Fikseringstidens indvirkning på vævsmorfologi, antigenisitet og DNA-bevarelse i væv

Transkript

1 Fikseringstidens indvirkning på vævsmorfologi, antigenisitet og DNA-bevarelse i væv Navn: Charlotte Fischer Rasmussen Studienummer: I-vejleder: Lektor, Cand. Scient. Birte Bunch Larsen K-vejleder: Bioanalytikerunderviser Susanne Rønn Jacobsen Antal tegn: tegn

2 Indholdsfortegnelse Forord... 4 Resumé... 5 Introduktion... 6 Problembaggrund... 6 Formål... 7 Problemformulering... 7 Målformulering... 7 Baggrund... 8 Huden... 8 Fiksering af væv... 9 Antistoffer Immunfarvninger HIER Benchmark XT Analyseprincip DNA-bevarelse Oprensning Multiplex-PCR Kapillærelektroforese Materiale og metode Materiale Metode Vævsfremføring Vævskontroller HE-farvning Immunhistokemi Scanning af snit Scoringsmetode Ekstern vurdering af farvede snit DNA-oprensning Multiplex-PCR

3 Kapillærelektroforese Resultat Fikseringstidens påvirkning på HE-farvning Fikseringstidens påvirkning på IHC-farvning Fikseringstidens påvirkning på DNA-bevarelse Diskussion Fikseringstidens indflydelse på vævsmorfologi Fikseringstiden indflydelse på antigenisitet Fikseringstidens indflydelse på bevarelsen af DNA Projektets opbygning Konklusion Perspektivering Litteraturliste Bilagsoversigt

4 Forord Jeg vil gerne takke Patologisk Analyse Institut (PAI) på Århus Universitetshospital, Nørrebrogade, for at give mig muligheden for at skrive mit bachelorprojekt hos dem, samt støtte og rådgivning i forbindelse med udførelsen af projektet. Jeg takker Peter Lauridsen, Tom Nordfeldt og Vibeke Jensen fra PAI, Tage-Hansens Gade for hjælp til udførelse af de immunhistokemiske farvninger og pålægning af dækglas. Jeg vil gerne takke Susanne Rønn Jacobsen for hjælpen til mikrotomi af snit. Jeg vil også gerne takke Jesper Berthelsen, PAI, Udviklingslab., Nørrebrogade, for demonstration, hjælp og vejledning af udførelse af DNAoprensning, PCR og kapillærelektroforese. Herudover vil jeg også gerne takke Kristina Lund Lauridsen for hjælp til scanning af snit. En særlig tak til klinisk professor i patologi og overlæge dr. med. Torben Steiniche, for idéen til forsøget, samt for hans omfattende arbejde med scoring af vævssnit. En speciel tak skal der gives til Susanne Rønn Jacobsen og Birte Bunch Larsen for vejledning igennem projektet. Den største tak skal lyde til mine medstuderende Nina Hagemann-Ribold, Stefny Neosan og Mirna Abde for deres hjælp og samarbejde under forsøget. De har under hele forløbet været gode sparringspartnere og været til stor hjælp med hensyn til forståelse af projektet. // Charlotte Fischer Rasmussen 4

5 Resumé Formålet med dette bachelorprojekt var at undersøge, hvilken betydning fikseringstid har på vævsmorfologi, antigenisitet og bevarelsen af DNA i væv og om det vil være muligt at forkorte fikseringstiden, således patienter kan få et hurtigere svar på deres prøve. Dette blev undersøgt ved at anvende et stykke hud fra én patient. Hudstykket blev skåret i mindre stykker, hvorved der fås et stykke hud til hver undersøgelse, til hver fikseringstid, hhv. 3, 6, 12, 24, 48 og 72 timer. Efter mikrotomi i tre niveauer, blev der udført hæmatoxylin-eosin farvning på snit fra niveau 1 og 3 til hver fikseringstid, immunhistokemisk farvning med anti-ae1/3, anti-cd34, anti-cd45, anti- CK7, anti-ki-67, anti-melan-a, anti-s100 og anti-vimentin på snit fra niveau 1 og 3 til hver fikseringstid, samt oprensning, PCR og kapillærelektroforese på snit fra niveau 2 til hver fikseringstid. De farvede snit blev scoret af projektgruppen og en blindet scoring blev foretaget af klinisk professor i patologi og overlæge dr. med. Torben Steiniche. Scoringerne af de hæmatoxylin-eosin-farvede snit viser, at det ikke er muligt at forkorte fikseringstiden, men at den tværtimod bør den forlænges til 48 timer. Scoringerne af de immunhistokemiske farvede snit viser, at det ved farvning med anti-ae1/3, anti- CD34, anti-ki-67 samt anti-s100 er muligt at forkorte fikseringstiden til 12 timer, frem for de 24 timer som er standardfikseringstiden der anvendes nu. Undersøgelsen viser, at DNA ikke tager skade af fiksering op til 72 timer. 5

6 Introduktion Problembaggrund I 2007 blev det besluttet af regeringen og Danske Regioner, at indføre pakkeforløb for alle patienter med begrundet mistanke om kræft og patienter med kræft. I januar 2009 blev alle pakkeforløbene implementeret. Beslutningen om at indføre pakkeforløb kom efter, at en sammenligning af kræftpatienters overlevelse i de nordiske lande viste, at overlevelsen for de mest udbredte kræftsygdomme var ringere i Danmark end i de øvrige nordiske lande. Formålet med pakkeforløbene er dermed, at tilbyde patienter en optimal udredning og behandling, uden unødvendig ventetid og således forbedre prognosen, livskvaliteten og mindske utrygheden ved ventetid. Et pakkeforløb omfatter hele forløbet fra begrundet mistanke om kræft, udredning, diagnose, behandling og efterbehandling. Pakkeforløbene beskriver de nødvendige undersøgelser og behandlinger, herunder fagligt begrundede forløbstider (1)(2). Således er det interessant, indenfor patologien, at bidrage til disse pakkeforløb, ved at undersøge om svartiden på de histologiske undersøgelser kan forkortes, idet lange ventetider kan betyde yderligere sygdomsudvikling og dermed forringet udsigt til helbredelse. Da fiksering af de histologiske prøver er den præanalytiske procedure der varer længst, er det relevant at undersøge om fikseringstiden kan nedsættes. Histologiske vævsprøver fikseres med 4 % neutral buffet formaldehyd (NBF), som er et gelerende fiksativ, hvor standardtiden for fikseringen i dag er timer (3). Da 4 % NBF forårsager maskering af antigene epitoper i væv, er det desuden relevant at undersøge, om fikseringstiden har indvirkning på bevarelsen af disse antigene epitoper (4). Dette vil undersøges ved immunhistokemisk påvisning af forskellige antigener. Endvidere er det interessant at undersøge, om ændringen af fikseringstiden har indflydelse på bevarelsen af DNA, idet molekylærbiologien i stigende grad anvendes til diagnostik og valg af behandling indenfor patologien. 6

7 Formål Formålet med dette professionsbachelorprojekt er, at undersøge om svartiden kan reduceres ved at forkorte fikseringstiden, således at vævsmorfologien ved hæmatoxylin-eosin (HE) farvning og kvaliteten af de immunhistokemiske (IHC) farvninger ikke forringes. Der medtages desuden vævsprøver, der er fikseret i 72 timer, da nogle vævspræparater kan opbevares i 4 % NBF weekenden over. Her vil det påvises, om denne fikseringstid medfører optimale resultater. Endvidere vil det blive undersøgt, om fikseringstiden har indvirkning på DNA-bevarelsen, da molekylærbiologiske analyser i stigende grad anvendes til diagnostik og valg af behandling indenfor patologien. Problemformulering Hvilken betydning har fikseringstiden i forhold til morfologi, antigenisitet og bevarelse af DNA i væv, der er fikseret i 4 % NBF? Målformulering For at undersøge og vurdere, hvordan fikseringstiden påvirker vævsmorfologi og IHC-farvninger: Anvendes et hudstykke, der udskæres i seks dele, som fikseres med 4 % NBF i henholdsvis 3, 6, 12, 24, 48 og 72 timer Skæres snit fra hver fikseringstid i tre niveauer: o Første snit fra niveau 1 og 3 med HE o Niveau 1 og 3 anvendes til IHC-farvning Foretages IHC påvisning af antigenerne med anti-ae1/3, anti-cd34, anti-cd45, anti-ck7, anti-ki-67, anti-mel-a, anti-s-100 og anti-vimentin Anvendes et scoringssystem på de HE-farvede snit til vurdering af vævsmorfologien Anvendes et scoringssystem på de IHC-farvninger Sammenholdes resultater opnået ved standardfikseringstiden med resultater opnået ved de øvrige fikseringstider for HE-farvningen og IHC-farvning For at undersøge fikseringstidens betydning for bevarelsen af DNA: Anvendes renskåret snit fra niveau 2 til oprensning af DNA Anvendes multiplex-pcr på det oprensede DNA Udføres kapillærelektroforese for at få fragmentstørrelserne visualiseret Sammenholdes resultater opnået ved standardfikseringstiden med resultater opnået ved de øvrige fikseringstider for molekylærbiologien 7

8 Baggrund Huden Huden, Cutis, består af tre lag. Epidermis, dermis og tela subcutanea. Strukturer som også hører til huden er hår, negle, sved- og talgkirtler (5). Epidermis er et epithelialt flerlaget pladeepithellag, som danner et hornlag, består af affladede, døde celler, som indeholder proteinkomplekset keratin. Størstedelen af cellerne i epidermis undergår keratinisering og bliver til keratinocytter. De resterende celler, der ses i vævet kan være melanocytter, Langerhans-celler, Merkel-celler og lymfocytter (5). Figur 1: Viser hudens anatomi (6) Melanocytter ses i basallaget i epidermis og i hårfollikler. De ses som afrundede celler, med adskillelige forgrenede udløbere. Melanocytter ligger i det basale lag af epidermis og altid på den epidermale side af basalmembranen. Melaninet i cellen, ses som gulligbrune korn, melaningranula. Melanocytterne ses som lyse celler i basallaget (5). Dermis er et tykt lag bindevæv, hvorpå epidermis er hæftet. Dette lag fortsætter over i det subkutane væv, som er meget fedtholdigt. I bindevævet ses hårfollikler, sved- og talgkirtler. Dermis består af to ikke skarpt afgrænsede lag. De øverste lag består af løst bindevæv med en del celler og et løst netværk af kollagene fibre. Det nederste lag er tættere og der ses grove bundter af kollagene fibre (5). 8

9 Fiksering af væv Efter vævet er udtaget fra patienten, skal det fikseres. Fiksativet skal forhindre nedbrydningsprocesser, som medfører ødelæggelse af morfologien. Nedbrydningsprocesserne sker som følge af, at der er nærings- og iltmangel i cellerne. Under nedbrydningsprocesserne frigives forskellige enzymer fra cellernes lysosomer og herfor startes autolysering af cellerne. I vævet findes også en række bakterier, som vil få vævet til at rådne (7)(8). For at fiksativet har de mest optimale kriterier, er der nogle krav, som bør overholdes. Kravene gør at uønskede artefakter i vævet minimeres. Disse krav er: - Fiksativet skal have samme osmolaritet som vævet, så vævet ikke svulmer eller skrumper - Fiksativet må hverken helt eller delvist opløse vævskomponenterne eller tilføje nye komponenter til vævet - Fiksativet skal dræbe bakterier, svampe og vira - Fiksativet skal inaktivere de autolytiske enzymer - Fiksativet skal stabilisere vævskomponenterne, så de bliver i stand til at modstå den videre behandling - Reaktionen mellem vævskomponenterne og fiksativet skal finde sted momentant - Fikseringsproceduren skal være reproducerbar 1 Når man IHC-farver, ønskes ikke kun bevarelse af morfologien, men også antigenisiteten i vævet. Derfor er der også opstillet krav til fiksativerne som skal anvendes hertil: - Immobilisere antigener - Bevare antigenisitet - Bevare vævs- og cellestruktur - Bevare permeabiliteten for immunreagenser (antistoffer mv.) 2 Der findes to forskellige fiksativer som der skelnes imellem, når man ønsker at fiksere væv. Det gelerende fiksativ fikserer ved en delvist reversibel denaturering. Gelerende fiksativer fikserer primært proteiner, ved at danne methen-broer mellem aminosyreradikalerne i polypeptidkæderne indenfor et protein og mellem naboproteiner. Herved opstår et netværk som gør, at proteinernes 1 Citat: Hallager, Jelsbak og Meyer: Noter i Farvning af Celler og Væv, 2. udgave, november 2006, Bioanalytikeruddannelsen - Århus 2 Citat: Vyberg: Anvendt Immunhistokemi, 6. udgave, 2005, Bioanalytikeruddannelsen - København 9

10 opbygning og struktur ikke kan forandres (7). Med henblik på IHC betyder dette, at tværbindingerne er med til at stabilisere antigenerne i deres naturlige position, hvorved de ikke koagulerer under efterfølgende vævsfremføring (4). Oftest anvendes 4 % NBF som gelerende fiksativ. Standardfikseringstiden er mellem 24 og 48 timer (7). I forbindelse med IHC ses det, at det gelerende fiksering påvirker antigenisiteten, hvorved antistofferne ikke kan binde sig til epitoperne (9)(10). Da det er en reversibel proces, kan man ved brug af proteolytiske enzymer eller varme, demaskere antigenerne og hermed opnå dannelsen af en antigen/antistof-reaktion (9). Det koagulerende fiksativ fikserer ved en irreversibel denaturering. Herved udfældes proteinerne, bl.a. fordi den tertiære struktur i proteinerne åbnes. Herved blotlægges forskellige reaktive og hydrofobe grupper. Disse grupper danner tværbindinger med hinanden under dannelse af større uordnede aggregater. Ved denne proces vil proteinernes struktur og egenskaber blive ødelagt, hvilket betyder at vævet får en grovere morfologi(7). Et koagulerende fiksativ kan fx være ethanol. I forbindelse med IHC, ses to forskellige strukturer, som vil være mulige at farve efter en koagulerende fiksering, nemlig cytokeratin (CK) og vimentin (9), da disse begge består af intermediære filamenter (4). Antigener som ikke er fikseret tilstrækkeligt i NBF, vil blive helt eller delvist fikseret i ethanol under vævsfremføringen, hvilket giver risiko for at blive ekstraheret. Dette kan fx være S- 100 protein (4). Fikseringstiden beregnes som værende den tid der medgår fra vævets immersion i fikseringsmidlet og indtil vævet er blevet stabiliseret. Diffusionstiden påvirkes af seks forskellige parametre. Disse er: Fiksativets art, dvs. fiksativmolekylernes størrelse og form og deres tilbøjelighed til indbyrdes reaktion Fiksativets koncentration Fiksativets temperatur Diffusionsvejen, dvs. hvor den betragtede celle eller vævsbestanddel befinder sig i forhold til fiksativets applikationssted Vævstype Fikseringens art (gelering eller koagulering, kemisk reaktion eller vandfjernelse) 3 3 Citat: Lyon og Prentø, Kompendium i kemiske og biokemiske analyseprincipper, A, 2002, Bioanalytikeruddannelse - København 10

11 Fiksering med 4 % NBF af væv som skal anvendes til DNA-bevarelse, skal for så vidt muligt minimeres, da NBF kan denaturere proteinerne i vævet. Der findes dog visse faktorer som kan minimere denatureringen af DNA, når man anvender 4 % NBF. Disse faktorer er: Koncentrationen Temperaturen ph (11). Antistoffer I forsøget anvendes otte forskellige antistoffer (Ab). Disse Ab fungerer ved at danne en antigen/antistof-reaktion, hvorved der ved detektion, kan se forskellige strukturer i vævet. Anti-AE1/3 er en blanding af to monoklonale Ab; AE1 og AE3. AE1 er rettet mod størstedelen af de sure typer af CK10, 14, 15, 16 og 19, mens AE3 er rette mod de basiske CK1-8. Anti-CD34 er et enkeltkædet transmembran glykoprotein. Det fungerer formentlig som celleadhæsionsmolekyle og inhiberer hæmatopoiese (12). Anti-CD45 er formentlig en del af signaltransduktion og celleaktivering. Det er til stede i alle hæmopoietiske og lymfoide celler, bortset fra erythrocytter, plasmaceller og megakaryocytter. CD45 påvises oftest membranøst (4). Anti-CK7 er et protein i gruppen af cytokeratiner (CK). Det farver i de intermediære filamenter og findes derfor i alle epithelceller. I cytoplasmaet danner CK et netværk, der har en funktion ifm. transport. CK7 er neutral-basisk, som betyder, at de formentlig altid danner komplekser af dimérstruktur. CK ses tydeligt i væv, som er fikseret med koagulerende fiksativ, da hverken den primære eller sekundære struktur påvirkes betydeligt under fikseringen (4). Anti-Ki-67 er et nukleoprotein og specifikt for celledeling, i og med at den ses i alle stadier af celleproliferationscyklussen. Netop fordi Ki-67 har denne funktion, bruges den som en vigtig markør for tumorproliferation (4). Dog er den ikke tilstrækkelig specifik som markør, hvilket betyder at man ikke kun må anvende denne til diagnosticering (13). Anti-Melan-A er en melanocytmarkør og den ses i både hvilende og aktive melanocytter. Da denne markør kan ses i melanocytter, anvendes den til identifikation af malignt melanom (4). Melan-A har en øget sensitivitet overfor anvendelse af HIER (12)(14). 11

12 Anti-S100 er et lille surt calciumbindende protein. S100 ses både i cellekerner, cytoplasma og cellemembraner. S100 er en del af cellulære processer og cellestrukturer, vækst og proliferation, har bevæge- og adhæsionsevne, kontraktionsevne, samt celle-til-cellekommunikation. Hvis fikseringen af væv, som skal IHC-farves med Anti-S100, ikke fikseres tilstrækkeligt i gelerende fiksativ, vil det kunne betyde ekstrahering, pga. fiksering i koagulerende fiksativ under vævsfremføringen (4). Anti-Vimentin er et intermediært filament, med strukturel funktion i cytoplasma. Vimentin ses i de tidlige stadier af alle celletyper. Vimentin er meget følsom overfor forlænget fikseringstid. På samme måde som ses ved CK, vil vimentin godt kunne fikseres med et koagulerende fiksativ, da Vimentin, som nævnt, også er et intermediært filament (4). Immunfarvninger IHC-farvninger anvendes af forskellige årsager. IHC-farvning er anvendeligt til diagnosticering, at kalkulere prognose og karakterisering af forskelligt tumorvæv. Herudover kan det også anvendes til monitorering af behandling (10). Når man har fikseret vævet med NBF, er der opstået en maskering af antigenerne i vævet. Derfor ønsker man at demaskere antigenerne, således man kan få en optimal farvning ved brug af antistoffer. Der kan anvendes proteolytiske enzymer eller varmeinduceret epitopdemaskering (HIER) for at demaskere. HIER Når man fikserer væv i formalin, dannes der kovalente bindinger mellem aldehyd- og aminogrupperne i vævet. Disse bindinger kan gå ind og denaturere proteinet i vævet, hvilket betyder at antigenisiteten i vævet forringes. Herudover kan formalin danne vævsproteiner, tværbundet via methylenbroer, hvilket reducerer penetrationen af vævet til store molekyler, som bl.a. antistoffer (4). HIERmetoden er den mest anvendte metode til demaskering. Til varmebehandling anvendes Tris EDTA buffer med en basisk ph. Bufferen anvendes som kogemedie og har to væsentlige egenskaber, nemlig ph og kogemediets evne til at kompleksbinde eller udfælde calciumioner. Årsagen til at HIER fungerer, er, at det kan bryde methenbroerne som er dannet under fiksering (9) og det fjerner Ca 2+ - ioner som er epitopmaskerende og kompleksbundne. Herudover medfører HIER en rehydrering af vævet som medfører forbedret penetration og der forekommer proteindenaturering, hvilket er resulterende i at blotlægge skjulte epitoper (4). De to vigtigste faktorer som bliver anvendt ved brug af HIER er temperatur og tid (8). 12

13 Benchmark XT Benchmark XT (BXT) er et apparatur, som kan anvendes til IHC-farvninger. Det første der sker i BXT er, en afparaffinering af vævet ved brug af EZ Prep (se bilag 4.1), således at den efterfølgende farvning optimeres. Herefter påføres Coverslip (se bilag 4.2) (se bilag 5). Efterfølgende sker en epitopdemaskering (se bilag 5), ved brug af HIER, for at blotlægge antigenerne i vævet. Det reagens som er hjælpende til at udføre epitopdemaskeringen er kogebufferen CC1 (se bilag 4.3). Herefter skal der tilsættes Reaction Buffer (se bilag 4.4) (se bilag 5). Efterfølgende foregår der blokering af endogen aktivitet (se bilag 5). Noget væv indeholder endogen peroxidase og alkalisk phoshphatase (AP). Årsagen til at dette enzym ønskes blokeret er, at det resulterer i uspecifik farvning af baggrunden og det kan give et falsk positivt resultat, hvis man bruger et konjugeret antistof. En måde hvorpå enzymet kan blokeres er, at tilføje brintperoxid til præparater, hvor der skal anvendes Horse Radish Peroxidase (HRP) og 3,3 -Diaminobenzidin (DAB), mens der ved anvendelse af alkalisk phosphatase (AP) og Fast Red TR/Naphthol-AS-MX phosphat (Fast Red TR) blokeres endogen aktivitet med brug af levamisol eller ved opvarmning til 65 C (4). Afhængig af hvad der ønskes farvet i vævet, vælges enzymlabellen ud fra dette. Efter blokering af endogen aktivitet tilsættes et primært Ab (se bilag 5). Det primære Ab vil give en positiv reaktion, en udfældning af en farve, hvis der er dannet en Antigen (Ag)/Ab-reaktion. Det primære Ab er specifikt for det Ag der ønskes at undersøge for (4). Efter det primære Ab er tilsat, skylles vævet (se bilag 5), således at det overskydende Ab fjernes. Herefter skal Ag/Ab-reaktionen detekteres (se bilag 5). Der findes to forskellige detektionssystemer; direkte og indirekte teknikker. Ved direkte teknikker er det primære Ab direkte konjugeret til en enzymlabel, fx HRP eller AP. Direkte teknik er simpel og hurtig at udføre, men dog ikke så sensitiv. Derimod er indirekte teknik sensitiv. Der findes en del forskellige systemer til brug af indirekte teknik (4), men det system som bruges på BXT er en 2-lags teknik (se bilag 4.5 og 4.6), som er det simpleste indirekte detektionssystem. Efter farvning med Ab, gøres det muligt at iagttage den præcise lokalisation af reaktionsproduktet i forhold til morfologien, ved hjælp af en kernefarvning. Kernefarvningen foregår ved brug af Hæmatoxylin (se bilag 5). Analyseprincip Analyseprincippet som anvendes på BXT er en indirekte teknik. Lige gyldigt om der anvendes HRP sammen med DAB eller AP sammen med Fast Red TR anvendes det samme analyseprincip. HRP og AP kan detektere et antigen, som sidder i paraffinindstøbt vævssnit. Først tilsættes et primært antistof. Dette binder sig til antigenet i vævet. Herefter tilsættes et sekundært antistof, som er en HRP multimer eller en AP multimer. Multimeren er i stand til at forstærke signalet af Ag/Ab- 13

14 reaktionen. Som tidligere nævnt, er HRP og AP usynlige. Derfor tilsættes enten DAB eller Fast Red TR og på denne måde fremkommer et brunt eller et rødt precipitat. Figur 2: Viser den indirekte metode, som bruges til IHC-farvning med brug af HRP og DAB (se bilag 4.5). Figur 3: Viser den indirekte metode, som bruges til IHC-farvning med brug af AP og Fast Red TR (se bilag 4.6). Ved IHC-farvning er det vigtigt, at man er sikker på, at farvningen er forløbet som den skulle og derfor kan man ved hvert snit have en positiv kontrol og en negativ kontrol. Den positive kontrol sikrer, at IHC-farvning er optimal og at der ikke opnås falske negative resultater. Den negative kontrol sikrer, at der ikke opnås falske positive resultater. For at være sikker på, at farvningen er optimal på de områder af vævet som det skal, kan der anvendes forskellige typer væv, fx appendix, hepar, tonsil og pancreas. Ved farvning af cutis, kan man medtage en kontrol, som består af naevus. Den indeholder modne og aktive melanocytter og er en positiv kontrol for anti-melan-a og negativ for de resterende antistoffer. 14

15 DNA-bevarelse For at opnå det bedste resultat, når man ønsker at undersøge DNAs bevarelse, er det bedst at anvende ufikseret væv, da fiksativet endnu ikke har været inde at fragmentere nukleinsyrerne i vævet. Væv som er udtaget fra en patient, bliver fikseret for at bibeholde den tertiære struktur i vævet, således vævsmorfologien og antigenisiteten i vævet er optimal. Ved bevarelse af DNA vil man gerne formindske fragmenteringen. For at gøre det, skal man sørge for at fiksere vævet så hurtigt som muligt efter det er udtaget af patienten. Fiksativet skal være NBF og der fikseres i 3-6 timer, for at opnå det bedste resultat (11). Hvis vævet fikseres i mere end 24 timer, vil det resultere i yderligere fragmentering. Herudover er det vigtigt at vævet er grundigt dehydreret inden det bliver paraffinindstøbt, da rester af formalin kan hæmme Proteinase Ks aktivitet (se bilag 6). Oprensning Oprensning af DNA sker gennem seks forskellige trin. Første trin består i, at paraffinen fjernes fra vævet. Herefter lyseres vævet ved brug af Proteinase K. Vævet inkuberes ved 90 C og herefter afpipetteres vævet over i et eppendorfrør, som indeholder en silica-membran, hvori DNAet binder til. Herefter vaskes membranen og resterende kontaminanter vaskes væk. Efterfølgende elueres det rene koncentrerede DNA fra membranen. På denne måde, er DNAet oprenset fra vævet, således det kan bruges til PCR og efterfølgende elektroforese (se bilag 6). Multiplex-PCR For at udføre en Polymerase Chain Reaction (PCR), er der brug for de samme komponenter in vitro, som der ses in vivo. Disse komponenter består af primere, en template, nukleotider, polymerase enzymer og buffere (15). PCR består af 3 trin. PCR starter med et dobbeltstrenget DNA. I det første trin, denatureringen, bliver DNAet adskilt til to enkelt strenge, således de kan blive kopieret. Det foregår ved at opvarme prøven til 95 C i 2 min. og herefter i 45 sekunder (15) (se bilag 9). Det næste trin, annealingen, også kaldet hybridisering, er det mest kritiske punkt for specificiteten af PCRen. Under annealingen vil to oligonukleotider hybridiserer til den komplementære sekvens af templaten, fra 5 -enden mod 3 -enden. Det er vigtigt, at annealingtemperaturen er optimeret ved reaktionsforholdene (15). Annealingen foregår ved 60 C i 35x45 sekunder (se bilag 9). Det tredje og sidste trin under PCR, er primer extension, også kaldet elongeringen. I dette trin syntetiserer polymerasen en kopi af DNAtemplaten, ved at tilføje nukleotider til de hybridiserede primere (15). Denne del af cyklussen fore- 15

16 går ved 72 C i 10 min. (se bilag 9). I løbet af en cyklus, som er alle tre trin, er et dobbeltstrenget DNA blevet til to kopier. Ved anvendelse af Multiplex-PCR, er der flere primer-par, som bliver tilføjet til PCR, således flere amplifikationer bliver primet på samme tid (15). Kapillærelektroforese Kapillærelektroforese bliver anvendt til at adskille og analysere nukleinsyrer baseret på størrelsen. Kapillærelektroforese udføres i et kapillær med et forstøbt gelkort. Hver prøve bliver automatisk loadet i hver sin kapillær og herefter bliver der sendt en spænding igennem gelen. Det er vigtigt, at DNAet er denatureret fuldstændigt, da dobbeltstrenget DNA vil påvirke vandre-hastigheden. De negativt ladet nukleinsyrer vandrer gennem gelen til den positiv ladet ende. Molekylerne med lav molekylevægt vandrer hurtigere end molekyler med høj molekylevægt. Når molekylerne vandrer igennem gelen, passerer de en detektor og der måles og afgives et fluorescerende signal. Signalet bliver konverteret til elektronisk data, som bliver ført ind i en computer. Når elektroforesen er færdig, bliver dataet vist som et gelbillede (se bilag 10) (15) og man kan herefter aflæse hvor størrelsen af fragmenterne er blevet. Under udførelsen af kapillærelektroforesen anvendes to forskellige markører. QX Alignment Markeren viser en øvre og nedre grænse for størrelsen af DNAet. Markørens størrelse afhænger af, hvilken størrelse fragmenter der ønskes påvist, og derfor skal denne ligge så tæt på egne valgte fragmentstørrelser som muligt (se bilag 10). Derfor skal der også anvendes en mere præcis markør. Ved at anvende DNA Size Marker kan størrelsen af fragmenterne let aflæses (se bilag 10). 16

17 Materiale og metode Materiale Jeg henviser til bilag 1 for materialeliste. For protokoller til anvendte apparaturer henviser jeg til bilag 2, 3, 6, 10. For datasheets til antistoffer henviser jeg til bilag 5. For beskrivelse af anvendte reagenser til immunfarvninger, henviser jeg til bilag 4. For beskrivelse af anvendte reagenser til oprensning af DNA, henviser jeg til bilag 7. Metode Efter aftale med Plastikkirurgiskafdeling, Afd. Z på Aarhus Universitetshospital leveres et ufikseret hudstykke fra brystet. Dette hudstykke udskæres i seks dele og hver del fikseres til tiderne 3, 6, 12, 24, 48 og 72 timer. De fikserede hudstykker fremføres og paraffinindstøbes efterfølgende. Fikseringen af vævet foregår i 4 % NBF i hhv. 3, 6, 12, 24, 48 og 72 timer. Figur 4: Viser ufikseret hud inden udskæring Figur 5: Viser ufikseret hud, efter afskæring af fedt 17

18 Figur 6: Viser udskåret hud i vævskassetter klar til fiksering Figur 7: Viser udskæring af hud i små stykker Vævsfremføring Vævsfremføringen foregår i VIP Maskinen er fuldautomatisk og sørger derfor selv at flytte vævet fra bad til bad. Der er 14 bade i alt (se bilag 2). For at vævsfremføringen af de korteste fikseringstider (3, 6 og 12 timer) kan lade sig gøre hurtigst muligt, bliver der anvendt tre VIP Vævet indstøbes herefter i paraffin på Sakura Tissue Tek TEC TM Tissue Embedding Console System. På rotationsmikrotomen, MICROM HM360, skæres vævet i en tykkelse på 3 µm. Èt snit skæres fra hver blok fra niveau 1, som skal bruges til HE-farvning. Dernæst skæres 8 snit fra niveau 1 til immunhistokemisk farvning. Inden snit til DNA-oprensning, multiplex-pcr og geleletroforese skæres, skal arbejdspladsen og instrumenterne rengøres i henhold til protokollen for mikrotomi til DNA og RNA ekstraktion (se bilag 11). Når arbejdsplads og instrumenter er rene, skæres, fra hver blok, seks snit med en tykkelse på 10 µm fra niveau 2 til oprensning, multiplex-pcr og gelelektroforese af DNA. Efterfølgende skæres ét snit fra niveau 3 fra hver blok til HE-farvning. Til slut skæres igen 8 snit til immunhistokemisk farvning fra niveau 3. Vævskontroller Der medtages en multiblokkontrol på alle objektglas med væv, der skal farves med immunhistokemiske teknikker. Multiblokkontrollen, der indeholder vævsstykker fra pancreas, appendix, tonsil og hepar, er en positiv kontrol. Mindst ét af vævstykkerne i denne kontrol er positiv for anti-ae1/3, anti-cd34, anti-cd45, anti-ck7, anti-ki-67, anti-s-100 og anti-vimentin. Alle vævstykker er negative for anti-mel-a. Ligeledes medtages en naevus-kontrol på objektglassene. 18

19 HE-farvning Farvningen af HE-snit foregår af to omgange, pga. manglende prøvemateriale. Metoden ved HE-farvning er ens, lige meget om man udfører farvningen manuelt eller på apparatur (se bilag 3.1 og 3.2). Vævsnit, som er fikseret i 3, 6, 12 og 24 timer, er HE-farvet på Sakura Tissue Tek Prisma. Snittene er anbragt i en vugge og placeret i maskinen. Her er indbygget varmestation, som foregår ved 60 C i 15 min.. Da maskinen er fuldautomatisk sørger den selv for, at flytte snittene fra et bad til det næste. Efter endt farvning, placerer maskinen glassene i Tissue Tek Glas, hvor der bliver lagt dækglas på (se bilag 3.3). Vævssnit, som er fikseret i 48 og 72 timer, er HE-farvet på Combitec Slide Stainer Snittene er anbragt i en vugge og varmet i et varmeskab i 15 min. ved 80 C. Herefter anbringes snittene i det første bad. Maskinen gennemfører derefter selv farvningen. Når farvningen er slut, påføres der dækglas manuelt med brug af pertex. Immunhistokemi Snittene, der skal immunfarves, tørres og snittene fastsættes på glasset, ved at anbringe dem i et varmeskab ved 60⁰ C i 60 min. Herefter placeres objektglassene på Ventana Benchmark XT, hvor snittene først afparaffineres og derefter farves med antistofferne anti-ae1/3, anti-cd34, anti-cd45, anti-ck7, anti-ki67, anti-mel-a, anti-s-100, og anti-vimentin. For at sikre ensartethed af farveprocedurerne, vil placeringen foregå således, at vævene på objektglassene, der skal farves med samme antistof farves på samme tid. Der kan farves med fire forskellige antistoffer på samme maskine, på samme tidspunkt. Derfor bliver farvningerne lavet af to omgange. Der bruges to forskellige visualiseringskit under immunfarvningen. Chromogenet DAB og enzymlabellen HRP bruges til at visualisere anti-ae1/3, anti-cd34, anti-cd45, anti-ck7, anti-ki67, anti- S-100 og anti-vimentin. Chromogenet Fast Red TR/Naphthol-AS-MX phosphat (Fast Red TR) og enzymlabellen Alkalisk Phosphatase (AP) bruges til at visualisere anti-mel-a. Farvning med rødt kit gør, at der ses en forskel i farven på melanocytterne og melaninen i vævet. Melaninen vil være brunlige, mens melanocytterne vil være rødlige, pga. brug af alkalisk phosphatase. 19

20 Efter farvning vaskes snittene i rindende varmt vand. En beholder fyldes med sæbevand, hvor snittene dyppes 50 gange. Herefter fyldes beholderen med rent varmt vand og snittene dyppes igen 50 gange. Efter vask dehydreres snittene i stigende procent ethanol, hvorefter de tørres ved brug af en føntørre, og dækglas kan nu monteres på Laica CV5030. Scanning af snit De farvede snit, HE- såvel som IHC, scannes ved brug af nanozoomer 2.0 HT. Softwareprogrammet, nanozoomer digital ndp viewer, er tilknyttet scanneren, gør det muligt at vurdere farvningen af snittene på en computer, i stedet for på mikroskopet. Før scanning af snittene fjernes dækglaskanter, der overskrider objektglassets kanter med en skalpel, og dækglassets overflade pudses for at fjerne fedtpletter. Snittene sættes i en vugge tilhørende nanozoomer 2.0 HT, sættes ind i maskinen, og denne startes. Scoringsmetode Ved scoringen til HE-farvningen lægges der vægt på vævsmorfologien; skrumpning af celler og kerner i epithelet, samt skrumpning af celler, kerner og strukturer i bindevævet. De HE-farvede snit kan inddeles i tre vurderinger i henhold til vævsmorfologien. Kriterierne er som følger: Optimal (O): Størstedelen af kernerne i overfladeepithelet er velbevaret og cellelagene er afgrænset og tydelige i bindevævet. Borderline (B): Størstedelen af kernerne i overfladeepithelet er velbevarede og cellelagene er let afgrænset og tydelige i bindevævet. Poor (P): Størstedelen af kernerne i overfladeepithelet er ikke velbevarede og cellelagene er uafgrænset og usammenhængende i bindevævet. Ved scoring af immunhistokemiske farvninger, tages der udgangspunkt i NordiQCs kriterier for optimal farvning, med nedenstående antistoffer. I henhold til kriterierne scores de farvede snit ud fra farveintensitet. Da der ikke er opstillet kriterier for Good, Borderline og Poor på rask hud fra Nordiqc, vurderes disse kriterier, på baggrund af sammenligning af egne snit. Good (G): En moderat farvning. Borderline (B): Svag til moderat farvning med evt. let og ubetydelig uspecifik farvning. 20

21 Poor (P): Ingen til svag farvning med uspecifik farvning. Alle farveresultater er fremkommet ved konsensus, blandt de projektansvarlige. Nedenfor ses tabel 1-8, som viser billeder af kontrolsnit, farvet med ét af de otte antistoffer (se bilag 12). 21

22 Tabel 1: viser multiblokkontrol og naevuskontrol farvet med anti-ae1/3 Appendix Tonsil Hepar Pancreas Naevus 22

23 Tabel 2: viser multiblokkontrol og naevuskontrol farvet med anti-cd34 Appendix Tonsil Hepar Pancreas Naevus 23

24 Tabel 3: viser multiblokkontrol og naevuskontrol farvet med anti-cd45 Appendix Tonsil Hepar Pancreas Naevus 24

25 Tabel 4: viser multiblokkontrol og naevuskontrol farvet med anti-ck7 Appendix Tonsil Hepar Pancreas Naevus 25

26 Tabel 5: viser multiblokkontrol og naevuskontrol farvet med anti-ki-67 Appendix Tonsil Hepar Pancreas Naevus 26

27 Tabel 6: viser multiblokkontrol og naevuskontrol farvet med anti-melan-a Appendix Tonsil Hepar Pancreas Naevus 27

28 Tabel 7: viser multiblokkontrol og naevuskontrol farvet med anti-s100 Appendix Tonsil Hepar Pancreas Naevus 28

29 Tabel 8: viser multiblokkontrol og naevuskontrol farvet med anti-vimentin Appendix Tonsil Hepar Pancreas Naevus 29

30 Ekstern vurdering af farvede snit Som en ekstern vurdering af de farvede snit, har klinisk professor i patologi og overlæge dr. med. Torben Steiniche, indvilliget i at score disse efter ovenstående kriterier. Torbens scoring sammenlignes med den scoring vi har foretaget, for at se om der er uoverensstemmelse i de to scoringer, i vurdering af vævsmorfologien ved HE-farvning og farvekvaliteten ved IHC. Torben Steiniches scoring er vurderet på en samlet vurdering af snittene for hver fikseringstid, således der kun gives et resultat for hver fikseringstid, da der ikke er blevet taget hensyn til snittenes niveau i vævet. DNA-oprensning Til oprensning af DNA fra det fikserede væv, bruges oprensnings-kittet QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (se bilag 6). Der oprenses DNA fra 3, 6, 12, 24, 48 og 72 timer to gange, for at lave dobbeltbestemmelse. Efter oprensningen bestemmes koncentrationen af DNA, ved at måle absorptionen ved 260 nm i IMPLEN nanophotometer. Dette foregår ved at, udvælge en hætte, som kan indeholde 4 µl prøvemateriale. Apparaturet nulstilles med ATE Buffer. Efter hver måling, skal hætten tørres af med en cellestofserviet. Herefter kan prøvematerialet afpipetteres over i hætten, én prøve ad gangen. Multiplex-PCR Ved fremstilling af PCR-mix multipliceres reagensernes mængde med antallet af PCR-prøver, der skal udføres. Da der medtages en positiv og en negativ kontrol, har vi 14 prøver. For at være sikker på, at der er PCR mix nok, vælges det, at mængderne multipliceres med 15 (se bilag 8). Primeropløsningen er en blanding af 5 primerpar, der er designet således, at de viser fragmenter af størrelserne 100, 200, 300, 400 og 600 bp. Den positive kontrol indeholder DNA fra en blodprøve, da dette er det reneste DNA man kan oprenses. Den negative kontrol indeholder miliq H 2 O, da denne ikke må indeholde noget DNA. I de 12 første PCR-rør tilsættes 22 µl PCR-mix sammen med 3 µl DNA fra hver enkelt fikseringstid. I ét PCR-rør tilsættes den positive kontrol og i ét PCR-rør tilsættes den negative kontrol. PCRrørene anbringes i Biometra T3000 fra Thermocycler, hvor det oprensede DNA amplificeres (se bilag 9). 30

31 Kapillærelektroforese Til udførelse af kapillæreletroforese anvendes apparaturet QIAxel Advanced fra Qiagen. Softwareprogrammet QIAxel ScreenGel tilknyttet QIAxel Advanced tillader, at man kan vurdere elektroforesen på en computer (se bilag 10). Inden udførelse af elektroforese loades PCR-produkterne og et gelkort på apparaturet. Der loades ligeledes en QX alignmentmarker, samt QX DNA Size marker. Efter klargøring startes apparaturet og afpipettering af reagenserne til elektroforesen påbegyndes automatisk. Slutproduktet er et billede af DNAets fragmentstørrelse. 31

32 Resultat Fikseringstidens påvirkning på HE-farvning Nedenfor ses udvalgte billeder af HE-farvning, som viser hvilket grundlag vi har valgt at give vores scorer ud fra. Resterende resultater ses i bilag 13. Scoring for HE Optimal (O) Oversigt 2,5X. Fikseret i 48 timer, niveau 1 Close-up 20X. Fikseret i 48 timer, niveau 1 Tabel 9: Optimal HE-farvning. Vurderingen begrundes med, at der ses velbevaret kerner i overfladeepithelet, samt cellelagene er velafgrænsede og tydelige i bindevævet Scoring for HE Borderline (B) Oversigt 2,5X. Fikseret i 12 timer, niveau 1 Close-up 20X. Fikseret i 12 timer, niveau 1 Tabel 10: Borderline HE-farvning. Vurderingen begrundes med, at størstedelen af kernerne i overfladeepithel er velbevaret, og at cellelagene er let afgrænset og tydelig i bindevævet. Der ses en smule ødelæggelse i bindevævet, og dette er afgørende for, at snittet vurderes som borderline. 32

33 Scoring for HE Poor (P) Oversigt 2,5X. Fikseret i 6 timer, niveau 1 Close-up 20X. Fikseret i 6 timer, niveau 1 Tabel 11: Poor HE-farvning. Vurderingen begrundes med, at størstedelen af kernerne i overfladeepithelet ikke er velbevaret, og at cellelagene er uafgrænset og usammenhængende i bindevævet. Nedenfor ses en tabel over, hvilke scorer vi har givet hver enkelt farvning til de forskellige fikseringstider. 72 timer 48 timer 24 timer 12 timer 6 timer 3 timer Snit niveau 1 O O O/B P B/O Snit niveau 3 B O O O/B P P Tabel 12: viser en vurdering af HE-farvninger, foretaget af de projektansvarlige. O/B betyder, at vævsmorfologien er på grænsen mellem Optimal og Borderline, men med primær fokus på Optimal. B/O betyder, at vævsmorfologien er på grænsen mellem Bordeline og Optimal, men med primær fokus på Borderline. 72 timer 48 timer 24 timer 12 timer 6 timer 3 timer Snit niveau 1 B O B P P Snit niveau 3 B O B B B B Tabel 13: viser en vurdering af HE-farvninger, foretaget af klinisk professor i patologi og overlæge dr. med. Torben Steiniche. 33

34 Fikseringstidens påvirkning på IHC-farvning Nedenfor ses udvalgte billeder af IHC-farvning, som viser hvilket grundlag vi har valgt at give vores scorer ud fra. Resterende resultater ses i bilag 14. Tabel 14: Scoring for anti-ae1/3 Optimal (O) - 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 1: En moderat til stærk cytoplasmareaktion i epitelceller Good (G) 10X. Fikseret i 6 timer, niveau 1: En moderat farvning. Borderline (B) 10X. Fikseret i 3 timer, niveau 3: Svag til moderat farvning med evt. let og ubetydelig uspecifik farvning. Poor 34

35 Tabel 15: Scoring for anti-cd34 Optimal (O): En moderat til stærk cytoplasmareaktion med fremhævelse ved membranen på næsten alle endotelceller i alle væv. Good (G) 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 1: En moderat farvning. Borderline (B) 10X. Fikseret i 6 timer, niveau 3: Svag til moderat farvning med evt. let og ubetydelig uspecifik farvning. Poor 35

36 Tabel 16: Scoring for anti-cd45 Optimal (O) - 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 1: En stærk membranfarvning i de normale lymfocytter. Good (G) 10X. Fikseret i 6 timer, niveau 3: En moderat farvning. Borderline (B) 10X. Fikseret i 3 timer, niveau 3: Svag til moderat farvning med evt. let og ubetydelig uspecifik farvning. Poor 36

37 Tabel 17: Scoring for anti-ck7 Optimal (O) - 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 1: Moderat til stærk cytoplasmareaktion i cylinderepithelceller i sved- og talgkirtler. Good (G) 10X. Fikseret i 6 timer, niveau 1: En moderat farvning. Borderline (B) 10X. Fikseret i 3 timer, niveau 3: Svag til moderat farvning med evt. let og ubetydelig uspecifik farvning. Poor 37

38 Tabel 18: Scoring for anti-ki-67 Optimal (O) 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 1: En stærk kernefarvning af prolifererende basale og parabasale celler i flerlaget pladeepitel. Good (G) 10X. Fikseret i 12 timer, niveau 1: En moderat farvning. Borderline Poor 38

39 Tabel 19: Scoring for anti-melan-a Optimal (O) 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 1: Stærk farvning af melanocytters cytoplasma i basalmembranen med evt. brune udløbere til omkringliggende celler. Good (G) 10X. Fikseret i 72 timer, niveau 3: En moderat farvning. Borderline (B) 10X. Fikseret i 12 timer, niveau 1: Svag til moderat farvning med evt. let og ubetydelig uspecifik farvning. Poor (P) 10X. Fikseret i 6 timer, niveau 3: Ingen til svag farvning med uspecifik farvning. 39

40 Tabel 20: Scoring for anti-s100 Optimal (O) 10X. Fikseret i 72 timer, niveau 1: En stærk særskilt kerne- og cytoplasmafarvning i de normale melanocytter og i de myoepiteliale celler i svedkirtlerne i huden. Ingen farvning i pladeepitelceller. En stærk særskilt kerne- og cytoplasmareaktion i fedtceller og makrofager. Good (G) 10X. Fikseret i 24 timer, niveau 3: En moderat farvning. Borderline (B) 10X. Fikseret i 6 timer, niveau 3: Svag til moderat farvning med evt. let og ubetydelig uspecifik farvning. Poor (P) 10X. Fikseret i 3 timer, niveau 3: Ingen til svag farvning med uspecifik farvning. 40

41 Tabel 21: Scoring for anti-vimentin Optimal (O) 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 1: En moderat til stærk farvning af cytoplasma i næsten alle endotelceller og fibroblaster. Good (G) 10X. Fikseret i 48 timer, niveau 3: En moderat farvning. Borderline Poor 41

42 Nedenfor ses en tabel over, hvilke scoringer af hver enkelt farvning til de forskellige fikseringstider. De rubrikker som er markeret med orange, betyder at de skiller sig ud fra resten af resultaterne. 72 timer 48 timer 24 timer 12 timer 6 timer 3 timer Anti-AE1/3 1 O O G G G 3 O negativ O O G/B B/G Anti-CD34 1 G G G/B B B 3 G B G G/B B B Anti-CD45 1 O O B/G G B 3 O G O G B B Anti-CK7 1 O O O G B 3 G O O O G B Anti-Ki-67 1 O O G O G 3 O G G G G G Anti-Mel-A 1 G O/G B B B 3 G G B B P B Anti-S100 1 O G G B B 3 O G G G B P Anti-Vimentin 1 O O G G G 3 O G G G G G Tabel 22: Viser hvordan IHC-farvningerne er scoret, ud fra konsensus blandt de projektansvarlige. O/G betyder, at farvningen er på grænsen mellem Optimal og Good, men med primær fokus på Optimal. G/B betyder at farvningen er på grænsen mellem Good og Borderline, men med primær fokus på Good. B/G betyder, at farvningen er på grænsen mellem Borderline og Good, men med primær fokus på Borderline. Ved antistoffarvning med AE1/3 som er fikseret i 48 timer og skåret fra niveau 2, er der ikke givet en score, da scanningen har givet et utydeligt billede af vævet. Rubrikker med orange farve, viser hvilke resultater der skiller sig ud fra de andre. 42

43 koncentration, ng/µl 72 timer 48 timer 24 timer 12 timer 6 timer 3 timer Anti-AE1/3 G G O O G B Anti-CD34 B O G O G G Anti-CD45 G O G G G G Anti-CK7 G B G G G B Anti-Ki-67 B G B O G B Anti-Mel-A O O B B B G Anti-S100 G O G O B B Anti-Vimentin O G O G G G Tabel 23: Viser hvordan IHC-farvningerne er scoret, foretaget af klinisk professor i patologi og overlæge dr. med. Torben Steiniche. Rubrikker med orange farve, viser hvilke resultater der skiller sig ud fra de andre. Fikseringstidens påvirkning på DNA-bevarelse Nedenfor ses resultaterne fra OD-måling, hvor der er målt koncentrationen på DNAet efter oprensning. OD-konc. ng/µl / Timer oprensning , ,5 oprensning , Tabel 24: Viser resultaterne for koncentrationen af DNA efter oprensning. På figur 8 ses en billedlig afbildning af de to oprensningers koncentrationer overfor hinanden. Fikseringstidens påvirkning af DNA-koncentration Timer Oprensning 1 Oprensning 2 Figur 8: Viser et billede af de to oprensningers koncentration af DNA overfor hinanden 43

44 Herunder ses et billede af gelen, som er resultatet af kapillærelektroforesen. Søjle 1 viser QX Size Marker, som afspejler størrelsen af DNA-fragmenterne, hvilket betyder, at der for hvert 50 basepar ses et fragmentbånd, således man kan aflæse DNA-fragmenternes størrelse. Søjle 2-13 viser vores oprensede og opformerede DNAs fragment-størrelser. Søjle 14 viser den positive kontrol, som bør indikerer at multiplex-pcr er forløbet korrekt. Søjle 15 viser den negative kontrol, som bør indikerer, at der ikke er sket kontamination under forberedelsen til multiplex-pcr, samt at multiplex-pcr er forløbet korrekt. Figur 9: Viser gelbillede efter udførelse af gelelektroforese. 1, 2, 3 angiver søjlenummer. S-M betyder Size Marker. 3.1, 3.2 angiver fikseringstid samt hvilken en af oprensningerne prøven tilhører. Pos. angiver den positive kontrol, Neg. angiver den negative kontrol. 44

45 Diskussion I de følgende afsnit vil jeg redegøre for fejlkilder og diskutere disse. Herefter vil jeg diskutere vores resultater for hver undersøgelse der er anvendt, dvs. HE-farvning, IHC-farvning og DNA-bevarelse. Jeg vil diskutere og resumere de scoringer af vævssnittene som projektgruppen har givet og sammenligne dem med de scoringer som klinisk professor i patologi og overlæge dr. med. Torben Steiniche har givet. I diskussionen af, hvilke antistoffer der kan anvendes ved kortere fikseringstid, vil jeg anvende de resultater som Torben Steiniche har givet, pga. hans kompetencer og erfaring indenfor patologien. Herefter vil jeg diskutere resultaterne ved sammenligning med standardfikseringstiden. Afslutningsvis vil jeg redegøre for metoden, som vi har anvendt og diskutere hvilken betydning denne har for udførelsen af forsøget. Fikseringstidens indflydelse på vævsmorfologi Farveresultater fra HE-farvningen fremgår af tabel 9, 10 og 11, mens scoringsresultater for HEfarvningen fremgår af tabel 12 og 13. I dette afsnit vil jeg diskutere projektgruppens resultater, herunder snittene fra niveau 1 vs. snittene fra niveau 3. Herefter diskuterer jeg Torben Steiniches resultater, herunder snittene fra niveau 1 vs. snittene fra niveau 3, samt Torben Steiniches resultater i forhold til standardfikseringstiden. Afslutningsvis vil jeg diskutere årsager til, at projektgruppen og Torben Steiniche ikke har givet de samme scorer. I tabel 12 ses projektgruppens scoringsresultater for HE-farvningen. Denne viser, at det vil være muligt at nedsætte fikseringstiden til 12 timer, da størstedelen af kernerne er velbevarede og cellelagene er velafgrænsede og bindevævet er tydeligt. Væv som er fikseret i 3 og 6 timer, har formentlig været udsat for koagulerende fiksativ, hvilket betyder at strukturerne i vævet ikke er bibeholdt (8) og derfor ikke har været velbevaret tilstrækkeligt til, at de kunne opnå en højere scoring. Dette kommer også til udtryk i forbindelse med scoringen, i forbindelse med forskellen på niveau 1 og niveau 3. Her ses det, at snittene der har fikseret i 3 timer ikke har opnået samme score, jf. tabel 12. Snittet fra niveau 1 har opnået borderline/optimal score, mens snittet fra niveau 3 har fået en poor score. Dette kan begrundes med, at fiksativet trænger ind i vævet ude fra og ind (4), hvorfor snittet fra niveau 3 derved ikke er fikseret så godt, som snittet fra niveau 1. Det samme gælder for snittene som er fikseret i 72 timer. Dette lyder dog ikke realistisk, da fiksativet har en indtrængningstid på 48 timer, når der anvendes 4 % NBF og temperaturen er 24 C (3). 45

46 I tabel 13 ses Torben Steiniches scoringsresultater for HE-farvingen. Denne viser, at det ikke er muligt at nedsætte fikseringstiden, men derimod sætte den op til 48 timer, hvis man ønsker et farveresultat, som skal have scoringen optimal. Denne vurdering vil dog ikke være oplagt at anvende, uden videre undersøgelse, da dette ikke vil være ideelt i forbindelse med kræftpakkeforløbene. Ved sammenligning af Torben Steiniches snit fra niveau 1 med snittene fra niveau 3, ses det ved fikseringstiderne 3 og 6 timer, at snittene fra niveau 3 har fået en højere score end snittene fra niveau 1, hvilket ikke er overensstemmende med teorien (3). Herfor vælger jeg at forkaste disse resultater, da de ikke er anvendelige til brug i konklusionen. Der ses ydermere en deviation fra standardfikseringstiden, ved snittene som er fikseret i 72 timer, da denne burde give en optimal scoring ifølge teorien (9). En vurdering af, hvorfor projektgruppen og Torben Steiniche ikke har formået at give de samme scoringer kunne være, at vi som studerende ikke havde erfaring i, at kigge på HE-farvninger og vævsmorfologi og projektgruppen kunne have givet højere scorer, fordi vi kendte til, hvilke snit der er fikseret til hvilke tider og hermed overvurderet snittene, fordi vi gerne ville se, at man kunne nedsætte fikseringstiden. I modsætning hertil, havde Torben Steiniche ikke haft oplysninger om, hvilke snit der var fikseret til hvilke tider og han havde derfor scoret objektivt, hvilket har givet et bedre grundlag for at give et ideelt resultat. Som følge af afvigelser i scoringerne, kunne disse komme af, at vi, i projektgruppen, scannede snittene ind på en computer og herefter udvalgte et lille område af vævet, for at vi kunne score på det samme område af vævet. Dette område har formentlig ikke været repræsentativt for hele vævssnittet og dermed har vi ikke givet en reel scoring af vævssnittet. Herimod havde Torben Steiniche vurderet og scoret snittene ved at kigge på dem i mikroskop og dermed haft mulighed for at kigge på hvert enkelte og hele snit. Det kunne forventes, at der ville være forskelligheder i HE-farvning, da ikke alle snittene var farvet, på samme apparatur. Man kunne dog stille spørgsmålstegn ved denne antagelse, da eosinkoncentrationen var den samme ved de to apparaturer (se bilag 3.1 og 3.2). En anden faktor, som kunne have indvirkning på HE-farvningens resultat er, antallet af minutter snittene er i de forskellige bade. Ved anvendelse af Histolab Products Combitec Slide Stainer 4009 er vævet i hvert bad i 4 minutter i modsætning til på Sakura Tissue Tek Prisma, hvor vævet er i hvert bad i 2 minutter (se bilag 3.1 og 3.2). På Histolab Products Combitec Slide Stainer 4009 anvendes vand til blåning af hæmatoxylin, mens der på Sakura Tissue Tek Prisma anvendes ammoniakopløsning (se bilag 3.1 og 46