blevet scoret til 0 ved PTM, og er derfor heller ikke diagnostiske anvendelige. Ved prøve 1 har lægen noteret, at der næsten ikke er nogle celler i det materiale der er modtaget, og at det ikke er egnet til at diagnosticere på. Hvilket også blevet observeret ved mikroskopi af prøve 1, for både Cellient og PTM. Det kan skyldes, at materialet, som er en cystevæske, forekom meget cellefattigt. Hele prøven må have været med få diagnostisk relevante celler, da både Cellient og PTM prøven blev noteret til ikke, at være diagnostisk anvendelig. Dette er et problem, da der ikke er mulighed for at stille en diagnose. Hvis der ikke har været prøvemateriale ved prøveudtagningen, så må der bestilles en ny, hvis dette er muligt. Ved prøve 12 på PTM er det noteret, at der er autolyserede mesothelceller i prøven, og ved prøve 15 på PTM er det noteret, at der er få mesothelceller til stede. Dette blev også observeret ved mikroskopi. Dog har Cellient prøverne, 12 og 15 fået en score på 1 ved samlet diagnostisk kvalitet.

66 66 Selvom Cellient prøve 15 er accepteret til at stille en diagnose på, så var der også meget få diagnostisk relevante celler i prøven, men alligevel nok til at stille diagnose i modsætning til PTM. Dette kan skyldes, at der har været flere celler i den prøve som er præpareret på Cellient, og at Cellient giver en bedre farvning og et bedre morfologisk overblik. Derudover bliver Cellient prøverne opbevaret i PS som sørger for, at fiksere cellerne med det samme så de ikke autolyserer, som det også fremgår af teorien, 6.5. Som nævnt tidligere, fikseres PTM prøverne ikke med det samme og derfor kan cellerne autolysere. PTM prøverne bliver formalinfikseret og det tager lidt længere tid for formalinen, at trænge ind til midten af koagelet [62] end det gør for PS, som kan fiksere en enkelt celle med det samme. Ved prøve 17 på PTM er det noteret og observeret mikroskopisk, at cellematerielt er autolyseret og at det derfor er svært, at give en vurdering da de diagnostisk relevante celler mangler kerner og kromatin struktur. Dog har Cellient prøve 17 fået en diagnostisk kvalitetsscore på 2, som er optimal. At prøve 17 ikke er diagnostisk anvendelig ved PTM, men er det ved Cellient kan skyldes de samme parametre, som er nævnt ved prøve 12 og delkonklusion: diagnostisk kvalitet Det konkluderes at Cellient viser en tendens til, at celleblokkende er af lidt bedre diagnostisk kvalitet end PTM s celleblokke, vurderet på baggrund af 30 prøver. Der er dog 14 prøver hvor Cellient og PTM er lige gode, så derfor viser det også, at metoderne giver meget ens resultater. Det ser også ud til, at Cellient muligvis bevare cellematerialet bedre end PTM på grund af forbehandlingen. Problematikken med Eosinen, på Cellient, er svær at løse, da Cellient er designet på den måde som den er. Derfor vil Eosinen muligvis fremadrettet give problemer ved cellefattigt prøvemateriale. Til sidst konkluderes det, at problemet med for gammelt Eosin kan løses ved, at stille Eosinen i køleskabet efter endt arbejdsdag, og skifte den hver 10 dag cirka Immunhistokemiske analyser 76,5% af PTM- og 50% af Cellient prøverne har fået en score 3 i kontrol materialet. PTM er 26,5% bedre end Cellient, ved score 3. Dette kan skyldes, at en del af Cellient IHC kontrollerne ikke kunne scores, da kontrolsnittene var faldet af. Det galt dog også for 8,8% af IHC kontrollerne ved PTM. Immunspecialist Pernille Frederiksen har udtalt, at det er et generelt problem der opleves i immunlaboratoriet på RH PA, at deres kontroller falder af, krøller og farver uspecifikt. De har i

67 67 immunlaboratoriet på RH PA, ikke noget svar på hvorfor det sker. En af grundene til, at kontrollerne ved Cellient har været så dårlige, at 21% har fået en score 0 kan være, at kontrollerne nogle gange har været i varmeskab 2 gange, da kontrolsnittene har været sat på flere dage inden prøvematerialet er blevet skåret. Det kan være, at kontrolsnittene ikke har kunnet tåle at være i varmeskab 2 gange. Forskellen mellem PTM og Cellient kan også skyldes, at der bruges protokoller anbefalet af specialist i cytologi, Anette W. Hamminga [12], til IHC prøver der er Cellient præparerede. Da de nye protokoller ikke er valideret og optimeret på RH PA, er de ikke optimale til brug endnu. I protokollerne for IHC, anbefalet til Cellient, bruger anti-p16, anti-ca125, anti-ck7, anti-ck20, anti-p53, anti-wt1 og anti-cdx2 et såkaldt prep kit som betyder, at det er en fortynding som hospitalet hvor, specialist i cytologi Anette W. Hamminga arbejder, selv laver [12]. Da det ikke vides hvad fortyndingerne er har immunspecialisterne valgt, at bruge de fortyndinger der bruges til PTM. Derfor kan mange af de dårlige farvninger også skyldes, at fortyndingen med antistoffet ikke er korrekt, da der ikke er noget svar på hvad den rigtige fortynding er. Anti-P53, som også har en protokol med prep kit, har kun fået én score 3 ud af 6 prøver. At anti-p53 har fået dårlige resultater kan skyldes, at det er et antistof som kun skal reagere hvis tumorsuspressor antigenet P53 er til stede, og at det kun farver b-cellernes kerner. Hvis fortyndingen med antistoffet har været for lav er det ikke sikkert, at der er nok antistof som har bundet sig til antigenet, og dermed er der ikke opstået en reaktion. Anti-P53 er monoklonalt, som alle andre antistoffer i projektet, så det burde ikke have en betydning for resultatet. Hvis anti-p53 var polyklonalt så kunne det have været en mulig grund til, at der ikke var sket en reaktion, da polyklonale antistoffer er mindre specifikke end monoklonale [66]. En anden parameter, som kan gå ind og ændre på IHC er, at de protokoller som er anbefalet til Cellient [12], er fra Holland og det kan tænkes, at grundvandet er anderledes der. Derfor er det vigtigt at forholde sig til at små parametre som vand, luftfugtighed og temperatur muligvis kan medvirke til, at IHC ikke virker optimalt altså, at antistof-antigen reaktion ikke forløber som den skal. Montgomery E, et al., [67] der har lavet en validering med 31 antistoffer på Cellient nævner, at deres fortynding er 1:1000 ved Anti-CK20, hvor fortyndingen på RH PA, er 1:400 [11]. Derfor kan fortyndingen have betydning for IHC resultatet, da antistofferne måske binder forskelligt alt efter hvilken fortynding der bruges, og måske kan der forekomme uspecifik eller ingen farvning ved ikke

68 68 optimal fortynding. For lav fortynding kan resultere i, ingen binding og dermed ingen farvning. For høj fortynding kan resultere i uspecifik baggrundsfarvning [66]. Montgomery E, et al., [67] har ikke valideret Anti-P53, så derfor er det ikke muligt at sammenligne deres fortynding med RH PA s. Montgomery E, et al., [67] nævner, at de havde problemer med Anti-CA125 og gik så fra, at benytte DAKO som leverandør til Novocastra. Dette gav et bedre resultat for Anti-CA125, med fortyndingen 1:200, ved begge metoder. På RH PA, er Novocastra også leverandør med fortyndingen 1:200 [11], derfor kan det tænkes, at fortyndingen er optimal. 3 prøver i mit projekt har fået IHC med Anti-CA125 og prøve 20, har fået score 0 i kontrollen, hvor de 2 andre prøver, 13 og 16 har fået score 2 og 3. I patient prøven på Cellient stemmer prøve 13, 16 og 20 overens med PTM, da de er blevet positive ved begge metoder. At prøve 20 har fået score 0 i kontrollen kan skyldes problemerne med, at kontrolmaterielt ofte faldt af eller, som nævnt ovenfor, at der generelt er problemer med kontrollerne. Det vil give mest mening, at det er derfor kontrollen har fået score 0, da Montgomery E, et al., [67], ikke har oplevet problemer efter de har skiftet leverandør til Novocastra, som RH PA også bruger og med samme fortynding [11]. På RH PA er leverandøren for Anti-P53, DAKO [11]. Havde det været muligt under projektforløbet kunne det være afprøvet, om det ville give et bedre resultat hvis Anti-P53 kom fra Novocastra. Dog er klonen, DO-7 ved Anti-P53 den samme hos DAKO [68] og Novocastra [69], dog bruger DAKO fortyndingen 1:200 [68] og Novocastra bruger fortyndingen 1:800 [69] derfor er det en mulighed, at afprøve fortyndingen 1:800 og se, om det giver et bedre resultat, selvom det er en lavere koncentration, som måske vil gøre det vanskeligere at få antistoffet til at binde sig til antigenet. Det kunne også være en mulighed, at afprøve en højere koncentration. Da klonen er den samme og er monoklonal kunne det afprøves med et polyklonalt antistof, selvom at det kan give stærkere baggrundsfarvning, da et polyklonalt antistof kommer fra flere kloner og er mere uspecifikt end monoklonale antistoffer [7]. Montgomery E, et al., [67] fandt, at Anti-ER gav dårlige resultater både ved Cellient og PTM hvor, at anti-er ved mit projekt gav gode resultater. Det kan igen have noget med fortyndingerne, at gøre og leverandøren af antistoffet. Anti-ER bliver leveret fra Roche på RH PA og bruger RTU [11] og for Cellient protokollen bruger Anti-ER fortyndingen 1:250 [12]. Montgomery E, et al., [67] bruger DAKO som leverandør og fortyndingen 1:50. Det er muligt, at Roche RTU antistof og fortyndingen 1:250 er bedre til, at lave antistof-antigenreaktion med anti-er og, at fortyndingerne binder bedre

69 69 og undgår uspecifik baggrundsfarvning. Montgomery E, et al., [67] konkluderer, at IHC på Cellient skal videreudvikles og optimeres. Ud fra ovenstående viser det, at fortyndinger og leverandør muligvis er afgørende for, hvor godt et IHC resultat der fås. Det var ikke forventet, at Cellient prøver ville give så mange problemer ved IHC, men da andre projekter har haft samme problemer kan det skyldes, at den rigtige IHC metode til Cellient prøver ikke er fundet endnu. I en anden undersøgelse af Kruger AM et al., [63] er Cellient metoden overfor agar metoden afprøvet i forhold til forskellige antistoffer. Herunder er anti-ck20, anti-ca125 og anti-p53 med i undersøgelsen, hvor fortyndingerne med antistofferne er anti-p53, 1:150, anti-ca125 og anti-ck20 1:200. Kruger AM et al., [63] fandt at 52% af prøverne ved begge metoder var i overensstemmelse med hinanden, i forhold til positiv og negativ antistof-antigenreaktion. Ved mit projekt er 74% af antistofreaktionerne ved, begge metoder, i overensstemmelse med hinanden, altså IHC patientprøverne opnåede samme antistof-antigenreaktion ved begge metoder. 26% opnåede en forskel mellem positiv og negativ reaktion i patientprøverne, se 10.5 tabel 19. Dog oplevede Kruger AM et al., [63] at anti-ck7, anti-ck20, anti-wt1, anti-er og anti-calret gav negative IHC resultater ved Cellient, hvor agar metoden gav positive resultater. I mit projekt var der 16% hvor Cellient gav negative resultater og PTM gav positive, ved anti-er, anti-ep4, anti-calret, anti- WT1 og anti-ck7. Det kan ses, at anti-calret, anti-wt1, anti-er og anti-ck7 har givet falsknegative resultater ved begge projekter. Der er dog stadig forskel på resultaterne ved mit projekt og Kruger AM et al s., [63] undersøgelse. Forskellen kan skyldes brugen agar metoden overfor Cellient, hvor jeg undersøger PTM overfor Cellient. Agar metoden skiller sig ud fra PTM ved, at koagelet ikke blandes med plasma og trombin, men at det pakkes ind i linsepapir også ligges det i 3% smeltet agar i få minutter [70]. Ved Kruger AM et al s., [63] undersøgelse er der også lavet ekstra biopsier til sammenligning af de Cellient prøver, som ikke var i overensstemmelse med agar prøverne og derfor dokumenteres det, at prøverne gav falsk-negative svar. Det er pudsigt, at der er falsk-negative resultater ved de samme antistoffer, men det er ikke til at sige om det er tilfældigt eller om der er en sammenhæng. Anti-CK7 har kun givet ét falsk-negativt svar ud af 4 ved mit projekt, så det kan skyldes tilfældigheder. Kruger AM et al., [63] mener, at protokoller til Cellient prøver skal optimeres for hvert enkelt antistof før, at metoden er brugbar. Der skal tages højde for at prøverne er alkoholfikseret, da det kan påvirke favningen mener Kruger AM et al., [63]. Teori beretter, at alkoholfiksering ændre den tertiære protein struktur, men at den

70 70 primære og sekundære struktur og antigenisiteten er velbevaret. Celle- og vævsmorfologi er ikke så godt velbevaret. Ved formalinfiksering bevares den oprindelige struktur næsten optimalt og celle og vævsmorfologi er velbevaret. Ulempen ved formalinfiksering er, at epitoper maskeres [62]. Det er derfor svært, at sige om det er alkoholfiskeringen der går ind giver problemer ved IHC, når det tyder mere på, at det er protokollerne der skal optimeres og specialiseres for hvert antistof. Der er forskellige fortyndinger både ved Montomery E, et al., [67] Kruger AM, et al., [63] og mit projekt, og det tyder på, at ingen af disse fortyndinger er helt optimale for IHC ved Cellient prøver. Derfor kan det være en idé, at lave et optimerings forsøg hvor forskellige fortyndinger og forbehandlinger afprøves med hvert antistof, som Kruger AM, et al., [63] også mener. Et andet projekt af Prendeville S, et al., [59] har fundet, at Cellient metoden gav bedst IHC resultater overfor PTM vurderet på 15 prøver med 4 antistoffer, anti-ck7, anti-ae1, anti-cd45 og anti-p63. Det kan være tilfældigheder der har afgjort, at Cellient gav bedre resultater end PTM når kun 15 prøver, med 4 ovenstående antistoffer, er valideret. Det er også nogle andre antistoffer end dem jeg har afprøvet, på nær anti-ck7 og det kan være, at anti-ae1, anti-cd45 og anti-p63 fungerer mere optimalt. De 4 antistoffer bliver leveret fra Ventana og er alle monoklonale. Fortyndingerne er ikke oplyst, men anti-ck7 har klonen SP52 hvor RH PA bruger det samme [71]. Anti-CK7 har i mit projekt ved PTM opnået score 3 i kontrol materialet på 5 ud af 5 prøver, og ved Cellient score 2, på 4 ud af 6 og score 3, på 2 ud af 6 kontroller. Set ud fra mit projekt og Prendeville S, et al., [59] så ser det ud til, at anti-ck7 muligvis fungerer optimalt med leverandør fra Ventana og klon SP52. Kruger AM, et al., [63] brugte 65 prøver og Montgomery E, et al., [67] brugte 38 patientprøver, med henholdsvis 31 og 19 forskellige antistoffer, hvilket gør deres projekt mere generaliserbart end Prendeville S, et al s., [59] projekt, da der er undersøgt flere antistoffer, på flere prøver. Antallet af prøver øger reproducérbarheden, da der tydeligere vil kunne ses en tendens hvis 20 prøver er valideret på anti-ck7 frem for 5 prøver. Ved mit projekt er valideret 7 prøver på 10 antistoffer, da det var det der kunne nås inden for tidsperioden. Selvom, at PTM har 76,5% prøver der har fået score 3 ved IHC, så er Cellient mere intens og uden så mange uspecifikke reaktioner. Det kan skyldes maskeringen af epitoper ved PTM, selvom der forbehandles ved IHC med demaskering, men der kan muligvis være nogle epitoper tilbage som forbliver maskerede. Cellient metoden bevare antigenisiteten bedre, da der bruges alkoholfiksering og det kan også betyde, at farvningen bliver mere specifik. Det kan også være, at nogle af

71 71 protokollerne er optimale for prøver præpareret på Cellient, men ikke for PTM prøver og Cellient kontrolmateriale, da det er formalinfikseret. Dette gælder især for prøver med positiv antistofreaktion, se figur 31 nedenfor. Selvom, at Cellient prøver ikke giver helt optimale resulter ved IHC, så er Cellient prøverne med IHC meget specifikke og optimale i farvningen når det virker. På figur 32, kan ses, at anti-ck7 fungerer optimalt både ved Cellient og PTM i patientprøven. Figur 31. CALRET.. Til venstre PTM og til højre Cellient. 400xforstørrelse. Figur 32. CK7 Til venstre PTM og til Højre Cellient. 200xforstørrelse Delkonklusion af immunhistokemiske analyser

72 72 Cellient og IHC skal optimeres, da der sker fejl som giver falsk-negative resultater. Det vides ikke præcis hvorfor der kommer falsk-negative resultater, men ud fra artiklerne Montgomery E, et al., [67] og Kruger AM, et al., [63] og mit projekt, så kan det have noget med fortyndingerne, fikseringen og forbehandlingen at gøre. Alle antistoffer bør valideres, og der bør laves en protokol specialiseret til hvert antistof. Andre parametre som kan have indflydelse på IHC, kan være leverandøren af antistofferne. Da antistofreaktioner gennemgår mange trin betyder det, at der kan ændres på mange trin for, at gøre metoden optimal. Cellient prøverne har vist sig, at være gode til IHC og der forekommer næsten ingen uspecifik farvning. Derfor kan det konkluderes, at det kunne være en god idé at arbejde videre med optimering af antistofferne, da der ses en tendens til at prøverne bliver optimale når IHC virker Diagnostisk kvalitet, udtalelse fra Overlæge Lotte Nedergaard Overlæge Lotte Nedergaard, har givet diagnostisk vurdering af Cellient vs. PTM. Hun mener, at baggrunden bliver pænere og renere ved Cellient, hvilket kan gøre det lettere, at se cellerne enkeltvis og der er ikke forstyrrende elementer i baggrunden. Det er det samme jeg har konkluderet i punkt Det skyldes muligvis forbehandlingen på Cellient. Derudover nævner Overlæge Lotte Nedergaard også, at cellerne ligger mere adskilt ved Cellient, så det gør det nemmere at orientere sig i cellebilledet og give en vurdering af hver celle. Dette er en fordel, da hver enkel celle er vigtig for diagnosticeringen, da der kan være én ud af alle cellerne som er malign. Det er ikke noget jeg har vurderet ud fra mine scoringsskemaer, men jeg nævner også i punkt 11.3, at cytoplasmaet ved Cellient ikke flyder sammen med baggrunden og derfor er det nemmere, at vurdere hver enkelt celle. Overlæge Lotte Nedergaard synes dog, at cytoplasmaet i Cellient er for Eosinofilt og derfor synes hun, at det gør det sværere at vurdere. I punkt 11.3 forklares det også hvorfor, at cytoplasmaet er mere Eosinofilt ved Cellient end ved PTM. Det fremgår også af teorien punkt 6.3, at PTM bruger formalin som fikseringsmiddel der går ind og danner methenbroer mellem proteinernes aminogrupper, og det kan så skabe problemer for HE-farvningen, når Eosinen binder sig til aminogruppernes aldehyder [62]. Da jeg ikke er vant til at se på Cellient- eller PTM, synes jeg ikke, at det er et problem, at cytoplasmaet er Eosinofilt. Jeg synes, at det Eosinofile cytoplasma gør det nemmere, at se på frem for PTM hvor cytoplasmaet er lilla og derfor synes jeg, at det er sværere at skelne mellem de andre komponenter i cellebilledet. At cellerne ser anderledes ud på Cellient end PTM, mener Overlæge Lotte Nedergaard kræver tilvænning eller oplæring. Hologic, nævner selv, at

73 73 de anbefaler at der tages et kursus, i at mikroskopere Cellient celleblokke, som Hologic også udbyder [1]. Jeg har selv pointeret, at lægerne kan være vant til at se på PTM og derfor kan de synes, at det er vanskeligere, at se på Cellient prøverne. Hun synes derudover, at det er ærgerligt, at der ikke har været så meget cellemateriale i tilgængeligt ved Cellient, men som jeg nævner i punkt 11.1, har det muligvis primært noget med opdelingen af prøverne, at gøre og det vil nok ikke ske hvis hele prøven bliver præpareret på Cellient. Overlæge Lotte Nedergaard, vurderer anti-ck7, anti-p53 og anti-ca125 til, at være pæne IHC snit på Cellient. Jeg nævner selv, at anti-ck7 er optimal i både prøve- og kontrolmateriale. Det kan, som nævnt i punkt 11.6, have noget at gøre med, at anti-ck7 protokollen, leverandøren og klonen er optimal for IHC, på prøver fra Cellient. Anti-P53 har jeg dog vurderet til, at være dårlig i kontrollen ved 3 ud af 6 IHC prøver på Cellient. I patientprøven stemmer alle anti-p53 Cellient prøver overens med PTM, og der forekommer ingen falsk negative/positive svar. Grunden til at Lotte og jeg har vurderet anti-p53 forskelligt, kan have noget at gøre med, at Overlæge Lotte Nedergaard, kun har vurderet patientprøven, hvor jeg både har vurderet kontrolmaterialet og patient prøven. Hvis der udelukkende ses på min vurdering af resultaterne ved patientprøverne med anti- P53, så har jeg vurderet det samme som overlæge Lotte Nedergaard. Cellient prøverne er, som nævnt i punkt 11.6 gode på IHC i patientmaterialet. Anti-CA125, som overlæge Lotte Nedergaard har vurderet til at være god, giver heller ingen falsk negative/positive svar og stemmer overens med PTM. 1 ud 3 anti-ca125 IHC kontroller på Cellient har dog fået en score 0, men det kan som nævnt tidligere måske skyldes problemet med kontrolmaterialet på RH PA. Grunden til at overlæge Lotte Nedergaard har vurderet anti-ca125 som godt er, at hun kun har vurderet patientmaterialet. De resterende IHC prøver har overlæge Lotte Nedergaard ikke vurderet, da hun mente, at der var for mange af de prøver som ikke kunne vurderes. Hun har derfor valgt de 3 bedste ud, som hver især giver en forskellig reaktion, anti-ck7 reagerer i cytoplasma, anti-p53 i kerner og anti-ca125 i membranen. Overlæge Lotte Nedergaard mener, at Cellient er god og på nogle punkter bedre end PTM. Men hun mener, at det kræver optimering af metoden, før den kan tages i brug, men at den er værd at arbejde videre med. Det er det samme artiklerne [59], [63] og [67] også mener Delkonklusion: Diagnostisk kvalitet udtalelse overlæge Lotte Nedergaard

74 74 Overlæge Lotte Nedergaard mener, at Cellient metoden bør arbejdes videre med, men at den kræver justering og optimering. Jeg er selv nået frem til det samme, og mine patientprøve resultater ved anti-ck7, anti-p53 og anti-ca125 stemmer overens med lægens. De resterende antistoffer har overlæge Lotte Nedergaard ikke vurderet, så dem kan jeg ikke sammenligne med Delvis medicinsk teknologivurdering med fokus på økonomi og apparatur Som det fremgår af punkt. 10.6, tabel 20, er det dyrere, at indføre Cellient metoden frem for den nuværende PTM. Det koster 46,56 kr mere, at lave en celleblok på Cellient end PTM. Det er en ulempe, at Cellient vil koste 46,46 kr mere pr. celleblok der laves på RH PA, hvis den indføres. Det er en fordel, at PTM s præpareringsmaskine allerede er indkøbt på afdelingen og derfor er der ingen fremtidig ugift ved det. Cellient apparaturet koster kr, og det er en del penge som skal afsættes i budgettet hvis apparaturet indkøbes. Dog er det kun et én gangs beløb. Ud fra min vurdering bør der være 2 Cellient apparaturer hvis der skal kunne laves minimum 8 celleblokke om dagen, især hvis Cellient skal erstatte den nuværende PTM. Det tager cirka 1 time og 15 minutter, fra forbehandling til færdig celleblok med Cellient, og hvis der skal laves 8 koageler en dag vil der være brug for 2 apparaturer, da der også er andre opgaver i CLAB. Der skal bruges 15 minutters laboratorie arbejde på PTM, pr. koagel, så det er halvt så lang tid, som der skal bruges på Cellient. Det er derfor en fordel, at der skal bruges mindre tid på laboratoriearbejdet i CLAB ved PTM end ved Cellient. Det er en stor fordel, at celleblokke på Cellient kan være klar til skæring efter 1 time og 15 minutter, da der er mulighed for at skære celleblokken samme dag, som prøven modtages. Det er en ulempe, at det vil tage minimum et døgn at lave en celleblok ved PTM, da det først er muligt at skære celleblokken efterfølgende, også derefter diagnosticere prøven. Dermed er der større sandsynlighed for, at svar til patienten vil tage længere tid ved PTM. Derudover er det også en fordel, at Cellient metoden ikke bruger formalin både i forhold til personale, sundhedsfare, som at stoffet er kræftfremkaldende i høje koncentrationer og ved længere påvirkning [72]. Formalin kan også minimere kvaliteten af celleblokkende i forhold til HE-farvningen og IHC som er nævnt i punkt 11.3, og 11.7, hvilket er en ulempe ved PTM. Dog er afdelingens læger vant til, at diagnosticere celleblokke lavet ved PTM, og det vil kræve tilvænning og oplæring af personale, at indføre Cellient. Dog bruger Cellient Xylen som også er sundhedsskadeligt. Det er kun hvis

75 75 personer udsættes for dampende i længere tid og i høje koncentrationer, at det kan give hjerneskader og skader i forbindelse med reproduktion [65]. På Cellient, er Xylenen opbevaret i et lukket system sammen med de andre væsker. Når der skal sættes en prøve på apparaturet åbnes lågen ikke til rummet med Xylen. Derfor udsættes personalet kun for Xylen, når der skal skiftes væsker men der tages forholdsregelser, og det er vigtigt at stå under udsug. Andre fordele ved Cellient er, at metoden er automatisk, og at bioanalytikerne derfor ikke behøver at bruge tid på at indstøbe celleblokken. Det er dog kun 5 minutter, der skal bruges på at indstøbe celleblokken, men den arbejdsopgave vil blive fjernet også kan bioanalytikerne bruge tid på andre arbejdsopgaver som også er vigtige. Derudover er det også en fordel, at Cellient bruger forbehandling som sørger for, at vaske cellerne for blod m.m. og at prøvematerialet fikseres med det samme, som det fremgår af teorien 6.4. Ved PTM bliver prøverne først fikseret 15 minutter efter koagelet er lavet, og det er en ulempe da cellerne kan autolysere, som det fremgår i 10.6 tabel 20. Cellerne bliver altså bedre bevaret ved Cellient på grund af forbehandlingen, og det er en fordel for diagnostikken. PTM kan præparere prøver ved natkørsels programmer hvilket er en fordel, da der ikke behøver at være personale til stede imens. Ved Cellient metoden, skal prøverne præpareres inden fyraften, og det kan selvfølgelig godt være end ulempe hvis der er travlt på afdelingen og der modtages 3 prøver klokken 14:30. Da Cellient kun kan lave en celleblok ad gangen, vil det cirka tage 3 timer og 30 minutter, at lave 3 celleblokke hvis der kun er et apparatur på afdelingen. Forbehandlingen er kun regnet med én gang, da alle 3 prøver vil kunne forbehandles på samme tid. Men hvis det er tilfældet, at der kommer 3 prøver mellem kl 14:00 og 14:30, så vil minimum én prøve alligevel først blive præpareret den efterfølgende dag. Indkøbes der 2 apparature er det mere sandsynligt, at alle prøver vil kunne præpareres inden endt arbejdsdag. Til sidst vil det kræve ekstra plads i laboratoriet, at indkøbe Cellient selvom apparaturet ikke er særlig stort, under 1 meter bred, vil det alligevel tage noget plads. Det er en ulempe, da det ikke er sikkert at RH PA, CLAB har plads til 2 apparaturer på afdelingen Delkonklusion, Delvis medicinsk teknologivurdering med fokus på økonomi og apparatur Ud fra den delvise MTV er der flest fordele i forhold til apparatur, personale, arbejdsmiljø og patient ved at indkøbe Cellient, men ulempen er økonomien og pladsen, og det er op til afdelingen

76 76 at vurdere, om de skal bibeholde PTM, da det er er en metode der fungerer, eller om de skal indkøbe Cellient Konklusion På baggrund af alle resultaterne konkluderes det, at PTM og Cellient er tilnærmelsesvis lige gode. Begge metoder er gode nok til at stille en diagnose på, men der er også fordele og ulemper. Ved resultaterne for diagnostisk relevante komponenter i cellebilledet konkluderes det, at Cellient er den fortrækkende metode. Begge metoder viser dog en tendens i cellebilledet til, at det er nemmere at vurdere maligne celler end benigne, hvilket er et problem ved metoderne. På baggrund af 30 patientprøver konkluderes det også, at HE-farvningen giver et mere optimalt resultat ved Cellient hvilket formegentlig skyldes, at der ikke fikseres med formalin, og at forbehandlingen fjerner baggrundsdebri. Den diagnostiske kvalitet viser ud fra stikprøven, at Cellient giver de bedste resultater. Dog konkluderes det, ud fra HE-farvningen, at begge metoder er af acceptabel diagnostisk kvalitet og kan bruges til at stille en diagnose på. Eosinen som tilføres på celleblokken ved Cellient metoden er et problem, og det konkluderes at der lige nu ikke er nogen løsning på, hvordan cellefattige prøver skal få påført Eosin. Problemet med for gammelt Eosin kan løses ved, at stille Eosinen i køleskabet efter endt arbejdsdag og skal skiftes hver 10 dag. IHC skal optimeres ved Cellient metoden, før den kan indgå i diagnostikken, som andre undersøgelser også mener, da metoden giver problemer med falsk-negative resultater. Derfor konkluderes det, at alle antistoffer bør valideres og der skal laves en protokol til hvert antistof med de rette fortyndinger, klon og leverandør, som er optimal for Cellient prøver. Cellient giver gode resultater i patientmaterialet ved Anti-CK7, Anti-P53 og Anti-CA125. Cellient med IHC giver gode resultater uden uspecifik farvning, når det virker, Derfor synes jeg at der skal arbejdes videre med optimering af metoden ved IHC. Overlæge Lotte Nedergaard konkluderer også, at Cellient bør arbejdes videre med, men at den kræver justering, oplæring og tilvænning. Derudover stemte vurderingen af mine IHC-resultater, i patientmaterialet, overens med overlæge Lotte Nedergaards resultater, og hun mener også, at IHC giver flotte resultater med Cellient, men at metoden skal optimeres. Ud fra den delvise MTV, er Cellient metoden vurderet til at have flest fordele undtagen det økonomiske aspekt. Hvis diagnostik, patient samt arbejdsmiljø for personale vægtes højere end

77 77 økonomi, så vil det være at foretrække at indkøbe Cellient på afdelingen, set ud fra den delvise MTV. Til sidst konkluderes det, at den nuværende PTM kan forblive på afdelingen og blive bibeholdt som metode til fremstilling af celleblokke på serøse- samt cystevæsker, men Cellient viser gode resulstater og vil kunne erstatte eller supplere PTM, hvis den optimeres ved IHC så der opnås optimale resultater, og hvis personalet får oplæring og kurser i at diagnosticere på Cellient præparerede celleblokke Perspektivering: Hvis tidsperioden for projektet var længere, eller hvis jeg var sammen med flere om projektet, kunne det også være interessant, at metodevalidere PTM overfor Cellient, i forhold til molekylærpatologi og specialfarvninger. På den måde kunne det blive undersøgt om Cellient også kunne fungere som erstatning for PTM, i en molekylærpatologisk sammenhæng og i forhold til specialfarvninger. Derudover kunne der, også være blevet optimeret på IHC.

78 Litteraturliste [1] Cellient Automated Cell Block system [hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.23/11/2016]. Tilgængelig på [2] Thomsen U., Ringsholt M., Wahl S., Kopke P., Balslev E., og Nielsen K. Basisbog i eksfoliativ cytologi. København: Bioanalytikeruddannelsen København, (s ). [3] Jain D., Mathur S.R., Iyer V.K., Cell Blocks in cytopathology: a review of preparative methods, utility in diagnosis and role in ancillary studies June 2; [4] Sundhedsstyrelsen [hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.18/12/2016]. Tilgængelig på [5] Procedurevejledning fra Rigshospitalets patologiafdeling, cytologisk laboratorie og udtalelse fra Fagansvarlig bioanalytiker for cytologisk laboratorie, Unni Hansen. [6] Holm L.I., Histokemi, Vævspræparering og vævsfarvning. Metropol: (Side. 5) [7] Vyberg M. Anvendt Immunhistokemi. 7.udg. Academic books: Forfatteren, Bioanalytikeruddannelsen og Odontologisk Boghandel & forlag, [8] Rigshospitalet patologi afdeling. Procedurevejledninger for fiksering, vævspræparering, indstøbning, skæring, farvning. [9] Hologic. Cellient Operator s Manual. U.S [10] Udtalelse fra Lotte Nedergaard Larsen, overlæge med speciale i gynækologi.

79 79 [11] skema fra rigshospitalet patologiafdelingen, immunlaboratoriet og udtalelse fra Bioanalytiker og immunspecialist, Pernille Frederiksen. [12] Protokoller til imunnhistokemiske analyser og udtalelse fra specialist i cytologi, Anette W. Hamminga. Holland. Hologic Netherlands B.V. [13] Rigshospitalets patologiafdelingen, immunlaboratoriet. Procedurevejledninger og protokoller for immunhistokemiske metoder og farvninger. [14] Lauritsen O.S. Statistik for Bioanalytikere. København: Academic books, (s ). [15] ReaseachGate [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d. 22/11/2016]. Tilgængelig på [16] Foto af adenokarcinom, fra righospitalets patologiafdeling, cytologisklaboratorie. [17] Ejersbo D., Sandahl P., Schou M., Kompendium i klinisk cytologi cervixcytologi. 3 udg. Marts (s ). [18] Bibbo M., Wilbur DC. Comprehensive cytopathology. 3 udg. Saunders elevier, (s ). [19] Holm L.I., Histokemi, Vævspræparering og vævsfarvning. Metropol: (s.18). [20] Cytyc corporation. Thinprep 2000 System Operator s Manual. U.S. (kap.2). [21] Cytyc corporation. Thinprep 2000 System Operator s Manual. U.S. (kap. 7). [22] Van Hemel B.M. Innovative issues in clinical cytopathology (kap. 4).

80 80 [23] Holm I.L. Histokemi, Væspreparering og vævsfarvning. Metropol: 2013 (s.66-72). [24] Sundhed.dk (lægehåndbogen). [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d. 22/11/2016]. Tilgængelig på [25] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [26] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [27] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [28] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [29] Roche/Ventana [Hjemmeside på internettet]. Roche [lokaliseret d.21/11/2016]. Tilgængelig på [30] Pathology outlines [hjemmeside på internettet]. USA [lokaliseret d. 21/11/2016]. Tilgængelig på [31] Abcam [hjemmeside på internettet]. Alan Hirzel CEO [lokaliseret d.21/11/2016]. Tilgængelig på [32] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [33] Roche/Ventana [Hjemmeside på internettet]. Roche [lokaliseret d.21/11/2016]. Tilgængelig på

81 81 [34] Abcam [hjemmeside på internettet]. Alan Hirzel CEO [lokaliseret d.21/11/2016]. Tilgængelig på [35] Roche/Ventana [Hjemmeside på internettet]. Roche [lokaliseret d.21/11/2016]. Tilgængelig på [36] Abcam [hjemmeside på internettet]. Alan Hirzel CEO [lokaliseret d.21/11/2016]. Tilgængelig på [37] Roche/Ventana [Hjemmeside på internettet]. Roche [lokaliseret d.21/11/2016]. Tilgængelig på [38] Roche/Ventana [Hjemmeside på internettet]. Roche [lokaliseret d.21/11/2016]. Tilgængelig på [39] Roche Children s Walk [Hjemmeside på internettet]. [Lokaliseret d.23/6/2016]. Tilgængelig på [40] Roche Children s Walk [Hjemmeside på internettet]. [Lokaliseret d.23/6/2016]. Tilgængelig på [41] Wikipedia the free encyclopedia [Hjemmeside på internettet]. [Lokaliseret d.23/6/2016]. Tilgængelig på [43] Roche Children s Walk [Hjemmeside på internettet]. [Lokaliseret d.23/6/2016]. Tilgængelig på [42] Roche Children s Walk [Hjemmeside på internettet]. [Lokaliseret d.23/6/2016]. Tilgængelig på entid=faa50ba1-33f5-e311-98a a9b0ba8.

82 82 eservices.roche.com/eld/(s(hsvsujz4zkus55oqcmxwwhcu))/es/da/documents/getdocument?docu mentid=b0b45ad9-32f5-e311-98a a9b0ba8 [44] Cytyc corporation. Thinprep 2000 System Operator s Manual. U.S. [45] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [46] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [47] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [48] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [49] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [50] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [51] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [52] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [53] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på

83 83 [54] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [55] NordicQC. [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d.21/11/2016] Tilgængelig på [56] Matematikfessor [Hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d. 17/12/2016]. Tilgængelig på [57] Statistisk noter [Hjemmeside på internettet]. [Lokaliseret d. 17/12/2016]. Tilgængelig på [58] Wagner DG., Russel DK., Bengson JM., Schneider AE., Hoda RS., Bongfiglio TA. Cellient tm Automated Cell Blok versus Traditional Cell Blok Preparation: A Comparison of Morphologic Features and Immunohisochemical Staining okt; 39(10): [59] Prendeville S., Brosnan T., Browne J., McCarthy J. Automated Cellient tm cytoblocks: better, stronger, faster? 2014 March 17; 1-9. [60] UK NEQAS [hjemmeside på internettet]. UK: National External Quality Assesment Service [lokaliseret d. 23/12/2016]. Tilgængelig på [61] Holm I.L. Histokemi, Væspreparering og vævsfarvning. Metropol: (s.9). [62] Holm I.L. Histokemi, Væspreparering og vævsfarvning. Metropol: (s ). [63] Kruger AM, Stevens MW, Kerley KJ, Carter CD. Comparison of the Cellient tm automated cell block system and agar cell blok method nov; [64] Ampliqon, Laboratory Regents [hjemmeside på internettet]. EU forordningen [lokaliseret d. 22/12/2016]. Tilgængelig på

84 84 5_v1-0_DK.pdf [65] Miljøstyrelsen Xylener [hjemmeside på internettet]. Miljøstyrelsen [lokaliseret d. 22/12/2016]. Tilgængelig på [66] Biotech acedemy [hjemmeside på internettet]. København. [lokaliseret d. 25/12/2016]. [67] Montgomery E, Gao C, De Luca J, Bower J, Attwood K, Ylagan L. Validation of 31 of the Most Commonly Used Immunohistochemical Antibodies in Cytology Prepared Using the Cellient Automated Cell Block System marts; 42(12): [68] DAKO, agilent [hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d. 26/12/2016]. Tilgængelig på [69] Lecia biosystems [hjemmeside på internettet]. [lokaliseret d. 26/12/2016]. Tilgængelig på [70] Ejersbo D., Sandahl P., Schou M., Kompendium i klinsik cytologi: Den cytologiske undersøgelse. Dansk cytologiforening, (s. 13). [71] Ventana/Roche [hjemmeside på interettet] Roche. [lokaliseret d. 26/12/16]. Tilgængelig på [72] Formaldehyd i spånplader og lignende [hjemmeside på internettet] Miljø- og fødevareministeriet. [lokaliseret d. 27/12/2016]. Tilgængelig på

85 Bilag Bilag 1. Projektbeskrivelse: Kunstige koagler kan bl.a. fremstilles af serøse væsker og abdominale skyllevæsker, og de er mere anvendelige til diagnostik end udstrygninger fremstillet af væsker alene, da man har større mulighed for at identificere de enkelte celler i væsken med f.eks. immunfarvninger. I dag fremstilles kunstige koagler rutinemæssigt ved at tilføje humant plasma og trombin til prøvematerialet, hvorefter en koagulationsreaktion vil finde sted, og et koagel vil dermed dannes. Processen fra at fremstille et kunstigt koagel til at få et færdigt præparat, der kan afleveres til lægen, forløber på ca. 24 timer. Dog kan processen udvides til mere end et døgn, hvis der udover HEfarvningen også bliver bestilt immunfarvninger. Hologic har udviklet et automatiseret cellebloksystem ved navn Cellient TM (Cellient) som ifølge producenten kan have en celleblok (koagel) klar på 45 minutter. Derudover har studier vist, at præparater lavet på Cellient vil have samme morfologi som de plasma-trombin koagler, der laves på patologiafdelingen i dag. Ved at anvende Cellient vil man bruge væsentlig mindre tid på at fremstille celleblokken (koaglet), og dermed nedsætte svartiden for prøven. Hologic står også for udviklingen af Thinprep 2000, der anvendes til væskebaseret udstrygningsteknik (VBT). Undersøgelser har vist, at VBT under mikroskopering giver en renere baggrund og højere nuklear detaljer, da indholdet af slim og blod vil blive minimeret, og cellerne bliver velbevaret. Dette kan resultere i en nemmere og hurtigere mikroskopering, og diagnostik kan hurtigt finde sted. I dag præpareres væskerne rutinemæssigt ved at anvende udstrygningsteknik vha. Shandon Cytospin, hvilket der kan være ulemper ved under mikroskoperingen (f.eks. forstyrrende elementer i baggrunden såsom blod og slim). Formålet med projektet er at sammenligne udstrygninger lavet ved den væskebaserede teknik, Thinprep 2000, med udstrygninger lavet med udstrygningsteknik Shandon Cytospin, samt celleblokke lavet på Cellient med koagler lavet på plasma-trombin metoden. Projektet afprøves med

86 86 henblik på at øge præparaternes kvalitet og dermed mindske tidsforbruget for præparering og diagnostik, således at svartiden forkortes. Til fordel for patologiafdelingen vil man via dette projekt og ud fra den bedste diagnostiske kvalitet finde en pakkeløsning for præparering, hvor begge apparaturer er fra samme firma. Hvis dette ikke kan lade sig gøre, kan løsningen være en kombination af en automatiseret og en manuel metode som allerede findes på patologiafdelingen. Projektet skal køre i 6 uger: Uge Til afdeling 4014 Procedurevejledning til ascitesvæsker, cystevæsker og skyllevæsker Når der er mulighed for at sende mere prøvemateriale end de vanlige 10 ml i et spidsglas, gøres følgende: 1. Prøvematerialet fordeles i 2 spidsglas á 10 ml, der begge markeres med navn og cpr-nr. 2. Prøven registreres KUN som én prøve med ét stregkodenummer 3. Begge spidsglas sendes samtidigt til Rigshospitalets patologiafdeling som vanligt 4. Patologiafdelingen fordeler selv materialet til projektet Der kræves ingen særlig tilladelse fra patienterne for medvirken i dette bachelorprojekt, idet projektet til projektet følger afdelingens rutinemæssige prøvemateriale dette gælder for præpareringen af prøvematerialet samt for svarafgivelsen, der forløber gennem lægerne på afdelingen. Dvs. at begge spidsglas indholdende materiale fra en patient vil indgå i den endelige diagnostik. Bilag 2. HJÆLP TIL BACHELORSTUDERENDE J

87 87 Procedurevejledning til ascitesvæsker, cystevæsker og skyllevæsker fra GYNafdeling Fra uge vil GYN-afdeling når det er muligt sende 2 spidsglas indeholdende samme patientprøve, begge markeret med navn og cpr-nr. 1. Begge spidsglas registreres i Patologisystemet som én prøve, og markeres med samme patologinummer. 2. Det ene spidsglas sættes i beholderen i køleskabet markeret Studerende. Det andet spidsglas præpareres som vanligt. 1. Præpareres som vanligt 2. Sættes i beholder markeret studerende Ved modtagelse af serøse væsker (som regel pleuravæsker) fra Hillerød indeholdende over 10 ml prøvemateriale gøres følgende: 1. Patientprøven registreres i Patologisystemet som vanligt, og der udskrives 2 etiketter med patologinummeret tilhørende prøven. 2. Der ophældes prøvemateriale i et spidsglas á 10 ml. 3. Spidsglasset markeres med den ene af de udskrevne etiketter. 4. Spidsglasset sættes i beholderen i køleskabet markeret studerende. Restmaterialet præpareres som sædvaneligt. OBS: De studerende sørger selv for at afhente det afsatte prøvemateriale.

88 88 Bilag 3.0 Prøve nummer: Væske type Benignt/Malignt Mand/kvinde 1 Cystevæske Ingen oplagt Kvinde malignitet 2 Ascites Ingen Kvinde væske tumorceller 3 Acites væske Maligne Kvinde tumorceller 4 Skyllevæske Maligne tumor Kvinde celler 5 Acites væske Maligne tumor Kvinde celler 6 Peritonal Maligne Kvinde Skyllevæske tumorceller 7 Peritoneum Ingen Kvinde skyllevæske tumorceller 8 Pleuravæske Ingen Kvinde tumorceller 9 Acites væske Ingen Kvinde tumorceller 10 Pleuravæske Ingen Mand tumorceller 11 Acites væske Ingen Kvinde tumorceller 12 Skyllevæske Ingen Kvidne tumorceller 13 Acitesvæske Maligne Kvinde tumorceller 14 Pleuravæske Ingen Kvinde tumorceller 15 Skyllevæske Ingen Kvinde tumorceller 16 Acitesvæske Maligne Kvinde tumorceller 17 Cystevæske Ingen Kvinde tumorceller 18 Acitesvæske Maligne tumorceller Kvinde

89 89 19 Acitesvæske Maligne tumorceller 20 Ascitesvæske Maligne tumorceller 21 Acitesvæske Ingen tumorceller 22 Pleuravæske Ingen tumorceller 23 Pleuravæske Ingen tumorceller 24 Ascitesvæske Ingen tumorceller 25 Pleuravæske Ingen tumorceller 26 Pleuravæske Ingen tumorceller 27 Pleuravæske Ingen tumorceller 28 Skyllevæske Ingen peritoneum tumorceller 29 Ascitesvæske Maligne tumorceller 30 Ascitesvæske Ingen tumorceller Kvinde Kvinde Kvinde Mand Kvinde Kvinde Mand Mand Kvinde Kvinde Kvinde Kvinde

90 90 Bilag 4. Cellient Beskrivelse Prøve antal Pris PTM Beskrivelse Prøve antal Pris PreservCyt (20 ml) 1 5,6 kr Koagelposer 1 2,92 kr Cytolyt 1 7,50 kr Trombin 1 18,72 kr opløsning Casettekit 1 55,1 kr Plasma 1 0 kr Samlet pris 68,2 kr Samlet pris 21,64 kr

91 91 Bilag 5

92 92 Bilag 6.

93 93

94 94 Bilag 7.

95 95 Bilag 8. Bilag 9.

96 96