ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay

Transkript

1 ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay Dansk /1 USA patent nr. 5,27,184; 5,547,861; 5,648,211; 5,712,124; 5,744,311; 5,846,726; 5,851,767; 5,866,336; 5,919,63; 5,928,869; 5,958,7; 6,54,279; 6,9,552; 6,117,635; 6,316,2; 6,656,68; 6,682,889; 6,743,582. TILSIGTET BRUG BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay (BD ProbeTec ET Chlamydiaceae familie (CF) forstærket DNA-analyse), til brug med BD ProbeTec ET System (BD ProbeTec ET systemet), anvender Strand Displacement Amplification (SDA) teknologi til direkte kvalitativ påvisning af DNA fra organismer tilhørende Chlamydiaceae familien (inklusive, men ikke begrænset til Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci). Analysen er indiceret til brug ved testning af svælgpodninger (med og uden transportmedium) fra patienter med kliniske tegn og symptomer og andre diagnostiske tegn på pneumoni. Analysen kan bruges som et hjælpemiddel ved tentativ diagnose af Chlamydiaceae familie-associeret pneumoni. RESUMÉ OG FORKLARING Chlamydophila pneumoniae forårsager cirka 5-15% af tilfælde MED samfundserhvervet pneumoni (CAP). 1 Mennesker er det eneste kendte reservoir. Transmission sker fra person til person via sekreter fra leftvejene og nær kontakt er normalt nødvendigt, 2 med en inkuberingsperiode på flere uger. Hoveddelen af tilfælde med pneumoni på grund af C. pneumoniae er henoldsvist milde og mortalitet er lav. Geninfektion er dog hyppig og forekommer almindeligvis blandt ældre patienter, som kræver hospitalsindlæggelse. Dyrkningsmetoder for C. pneumoniae er langsomme og yderst vanskelige at foretage, og bruges derfor ikke rutinemæssigt ved diagnose. Dyrkningsmetoder er dog vigtige ved dokumentation af organismernes levedygtighed og til at tilvejebringe prøver til følsomhedstestning. Mikroimmunofluorescens (MIF) testen for IgM og IgG antistoffer er den mest almindelige serologiske analyse anvendt til diagnsose, og den gør det muligt at skelne mellem primær infektion og geninfektion. Akut infektion defineres som en firefoldig stigning i IgG titer mellem akut sera og konvalescenssera eller en IgM titer 16. Tidligere eksponering angives med en IgG titer Brug af en enkelt forhøjet IgG titer ved diagnose frarådes. Serologisk diagnose er derfor kun nyttig som et retrospektivt epidemiologisk redskab i stedet for som patientbehandling. Vigtigheden af at etablere en diagnose for pneumoni og tilknyttet ætiologi forhøjes pga. øget bekymring om overbrug af antibiotika. Hurtige diagnostiske teknikker, som bruger nukleinsyre-forstærkning, kan være nyttige ved etablering af diagnose og derved muliggøre rettidig indgivelse af passende tilskrevet behandling. PROCEDURENS PRINCIPPER BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay er baseret på den samtidige amplifikation og påvisning af fokus-dna ved hjælp af amplifikationsprimere og en fluorescensmærket detektorprobe. SDAreagenserne tørres i to separate engangsmikrobrønde. Den bearbejdede prøve tilsættes primermikrobrønden, som indeholder amplifikationsprimere, fluorescensmærket detektorprobe og andre reagenser, som er nødvendige for amplifikation. Primerne er udformet til at forstærke et 63-base-par område i RNAse P genet tilhørende medlemmer af Chlamydiaceae familien, inklusive Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis og Chlamydophila psittaci. Efter inkubation overføres reaktionsblandingen til amplifikationsmikrobrønden, som indeholder to enzymer (en DNA polymerase og en restriktionsendonuklease), som er nødvendig for SDA. Amplifikationsmikrobrøndene forsegles for at forhindre kontaminering, og de inkuberes derefter i en varmekontrolleret fluorescensaflæser, som overvåger hver reaktion for dannelsen af forstærkede produkter. Hver reaktion sam-forstærker og påviser en intern amplifikationskontrol (Internal Amplification Control, IAC), hvis formål er at verificere, at de rigtige forhold eksisterer til amplifikation og at reducere muligheden for rapportering af et falsk negativt resultat på grund af tilstedeværelse af analysehæmmere. Tilstedeværelsen eller fraværet af Chlamydiaceae familie DNA bestemmes ved at beregne PAT (Passes After Threshold) scoringer for prøven baseret på forudbestemte tærskelværdier. Instrumentet rapporterer automatisk resultater som positive, negative eller inkonklusive. REAGENSER OG MATERIALER BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay reagenspakke indeholder: Chlamydiaceae familie (CF) primermikrobrønde, (1x24) 6 oligonukleotider 7,5pmol, dntp'er 15,2nmol, 2 detektorprober 22,5pmol, Syntetisk oligonukleotid 75 kopier Chlamydiaceae familie (CF) amplifikationsmikrobrønde, (1x24) Restriktionsenzym: 33 enheder, DNA polymerase 14 enheder 1 Primerlåg, 16 amplifikationsforseglere (1/2), 8 engangsposer BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (BD ProbeTec ET luftvejspræparat- og mediefortynder og kontrolkit) (CF/LP*/MP**): Indhold: Luftvejspræparat- og mediediluent: Bicin, kaliumphosphat, kaliumhydroxid, DMSO og Proclin; 1 (CF/LP/MP) positive kontroller: 15 ng laksesædvæske-dna, 47,3 µg Tris, 9, µg EDTA, 36 kopier CF plasmid, 48 kopier LP plasmid, 54 kopier MP plasmid; 1 (CF/LP/MP) negative kontroller: 15 ng laksesædvæske-dna, 47,3 µg Tris, 9, µg EDTA; 1 2-mL glas med trykhætte * Referer til BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) amplificeret DNA-analyse ** Refererer til BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) amplificeret DNA-analyse BD ProbeTec ET podepindsdiluent og kontrolkit (tcf/tmp)*: Indhold: Podepindsdiluent: Bicin, kaliumphosphat, kaliumhydroxid, DMSO og Proclin; 1 (tcf/tmp) positive kontroller: 175 ng laksesædvæske-dna, 78,8 µg Tris, 15, µg EDTA, 6 kopier CF plasmid, 8 kopier LP plasmid, 9 kopier MP plasmid; 1 (tcf/tmp) negative kontroller: 175 ng laksesædvæske-dna, 78,8 µg Tris, 15, µg EDTA * Designationen "t" refererer til reagenser, som udelukkende er udformet til brug med svælgpodning (uden transportmedium).

2 Instrumenter, udstyr og materialer: BD ProbeTec ET Instrument and Instrument Plate (BD ProbeTec ET instrument og instrumentplade), BD ProbeTec ET lysing Heater (BD ProbeTec ET lyseringsvarmeapparat), BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater (BD ProbeTec ET primer- og opvarmerapparat), BD ProbeTec ET Lysing Rack (BD ProbeTec ET lyseringsstativ), BD ProbeTec ET Pipettor, stand and Power Supply (BD ProbeTec ET pipettor, platform og strømforsyning), BD ProbeTec ET Accessories kit (BD ProbeTec ET tilbehørssæt), BD ProbeTec ET 2 ml and 4 ml Sample Tubes and Caps (BD ProbeTec ET 2 ml og 4 ml prøveglas og hætter), BD ProbeTec ET Pipette Tips (BD ProbeTec ET pipettespidser). Nødvendige materialer, der ikke er vedlagt: Klasse II biologisk sikkerhedsskab (biological safety cabinet, BSC), vortexmixer, -2 C og/eller -7 C (eller koldere) en ikke-selvafrimende fryser, mikrocentrifuge, der kan klare 16 x g, vandbade, digitalt termometer, vandbadstativ med låg, der kan skrues på, 2 ml prøveglasstativ og andre egnede prøveglasstativer, BBL CultureSwab EZ swabs (BBL CultureSwab EZ podepinde), engangshandsker, mikropipetter i stand til at overføre volumener på 2-1 µl, aerosol-resistente pipettespidser, destilleret vand, moleculaert biologisk vand, 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox.* * Opløs 7,5 g Alconox med 1 L af en 1 % (vol/vol) natriumhypochloritopløsning og bland. Klargør frisk blanding dagligt. Krav til opbevaring og håndtering: BD ProbeTec ET CF reagent pack (BD ProbeTec ET CF reagenspakke) kan opbevares ved 2-33 C. De uåbnede reagenspakker må ikke anvendes efter udløbsdatoen. Så snart en pose er åbnet, er mikrobrøndene stabile i 12 uger, hvis de genlukkes korrekt, eller indtil udløbsdatoen, alt efter hvad der kommer først. Må ikke fryses. BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF/LP/MP) kan opbevares ved 2-33 C. Reagenserne må ikke anvendes efter udløbsdatoen. Må ikke fryses. BD ProbeTec ET Swab Diluent and Control Kit (tcf/tmp) kan opbevares ved 2-33 C. Reagenserne må ikke anvendes efter udløbsdatoen. Må ikke fryses. Advarsler og forholdsregler Til in vitro diagnostik. 1. Patogene mikroorganismer, herunder hepatitisvira og humant immundefekt virus, kan forekomme i kliniske prøver. "Standardforholdsregler" 4-7 og institutionelle retningslinier skal overholdes ved håndtering af alle emner, der er kontamineret med blod og andre legemsvæsker. 2. BD ProbeTec ET Swab Diluent og Respiratory og Media Diluent indeholder dimethylsulfoxid (DMSO). DMSO er skadelig ved indånding, ved hudkontakt eller ved indtagelse. Undgå kontakt med hud og øjne og brug altid handsker ved håndtering. Kommer stof i øjnene, skylles straks grundigt med vand og læge kontaktes. Kommer stof på huden, vaskes straks med store mængder vand. 3. Selv om specielle arbejdsområder ikke kræves, fordi BD ProbeTec ET designet nedsætter muligheden for kontaminering med forstærket DNA-fragment i testmiljøet, er andre forholdsregler til kontrol af kontaminering nødvendige, især for at undgå kontaminering af præparater under bearbejdning. 4. Reagensposer indeholdende ubrugte primermikrobrønde og amplifikationsmikrobrønde SKAL lukkes omhyggeligt igen efter åbning. Bekræft, at der findes et tørremiddel, inden reagensposerne lukkes. 5. Pladen indeholdende amplifikationsmikrobrønde SKAL være korrekt lukket med amplifikationsforsegleren, inden pladen flyttes fra BD ProbeTec ET primer- og opvarmerapparat til BD ProbeTec ET instrumentet. Forsegling sikrer en lukket reaktion til amplifikation og påvisning og er nødvendig for at undgå kontaminering med amplifikationsprodukter af instrumentet og arbejdsområdet. Forseglingsmaterialet må ikke på noget tidspunkt fjernes fra mikrobrønde. 6. Primermikrobrønde med residualvæske (efter overførsel af væske fra primermikrobrønde til amplifikationsmikrobrønde) udgør en kilde til kontaminering af fokus. Forsegl omhyggeligt primermikrobrønde med en pladeforsegler inden bortskaffelse. 7. For at forhindre kontaminering af arbejdsmiljøet med amplifikationsprodukter bruges engangsposerne, der følger med reagenspakkerne, til at kassere testede amplifikationsmikrobrønde. Sørg for, at poserne er korrekt lukket inden bortskaffelse. 8. SKIFT HANDSKER ved specificerede trin under bearbejdning af prøver og analyseproceduren for at undgå krydskontaminering af præparater. Hvis handsker får kontakt med præparater, skiftes handskerne straks for at undgå at kontaminere andre præparater. 9. I tilfælde af, at arbejdsområdet eller udstyret kontamineres med prøver eller kontroller, rengøres det kontaminerede område grundigt med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox, og der skylles grundigt med vand. Lad overfladen tørre fuldstændigt, inden De fortsætter med yderligere testning. 1. Brug kun BD ProbeTec ET pipettor og BD ProbeTec ET pipettespidser til overførsel af bearbejdede prøver til primermikrobrønde og overførsel af prøver fra primermikrobrøndene til amplifikationsmikrobrøndene. 11. Anvend fastlagt laboratoriepraksis ved bortskaffelse af brugte pipettespidser, prøveglas, primermikrobrønde og andre engangsartikler. Bortskaf engangsartikler omhyggeligt. Forsegl og kassér affaldsbeholdere, når de er ¾ fyldte eller dagligt (alt efter hvad der kommer først). 12. Mikrobrønde, kontroller eller bearbejdningsreagenser fra kits med forskellige lotnumre må ikke ombyttes eller blandes. 13. Kontakt Teknisk service i tilfælde af en usædvanlig situation, som for eksempel, hvis der spildes ned i BD ProbeTec ET instrumentet, eller kontaminering med DNA, som ikke kan fjernes ved hjælp af rengøring. PODNING OG TRANSPORT 1. Prøvetagning Præparater skal opsamles som anbefalet i Clinical Microbiology Procedures Handbook 8 (håndbogen om kliniske mikrobiologiprocedurer) eller Deres laboratoriemanual. BBL CultureSwab EZ (BD kat. nr 22144) bør anvendes til indsamling af svælgpodninger opbevaret uden transmedium. 2. Prøveopbevaring og -transport Svælgpodninger (uden transportmedium): Præparater kan opbevares/transporteres ved C i højst 2 dage. Præparater kan opbevares i køleskab ved 2-8 C i højst 3 dage. Præparater kan placeres ved -2 C eller derunder til opbevaring i højst 14 uger. Svælgpodninger i 2SP medium: 8 Præparater skal nedkøles ved 2-8ºC øjeblikkeligt. Transportér på vådis eller kølepakker, hvis transportiden er længere end få minutter. Præparater skal opbevares ved 2-8 C i højst 2 dage. Præparater, som kræver længere opbevaringsperioder, skal opbevares ved -7ºC. 2

3 TESTPROCEDURE Der henvises til brugermanualen til BD ProbeTec ET systemet for specifikke instruktioner i betjening og vedligeholdelse af komponenterne i systemet. A. Klargøring af instrument: 1. Der skal være tændt for strømmen til instrumentet, og det skal have tid til at varme op, inden analysen påbegyndes. a. Lyseringsvarmeapparatet og primer- og opvarmerapparat kræver ca. 9 min til opvarmning og stabilisering. Indstillingspunktet til lyseringsvarmeapparatet er 114 C. Indstillingspunktet for primerkomponenten i primer- og opvarmerapparatet er 72,5 C. Indstillingspunktet for opvarmerkomponenten i primer- og opvarmerapparatet er 54 C. b. BD ProbeTec ET instrumentet er softwarestyret og kræver ca. 3 min til opvarmning. 2. Varmeapparatets temperaturer skal kontrolleres inden analysen påbegyndes. Notér temperaturerne på BD ProbeTec ET System Maintenance Log (BD ProbeTec ET systemets vedligeholdelsesjournal). a. Lyseringsvarmeapparat Fjern plasticlåget og lad temperaturen komme i ligevægt i 15 min. Termometret skal vise mellem C. b. Primer- og opvarmerapparat Termometret i primervarmerapparatet skal vise mellem C. Termometret i opvarmerapparatet skal vise mellem 53,5-54,5 C. 3. Kontrollér temperaturen, der vises på BD ProbeTec ET skærmbilledet. Temperaturen skal læse mellem C. Notér temperaturerne på BD ProbeTec ET System Maintenance Log. B. Pipettor: Der henvises til brugermanualen til BD ProbeTec ET systemet for en detaljeret forklaring på tastaturfunktionerne i BD ProbeTec ET Pipettoren. Desuden skal BD ProbeTec ET pipettoren rengøres efter hver brug. Der henvises til repræsentanten fra Teknisk service for vejledning om korrekt rengøring og vedligeholdelse af BD ProbeTec ET pipettoren. Følgende programmer er påkrævet til udførelse af BD ProbeTec ET CF Assay (BD ProbeTec ET CF analysen). Program 1 overfører væske fra de bearbejdede prøver til CF primermikrobrøndene. Program 5 overfører væske fra CF primermikrobrøndene til CF amplifikationsmikrobrøndene. Programmér pipettoren som følger: Program 1: 1. TÆND for pipettoren. Pipettoren vil bippe en gang, blinke "ZERO,"(nul), blinke softwareversionsnummer og bippe en gang til. 2. Tryk på den blå "Prog" (Program) tast. Tryk på "Vol" (Volumen) tasten, indtil "1" vises for at vælge Program 1. Tryk på "Enter". 3. Tryk på "Prog" (Program) tasten for at gå i programmeringsmodus. Mens De trykker på "Prog" (Program) tasten, trykker De samtidigt på specialfunktionstasten med en pipettespids eller enden af en papirclips. 4. Tryk på "Fill" (Fyld). Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 2. Tryk på "Enter". 5. Tryk på "Disp" (Dispensér). Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 15. Tryk på "Enter". 6. Tryk på "Enter" endnu en gang for at gemme programmet og afslutte. De skulle høre et "bip," der angiver, at programmeringen er færdig. 7. Bekræft programmet ved at trykke på udløseren for at gå frem gennem hvert punkt. Efterhånden som De går gennem hvert punkt, indstiller De hastigheden på fyld/dispensér med "Vol" (Volumen) tasten. Hastighedsindikatoren fremkommer ved hvert punkt. Brug "Vol" (Volumen) tasten til at justere hastighedsindikatoren til at vise 2 firkanter for "Fill" (Fyld) og "Disp" (Dispensér) punkterne. Program 5 1. Tryk på "Prog" (Program) tasten. Tryk på "Vol" (Volumen) tasten, indtil "5" vises for at vælge Program 5. Tryk på "Enter". 2. Tryk på "Prog" (Program) tasten og hold den nede for at gå i programmeringsmodus. Mens De trykker på "Prog" (Program) tasten, trykker De samtidigt på specialfunktionstasten med en pipettespids eller enden af en papirclips. 3. Tryk på "Fill" (Fyld). Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 1. Tryk på "Enter". 4. Tryk på "Disp" (Dispensér). Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 1. Tryk på "Enter". 5. Tryk på "Mix" (Bland). Tryk på pil-op-tasten, indtil der står 5. Tryk på "Enter". 6. Tryk på "Enter" endnu en gang for at gemme programmet og afslutte. De skulle høre et "bip," der angiver, at programmeringen er færdig. 7. Bekræft programmet ved at trykke på udløseren for at gå frem gennem hvert punkt. Efterhånden som De går gennem hvert punkt, indstiller De hastigheden på fyld/dispensér/bland med "Vol" (Volumen) tasten. Hastighedsindikatoren fremkommer ved hvert punkt. Brug "Vol" (Volumen) tasten til at justere hastighedsindikatoren til at vise 2 firkanter for funktionerne fyld og dispensér. Brug "Vol" (Volumen) tasten til at justere hastigheden for blandingen, så den viser 3 firkanter. Programgennemgang Programmerne skal gennemgås, inden proceduren påbegyndes. Sæt pipettoren til TÆNDT for at gennemgå programmet. Tryk på den blå "Prog" (Program) tast. Tryk på "Vol" (Volumen) tasten, indtil det rette programnummer (1 eller 5) vises. Tryk på "Enter" tasten. Brug pipetteringsudløseren for at gå frem punkt for punkt gennem programmet. Program 1: Dette program aspirerer 2 µl; dispenserer 15 µl i CF mikrobrønden. Pipettorens display skal vise som følger: Fill 2 µl SII (Fyld 2 µl SII ) Dispense 15 µl SII (Dispensér 15 µl SII ) Program 5: Dette program aspirerer 1 µl; dispenserer 1 µl, og blander 5 µl tre gange. Pipettorens display skal vise som følger: Fill 1 µl SII (Fyld 1 µl SII ) Dispense 1 µl SII (Dispensér 1 µl SII ) Mix 5 µl SIII (Bland 5 µl SIII ) Zero (nul) (blinker skiftevis) 3

4 C. Pladelayout: Pladelayoutrapporten genereres fra BD ProbeTec ET instrumentet efter analysetype, præparatidentifikation, kontrollotnumre, og kitlotnumre logges ind i systemet. Pladelayoutrapporten viser den fysiske layout af præparater og kontroller for hver plade, der skal testes. Denne orientering bruges til både primermikrobrøndpladen og amplifikationsmikrobrøndpladen. For CF analysen er primermikrobrøndene helt lyseblå mikrobrøndstrimler. Amplifikationsmikrobrøndene er lyseblå mikrobrøndstrimler med striber. D. Svælgpodning (uden transportmedium) præparatbearbejdning: NOTER: Lad BD ProbeTec ET Swab Diluent (tcf/tmp) opnå stuetemperatur og bland forsigtigt ved at vende den op og ned inden brug. Afmål den nødvendige mængde BD ProbeTec ET Swab Diluent (tcf/tmp) ned i en ren beholder. Den nødvendige mængde bestemmes ved at bruge 1 ml for hvert præparat og tilsætte yderligere 1-2 ml, så det er let at pipettere. Undgå kontaminering af fortynderen - hæld ikke tiloversbleven fortynder tilbage i flasken. 1. Sæt mærkat på et 4 ml prøveglas for hver podepind, der skal bearbejdes. 2. Lad præparaterne nå stuetemperatur. 3. Pipettér 1 ml Swab Diluent (tcf/tmp) i hvert prøveglas. 4. Indsæt podepinden. Bland ved at vortexe podepinden i fortynderen i 5-1 s. 5. Tryk podepinden af langs indersiden på glasset, således at væsken løber tilbage til bunden af glasset. 6. Fjern podepinden forsigtigt for at undgå at stænke. BEMÆRK: Små dråber kan kontaminere arbejdsområdet. 7. Sæt podepinden tilbage i transportglasset og kassér det. 8. Sæt hætten godt fast på glasset. 9. Vortex glasset i 5 s. 1. Gentag punkt 3-9 for yderligere svælgpodninger. 11. Præparér kontrollerne. Se Præparering af svælgpodningskontroller (Afsnit F). 12. Anbring ved hjælp af pladelayoutrapporten prøver og kontroller i rækkefølge i lyseringsstativet. 13. Lås prøverne på plads i BD ProbeTec ET Lysing Rack. 14. Sæt lyseringsstativet i BD ProbeTec ET Lysing Heater. 15. Opvarm prøverne i 1 min. 16. Fjern efter 1 min BD ProbeTec ET Lysing Rack fra BD ProbeTec ET lyseringsvarmeapparatet og lad det køle ned i mindst 15 min. Bank stative let på et bord for at samle så meget kondensat som muligt i bunden af glasset. BEMÆRK: Efter lysering af prøver: a. De kan opbevares ved C i op til 6 h og kan testes uden relysering. b. De kan opbevares op til 3 dage ved 2-8 C. Prøver skal vortexes og relyseres inden testning. c. De kan opbevares i op til 14 uger ved -2 ºC. Prøver skal optøs ved stuetemperatur, vortexes og relyseres inden testning. 17. Præparaterne er klar til Testningsprocedure for BD ProbeTec ET CF Assay (BD ProbeTec ET CF analysen) (Afsnit G). E. Svælgpodning (2SP medium) præparatbearbejdning Procedurerelaterede bemærkninger: Skift pipettespidser mellem alle væskeoverførsler. Det anbefales at bruge spidser med aerosolbarriere. Lad BD ProbeTec ET luftvejspræparat- og mediefortynder (CF/LP/MP) opnå stuetemperatur og bland forsigtigt ved at vende den op og ned inden brug. Afmål den nødvendige mængde BD ProbeTec ET Respiratory and Media Sample Diluent (CF/LP/MP) over i en ren beholder. Den nødvendige mængde bestemmes ved at bruge,4 ml for hvert præparat og tilsætte yderligere 1-2 ml, så det er let at pipettere. Undgå kontaminering af fortynderen - hæld ikke tiloversbleven fortynder tilbage i flasken. 1. Lad præparaterne nå stuetemperatur. 2. Mærk et 2 ml glas med skruelåg for hvert præparat, der skal testes. 3. Overfør 4 µl luftvejspræparat- og mediefortynder (CF/LP/MP) til hvert glas med skruehætte. Følgende trin 4-6 skal udføres i et biologisk sikkerhedsskab (BSC): 4. Vortex præparaterne i 5-15 s for at blande grundigt. 5. Pipettér 2 µl af prøven over i det mærkede glas. BEMÆRK: Hvis præparatvolumen er mindre end 2 µl (prøven skal være mindst 1 µl), bringes volumen til 2 µl ved brug af molekulært, biologisk vand. 6. Skift handsker efter tilsætning af præparater. BEMÆRK: Fyld et vandbad med destilleret vand og bring badet i kog, inden der fortsættes til trin Vortex i 5 s. 8. Præparér kontrollerne. Se Præparering af 2SP mediekontrol (Afsnit F). 9. Overfør præparater og kontroller til et vandbadstativ. 1. Anbring vandbadstativet i det kogende vandbad i 1 min. 11. Når de 1 min er gået, tages vandbadstativet op og glassene får lov at afkøle ved stuetemperatur i mindst 15 min. ADVARSEL: Vær forsigtig med at undgå forbrændinger fra det kogende vand, vandbadstativet eller overfladen af vandbadet, der kan være meget varme. 12. Efter afkøling centrifugeres (16 x g) i ca. 5 s. BEMÆRK: Efter kogning af prøver: De kan opbevares ved C i op til 6 h og kan testes uden at koges igen. De kan opbevares op til 3 dage ved 2-8 C. Prøver skal vortexes og relyseres inden testning. De kan opbevares i op til 14 uger ved -2ºC. Prøver skal optøs ved stuetemperatur, vortexes og koges igen inden testning. 4

5 13. Præparaterne er klar til Testningsprocedure for BD ProbeTec ET CF Assay (BD ProbeTec ET CF analysen) (Afsnit G). F. Kontrolpræparation: Præparation af svælgpodningskontrol 1. For hver kørsel (plade), der skal testes, klargøres et negativt kontrolglas (tcf/tmp) og et positivt kontrolglas (tcf/tmp). Hvis en plade indeholder mere end et reagenspakke-lotnummer, skal kontroller testes med hvert lot. 2. Tag hætten af det negative kontrolglas (tcf/tmp). 3. Brug en ny pipettespids og tilsæt 1 ml podningsfortynder. 4. Sæt hætten godt fast på glasset. 5. Tag hætten af det positive kontrolglas (tcf/tmp). 6. Brug en ny pipettespids og tilsæt 1 ml podningsfortynder. 7. Sæt hætten godt fast på glasset. 8. Vortex kontrolglassene i 5 s. 9. Kontrolglassene er klar til at blive lyseret. Se Bearbejdning af præparater fra de nedre luftveje (Afsnit D). Præparation af 2SP mediekontrol: 1. For hver kørsel (plade), der skal testes, klargøres et negativt kontrolglas (CF/LP/MP) og et positivt kontrolglas (CF/LP/MP). Hvis en plade indeholder mere end et reagenspakke-lotnummer, skal kontroller testes med hvert lot. 2. Vend forsigtigt luftvejspræparat- og mediefortynder op og ned inden brug. 3. Tag hætten af det negative kontrolglas (CF/LP/MP). 4. Med en ny pipettespids for hvert kontrolglas tilsættes 2 µl molekulært, biologisk vand. 5. Med en ny pipettespids for hvert kontrolglas tilsættes 4 µl luftvejspræparat- og mediefortynder. 6. Sæt hætten godt fast på glasset. 7. Tag hætten af det positive kontrolglas (CF/LP/MP). 8. Med en ny pipettespids for hvert kontrolglas tilsættes 2 µl molekulært, biologisk vand. 9. Med en ny pipettespids for hvert kontrolglas tilsættes 4 µl luftvejspræparat- og mediefortynder. 1. Sæt hætten godt fast på glasset. 11. Vortex kontrolglassene 5 s. 12. Kontrollerne er klar til at blive kogt. Se Bearbejdning af 2SP mediepræparat (Afsnit E). G. Testningsprocedure for BD ProbeTec ET CF assay: BEMÆRK: Inden udførelse af testningsproceduren arrangeres de bearbejdede præparater og kontroller i et stativ, der kan håndtere 2 ml eller 4 ml prøveglas, som fx BD ProbeTec ET 2 ml Sample Tube Rack eller BD ProbeTec ET Lysing Rack, som begge er kompatible med BD ProbeTec ET Pipettor. 1. Fjern og bortskaf hætterne fra de afkølede præparater og kontroller. 2. SKIFT HANDSKER, inden De fortsætter for at undgå kontaminering. 3. Klargør primermikrobrøndpladen ved hjælp af pladelayoutrapporten - se Pladelayout (Afsnit C). 4. Forsegl mikrobrøndposerne igen som følger: a. Anbring posen på en plan flade. Hold den åbne ende fladt med den ene hånd. b. Med påføring af tryk køres fingeren hen over ydersiden af forseglingen fra den ene kant af posen til den anden. c. Se efter for at sikre, at posen er forseglet. 5. Vælg Program 1 på BD ProbeTec ET pipettoren. 6. Saml pipettespidserne op. Udvid BD ProbeTec ET pipettoren ved at trække afstandsknappen helt ud. BEMÆRK: Sørg for, at spidserne er sat forsvarligt på pipettoren, så lækage undgås. 7. Aspirér 2 µl fra den første kolonne af prøver. 8. Pres forsigtigt pipettoren sammen, lad pipettespidser berøre siderne af brøndene og dispensér 15 µl i den tilsvarende kolonne af primermikrobrønde (1 A-H). BEMÆRK: Pipettoren må ikke presses sammen over prøver eller mikrobrønde, da dette kan give kontaminering. Pludselige bevægelser kan give dråber eller aerosoler. 9. Kassér spidserne. Tryk ned på pipetteringsudløseren for at nulstille pipettoren. BEMÆRK: Kassér spidserne forsigtigt for at undgå små dråber eller aerosoler, hvilket kan kontaminere arbejdsområdet. 1. Saml nye spidser op, udvid pipettoren og aspirér 2 µl fra den anden kolonne af prøver. 11. Pres forsigtigt pipettoren sammen, lad pipettespidser berøre siderne af brøndene og dispensér 15 µl i den tilsvarende kolonne af primermikrobrønde (2 A-H). 12. Kassér spidserne. 13. Fortsæt med at overføre de resterende prøver til kørslen. 14. Dæk primermikrobrøndpladen med primerlåget og lad pladen inkubere ved stuetemperatur i mindst 2 min. (Kan inkubere op til 6 h). BEMÆRK: Sæt nye hætter på de bearbejdede prøver. SKIFT HANDSKER. 15. Når inkubationen af primeren er færdig, klargøres amplifikationsmikrobrøndpladen. Konfigurér amplifikationsmikrobrønden i en plade, der matcher pladelayoutrapporten (samme som primerpladen). Forsegl mikrobrøndposerne igen som beskrevet i punkt Tag låget af primermikrobrøndpladen og overfør pladen til primervarmeapparatet. Anbring STRAKS amplifikationsbrøndpladen i opvarmerapparatet for at forvarme. 17. Indstil uret til 1 min. (BEMÆRK: Korrekt tid er vigtig for dette punkt.) 18. Ved afslutningen af de 1 min (± 1 min) inkubation vælges Program 5 på pipettoren. 19. Saml pipettespidser op og overfør 1 µl fra kolonne 1 i primermikrobrøndenpladen til kolonne 1 i amplifikationsmikrobrøndpladen. Lad pipettespidserne berøre siderne af brøndene og dispensér væsken. Lad efter dispenseringen pipettoren blande væsken i brøndene automatisk. Løft forsigtigt pipettoren væk fra pladen. Undgå berøring af andre brønde. 5

6 2. Kassér spidserne. Saml nye spidser op og fortsæt med at overføre reaktionsblandingen fra primermikrobrøndene til amplifikationsmikrobrøndene, kolonne efter kolonne, idet der bruges nye spidser for hver kolonne. 21. Når den sidste kolonne er blevet overført, fjernes bagbeklædningen fra en amplifikationsforsegler (En amplifikationsforsegler (1/2) vil dække op til 6 kolonner. Hvis pladen overstiger 6 kolonner, SKAL et helt forseglerark bruges). Hold forsegleren i kanterne og læg den over mikrobrøndene. Brug retningslinierne på opvarmerapparatet for at hjælpe Dem med at lægge forsegleren over. Tryk nedad på forsegleren for at sikre, at alle mikrobrønde er fuldstændig forseglet. 22. Ved BD ProbeTec ET betjeningspanelen flyttes bæreren ud og døren åbnes og pladelåget løftes. Overfør STRAKS (inden for 3 s) den forseglede amplifikationsmikrobrøndplade til BD ProbeTec ET instrumentet og start kørslen. (Der henvises til brugermanualen til BD ProbeTec ET systemet for detaljerede instruktioner.) 23. Når kørslen er startet, fortsættes med følgende del af rengøringsproceduren: a. Forsegl primermikrobrøndene med amplifikationsforsegleren og fjern pladen fra primer- og opvarmerapparatet. ADVARSEL: Temperaturen er over 7 C - Brug den varmebestandige handske til at fjerne pladen. b. Lad pladen afkøle på bordet i 5 min. c. Fjern de forseglede primermikrobrønde fra pladen ved at holde fat i begge sider af forsegleren og løfte brøndene lige op som en enhed. Anbring de forseglede mikrobrønde i en engangspose og forsegl. d. Rengør metalpladen: Skyl pladen med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit - Alconox opløsning. Skyl pladen med vand. Pak pladen ind i et rent papirhåndklæde og lad den tørre, inden den tages i brug igen. 24. Når kørslen er færdig, vil der genereres en udskrift af testresultaterne. 25. Flyt pladebæreren ud af platformen, åbn døren og fjern pladen. Luk døren og sæt pladeplatformen tilbage ind i instrumentet. 26. Fjern de forseglede amplifikationsmikrobrønde fra pladen. FORSIGTIG: Forseglingsmaterialet må ikke fjernes fra mikrobrøndene. De forseglede mikrobrønde kan let fjernes som en enhed ved at holde fat i top og bund af forsegleren og løfte lige op og ud af pladen. Anbring de forseglede mikrobrønde i engangsposen. Forsegl posen. 27. Rengør metalpladen: Skyl pladen med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit - Alconox opløsning. Skyl pladen med vand. Pak pladen ind i et rent papirhåndklæde og lad den tørre, inden den tages i brug igen. 28. Ved dagens sidste kørsel udføres følgende rengøringsprocedurer: a. Gennemvæd papirhåndklæder eller gazestykker med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox opløsning og påfør det på bordflader og på de udvendige flader af lyseringsvarmeapparetet, primer- og opvarmerapparatet, prøveglasstativet, vandbadet, centrifuge og BD ProbeTec ET instrument. Lad opløsningen sidde på overfladerne i 2-3 min. Gennemvæd papirhåndklæder eller gazestykker med vand og aftør rengøringsopløsningen. Skift håndklæder eller gaze hyppigt, når der påføres rengøringsopløsning og skylles med vand. Fugt papirhåndklæder eller gazestykker med 1 % (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox og aftør pipettorens håndtag (KUN HÅNDTAGET). Efter 2-3 min aftørres håndtaget med papirhåndklæder eller gazestykker fugtet med vand. b. Læg lyseringsstativet, sokkel til lyseringsstativ og låg til lyseringsstativ og plader i blød eller vandbadets stativ i 1% (vol/vol) natriumhypochlorit med Alconox i 1-2 min. Skyl grundigt med vand og lad det lufttørre. c. Genoplad pipettoren. d. Bortskaf den forseglede engangspose og biofareposen i overensstemmelse med fastlagte procedurer for bortskaffelse af kontamineret affaldsmateriale. 29. Udfør de følgende procedurer mindst én gang om ugen: a. Bortskaf vandet i vandbadene. b. Rengør vandbadene med 1 % (v/v) natriumhypochlorit med Alconox. Skyl grundigt med vand og lad dem lufttørre. c. Fyld op med destilleret vand. Kvalitetskontrol Krav til kvalitetskontrol skal udføres i overensstemmelse med gældende lokale, statslige og/eller nationale krav eller akkrediteringskrav og Deres laboratoriums standardkvalitetskontrolprocedurer. Det anbefales at læse de relevante CLSI (tidligere NCCLS)-retningslinjer og CLIA-regulativer mht. passende kvalitetskontrolprocedurer. Podningsfortynder og kontroller leveres sammen i podningsfortynder og kontrolkittet (tcf/tmp). Luftvejspræparatog mediefortynder og kontroller leveres sammen i Luftvejspræparat- og mediefortynder og kontrolkit (CF/LP/MP). En positiv og en negativ kontrol skal inkluderes for hver præparattype og analysekørsel på en plade og for hvert nyt reagenskit-lotnummer. Kontroller kan placeres tilfældigt. Den positive kontrol overvåger for væsentlige reagensfejl. Den negative kontrol overvåger for reagens- og/eller miljømæssig kontaminering. Den positive og negative kontrol skal teste som henholdsvis positiv og negativ for at rapportere prøveresultater. Hvis kontrollerne ikke præsterer som forventet, betragtes analysekørslen som ugyldig og instrumentet vil ikke rapportere patientresultater. Hvis kørselskontrollerne ikke giver de forventede resultater, gentages hele kørslen med et nyt sæt kontroller, nye mikrobrønde og de bearbejdede præparater. Hvis der ikke er nok af bearbejdet præparat for en gentagen test, genbearbejdes en anden afmåling af det primære præparat. Hvis de gentagede kontroller ikke giver de forventede resultater, kontaktes Teknisk service (se "Tolkning af resultater"). En intern amplifikationskontrol (IAC) er tørret i primermikrobrønden. IAC indeholder nukleinsyrefokus, som forstærkes ved tilstedeværelsen af prøvematricen. IAC er designet for at bekræfte gyldigheden af amplifikationsreaktionen og for at identificere potentiel hæmning fra det bearbejdede præparat. Præparatbearbejdningskontroller Præparatbearbejdningskontroller kan testes i overensstemmelse med kravene fra relevante akkrediteringsorganisationer. Positive og negative kontroller bør teste hele analysesystemet. Til dette formål kan kendte positive præparater tjene som kontroller ved at blive bearbejdet og testet sammen med ukendte præparater. Præparater, der bruges som bearbejdningskontroller, kan lagres, bearbejdes og testes i henhold til produktindlægssedlen. Positive og negative kontroller er udformet til at kontrollere for effektiviteten af præparatbearbejdningsprocedurerne, når svælgpodninger testes (enten med eller uden transportmedium; podningskontrol og luftvejspræparat- og mediekontroller, henholdsvist), da kontrollerne bearbejdes på samme måde som selve præparaterne. 6

7 Overvågning af tilstedeværelsen af kontaminering med DNA Mindst en gang om måneden bør følgende testprocedurer udføres for at overvåge arbejdsområdet og udstyrsflader for tilstedeværelse af kontaminering med DNA. Overvågning af miljøet er væsentligt for at påvise kontaminering, inden der opstår et problem. 1. For hvert område*, der skal testes, bruges en BBL CultureSwab EZ swab. 2. Mærk et prøveglas for hvert område, som skal podes, og pipettér 1 ml podningsfortynder (tcf/tmp) over i hvert glas. 3. Dyp den første podepind i fortynderen, og aftør det første område med en bred, fejende bevægelse. 4. Bland podepinden i fortynderen, tryk podepinden af, sæt hætten tilbage på glasset og vortex i 5 s. Kassér podepindene. 5. Gentag for hvert podet område. 6. Anbring glassene i lyseringsstativet og opvarm i lyseringsvarmeapparatet i 1 min. Fjern stativet fra varmeapparatet og lad prøverne køle ned i 15 min, inden der fortsættes. 7. Mens glassene varmes op, bruges rene håndklæder vædet med vand til at fjerne rester af bufferblandingen fra de podede overflader. 8. Når prøverne er afkølet, fortsættes med Testningsprocedure for BD ProbeTec ET CF analysen (Afsnit G). *Anbefalede områder, der skal testes, omfatter: Overflader på lyseringsstativet, lyseringsvarmeapparatet, vandbadstativet, mikrocentrifugen, primer- og opvarmerapparatet, sorte mikrobrøndplader, pipettorhåndtaget, instrumentets berøringstaster, instrumentets tastatur, de tørre overflader på vandbadene, overfladerne på prøvestativerne og arbejdsbordene, herunder områder hvor prøver bearbejdes. Hvis et område giver et positivt resultat, rengøres området med frisk 1 % (v/v) natriumhypochlorit med Alconox. Sørg for, at hele området er vædet med rengøringsopløsningen og lad rengøringsopløsningen få lov at blive på fladen i mindst 2 min, eller indtil tørhed opnås. Fjern overskydende rengøringsopløsning med et rent håndklæde, hvis det er nødvendigt. Aftør området med et rent håndklæde vædet med vand og lad fladen tørre. Test området igen. Gentag, indtil der foreligger negative resultater. Hvis der bliver ved med at være kontaminering, kontaktes Teknisk service for yderligere information. TOLKNING AF TESTRESULTATER Tilstedeværelsen eller fraværet af Chlamydiaceae familie DNA bestemmes ved at beregne PAT (Passes After Threshold) scoringer for prøven baseret på forudbestemte tærskelværdier. PAT scoren er en metrik, der anvendes til at vurdere signalstørrelsen som et resultat af reaktionen. Ved denne metrik indikerer store tal, at tærsklen blev nået i de tidlige faser af amplifikation, mens små tal betyder, at tærsklen blev nået senere i reaktionsforløbet. PAT scoringens størrelse antyder ikke niveauet af Chlamydiaceae familie DNA i præparatet. Hvis analysekontrolresultater ikke er som forventet, skal patientresultaterne ikke rapporteres. Se afsnittet Kvalitetskontrol for forventede kontrolværdier. Rapporterede resultater bestemmes som følger: PAT Score CF fokus IAC fokus Resultat Tolkning Rapport > > eller = Positiv Chlamydiaceae familie DNA påvist ved SDA. Positiv for organismer Chlamydiaceae familien, antydende aktuel infektion. Yderligere testning nødvendig for at identificere de påviste typer. = > Negativ Chlamydiaceae familie DNA ikke påvist ved SDA. Formodet negativ for organismer Chlamydiaceae familien. Infektion på grund af Chlamydiaceae familien kan ikke udelukkes, da niveauet af tilstedeværende DNA kan være under testens påvisningsgrænse. = = Inkonklusivt Amplifikationskontrol inhiberet. Yderligere testning nødvendig for tolkning af resultat. a a Gentag BD ProbeTec ET CF Assay fra det bearbejde prøveglas. Hvis der ikke er tilstrækkelig volumen tilbage fra den bearbejdede prøve, gentages fra det oprindelige præparat eller anmod om et nyt præparat, hvis det er nødvendigt. Hvis resultatet fra gentagelsen er positivt eller negativ, tolkes som beskrevet ovenfor. Hvis resultatet gentager som inkonklusivt, bør der anmodes om et nyt præparat. Bestemmelse af CF og IAC tærskel: Tærskelværdierne for Chlamydiaceae familie DNA og IAC blev initialt fastlagt ved hjælp af Receiver Operator Characteristic kurveanalyse af data opnået fra positive og negative kontroller. Disse tærskelværdier blev bekræftet og valideret i kliniske undersøgelser. PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER 1. BD ProbeTec ET CF Assay er specifik for, men skelner ikke mellem medlemmerne af Chlamydiaceae familien (dvs. C. trachomatis, C. muridarum, C. suis, C. abortus, C. percorum, C. caviae, C. pneumoniae, C. felis og C. psittaci). 2. BD ProbeTec ET CF Assay er kun blevet evalueret med svælgpodninger (med og uden 2SP transportmedium). Ydelse med andre præparattyper er ikke blevet bestemt. 3. BD ProbeTec ET CF Assay er kun blevet evalueret med patienter på ét år og ældre. 4. Som det er tilfældet med mange diagnostiske tests, bør resultater fra BD ProbeTec ET CF Assay tolkes sammen med andre laboratorie- og kliniske data, som er til rådighed for lægen. Et positivt resultat for denne analyse i kombination med andre kliniske tegn og symptomer og diagnostiske tegn på pneumoni er indikative for Chlamydiaceae familie-associeret pneumoni. 7

8 5. Et negativt testresultat bør ikke anvendes til at udelukke diagnosen af Chlamydiaceae familie-associeretpneumoni, fordi testresultater kan være påvirket af ukorrekt opsamling af præparatet, tekniske fejl, sammenblanding af præparater, samtidig antibiotikabehandling eller tilstedeværelsen af en mængde Chlamydiaceae familie-dna i præparatet, som ligger under testens analytiske sensitivitet. Yderligere diagnostiske testprocedurer kan derfor være nødvendige, såsom dyrkning, serologi og/eller en valideret nuklein-forstærkningstest, som anbefalet i offentliggjorte retningslinjer BD ProbeTec ET CF Assay kan ikke bruges til at vurdere terapeutisk succes eller fiasko, da nukleinsyrer fra Chlamydiaceae familie kan persistere efter antimikrobiel behandling. 7. Optimal ydelse af denne analyse kræver adækvat præparatopsamling og -håndtering. 8. Brug af BD ProbeTec ET CF Assay begrænses til personale, som er blevet uddannet i analyseproceduren og BD ProbeTec ET systemet. 9. BD ProbeTec ET CF Assay giver kvalitative resultater. Der kan ikke bestemmes en sammenhæng mellem størrelsen af PAT scoren og mængden af Chlamydiaceae familie DNA i en prøve. FORVENTEDE RESULTATER A: Prævalens Hyppigheden af positiviteten, der kan observeres i Chlamydiaceae testning, vil variere afhængigt af prøvetagningsmetoden, patientens alder, tilstedeværelse af underliggende risikofaktorer, geografisk beliggenhed, og vigtigst af alt, den lokale sygdomsprævalens, herunder mulige erhversmæssig eksponering. B: Fordeling af PAT scoringshyppighed Prospektiv undersøgelse Bemærk: Alle BD ProbeTec ET CF Assay resultater blev sammenlignet med dyrkningsresultatet for en svælgpodning trykket ud i 2SP transportmedium. Se afsnittet Ydelseskarakteristika for en detaljeret beskrivelse af det kliniske undersøgelsesdesign. I alt 354 svælgpodninger (opbevaret uden transportmedium) indsamlet prospektivt fra 354 patienter på syv kliniske steder i USA og Canada blev analyseret med BD ProbeTec ET CF Assay. En hyppighedsfordeling af de indledningsvise CF PAT scoringer sammenlignet med dyrkningsresultaterne vises i Figur 1. Femoghalvfjerds af svælgpodningerne, som blev indsamlet prospektivt og trykket ud i 2SP transportmedium til dyrkningstestning, blev også testet med BD ProbeTec ET CF Assay. En hyppighedsfordeling af de indledningsvise CF PAT scoringer sammenlignet med dyrkningsresultaterne vises i Figur 2. Retrospektiv undersøgelse Femogtyve retrospektive svælgpodninger, som blev trykket ud i 2SP transportmedium og opbevaret frosne, blev testet med BD ProbeTec ET CF Assay på et klinisk sted i Euorpa. En hyppighedsfordeling af de indledningsvise CF PAT scoringer sammenlignet med det originale dyrkningsresultat vises i Figur 3. En hyppighedsfordeling for de indledningsvise CF PAT scoringer sammenlignet med det originale PCR resultat fra de samme præparater vises i Figur 4. Figur 1: Fordeling af hyppighed af CF PAT scoring - Prospektive svælgpodningsresultater (uden transportmedium) sammenlignet med dyrkning Hyppighed (-) (+) CF PAT scoring 1 Dyrkning - Dyrkning + Dyrkningsresultat I alt Negativ Positiv I alt

9 Figur 2: Fordeling af hyppighed af CF PAT scoring - Prospektive svælgpodningsresultater (2SP medium) sammenlignet med dyrkning Hyppighed (-) (+) Dyrkning - Dyrkning CF PAT scoring Dyrkningsresultat I alt Negativ Positiv I alt Figur 3: Fordeling af hyppighed af CF PAT scoring - Retrospektive svælgpodningsresultater (2SP medium) sammenlignet med dyrkning (2SP medium) Hyppighed (-) (+) 1 Dyrkning - Dyrkning CF PAT scoring Dyrkningsresultat I alt Negativ Positiv 1 3 I alt

10 Figur 4: Fordeling af hyppighed af CF PAT scoring - Retrospektive svælgpodningsresultater (2SP medium) sammenlignet med PCR (2SP medium) Hyppighed (-) (+) CF PAT scoring Dyrkning - Dyrkning + PCR resultat I alt Negativ Positiv I alt C. Kontroller Under den kliniske evaluering blev i alt 45 kørsler foretaget ved brug af luftvejs- og mediekontrollerne (CF/LP/MP). Alle kørsler havde acceptable kontrolresultater. I alt 78 kørsler blev foretaget ved brug af podningskontrollerne (tcf/tmp). To af kørslerne havde kontrolfejl. En fejl var på grund af en proceduremæssig fejl, den anden kunne ikke forbindes med en specifik årsag. PAT scoringerne for CF/LP/MP kontrollerne og tcf/tmp kontrollerne sammenfattes i Tabel 1 og Tabel 2, henholdsvist. Tabel 1: Oversigt over CF PAT scoring for luftvejs- og mediekontroller (CF/LP/MP) Kontrol N Område 5. percentil Middel Median 95. percentil CF Negativ 45 CF Positiv 45 39,5 52,3 41,4 49, , Tabel 2: Oversigt over CF PAT scoring for podningskontroller (tcf/tmp) Kontrol N Område 5. percentil Middel Median 95. percentil CF Negativ 77 CF Positiv 76 28,3 52,7 48,5 51,1 51,8 52,5 YDELSESKARAKTERISTIKA Prospektiv undersøgelse BD ProbeTec ET CF analysen blev evalueret prospektivt ved syv kliniske centre i USA og Canada i sæsonen for luftvejslidelser. En svælgpodning (CultureSwab EZ - opbevaret uden transportmedium) blev indsamlet til testning med BD ProbeTec ET CF Assay. En polyesterpodepind blev anskaffet og suspenderet i 2SP (sucrosephosphat) transportmedium til dyrkningstestning og en anden polyesterpodepind blev anskaffet og suspenderet i Tris-EDTA (TE) buffer til polymerase kædereaktion (Polymerase Chain Reaction (PCR)) testning. BD ProbeTec ET CF Assay resultater fra alle prospektivt indsamlede præparater blev sammenlignet med resultatet for svælgpodningsdyrkning fra 2SP medium. Ét af de syv kliniske centre foretag al reference Chlamydiaceae dyrkningstestning. Tilstedeværelsen af mindst én inklusion efter farvning med et genus-specifikt monoklonalt antistof blev overvejet for at angive, at præparatet var positivt for en art af Chlamydiaceae. Tilstedeværelsen af mindst én inklusion efter farvning med FITCkonjugeret C. pneumoniae-specifikt monoklonalt antistof blev overvejet for at angive, at præparatet var positivt for C. pneumoniae. Ét af de syv kliniske centre foretag al PCR testning for de prospektive præparater. PCR blev foretaget på svælgpodninger trykket ud i TE buffer fra alle BD ProbeTec ET CF Assay positive patienter, samt en del af konkordante negative præparater og alle præparater med afvigende resultater (dvs. præparater med en uoverensstemmelse mellem BD ProbeTec ET CF Assay og referencemetoden). PCR analysen var specifik for C. pneumoniae og er én af fire offentliggjorte protokoller, som tilfredsstiller de optimale kriterier for en valideret PCR analyse. 3,9 I alt 354 svælgpodninger (opbevaret uden transportmedium), som blev indsamlet fra 354 patienter opfyldte inklusionskriterierne for undersøgelsen (dvs. radiologisk tegn på pneumoni, patienter på 1 år, på antibiotika 14 dage, gyldige præparattyper opsamlet, relevante referencemetoder udført osv.). Resultater fra svælgpodninger (uden transportmedium) blev sammenlignet med dyrkningsresultaterne fra en prallel svælgpodning trykket ud i 2SP medium for at estimere ydelseskarakteristika for BD ProbeTec ET CF Assay. Et præparat blev betragtet som positivt, hvis dyrkningsresultatet var positivt. Et præparat blev betragtet som negativt, hvis dyrkningsresultatet var negativt. Resultater for svælgpodningerne (uden transportmedium) sammenfattes i Tabel 3. Ingen inkonklusive resultater blev observeret. 1

11 Tabel 3: BD ProbeTec ET CF Assay prospektive svælgpodningsresultater (uden transportmedium) sammenlignet med dyrkning Dyrkning Sted CF Resultat Positiv Negativ I alt 1 Positiv Negativ 2 a I alt Positiv Negativ Følsomhed (95 % CI) % (/2) ( % 84,2 %) I alt IR 3 Positiv 1 b 1 Negativ I alt IR 4 Positiv Specificitet (95 % CI) 1 % (89/89) (95,9 % 1 %) 1 % (26/26) (86,8 % 1 %) 99 % (97/98) (94,4 % 1 %) Negativ I alt IR 6 Positiv Negativ I alt IR 7 Positiv 1 % (24/24) (85,8 % 1 %) 1 % (34/34) (89,7 % 1 %) Negativ 1 c 8 81 I alt Samlet Positiv 1 1 Negativ I alt % (/1) ( % 97,5 %) % (/3) ( % 7,8 %) 1 % 8/8) (95,5 % 1 %) 99,7 % (35/351) (98,4 % 1 %) a Dyrkningsresultaterne for begge præparater havde en trinvis 1+ vækst (1 inklusion pr. brønd eller 5 inklusioner pr. ml 2SP medium). PCR resultaterne for begge præparater var negative. b PCR resultatet var positivt. c Dyrkningen havde en trinvis 2+ vækst (72 inklusioner pr. brønd eller 36 inklusioner pr. ml 2SP medium). PCR resultatet var også negativt. IR = Ikke relevant BEMÆRK: PCR analysen er specifik for C. pneumoniae og er én af fire offentliggjorte protokoller, som tilfredsstiller de optimale kriterier for en valideret PCR analyse. 3,9 Femoghalvfjerds svælgpodninger (trykket ud i 2SP medium), som blev indsamlet prospektivt og trykket ud i 2SP transportmedium til dyrkningstestning, blev også testet med BD ProbeTec ET CF Assay. Resultater fra svælgpodninger trykket ud i 2SP medium blev sammenlignet med dyrkningsresultatet fra det samme præparat. Et præparat blev betragtet som positivt, hvis dyrkningsresultatet var positivt. Et præparat blev betragtet som negativt, hvis dyrkningsresultatet var negativt. Resultater for svælgpodningerne opbevaret i 2SP transportmedium sammenfattes i Tabel 4. Ingen inkonklusive resultater blev observeret. 11

12 Tabel 4: BD ProbeTec ET CF Assay prospektive svælgpodningsresultater (2SP medium) sammenlignet med dyrkning Dyrkning Sted CF Analyse Positiv Negativ I alt 2 Positiv Negativ 1 a I alt Positiv 1 c 1 Negativ 2 b I alt Samlet Positiv 1 1 Negativ I alt Følsomhed (95 % CI) % (/1) ( % 97,5 %) % (/2) ( % 84,2 %) % (/3) ( % 7,8 %) Specificitet (95% CI) 1 % (36/36) (9,3 % 1 %) 97,2 % (35/36) (85,5 % 99,9 %) 98,6 % (71/72) (92,5 % 1 %) a Dyrkningen havde en trinvis 2+ vækst (72 inklusioner pr. brønd eller 36 inklusioner pr. ml 2SP medium). PCR resultatet var også negativt. b Dyrkningsresultaterne for begge præparater havde en trinvis 1+ vækst (1 inklusion pr. brønd eller 5 inklusioner pr. ml 2SP medium). PCR resultatet for begge præparater var negativt. c PCR resultatet var positivt. BEMÆRK: PCR metoden er specifik for C. pneumoniae og er én af fire offentliggjorte protokoller, som tilfredsstiller de optimale kriterier for en valideret PCR analyse. 3,9 Én af svælgpodningerne indsamlet fra hver patient optaget i den prospektive undersøgelse for BD ProbeTec ET CF Assay blev suspenderet i Tris-EDTA buffer til PCR testning. Alle positive, afvigende (BD ProbeTec ET CF Assay-positiv, kurturnegativ eller omvendt) og cirka 1 % af de konkordante negative præparater blev testet ved brug af en etableret C. pneumoniae-specifik PCR metode. Al PCR testning blev foretaget på et klinisk sted. I alt 27 patienter havde præparater, som blev testet med en C. pneumoniae PCR analyse (dvs. 21 patienter med konkordante negative resultater og seks patienter med afvigende resultater). Tabel 5 sammenfatter de samlede resultatskombinationer fra dyrkning, BD ProbeTec ET CF Assay og PCR analysen. Tabel 5: Oversigt over prospektive patienttestmetoder og BD ProbeTec ET CF Assay resultater BD ProbeTec ET CF Assay Dyrkningsresultat Svælgpodepind 2SP medium PCR resultat c Patientantal + a 3 Ikke-kompatibel b + IR IR 65 IR 17 IR IR 263 IR IR 1 Forklaring: IR = Ikke relevant + angiver et positivt resultat angiver et negativt resultat a To dyrkninger havde en trinvis 1+ vækst (1 inklusion pr. brønd eller 5 inklusioner pr. ml 2SP medium). Én dyrkning havde en trinvis 2+ vækst (72 inklusioner pr. brønd eller 36 inklusioner pr. ml 2SP medium). b Præparatet var optøet ved modtagelse på teststedet. Dyrkningen blev stadigvæk foretaget og var negativ. Da præparatet var kompromitteret, blev dyrkningsresultatet ikke anvendt ved estimat af ydelseskarakteristika for BD ProbeTec ET CF analysen. c PCR metoden er specifik for C. pneumoniae og er én af fire offentliggjorte PCR protokoller, som tilfredsstiller de optimale kriterier for en valideret PCR analyse. 3,9 Retrospektiv undersøgelse På grund af det lave antal positive præparater i den prospektive undersøgelse, identificerede BD et sted i Europa, som havde 25 svælgpodningspræparater udtrykt og opbevaret frosne i 2SP transportmedium. Disse retrospektive præparater blev opbevaret i frossen tilstand i op til otte år, med størstedelen af præparaterne (84 %; 21/25) opbevaret i under seks år. De 25 retrospektive præparater blev karakteriseret af en kombination af dyrkning og PCR eller kun PCR. Af de 25 præparater havde alle PCR resulater (22 positive, tre negative). Af de 22 PCR positive præparater havde kun fire positive C. pneumoniae dyrkningsresultater. For de resterende 18 PCR positive præparater og tre PCR negative præparater blev ingen dyrkningstestning foretaget. 12

13 Et præparat blev betragtet som positivt, hvis enten dyrkningsresultatet eller PCR resultatet var positivt. Et præparat blev betragtet som negativt, hvis det tilgængelige PCR resultat var negativt. De procentvise overensstemmelsesestimater for BD ProbeTec ET CF Assay fra svælgpodningen opbevaret i 2SP transportmedium sammenlignet med de tilgængelige dyrknings- og/eller PCR resultater sammenfattes i Tabel 6. Sammenlignet med dyrkning var den positive procentvise overensstemmelse 1 % (4/4) De positive, negative og samlede procentvise overensstemmelser sammenlignet med PCR var 81,8% (18/22), 1% (3/3) og 84% (21/25), henholdsvist. Tabel 6: BD ProbeTec ET CF Assay retrospektive svælgpodningsresultater (2SP medium) sammenlignet med dyrkning (2SP medium) og/eller PCR (2SP medium) Dyrkning og/eller PCR Procent overensstemmelse estimater (95 % konfidensinterval) Sted CF Resultat Positiv Negativ I alt Positiv Negativ Samlet DAN 8 Positiv 18 a,b 18 Negativ 4 c 3 d 7 I alt a Fire af de 18 præparater blev identificeret som positive for C. pneumoniae ved brug af dyrkning. b Af de 18 præparater, som var positive med PCR, blev to præparater identificeret som positive for C. psittaci, og 16 blev identificeret som positive for C. pneumoniae. c Fire præparater blev identificeret som PCR positive for C. pneumoniae. d Tre præparater var PCR-negative med både en Chlamydiaceae genus og en art-specifik C. pneumoniae PCR analyse. Dyrkningstestning blev ikke foretaget. Analytiske undersøgelser BD ProbeTec ET CF Assay amplifikationsreaktionsvolumen er 1 µl bearbejdet prøve. Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitivitet for BD ProbeTec ET CF Assay blev bestemt ved at teste et repræsentativt panel med organismer tilhørende Chlamydiaceae familien, inklusive Chlamydophila pneumoniae (16 stammer), Chlamydia trachomatis (15 serotyper), Chlamydophila psittaci (6 stammer) and C. muridarum (1 stamme). Bakterielle suspensioner blev fortyndet til niveauer på, 6, 9 og 12 elementarlegemer (Elementary Bodies (EB)) pr. reaktion for hver organisme. C. trachomatis serotyper E og F blev testet ved, 6, 12 og 18 EB/reaktion. C. pneumoniae stamme ATCC AR39 blev valgt som den repræsentative organisme for Chlamydiaceae familien for undersøgelser foretaget med kliniske præparater eller transportmedium. Den analytiske sensitivitet for BD ProbeTec ET CF Assay ved tilstedeværelse af en matrix af præparater fra svælgpodning blev bestemt ved at udså podninger med 2 µl fortyndet C. pneumoniae AR-39 stamme for at give niveuer på, 3, 6 og 9 EB pr. reaktion. Den analytiske sensitivitet for BD ProbeTec ET CF Assay ved tilstedeværelse af 2SP transportmedium blev bestemt ved at udså 2SP medium med fortyndet C. pneumoniae AR-39 stamme for at give niveuer på, 9, 12, 2, 4 og 6 EB pr. reaktion. Alle prøver blev bearbejdet og analyseret i tre eksemplarer. Baseret på 1 % positivitet sammenfattes den analytiske sensitivitet for de forskellige matricer af organismer og præparater i Tabel 7. Den faktiske påvisningsgrænse (Limit of Detection (LOD)) kan dog være under det laveste testede niveau. Tabel 7: BD ProbeTec ET CF Assay - Analytisk sensitivitet for forskellige isolater* Organisme Analytisk sensitivitet (EB/reaktion) C. pneumoniae (16 stammer) 6 C. trachomatis serovars B, Ba, C, D, I, LGV-1, LGV-2, LGV-3 81,8 % (18/22) (59,7 % 94.8 %) 1 % (3/3) (29,2 % 1 %) C. trachomatis serotype A 9 C. trachomatis serotype G 12 C. trachomatis serotyper H, J, K 15 C. trachomatis serotype E og F 12 og 25, henholdsvist C. psittaci (6 stammer) 6 (5 stammer) og 12 (1 stamme) C. muridarum (1 stamme) 6 Bearbejde svælgpodninger 3 2SP transportmedium 9 * Medmindre andet er noteret, repræsenterer LOD median for all testede stammer og serotyper. Analytisk specificitet I alt 18 mikroorganismer (86 bakterier, syv svampe, 14 vira og én parasit) blev evalueret ved brug af BD ProbeTec ET CF Assay. Bakterieisolater blev testet ved koncentrationer fra 1,17 x 1 7 til 3,7 x 1 9 CFU/mL eller celler/ml, med undtagelse af Coccidioides immitis og Haemophilus ducrei, som blev testet ved brug af bakteriesuspensioner, som svarede til McFarland standarder på 5 og 2, henholdsvist. Viruser blev testet ved en koncentration på 1 x 1 6 viruspartikler/ml, mens Trichomonas vaginalis blev testet ved 4,6 x 1 6 celler/ml. Genom-DNA eller genom-rna blev testet for fire viruser ved en koncentration på 1 x 1 6 genomer/ml. Ingen af de testede mikroorganismer producerede et positivt resultat eller inhiberede IAC (Tabel 8) % (21/25) (63,9 % 95,5 %) 13

14 Tabel 8: BD ProbeTec ET CF Assay - Analytisk specificitet Acinetobacter calcoaceticus Haemophilus parainfluenzae Peptostreptococcus Acinetobacter lwoffii Herpes simplex virus-1 asaccharolyticus Actinomyces israelii Herpes simplex virus-2 Peptostreptococcus productus Adenovirus-5 Histoplasma capsulatum Plesiomonas shigelloides Aeromonas hydrophila HIV-I, Clade B Porphyromonas asaccharolytica Alcaligenes faecalis HPV, type 16 Prevotella melaninogenicus Bacillus subtilis HPV, type 18 Prevotella oralis Bacteroides fragilis Influenzavirus A Propionibacterium acnes Blastomyces dermatitidis Influenzavirus B Proteus mirabilis Bordetella bronchiseptica Kingella kingae Providencia stuartii Bordetella parapertussis Klebsiella pneumoniae underart Pseudomonas aeruginosa Bordetella pertussis ozaenae type 4 Respiratorisk syncytialvirus, lang Branhamella catarrhalis Klebsiella pneumoniae subsp. stamme Candida albicans pneumoniae Rhinovirus Candida glabrata Lactobacillus acidophilus Salmonella choleraesuis serotype Candida tropicalis Lactobacillus brevis Enteritidis Citrobacter freundii Legionella pneumophila Salmonella choleraesuis serotype Clostridium perfringens Listeria monocytogenes Typhi Coccidioides immitis Mobiluncus mulierieris Salmonella Minnesota Corynebacterium diphtheriae Moraxella lacunata Salmonella typhimurium Corynebacterium jeikeium Moraxella osloensis Serratia marcescens Corynebacterium renale Morganella morganii Staphylococcus aureus, protein A- Cryptococcus neoformans Mycobacterium avium producerende Cytomegalovirus Mycobacterium gordonae Staphylococcus aureus, ikkeprotein Edwardsiella tarda Mycobacterium kansasii A-producerende Eikenella corrodens Mycobacterium intracellulare Staphylococcus epidermidis Enterobacter aerogenes Mycobacterium smegmatis Stenotrophomonas maltophilia Enterobacter cloacae Mycobacterium tuberculosis Streptococcus gruppe B Enterococcus faecalis Mycoplasma genitalium Streptococcus mitis Enterococcus faecium Mycoplasma hominis, type 1 Streptococcus mutans Enterovirus (Echovirus) Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pneumoniae Epstein-Barr virus Neisseria cinerea Streptococcus pyogenes Escherichia coli Neisseria gonorrhoeae Streptomyces griseus Flavobacterium meningosepticum Neisseria meningitidis Tatlockia (Legionella) micdadei Fusobacterium nucleatum Neisseria mucosa Trichomonas vaginalis Gardnerella vaginalis Neisseria polysaccharea Ureaplasma urealyticum Gemella haemolysans Parainfluenza type 1 Veillonella parvula Haemophilus ducreyi Peptostreptococcus anaerobius Vibrio parahaemolyticus Haemophilus influenzae Yersinia enterocolitica Interfererende stoffer Potentielle interfererende stoffer, som kan være aktuelle i svælgpodninger, blev testet med BD ProbeTec ET CF Assay i fravær af fokus eller i tilstedeværelse af 15 EB/reaktion af C. pneumoniae ATCC stamme AR39. I fravær af fokus producerede ingen af de testede stoffer et positivt resultat eller inhiberede IAC ved koncentrationerne opgivet i Tabel 9. Når fokus var tilstede med stoffer ved koncentrationerne opgivet i Tabel 9, producerede alle testede prøver et positivt resultat. 14

15 Hostesaft Tabel 9: BD ProbeTec ET CF Assay - Stoffer screenet for interferens Testede stoffer Undersøgelse af spiket præparat For at supplere antallet af positive præparater, der træffes i den kliniske undersøgelse, blev 25 svælgpodninger spiket med 5 x 1 4 EB/mL C. pneumoniae (positive præparater). For at simulere Chlamydiaceae-negative svælgpodninger, blev 5 podninger ligeledes spiket med en bakteriesuspension, som kun indeholdt L. pneumophila and M. pneumoniae. Alle præparater blev testet i BD ProbeTec ET CF Assay. Resultater sammenfattes i Tabel 1. Samlet nøjagtighed var 98,7 % (74/75). Tabel 1: BD ProbeTec ET CF Assay - Spikede resultater for svælgpodning BD ProbeTec ET CF Assay resultater Præparater fra svælgpodepind Koncentration i præparat Robitussin DM 25 % Triaminic (vindrue) 25 % Næsespray (poolet) Vicks Sinex 1 % Neo-Synephrine (almindelig styrke) 1 % Halsspray Cepacol (kølig menthol) 25 % Vicks Chloraseptic (kirsebær) 25 % Mundvand Scope (original pebermynte) 25 % Listerine (original) 25 % Hostebolsjer Halls sukkerfri citrusblanding 25 % Cold-Eeze Zinc 25 % Organismer Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae og Legionella pneumophila 1 7 celler/ml 1 7 CFU/mL 1 7 celler/ml og 1 7 CFU/mL, henholdsvist Spike niveau Positiv Negativ I alt Positiv 25 1* 26 Negativ I alt *Initiale falske positive gentagne negative med BD ProbeTec ET CF Assay Reproducerbarhed Reproducerbarheden for BD ProbeTec ET CF Assay blev vurderet for svælgpodninger på tre laboratorier ved at teste paneler bestående af 24 prøver, der blev forberedt i PBS/BSA. Bestod panelet af 12 prøver, som var negative for C. pneumoniae samt tre lave og tre høje C. pneumoniae positive prøver (45 og 75 EB/reaktion, henholdsvist). Der var endvidere tre lave positive prøver, som indeholdte 45 EB, 4 CFU og 6 celler/reaktion af C. pneumoniae (CP), L. pneumophila (LP) og M. pneumoniae (MP), henholdsvist, og tre høje positive prøver, som hver indeholdte 75 EB, 65 CFU og 1 celler/reaktion af disse organismer, henholdsvist. En operatør på hvert af de tre steder testede panelerne én gang om dagen i tre dage. Resultaterne er sammenfattet i Tabel 11. Tabel 11: BD ProbeTec ET CF Assay: Reproducerbarhedsestimater for svælgpodning efter prøveniveau Mellem dag på Mellem stedet sted Panelmedlem N % korrekt Middel PAT SD % CV SD % CV CP-HØJ 27 1 % 51,2,31,61,11,21 CP-LAV 27 1 % 5,7,,,29,58 CP/LP/MP-HØJ 27 1 % 51,8,26,51,, CP/LP/MP-LAV 27 1 % 5,6,,,, Negativ 18 1 %, IAC med CP-negative prøver 18 1 % 52,,17,32,6,12 15

16 BESTILLING De følgende BD ProbeTec ET produkter er disponible: Kat. nr. Beskrivelse BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay (BD ProbeTec ET Chlamydiaceae familien (CF) forstærket DNA-analyse) 4473 BD ProbeTec ET Swab Diluent and Control Kit (BD ProbeTec ET podepindsfortynder og kontrolkit) BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (BD ProbeTec ET luftvejs- og mediefortynder og kontrolkit) BD ProbeTec ET Accessories Kit (BD ProbeTec ET tilbehørssæt) 4471 BD ProbeTec ET Accessories II Kit (BD ProbeTec ET tilbehørssæt II) BD ProbeTec ET Pipette Tips 6 x 12 (BD ProbeTec ET pipettespidser 6 x 12) BD ProbeTec ET 2 ml Sample Tubes, Caps and Labels (BD ProbeTec ET 2 ml prøveglas og hætter og etiketter), 2 af hver BD ProbeTec ET Sample Tubes (4. ml) and Caps (BD ProbeTec ET prøveglas (4, ml) og hætter), 4 af hver BD ProbeTec ET 2 ml Caps (BD ProbeTec ET 2 ml hætter), BD ProbeTec ET Instrument, uden for USA BD ProbeTec ET Instrument, USA og Canada BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater (BD ProbeTec ET primer- og opvarmerapparat), 22V 4448 BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater (BD ProbeTec ET primer- og opvarmerapparat), 12V BD ProbeTec ET Lysing Heater (BD ProbeTec ET lyseringsvarmeapparat), 22V BD ProbeTec ET Lysing Heater (BD ProbeTec ET lyseringsvarmeapparat), 12V BD ProbeTec ET Pipettor 4452 BD ProbeTec ET Lysing Rack (BD ProbeTec ET lyseringsstativ) LITTERATUR 1. Bartlett, J.G., Dowell, S. F., Mandell, L.A., File, T.M., Musher, D.M., Fine, M.J. 2. Guidelines from the Infectious Diseases Society of America - Practice guidelines for the management of community-acquired pneumonia in adults. Clin Infect Dis 31: Murray et al Manual of clinical microbiology, 7th edition, ASM Press. 3. Dowell, S.F., Peeling, R.W., et.al. 21. Standardizing Chlamydia pneumoniae Assays: Recommendations from the Centers for Disease Control and Prevention (USA) and the Laboratory Centre for Disease Control (Canada). Clin Infect Dis 33: National Committee for Clinical Laboratory Standards. 21. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd. ed. NCCLS, Wayne, Pa. 5. Garner. J.S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 7. Directive 2/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/1/2, p Isolation of Chlamydia ssp. in cell culture. In: Clinical microbiology procedures handbook, Isenberg HD (Ed.), 1992, American Society for Microbiology, Washington DC, pp Mandell, L.A., Bartlett, J.G., et. al. 23. Update of practice guidelines for the management of community-acquired pneumonia in immunocompetent adults. Clin Infect Dis 37:

17 17

18 Becton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, Maryland USA BENEX Limited Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: Alconox is a trademark of Alconox, Inc. ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo, BBL, BD ProbeTec and CultureSwab are trademarks of Becton, Dickinson and Company. 28 BD.