Optimering af specialfarvningen Masson Trichrom

Transkript

1 Optimering af specialfarvningen Masson Trichrom Lonnie Frederiksen, VIA University College, Campus Aarhus N, Bioanalytikeruddannelsen I-vejleder: Inge Rasmussen, Lektor v Bioanalytikerunderviser i Aarhus, ir@via.dk K-vejleder: Birthe Søltoft Lundsgaard, Bioanalytikerunderviser på Patologisk Institut, Regionshospitalet Viborg, xtbilu@via.dk Antal tegn: Dato for bachelorprojektets aflevering: 17/

2 Forord Optimering af specialfarvningen Masson Trichrom er udarbejdet som en del af min afsluttende eksamen på bioanalytikeruddannelsen, VIA University College, Århus. Selve laboratoriearbejdet blev udført på Patologisk Institut, Regionshospitalet Viborg i et samarbejde med 3 andre bioanalytikerstuderende. Jeg vil først og fremmest takke Patologisk Institut Viborg for at muliggøre projektet ved at låne os deres lokaler og laboratorie, men også i høj grad fordi de delt deres professionelle viden med os og været tålmodige igennem hele processen. Derudover vil jeg gerne takke min I-vejleder Inge Rasmussen, lektor ved Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus og K-vejleder Birthe Søltoft Lundsgaard, bioanalytikerunderviser på Patologisk Institut, Regionshospitalet Viborg, for fantastisk råd og vejledning igennem processen. Min familie skal have stor tak for at være en god støtte igennem projektet. Til slut vil jeg takke min bachelorgruppe for et godt samarbejde, hvor der har været mange gode diskussioner og en masse støtte. Lonnie Frederiksen Bioanalytikerstuderende

3 Resumé Problembaggrund På størstedelen af landets patologiske institutter farves Masson Trichrom på forskellig vis. Et af problempunkterne i farvningen er efterfikseringstrinnet i Bouin s fiksativ, der indeholder bl.a. pikrinsyre, som er på E.U.s forordningsliste. Fiksativet anvendes på langt de fleste patologiske institutter, hvor der efterfikseres enten opvarmet i kort tid eller ved stuetemperatur i lang tid. Disse kombinationer har enten indvirkning på arbejdsmiljø eller svartid. Projektet omhandler derfor en optimering af Masson Trichrom, hvor efterfiksering i Bouin s fiksativ ikke er nødvendig. Metode Der blev sammensat en farveforskrift som projektet tog udgangspunkt i. Variationer i form af efterfikseringstid og temperatur blev undersøgt i forbindelse med Bouin s fiksativ. Derudover blev andre farvetrin på farveforskriften også optimeret. Farvetrinnet til farvning af globulære proteiner med Biebrich Scarlet-syrefuchsin blev undersøgt i form af farvetid og mulig erstatning af andet farvestof. Farvetrinnet, hvor de kollagene fibre blev farvet, blev det undersøgt om hhv methylblå eller anilinblå var bedst at anvende. Klaringstrinnet i 1 % eddikesyre, blev også optimeret i form af tidsvariationer. Anvendt prøvemateriale var i forsøg 1-6 tyndtarmsvæv og i forsøg 7-6 tyndtarm, hud- og blærevæv. Farveresultaterne blev vurderet ud fra et scoreskema, designet af projektgruppen. Resultater I forsøg 1 blev det vurderet at methylblå var det bedst egnede farvestof til farvning af kollagene fibre. I forsøg 2 blev det vurderet at en farvetid på 10 min. i Biebrich Scarletsyrefuchsin var mest optimal. Ud fra forsøg 3 blev det vurderet, at efterfiksering i Bouin s fiksativ i 5 min. ved 60 C var tilstrækkelig, hvorimod efterfiksering i Bouin s fiksativ på 2 timer og derunder ikke var brugbart. Ud fra forsøg 4 blev det udledt at Biebrich Scarletsyrefuchsin var egnet som farvestof i foreskriften. I forsøg 6 blev det vurderet, at det var nødvendigt at bevare klaringstiden på 5 min. Ud fra forsøg 7-8 blev det vurderet at yderligere optimering af farveforskriften er nødvendig, hvis Masson Trichrom kan anvendes uden Bouin s fiksativ. Konklusion Ud fra de samlede resultater er det en nødvendighed at anvende Bouin s fiksativ. Der bør foretageres yderligere forsøg, for at opnå en optimeret Masson Trichrom farveforskrift uden brug af Bouin s fiksativ.

4 Indholdsfortegnelse Introduktion... 1 Baggrund:... 1 Formål:... 2 Problemformulering:... 3 Målformulering:... 3 Teori... 4 Trichromfarvning Masson Trichrom... 4 Farveresultat ved farvning med Masson Trichrom... 4 Farvemekanisme for Masson Trichrom... 5 Bouin s Fiksativ... 5 Kernefarvning... 6 Farvning af globulære proteiner... 6 Phosphormolybdænsyre og phosphorwolframsyre... 7 Farvning af kollagene fibre... 8 Eddikesyre... 8 Materialer og metoder... 9 Materialeliste... 9 Apparatur, utensilier og reagenser... 9 Prøvemateriale... 9 Metoder... 9 Indsamling af prøvemateriale... 9 Indsamling af farveforskrifter... 9 Fremstilling af farveopløsninger og reagenser Opbygning af foreløbig farveforskrift Forsøg Forsøg Forsøg Forsøg Forsøg Forsøg Forsøg Forsøg Resultatvurdering... 17

5 Litteratursøgning Resultater Forsøg Forsøg Forsøg Forsøg Forsøg Forsøg Forsøg Forsøg Diskussion Diskussion af materialer og metoder Forsøg Forsøg Forsøg Delkonklusion af forsøg Forsøg Forsøg Forsøg Delkonklusion af forsøg Forsøg Forsøg Delkonklusion af forsøg Arbejdsmiljø i forhold til Masson Trichrom Svartid versus arbejdsmiljø Immunhistokemi versus histokemi Konklusion Perspektivering Referenceliste Bilag Bilag 1 Mail til bioanalytikerundervisere Bilag 2 Reagenser, apparatur og Utensilier Bilag 3 Opskrifter på reagens- og farveopløsninger Bilag 4 Sammenligning af farveforskrifter... 50

6 Bilag 5 Afparaffinering og hydrering Bilag 6 Hurtig dehydrering Bilag 7 Søgehistorik Bilag 8 USB med billeder af alle vævssnit... 61

7 Professionsbachelorprojekt Lonnie Frederiksen Afleveret d. 17/ Introduktion Baggrund: I løbet af uddannelsen har projektgruppens medlemmer haft praktikforløb på forskellige patologiske institutter. Disse praktikforløb foregik på Patologisk Institut (PAI) på hhv. Aalborg Universitetshospital, Sygehus Vendsyssel, Regionshospitalet Viborg og Aarhus Universitetshospital, Nørrebrogade. Ud fra gruppens praktikerfaringer på ovennævnte institutter blev der observeret, at der anvendes forskellige farveforskrifter for Masson Trichrom, hvor der ses store forskelle i valg af reagenser og inkubationstider. Masson Trichrom er en bindevævsfarvning, der kan anvendes til, at differentiere mellem de kollagene fibre i bindevævet og de øvrige vævskomponenter. Masson Trichrom farvningen blev opfundet af doktor Claude L. Pierre Masson omkring år Oprindeligt skulle vævet fikseres i et fiksativ kaldet Bouin s opløsning, men i dag bliver vævet fikseret i 10 % neutral buffet formalin (NBF), og Bouin s fiksativ anvendes som efterfiksering i selve farveproceduren (1 3). Bouin s fiksativ indeholder eddikesyre, pikrinsyre og formaldehyd, og er grundet de to sidstnævnte stoffer meget sundhedsskadeligt, og dampene fra Bouin s fiksativ er farlige at inhalere, både ved stuetemperatur og opvarmet, og kan desuden irritere slimhinder, hud og øjne (1,4). Derudover er pikrinsyre eksplosivt og på EU s forordningsliste, hvilket betyder at der skal indhentes særlig tilladelse for at købe produktet (5). For at undersøge hvorvidt variationerne i Masson Trichrom farvningen er gældende for alle landets institutter, blev der sendt en forespørgsel ud, omhandlende institutternes farveforskrifter for Masson Trichrom, med det formål at forsøge, at optimere specialfarvningen med henblik på, at nedsætte svartiden og forbedre arbejdsmiljøet for bioanalytikerne (Se bilag 1). Den mest udprægede variation i institutternes forskrifter, er anvendelsen af Bouin s fiksativ. På PAI Viborg anvendes Bouin s fiksativ ikke, mens andre institutter opvarmer det til 60 C eller anvender det ved stuetemperatur. Inkubationstiden varierer også institutterne imellem, fra 5 minutter til 18 timer. De to institutter i Region Nordjylland behandler vævssnittene i Bouin s fiksativ i hhv. 18 timer og natten over, hvilket bevirker, at svartiden på vævsprøver, der skal farves efter Masson Trichrom metoden, bliver forlænget med en dag set i forhold til de resterende 9 institutter. De to institutter i Region 1

8 Nordjylland har til gengæld et bedre arbejdsmiljø end de andre institutter, idet de ikke opvarmer Bouin s fiksativ, og derfor undgår dampene, der opstår under opvarmningen. De patologiske institutter anvender desuden forskellige kombinationer af farvestofferne til farvning af de globulære proteiner. De fleste institutter anvender en kombination af de to anionfarvestoffer Biebrich Scarlet og Syrefuchsin. Nogle institutter anvender andre anionfarvestoffer i kombination med Syrefuchsin. Disse farvestoffer er Ponceau 2R/Poncheau Xylidin og Chromotrop 2R. Enkelte institutter anvender kun et anionfarvestof, som er enten Ponceau Red eller Ponceau BS. Et institut anvender en kombination af Poncheau S og Fuchsin. Til farvning af de kollagene fibre anvendes enten anilinblå eller methylblå. I dette projekt vil de ovennævnte variationer undersøges ved en række forsøg, således at farveforskriften eventuelt kan optimeres. Ved en Masson Trichrom farvning er det vigtigt, for en optimal farvning, at der kan differentieres mellem de blå kollagene fibre og de røde globulære proteiner. Derfor er det også denne differentiering, der bliver lagt stor vægt på i dette projekt. Det er endvidere forskelligt fra institut til institut, hvor ofte der udføres en Masson Trichrom farvning. På PAI Vendsyssel er det en af de mest anvendte specialfarvninger, og der blev på et år (oktober 2013 til oktober 2014) farvet snit efter denne metode. Til sammenligning blev der i samme periode farvet ca snit efter HE-metoden. PAI på Aarhus Universitetshospital foretog i alt farvninger fordelt på PAI Nørrebrogade og PAI Tage Hansens Gade, og PAI Viborg brugte farvemetoden 186 gange i samme periode (6 8). Formål: Formålet med projektet er, at optimere specialfarvningen Masson Trichrom. Herunder undersøges hvilken indflydelse brugen af Bouin s fiksativ har på farveresultatet, samt betydningen af valg af farvestof til farvning af kollagene fibre og globulære proteiner. Endvidere undersøges nødvendigheden af Bouin s fiksativ med henblik på, at forbedre arbejdsmiljøet for bioanalytikeren samt minimere svartiden for patienten. Der udarbejdes en forskrift ud fra de undersøgte variationer, hvorefter forskriftens reproducerbarhed undersøges. 2

9 Problemformulering: Hvilken konsekvens har valg af efterfikseringstid og temperatur i Bouin s fiksativ samt valg af farvestoffer for farveresultatet ved specialfarvningen Masson Trichrom, og hvordan kan en optimering af denne føre til en tilfredsstillende reproducerbarhed? Målformulering: For at undersøge og vurdere ovenstående problematik, bliver der udført en række forsøg med variationer af de forskellige trin i den foreløbige Masson Trichrom farveforskrift, der er sammensat ud fra de indsamlede farveforskrifter. I forsøg 1-6 benyttes tyndtarm som prøvemateriale. I forsøg 7 og 8 benyttes tyndtarm, hud og blære som prøvemateriale. I forsøg 1 undersøges to forskellige farvetrin i farveforskriften. Der undersøges hvorledes efterfikseringstiden for Bouin s fiksativ samt temperaturen af denne efterfiksering påvirker farveresultatet. Endvidere undersøges der, om Bouin s fiksativ kan undlades, samt om der er en forskel mellem methylblå og anilinblå til farvning af kollagene fibre undersøges. De forskellige variationer af Bouin s fiksativ er: ingen Bouin, i Bouin ved stuetemperatur i hhv. 5 minutter og 18 timer samt i Bouin ved 60 C i hhv. 5 minutter og 1 time I forsøg 2 undersøges den optimale inkubationstid ved hhv. 5, 10 og 15 minutter for Biebrich Scarlet - syrefuchsin til farvning af de globulære proteiner ved de, i forsøg 1, valgte variationer af Bouin s fiksativ. I forsøg 3 undersøges den optimale efterfikseringstid i Bouin s fiksativ ved 60 C i et 10 minutters interval fra 15 til 55 minutter, samt den optimale efterfikseringstid i Bouin s fiksativ ved stuetemperatur i hhv. 1 time, 1½ time og 2 timer. I forsøg 4 behandles snittet ikke med Bouin s fiksativ, og Biebrich Scarlet - syrefuchsin erstattes med Poncheau S - fuchsin som farvestof til farvning af de globulære proteiner I forsøg 5 farves et snit efter PAI Viborgs farveforskrift. Denne afdeling anvender ikke Bouin s fiksativ, men anvender Poncheau S - fuchsin til farvning af de globulære proteiner. Endvidere anvender denne afdeling nogle andre farvetider i Weigert-Lillies Jernhæmatein og eddikesyre samt anvender kun fosformolybdænsyre og ikke fosforwolframsyre. 3

10 I forsøg 6 behandles snittene ikke med Bouin s fiksativ, og klaringstid i eddikesyre undersøges i hhv. 1, 2, 3, 4 og 5 minutter. Ud fra forsøg 1-6 udarbejdes en optimeret farveforskrift. Dennes reproducerbarhed undersøges i forsøg 7 og 8. Teori Trichromfarvning Masson Trichrom De fleste bindevævsfarvninger er Trichrom farvninger, hvor der anvendes to eller flere anionfarvestoffer i sur opløsning(9). Disse anionfarvestoffer binder på forskellig vis, samt har forskellig molekylestørrelse. På denne måde vil små farvemolekyler binde sig til proteinerne i vævskomponenterne, men bliver erstattet med et større farvemolekyle, hvis dette bindes til vævskomponentet (4,10). Specialfarvningen Masson Trichrom anvendes til at identificere og påvise bindevæv og muskler i vævsprøver ved hjælp af lysmikroskopi. Farvningen anvendes bl.a. til diagnosticering ved bindevævssygdomme, dermatologiske sygdomme og histologiske ændringer i tumorer. Der anvendes tre anionfarvestoffer, som skelner mellem kollagen og cytoplasma i vævet (4,11). Disse tre anionfarvestoffer er Biebrich Scarlet-syrefuchsin, som anvendes til farvning af globulære proteiner samt anilinblå eller methylblå til farvning af kollagene fibre. Farveresultat ved farvning med Masson Trichrom I tabel 1 er vist en oversigt over de vigtige komponenter der farves i en Masson Trichrom farvning, samt hvilken farve de forskellige komponenter får med denne specialfarvning. I figur 1 ses et farveeksempel, hvor det illustreres, hvor de forskellige vævskomponenter er i tyndtarmsvæv (12)(11). Vævskomponent Cellekerner Blå/violet Cytoplasma i alle celler, muskelfibre, erytrocytter, histoner, granula i Rød paneth-celler Kollagene fibre Blå Tabel 1 Oversigt over de væsentlige vævskomponenter, samt hvilken farve disse får ved en Masson Trichrom farvning. 4

11 Figur 1 Oversigtsbillede af, hvor vævskomponenterne fra tabel 1, findes i tyndtarmsvæv. Eget foto fra forsøg 3. Redigeret. 40X forstørrelse. Farvemekanisme for Masson Trichrom I de følgende afsnit beskrives de enkelte farveopløsninger og reagenser, der anvendes i Masson Trichrom, til at opnå farveresultatet vist i figur 1. Bouin s Fiksativ Bouin s fiksativ blev opfundet af Pol André Bouin i 1897, og består af koncentreret formaldehyd 37 %, koncentreret eddikesyre, en mættet vandig opløsning af pikrinsyre samt vand som solvent (4,12). Bouin s fiksativ benyttes i Masson Trichrom som et efterfikseringsmiddel, idet fiksativet intensiverer farverne i vævskomponenterne, hvorved disse lettere differentieres (4,10). Denne efterfiksering er nødvendig, da vævet fikseres i 10% NBF, som er et gelerende fiksativ, indeholdende 4 % formaldehyd. Under denne fiksering binder aldehydgrupper sig til to aminogrupper, hvorved der dannes methylenbroer i samme protein og imellem andre proteiner, som medfører at de upolære grupper maskeres. Disse upolære grupper skal blotlægges for at opnå en optimal Masson Trichrom farvning. På figur 2 ses det hvordan globulære proteiner reagerer ved fiksering i formalin, og hvordan de upolære grupper blotlægges ved efterfiksering i Bouin s fiksativ (10,13). Pikrinsyre er et stærkt koagulerende fiksativ, som koagulerer proteinerne og medfører forringet morfologi, idet pikrinsyren skrumper vævet. Pikrinsyren danner svage bindinger 5

12 til de upolære aminogrupper der findes i proteinets indre, hvorved den tertiære struktur åbnes. Ved at tilsætte formaldehyd, opstår en konkurrence om binding til aminogrupperne. På den måde bliver pikrinsyrens effekt begrænset, da en del af aminogrupperne bindes til formaldehyd. Eddikesyren er tilsat for at modvirke den skrumpning af vævet, der forekommer ved brug af pikrinsyre, hvorved morfologien bevares (4,13). Kernefarvning I Masson Trichrom anvendes Weigert- Lillies Jernhæmatein til farvning af cellekerner. Det består af ligandfarvestoffet Hæmatein og jern-ioner, som anvendes da de er mere standhaftige overfor syreholdige væsker, end f.eks. aluminium-ioner. Jern-hæmatein binder sig til de negativt ladede phosphatgrupper i kernes DNA eller RNA ved hydrofob stabilisering eller kompleksbindinger. Når snittet er farvet, udsættes det for en blåning i vand, hvor hæmateinens OH-grupper ioniseres. Dette fremkalder et farveskift fra brun til blå (4,9,14). Farvning af globulære proteiner Globulære proteiner er vandopløselige proteiner, der findes i cellers cytoplasma og kerner. De globulære proteiner har en tertiær struktur, hvor polypeptidkæden er foldet om sig selv. Der findes ioniserede sidegrupper på overfladen, mens de upolære grupper primært findes i proteinets indre (13,15). Da globulære proteiner findes i alle tre typer væv, der er arbejdet med i projektet, gives der nedenfor en uddybning af, i hvilke vævskomponenter de globulære proteiner findes. Globulære proteiner findes i cytoplasma i epitel og celler. I tyndtarms cytoskelet findes mikrotubuli og aktinfilamenter, hvor mikrotubuli er opbygget af det globulære protein tubulin, mens aktinfilamenterne er opbygget af det globulære protein, aktin. I både tyndtarm og blære findes der i muskelcellernes cytoplasma både aktin- og myosin filamenter. Figur 2 figur lånt fra (13). Redigeret. 3 globulære proteiner fikseres i 10% NBF og dannet Methylenbroer og upolære grupper maskeres. Dernæst efterfikseres proteinerne i Bouin s fiksativ, hvor de upolære grupper blotlægges. 6

13 I cellekernernes kromatin findes histonproteiner, som er bundet til DNA. Disse celler omfatter bl.a. enterocytter, Paneth-celler indeholdende granula, der også indeholder globulære proteiner, glatte muskelceller samt fikse celler og vandreceller som findes i bindevævet. I erytrocytternes findes det globulære protein globin. I hud findes de globulære proteiner i keratinholdige keratinocytter (16). Der henvises til figur 1, hvor de forskellige vævskomponenter er illustreret. Til farvning af globulære proteiner i projektets Masson Trichrom farvning, anvendes to forskellige anionfarvestoffer. Der benyttes primært Biebrich Scarlet-syrefuchsin, men Poncheau S-fuchsin afprøves også i projektet. Forud for farvningen af de globulære proteiner, er de upolære grupper blevet blotlagt, hvorved bindinger mellem aminosyre-sidekæderne og farvestofferne, foregår vha. hydrofob stabilisering. Hydrofob stabilisering er en farvebindingsmekanisme, hvor solventet vand har en aktiv rolle i farvebindings-processen. Ved en hydrofob stabilisering, er der flere forskellige bindingstyper underforstået. Der foregår en iontiltrækning, idet farvestoffet og de globulære proteiner er modsat ladede. Når farvestoffet og de globulære proteiner undergår iontiltrækning, opstår der londonkræfter, eftersom der findes hydrofobe grupper i både farvestoffet og i det glubulære protein. De vandmolekyler der er i kontakt med de hydrofobe områder kan rive sig løs og danne hydrogenbindinger med andre vandmolekyler. Dette udløser endnu flere londonkræfter samt hydrogenbindinger. Til sidst er det kun de hydrofobe områder i molekylerne, der kan komme så tæt på hinanden at de kan danne londonkræfter. Derved har farvemolekylerne mulighed for at trænge ind, hvor vand ikke længere kan være pga. hydrogenbindingerne (9,14). Biebrich Scarlet-syrefuchsin er to aniofarvestoffer, der er blandet sammen under fremstillingen. Disse to anionfarvestoffer konkurrerer om bindingsmulighederne til aminogrupperne i de globulære proteiner. De binder ved hjælp af hydrofob stabilisering, som er beskrevet overfor. Biebrich Scarlet-syrefuchsin binder desuden til kollagene fibre vha ionbindinger og londonkræfter, som er svage bindingstyper. Phosphormolybdænsyre og phosphorwolframsyre I projektets Masson Trichrom farvning anvendes en opløsning bestående af Phosphormolybdænsyre (PMA) og phosphorwolframsyre (PWA). PMA og PWA er begge anioner som anvendes til at differentiere farvningen og undgå farveoverlap. Ved ladningsafmætning og iontiltrækning udkonkurrerer PMA/PWA det røde anionfarvestof i 7

14 de kollagene fibre, idet de er bundet svagt hertil. PMA/PWA kan ikke udkonkurrere Biebrich Scarlet-syrefuchsin i cytoplasma, da dette er bundet ved hydrofob stabilisering, som er en stærk bindingstype. I stedet binder polyanionerne sig svagt til vævet. Ved efterfølgende farvning af kollagene fibre, undgåes det at methylblå eller anilinblå farver cytoplasmaet (4,10,13). Farvning af kollagene fibre Bindevævet funktion er, at støtte væv og organer. Der findes 3 typer fibre i bindevæv, hvor den ene type som nævnes her, kaldes kollagene fibre. Kollagene fibre er den hyppigst forekommende bindevævsfiber, idet det udgør 1/3 af alt proteinet i menneskekroppen. De kollagene fibre er sammensat af fibriller. Disse fibriller består af mikrofibriller som er opbygget af tropokollagen (17). Kollagene fibre er til stede i alle tre typer væv der arbejdes med i projektet (17). På figur 1 er placeringen af de kollagene fibre illustreret. I projektet anvendes to anionfarvestoffer til farvning af kollagene fibre. Der anvendes enten methylblå eller anilinblå. Sidstenævnte er et blandingsfarvestof bestående af methylblå og water blue (18). Eftersom de polære og upolære sidegrupper i kollagenet ligger meget struktureret i korte sekvenser, er det derfor ikke muligt at binde ved hjælp af hydrofob stabilisering. I stedet binder anionfarvestofferne sig til de kollagene fibre ved hjælp af hydrogenbindinger og upolære bindinger. Eftersom Biebrich Scarlet-syrefuchsin binder vha. hydrofob stabilisering, kan methylblå eller anilinblå ikke udkonkurrere disse, men i stedet kan det udkonkurrere PMA/PWA, som har bundet sig til de kollagene fibre med svage bindinger, hvilket medfører at de kollagene fibre farves blå (13). Eddikesyre Det sidste trin i Masson Trichrom farvningen er klaringstrinnet i eddikesyre 1 %. Dette trin udføres for at forfine farvenuancerne og klare farvningen. Desuden anvendes eddikesyren til at differentiere overskydende farve fra farvningen af de kollagene fibre (19). 8

15 Materialer og metoder Materialeliste Apparatur, utensilier og reagenser Se apparatur-, utensilie- og reagensliste i bilag 2 Prøvemateriale Tyndtarm Hud Blære Metoder Indsamling af prøvemateriale Det andvendte prøvemateriale i forsøg 1-6 er paraffinindstøbt tyndtarm fra blokarkiv udleveret af den kliniske vejleder, Birthe Søltoft Lundsgaard. Dette patientmateriale er fra 2014 og er max fikseret i 4 dage i 10% neutralbuffet formalin. Det er valgt på baggrund af at tyndtarm indeholder både bindevæv og globulære proteiner i flere forskellige vævskomponenter. Prøvematerialet i forsøg 7 og 8 er tre typer væv fra øveblokke, der er udvalgt til studerende. Disse tre typer væv er tyndtarm, hud og blære. Hudmaterialet er 3 uger gammel og er blevet fikseret i op til 3 uger. Blærematerialet er flere år gammelt og har ukendt fikseringstid. Tyndtarmsmaterialet er fikseret i op til 3 uger, men alder af dette er ukendt. Det vides dog at det er nyere end blærematerialet, men ældre end hudmaterialet. Alle tre typer væv er fikseret i 10% neutralbuffet formalin og efterfølgende indstøbt i paraffin. Hud og blære er valgt som reproducerbarhedsmateriale, da det er to organtyper der oftest farves med Masson Trichrom på de fire patologiske institutter, projektgruppen har været i praktik. Indsamling af farveforskrifter På projektgruppens modul 12, blev der sendt mails ud til bioanalytikerunderviserne på alle landets patologiske institutter (se bilag 1). Heraf svarede 11 tilbage, hvilket betyder at der i projektet er anvendt 12 forskellige farveforskrifter inkl. farveforskriften for Masson Trichrom på PAI Viborg. 9

16 Fremstilling af farveopløsninger og reagenser Alle reagenser og farveopløsninger er fremstillet af projektgruppen. Weigert-Lillies Jernhæmatein opløsning B samt 1% eddikesyre, blev dog ikke fremstillet, da disse reagenser var til rådighed på laboratoriet. Til forsøg 5, blev laboratoriets farveopløsninger anvendt, da disse bruges til rutinefarvning af Masson Trichrom. Alle farveopløsninger blev genbrugt i en uge med de undtagelser, at 1% eddikesyre blev udskiftet hver dag eller efter behov, og Weigert-Lilles Jernhæmatein blev anvendt i maximalt 3 dage, da der kan ske en oxidation af jernhæmateinen. Ud fra opskrifterne på farveopløsningerne på de forskellige institutter, kunne det konstateres at der var tydelige variationer i disse, så gruppen besluttede at anvende nogle ældre opskrifter til fremstilling af reagenser og farveopløsninger (10,12). Opskrifter på reagensopløsninger ses i bilag 3. Opbygning af foreløbig farveforskrift Ud fra de indsamlede farveforskrifter for Masson Trichrom, er der udarbejdet en foreløbig farveforskrift (se figur 3), som projektet tager udgangspunkt i. Denne farveforskrift er sammensat ved at sammenligne de forskellige institutters farveforskrifter for Masson Trichrom, og udvælge de punkter hvor institutterne så vidt muligt gør det ens, så den foreløbige farveforskrift i projektet afspejler de mest anvendte farvestoffer, farvetider og skylleprocedurer på institutterne (Se bilag 4). Da det er jævnt fordelt, hvorvidt institutterne bruger anilinblå eller methylblå, blev det bestemt at anilinblå anvendes til den foreløbige farveforskrift, da denne oprindeligt blev brugt til Masson Trichrom (12,20). På figur 3 er de farvede trin i forskriften de, trin som forsøges optimeret i de efterfølgende forsøg. Tyndtarmssnittenes tykkelse er 3µm. Alle snit afparaffineres, hydreres og dehydreres på farvemaskine (se bilag 5 og 6). Til slut monteres Figur 3 Foreløbig farveforskrift udarbejdet ud fra farveforskrifter fra 12 af landets institutter. De farvede trin, er de trin der forsøges optimeret i projektet. 10

17 dækglas med pertex på dækglasmaskine. Den sammensatte farveforskrift forsøges optimeret i forsøg 1-6, som er en løbende proces, hvor resultatet af det ene forsøg udleder fremgangsmåden på det næste forsøg. Forsøg 7 og 8 er reproducerbarhedsforsøg, foretaget på baggrund af de farvetrin, der er ændret under forsøg 1-6. I de følgende afsnit følger en forklaring på de enkelte forsøg med tilhørende flowcharts. Forsøg 1 I forsøg 1 undersøges to farvetrin i den foreløbige farveforskrift. Det ene farvetrin omhandler efterfiksering i Bouin s fiksativ, som varieres på forskellig vis ud fra de variationer, der var at finde i farveforskrifterne fra de 11 forskellige institutter. Det andet farvetrin der undersøges i dette forsøg er bindevævsfarvningen, hvor der anvendes enten methylblå eller anilinblå til farvning af de kollagene fibre. Variationerne for disse to farvetrin ses i figur 4, hvor forsøgsopstillingen er vist. Der blev i alt anvendt 100 tyndtarmssnit som anvendes i dette forsøg. Den foreløbige farveforskrift, der tages udgangspunk i, ses i figur 3. Når alle snittene er farvet, vurderes disse i mikroskop. Figur 4 På figuren ses forsøgsopstillingen for forsøg 1. Der anvendes 20 snit til hver variation med forbehandling med og uden Bouin s fiksativ. Efterfølgende følges den foreløbige farveforskrift hvorefter 10 snit fra hver variation farves med hhv. anilinblå og methylblå. 11

18 Forsøg 2 I forsøg 2 undersøges farvetiden for cytoplasmafarvningen med anionfarvestoffet Biebrich Scarlet syrefuchsin. Der undersøges desuden, ligesom i forsøg 1, forskellige variationer af efterfiksering i Bouin s fiksativ. Disse variationer for hhv farvetid i Biebrich Scarletsyrefuchsin og efterfiksering i Bouin s fiksativ fremgår af figur 5, hvor forsøgsopstillingen er vist. Der anvendes 15 tyndtarmssnit i alt til dette forsøg. Den foreløbige farveforskrift, der tages udgangspunk i, ses i figur 3. Efter farvning, vurderes snittene i mikroskop, for at finde den optimale farvetid for Biebrich Scarlet-syrefuchsin samt efterfiksering i Bouin s fiksativ. Figur 5 På figuren ses forsøgsopstillingen for forsøg 2. Der anvendes 15 tyndtarmssnit, som behandles med forskellige variationer af Bouin s fiksativ. 1 snit fra hver variation af Bouin s fiksativ farves i Biebrich Scarlet-syrefuchsin ved forskellige farvetider. Forsøg 3 I forsøg 3 undersøges den optimale fikseringstid ved brug af Bouin s fiksativ ved hhv opvarmning til 60 C og ved stuetemperatur. Disse variationer ses på figur 6. Der anvendes i alt 8 tyndtarmssnit i dette forsøg, således at der i alt foretages 8 forskellige farvninger 12

19 med hver sin efterfikserings-variation. Den foreløbige farveforskrift, der tages udgangspunkt i, ses i figur 3. Efter farvning, vurderes snittene i mikroskop. Figur 6 På figuren ses forsøgsopstillingen for forsøg 3. Der varieres i efterfikseringen i Bouin s fiksativ. Der farves et snit til hver variation. Efterfølgende følges den foreløbige farveforskrift. Forsøg 4 I forsøg 4 undersøges det hvorvidt Biebrich Scarletsyrefuchsin kan erstattes med Poncheau S fuchsin. Den foreløbige forskrift følges, med den ændring at der andvendes Poncheau S Fuchsin som cytoplasmafarvning i stedet for Biebrich Scarletsyrefuchsin, som ses på figur 7. Der anvendes ét tyndtarmssnit i dette forsøg. Den foreløbige farveforskrift, der tages udgangspunk i, ses i figur 3. Der vurderes i mikroskop, hvorvidt Poncheau S fuchsin er mere anvendeligt som cytoplasmafarvning i den foreløbige farveforskrift. Figur 7 På figuren ses forsøgsopstillingen for forsøg 4. Det undersøges hvorvidt Poncheau S- Fuchsin kan anvendes i projektet som cytoplasmafarvestof 13

20 Forsøg 5 I dette forsøg undersøges hvordan vævskomponenterne i et tyndtarmssnit, der er farvet efter PAI Viborgs farveforskrift, ser ud. PAI Viborgs farveforskrift for Masson Trichrom, som følges i forsøget, ses på figur 8. I denne farveforskrift anvendes der ikke Bouin s fiksativ eller anden efterfiksering. Der farves ét tyndtarmssnit efter denne farveforskrift. Efterfølgende vurderes snittet i mikroskop. Forsøg 6 Forsøg 6 udføres som illustreret på figur 9. Der anvendes i alt 5 tyndtarmssnit i forsøget. Den foreløbige farveforskrift (figur 3) med de ændringer fra tidligere forsøg følges til farvning af de 5 snit, men hvor der varieres i klaringstrinnet med 1% eddikesyre. Snittene Figur 8 PAI Viborgs farveforskrift for Masson trichrom. Der anvendes ikke Bouin s fiksativ i denne farvning. vurderes efterfølgende. Til dette forsøg anvendes der ikke Bouin s fiksativ. Figur 9 På figuren er illustreret, hvordan den foreløbige farveforskrift følges indtil sidste punkt, hvor klaringstiden varieres. 14

21 Forsøg 7 Forsøg 7 er et reproducerbarhedsforsøg, hvor Masson Trichrom udføres uden behandling i Bouin s fiksativ. På figur 10 er illustreret, hvorledes reproducerbarhedsforsøget med tilhørende farveforskrift udføres. Farveforskriften der anvendes til reproducerbarhedsforsøget er udarbejdet ud fra forsøg 1-6. Der udføres reproducerbarhed på 3 forskellige slags væv, tyndtarm, blære og hud. Farvningen udføres af 4 personer, men i samme farvevæske. Hver person farver et sæt bestående af 3 organtyper, hvor der mikrotomeres 3 snit ved hvert væv ved hhv. 3µm, 3,5µm og 4µm. Der foretages yderligere dobbeltbestemmelse, således at hver person farver 18 snit. Figur 10 På figuren er forsøg 7 illustreret. Der anvendes 3 organtyper i dette forsøg, hvor der bliver skåret 6 snit fra hvert organ med forskellig snittykkelse. 4 personer farver hver 18 snit ud fra farveforskriften. 15

22 Forsøg 8 Forsøg 8 er et reproducerbarhedsforsøg, hvor Masson Trichrom udføres med behandling i Bouin s fiksativ opvarmet til 60 C i 5 min. På figur 11 er forsøgsopstillingen for forsøg 8 illustreret. Reproducerbarhedsforsøget er udarbejdet ud fra forsøg 1-6. Dette forsøg minder meget om forsøg 7. Den eneste forskel består i, at der i farveforskriften i dette forsøg, efterfikseres i Bouin s fiksativ. Rammerne om forsøget er dermed de samme som i forsøg 7 med hensyn til prøvemateriale, deltagelse og fremgangsmåde på nær efterfikseringstrinnet som før er nævnt. Figur 11 På figuren er forsøg 8 illustreret. Der anvendes 3 organtyper i dette forsøg, hvor der bliver skåret 6 snit fra hvert organ med forskellig snittykkelse. 4 personer farver hver 18 snit ud fra farveforskriften. 16

23 Resultatvurdering Efter hvert forsøg, vurderes farvningen mikroskopisk ud fra et udarbejdet scoreskema. Dette scoreskema ses i tabel 2. Der ses yderligere eksempler på udseendet af farveresultaterne i figur 12. Score Resultat 0 Ringe farvning, man kan ikke differentiere mellem de forskellige vævskomponenter, og farvningen kan ikke anvendes som led i diagnosticeringen. Kollagene fibre fremstår ikke blå Cellekernerne fremstår svagt violette eller violette Cytoplasma, ERC, keratin og muskulatur fremstår ikke røde eller svagt røde eller blå + Borderline farvning, man kan i ringe grad differentiere mellem de forskellige vævskomponenter, og farvningen kan ikke anvendes som led i diagnosticeringen. Kollagene fibre fremstår blå Cellekernerne fremstår violette Cytoplasma, ERC og keratin fremstår ikke røde eller svagt røde Muskulatur fremstår grålig eller svagt røde ++ Acceptabel farvning, man kan differentiere mellem de forskellige vævskomponenter, og farvningen kan anvendes som led i diagnosticeringen. Kollagene fibre fremstår blå Cellekernerne fremstår violette Cytoplasma, ERC, keratin og muskulatur fremstår røde +++ Optimal farvning, man kan differentiere mellem de forskellige vævskomponenter, og farvningen kan anvendes som led i diagnosticeringen. Kollagene fibre fremstår kraftig blå, men stadig lette at differentiere Cellekernerne fremstår violette Cytoplasma, ERC, keratin, granula i paneth-celler og muskulatur fremstår kraftigt røde Tabel 2 Scoreskema til bedømmelse af vævssnit 17

24 Figur 12 I figuren ses farveeksempler på de forskellige farveresultater i projektet. Alle billeder er tyndtarmssnit taget med en 40X forstørrelse. A: Snit fra forsøg 1 med en ringe score (0). B: Snit fra forsøg 1 med en borderline score (+). C: snit fra forsøg 6 med en acceptabel score (++) D: snit fra forsøg 2 med en optimal score (+++) Litteratursøgning Søgning af litteratur er foretaget på naturvidenskabelige databaser som f.eks. PubMed og Google Scholar. De oftest anvendte søgeord har været søgeord som staining AND bouin s fixative, Use of bouin's fluid connective tissue masson og histological AND methods AND bouin s fixative, hvor der også er foretaget kædesøgning på disse. Da Masson Trichrom er en farvemetode, der har været anvendt i mange år, har det ikke været muligt at finde nyere materialet om emnet. Inklusionskriterier for søgningen har derfor været alle relevante artikler uanset udgivelsesår, der har omhandlet Masson Trichrom eller Bouin s fiksativ. Eksklusionskriterierne for søgningen var at artikler skulle være peer-reviewed, sproget skulle være dansk eller engelsk og litteraturen skulle være relevant i forhold til Masson trichrom eller Bouin s fiksativ. Der er søgt faglitteratur på bibliotekerne, anvendt bøger fra PAI Viborgs studerende bibliotek og udleverede kompendier fra skolen, til baggrundsviden og farveteori. Se bilag 7 for søgehistorik. 18

25 Resultater Alle Masson Trichrom farvede vævssnit er, efter hvert forsøg, vurderet ud fra scoreskemaet i tabel 2 i metodeafsnittet. Alle billeder er taget på mikroskop ved en 40x forstørrelse. Forsøg 1 I tabel 3 ses resultaterne fra forsøg 1, efter vurdering i mikroskop. Resultaterne af de 100 farvede snit, er talt op og indført i skemaet. Efterfiksering i Bouin s fiksativ Ingen Bouin 5 min, stuetemp 5 min, 60 C 1 time, 60 C 18 timer, stuetemp. A M A M A M A M A M Score Tabel 3 Samlet oversigt over resultaterne af forsøg 1. Resultaterne alle farvningerne er talt sammen og indført i skemaet. A= anilinblå. M=methylblå I figur 13 ses et repræsentativt udvalg af billeder fra forsøg 1, der illustrerer de forskellige farvninger ved forskellig score, som ses i tabel 3. Da der ikke var nogle farvninger der blev vurderet som værende optimale, ses der intet billede heraf. Billederne fra forsøg 1 findes i bilag 8 -forsøg 1. Figur 13På figuren er der vist farveeksempler på de scorer der er givet i forsøg 1. A: Repræsentativt billede af vævssnit med scoren 0. Farvet med methylblå. B: Repræsentativt billede af vævssnit med scoren +. Farvet med anilinblå. C: Repræsentativt billede af vævssnit med scoren +. Farvet med methylblå. D: Repræsentativt billiede af vævssnit med scoren ++. Farvet med anilinblå. E: Repræsentativt billede af vævssnit med scoren ++. Farvet med methylblå. 40X forstørrelse 19

26 Forsøg 2 I tabel 4 ses resultatvurdering af vævssnittene i forsøg 2, der er farvet med Masson Trichrom, hvor Biebrich Scarlet-syrefuchsin (BS-S) samt efterfiksering i Bouin s fiksativ, er varieret. Efterfiksering i Bouin s fiksativ Ingen Variation med Bouin 5 min, 18 timer, 5 min, 1 time, BS-S stuetemp. stuetemp. 60 C 60 C 5 min min min Tabel 4 Resultater af farvning i BS-S ved forskellige farvetider kombineret med forskellige tids- og temperaturvariationer af efterfiksering i Bouin s fiksativ. I figur 14 ses farveresultaterne fra forsøg 2, hvor der ikke er anvendt Bouin s fiksativ. Figur 14 Billeder af vævssnit, farvet unden efterfiksering i Bouin s fiksativ. A: Farvning med Biebrich Scarlet-syrefuchsin i 5 min. B: Farvning med Biebrich Scarlet-syrefuchsin i 10 min. C: Farvning med Biebrich Scarlet-syrefuchsin i 15 min. 40x forstørrelse. I figur 15 ses farveresultaterne fra forsøg 2, hvor der er efterfikseret i Bouin s fiksativ i 5 min. ved stuetemperatur. Figur 15 Billeder af vævssnit, farvet hvor efterfiksering i Bouin s fiksativ i 5 min. ved stuetemp indgår. A: Farvning med Biebrich Scarlet-syrefuchsin i 5 min. B: Farvning med Biebrich Scarlet-syrefuchsin i 10 min. C: Farvning med Biebrich Scarlet-syrefuchsin i 15 min. 40x forstørrelse. I figur 16 ses farveresultaterne fra forsøg 2, hvor der er efterfikseret i Bouin s fiksativ i 18 timer ved stuetemperatur. 20

27 Figur 16 Billeder af vævssnit efterfikseret i Bouin s fiksativ i 18 timer ved stuetemp. A: Farvning med Biebrich Scarletsyrefuchsin i 5 min. B: Farvning med Biebrich Scarlet-syrefuchsin i 10 min. C: Farvning med Biebrich Scarlet-syrefuchsin i 15 min. 40x forstørrelse. I figur 17 ses farveresultaterne fra forsøg 2, hvor der er efterfikseret i Bouin s fiksativ i 5 min. ved 60 C. Figur 17 Billeder af vævssnit, der er efterfikseret i Bouin s fiksativ i 5 min. ved 60 C. A: Farvning med Biebrich Scarletsyrefuchsin i 5 min. B: Farvning med Biebrich Scarlet-syrefuchsin i 10 min. C: Farvning med Biebrich Scarlet-syrefuchsin i 15 min. 40x forstørrelse. I figur 18 ses farveresultaterne fra forsøg 2, hvor der er efterfikseret i Bouin s fiksativ i 1 time ved 60 C. Originalbillederne fra figur findes i bilag 8 forsøg 2. Figur 18 Billeder af vævssnit, der er efterfikseret i Bouin s fiksativ i 1 time ved 60 C. A: Farvning med Biebrich Scarletsyrefuchsin i 5 min. B: Farvning med Biebrich Scarlet-syrefuchsin i 10 min. C: Farvning med Biebrich Scarlet-syrefuchsin i 15 min. 40x forstørrelse. 21

28 Forsøg 3 I tabel 5 ses resultaterne fra vurdering af vævssnittene i forsøg 3, hvor efterfikseringstrinnet i Bouin s fiksativ blev undersøgt yderligere ud fra tid og temperatur. Temp/tid 15 min. 25 min. 35 min. 45 min. 55 min Bouin 60 C Bouin stuetemp. 1 time 1½ time timer. Tabel 5 I tabellen er resultaterne af vurdering af vævssnittene vist. Der ses på efterfikseringstiden og temperaturen. På figur 19 ses farveresultaterne fra efterfiksering i Bouin s fiksativ ved 60 C. Figur 19 Billeder af vævssnit der er efterfikseret i Bouin s fiksativ ved 60 C. A: Efterfiksering i 15 min. B:Efterfiksering i 25 min. C: Efterfiksering i 35 min. D: Efterfiksering i 45 min. E: Efterfiksering i 55 min. 40x forstørrelse. På figur 20 ses farveresultaterne fra efterfiksering i Bouin s fiksativ ved stuetemperatur. Originalbillederne fra figur findes i bilag 8 forsøg 3. Figur 20 Billeder af vævssnit der er efterfikseret i Bouin s fiksativ ved stuetemp. A: Efterfiksering i 1 time. B: Efterfiksering i 1½ time. C: Efterfiksering i 2 timer. 40x forstørrelse. 22

29 Forsøg 4 Herunder vises resultatet med tilhørende billede af vævssnit på figur 21, af en Masson Trichrom farvning, hvor Biebrich Scarlet Syrefuchsin er blevet erstattet med Poncheau S-Fuchsin. Originalbilledet er desuden at finde i bilag 8 forsøg 4. Poncheau S-Fuchsin Resultat: + Figur 21 Poncheau S-Fuchsin erstatter Biebrich Scarlet- Syrefuchsin i egen forskrift. 40x forstørrelse. Forsøg 5 Herunder vises resultatet fra vudering af Masson Trichrom farvning udført ud fra PAI Viborgs farveforskrift med tilhørende billede af vævssnit på figur 22. Originalbilledet findes i bilag 8 forsøg 5 PAI Viborg Resultat: ++ Figur 22 Tyndtarmssnit farvet efter PAI Viborgs farveforskrift. 40x forstørrelse. 23

30 Forsøg 6 I forsøg 6 er der undersøgt, hvor lang tid, vævssnittene skal klares i 1% eddikesyre. Vurderingsresultaterne ses i tabel 6. Klaringstid i 1 % eddikesyre 1 min. 2 min. 3 min. 4 min. 5 min. Resultat Tabel 6 Resultater af vævssnit efter variation i klaringstiden med 1 % Eddikesyre. Billeder af vævssnit, hvor de 5 variationer af klaringstiden er anvendt, ses i figur 23. Originalbillederne findes i bilag 8-forsøg 6. Figur 23 Billeder af vævssnit i forsøg 6, hvor klaringstid er varieret. A: 1 min. i 1 % eddikesyre. B: 2 min i 1 % eddkikesyre. C: 3 min. i 1 % eddikesyre. D: 4 min. i 1 % eddikesyre. E: 5 min. i 1 % eddikesyre. 40x forstørrelse. 24

31 Forsøg 7 Forsøg 7 er et reproducerbarhedsforsøg. Resultaterne i forsøget ses i tabel 7. Vævstype Snittykkelse Person 1 Person 2 Person 3 Person 4 Snit 1 Snit 2 Snit 1 Snit 2 Snit 1 Snit 2 Snit 1 Snit 2 Hud 3 µm Intet snit 3,5 µm Intet Intet ++ Intet snit snit snit 4 µm ++ Intet Intet snit snit Blære 3 µm ,5 µm µm Tyndtarm 3 µm ,5 µm µm Tabel 7 De samlede resultater fra forsøg 7, hvor der er udført reproducerbarhed på projektgruppens farveforskrift. Der vises repræsentative billeder af vævssnit i figur 24, hvor resultaterne fra tabel 7 er repræsenteret. Originalbillederne findes i bilag 8-forsøg 7. Figur 24 Repræsentative snit fra reproducerbarhedsforsøget. A: Billede af blæresnit, 3 µm, farvet af person 2, score +. B: Billede af hudsnit, 3,5 µm, farvet af person 3, score ++. C: Billede af tyndtarmssnit, 3 µm, farvet af person 2, score +. 40x forstørrelse. 25

32 Forsøg 8 Forsøg 8 er et reproducerbarhedsforsøg. Resultaterne i forsøget ses i tabel 8. Vævstype Snittykkelse Person 1 Person 2 Person 3 Person 4 Snit 1 Snit 2 Snit 1 Snit 2 Snit 1 Snit 2 Snit 1 Snit 2 Hud 3 µm ,5 µm µm Blære 3 µm ,5 µm µm Tyndtarm 3 µm ,5 µm µm Tabel 8 De samlede resultater fra forsøg 8, hvor der er udført reproducerbarhed på projektgruppens farveforskrift Der vises repræsentative billeder af vævssnit i figur 25, hvor resultaterne fra tabel 8 er repræsenteret. Originalbillederne findes i bilag 8-forsøg 8. Figur 25 Repræsentative snit fra reproducerbarhedsforsøget. A: Billede af blæresnit, 4 µm, farvet af person 3, score ++. B: Billede af hudsnit, 3 µm, farvet af person 2, score +++. C: Billede af tyndtarmssnit, 3,5 µm, farvet af person 1, score x forstørrelse. 26

33 Diskussion Diskussionen for dette projekt er opdelt i diskussion materialer og metoder, af de enkelte forsøg samt delkonklussioner. Herefter er den endelige farveforskrift diskuteret i forhold til to udvalgte artikler. Billederne fra resultatafsnittet, der diskuteres i dette afsnit, stemmer ikke overens med de resultater og scoringer, projektgruppen har givet de enkelte farvninger. Dette skyldes at der ikke kunne tages billeder af resultaterne på PAI Viborg, hvilket gjorde at projektgruppen var nødsaget til at tage disse billeder på VIA University College, Campus Aarhus N. Der er derfor udført scoring og vurdering af farvningerne i de enkelte forsøg umiddelbart efter farvning, hvor billederne først er taget i slutningen af projektet. Desværre er farvningerne blevet forringet under transport af ukendt årsag. Billederne skal derfor anvendes som en vejledende faktor, i det de stemmer ikke overens med den scoring, der er givet. Diskussion af materialer og metoder Det anvendte prøvemateriale i forsøg 1-6 er tyndtarm, som er valgt på baggrund af at projektgruppens medlemmer har erfaring med farvning af denne type væv. Desuden indeholder tyndtarm alle de vævskomponenter der farves med Masson Trichrom, dvs. globulære proteiner og kollagene fibre. Til vurdering af vævssnittene, valgte projektgruppen at vurdere snittene sammen i et undervisningsmikroskop for at opnå det mest korrekte og objektive resultat af de enkelte farvninger. Disse farvninger blev vurderet udfra et scoreskema (tabel 2). Scoreskemaet er udarbejdet af projektgruppen. Fælles for alle forsøgene, var det et krav at farvningerne som minimum skulle have scoren ++, hvilket svarer til en acceptabel farvning, eller scoren +++, som svarer til en optimal farvning. Farvninger, der får disse scorer, vil kunne anvendes som led i diagnosticering, idet de forskellige vævskomponenter kan differentieres. En ringe farvning med scoren 0 eller en borderline farvning med scoren +, kan ikke anvendes til diagnosticering, idet der ikke kan differentieres eller i ringe grad kan differentieres mellem vævskomponenterne. Årsagen til at projektgruppen har valgt at godtage en acceptabel farvning, på trods af at en optimal farvning altid er at foretrække, er at vævkomponenterne ifølge teorien ikke vil kunne farves ligeså godt når der ikke anvendes Bouin s fiksativ, som efterfikseringsmiddel i Masson Trichrom. Projektgruppen besluttede derfor, med fokus på arbejdsmiljø og svartid, at et ringere men dog acceptabelt resultat er godkendt. 27

34 Den anvendte litteratur i projektet, har som skrevet i litteratursøgningsafsnittet primært været faglitteratur, da det ikke var muligt at finde videnskabelige studier omhandlende optimering af Masson Trichrom. Dette skyldes nok, at de fleste optimeringer af farveforskrifter sker internt på de patologiske institutter, hvilket også er årsagen til, at farveforskrifterne er så forskellige. Pga. dette var det ikke muligt at foretage en sammenligning af projektets resultater med resultater fra andre studier. Forsøg 1 Forsøg i var som udgangspunkt det egentlige projektforsøg, hvor brugen af Bouin s fiksativ var i fokus. Der blev derfor benyttet 100 objektglas med tilhørende snit. Det ville dog have været hensigtsmæssigt at udføre et pilotprojekt forud for dette, for at sikre at farveforskriften samt fremgangsmåden var brugbar. Efter forsøg 1 blev gruppen dog klar over, at der skulle en egentlig optimering af vores farveforskrift til, før det kunne siges, om Masson Trichrom kan anvendes uden Bouin s fiksativ. Ved at se på resultaterne i tabel 3 fremkommer det, at farvningen ikke har fungeret (Se evt. figur 13 for billeder i resultatafsnittet), udover ved anvendelse af Bouin s fiksativ i 1 time ved 60 C. Der er ved de resterende variations-farvninger, ikke nogen synlig cytoplasmafarvning, hvilket ses i muskulaturen, som forekommer blålig eller svagt grå. Gruppen blev herefter klar over, at Bouin s fiksativ ikke var fremstillet korrekt, idet der var anvendt 10 % neutralbuffet formalin i stedet for koncentreret formalin 37%. En mulig forklaring hertil er at 10 % formalin er en opløsning af formaldehyd og fremkommer derved i lavere koncentration end den koncentrerede 37% formalin. Idet koncentrationen er lavere, opnås der ikke en konkurrence mellem pikrinsyre og formaldehyd i Bouin s fiksativ som nævnt i teoriafsnittet omhandlende Bouin s fiksativ og derved bindes pikrinsyren til de globulære proteiner uden tilstrækkelig interaktion med formaldehyd. Pga den koagulerende effekt må pikrinsyren ødelægge visse af de globulære proteiners bindingssteder, hvorfor Biebrich Scarlet-syrefuchsin ikke kan finde sig. Resultaterne fra dette forsøg omhandlende brugen af Bouin s fiksativ måtte derfor forkastes. Årsagen til hvorfor farvningen fungerede i 1 time ved 60 C, kan muligvis skyldes at Bouin s fiksativ var utrolig længe om at varme op og der derved er sket en fordampning, der har gjort opløsningen med formaldehyd mere koncentreret. Resultaterne til bestemmelse om enten anilinblå eller methylblå kan dog stadig anvendes da denne farvning ikke er afhængig af brugen af Bouin s fiksativ. Gruppen valgte 28

35 derfor at benytte sig af methylblå i fremtidige forsøg, der forekom en kraftigere blåfarvning med methylblå fremfor med anilinblå (se figur 13 A og B). Forsøg 2 Forsøg 2 er et 2-i-1 forsøg. Eftersom forsøg 1 ikke er brugbart i forhold til efterfiksering i Bouin s fiksativ, er der valgt at gøre dette i forsøg 2, samtidig med at der varieres i farvetid for Biebrich Scarlet syrefuchsin. Denne farvetid ønskes undersøgt på baggrund af teorien omkring Bouin s fiksativ. Pikrinsyren i Bouin s fiksativ bevirker en åbning af de globulære proteiners tertiære struktur, hvilket bevirker at Biebrich Scarlet- Syrefuchsin bedre kan bindes vha hydrofob stabilisering. Projektgruppens hypotese var derfor, at hvis der ikke blev efterfikseret i Bouin s fiksativ, blev de globulære proteiner ikke farvet tilstrækkelig røde. Hvis farvetid blev forlænget, kunne dette muligvis kompensere for, at der ikke var sket en efterfiksering. Gruppen valgte desuden at udføre farvning i Biebrich Scarletsyrefuchsin for at se, hvis overstående hypotese ikke om der evt kunne farves i kortere tid for at nedsætte svartiden. Ved at undersøge resultaterne af farvetiden med Biebrich Scarlet syrefuchsin som ses i tabel 4, ses det at farvetiden i 5 minutter er for svag (Se evt. figur 14A). Dette kan skyldes at de efterfølgende farvetrin er meget vandholdige, hvilket kan differentiere Biebrich Scarlet syrefuchsin som er et anion-farvestof. Ved farvning i 15 minutter (se figur 18C), ses det bl.a. at kernefarvningen er blevet en smule ringere, hvilket må skyldes at kernefarvningen er blevet differentieret i Biebrich Scarlet syrefuchsin, pga syren heri. Den bedste farvetid at anvende må derfor være 10 minutter, da den giver en bedre cytoplasmafarvning uden at differentiere kernefarvningen (se figur 16B). Den anden del af forsøget, var efterfiksering med Bouin s fiksativ, hvor der varieres i tid og temperatur. Ved vurdering af disse, kan det udledes, at farvningen med Bouin s fiksativ forekommer pænere, når vævssnittene har efterfikseret i Bouin s fiksativ i 18 timer eller under opvarmning til 60 C. Der ses både optimale farvninger ved efterfiksering i 5 min ved 60 C og ved 1 time ved 60 C (Se figur 16 og 17), hvilket betyder at en efterfiksering på 1 time er overflødig. Forsøg 3 I forsøg 3 har tiden været en variation, for at udlede den optimale efterfiksering med Bouin s fiksativ. Den maximalt anvendte efterfikseringstid er 2 timer ved stuetemperatur, da farvningen udføres med tanke på forkortet svartid. Efterfikseringen må derfor ikke overstige, hvad der kan nås på en dag, når snittet også skal igennem de resterende farvetrin. 29