NGAL en akut nyreparameter

Transkript

1 NGAL en akut nyreparameter - Validering og opsætning af NGAL på Roche Modular P, Klinisk Biokemisk Afdeling, Sygehus Lillebælt, Fredericia Udarbejdet af: Chalotte Lindholt Christensen, studienr I samarbejde med Helle Eckert, studienr Vejledere: Jacob Tovbjerg Simonsen Helle Glud Binderup Rapporten indeholder tegn

2 Forord Dette bachelorprojekt er udarbejdet af undertegnede, Chalotte Christensen, i samarbejde med Helle Eckert på modul 14 af bioanalytikeruddannelsen ved VIA University College, Århus. Projektet er udarbejdet over en periode på 9 uger og to dage i foråret Det praktiske laboratoriearbejde er udført af både Helle og jeg og ligeledes perspektiveringen, mens resten af rapporten er lavet individuelt. Vores projekt omhandler validering og opsætning af Neutrofil gelatinase associeret lipocalin (herefter NGAL) på klinisk biokemisk afdeling, sygehus lillebælt, Fredericia. Endvidere kigges der på, hvilke patientgrupper analysen kan være gavnlig for. Vi takker Bioporto for levering af reagenser, kontroller og kalibreringsmateriale til analysen. Vi vil også gerne takke læge Jannie Bisgaard, Intensiv afdeling, Kolding sygehus, sygehus Lillebælt, for levering af prøvemateriale samt vejledning omkring de kliniske aspekter i forhold til relevans og betydning af de enkelte resultater. Ligeledes vil vi gerne takke læge Gudrun Steffensen, Medicinsk afdeling, Fredericia sygehus, sygehus Lillebælt, for at hjælpe med prøveindsamling og vejlede omkring hvilke patientgrupper, der klinisk ville være interessante. Og for vejledning omkring de kliniske aspekter i forhold til relevans og betydning af de enkelte resultater. Til sidst vil vi gerne takke kemiker Poul Jørgen Jørgensen, Klinisk biokemisk afdeling, Kolding sygehus, sygehus Lillebælt, for statistisk rådgivning og personalet på klinisk biokemisk afdeling, Fredericia sygehus, sygehus Lillebælt, for deres overbærenhed i forbindelse med den praktiske udførsel af projektet. Chalotte Christensen 2

3 Indholdsfortegnelse Forord... 2 Abstrakt... 5 Introduktion... 6 Baggrund... 6 Formål... 6 Problemformulering... 7 Målformulering... 7 Teori... 9 Analyse og måleprincip... 9 Metodevalidering Intra-og interseriel præcision Korrekthed Måleusikkerhed Krav til analysen Materialer og metode Materialer Metoder Prøveindsamling Databearbejdning Resultater Validering Præcision Korrekthed Måleusikkerhed Økonomi Jannies prøver Gudruns prøve Cutoff værdier Diskussion Validering Økonomi Jannies prøver Gudruns prøver

4 Akut nyresvigt Sepsis Prærenal uræmi Postrenal uræmi Hæmatologiske lidelser Kronisk nyreinsufficiens Opsamling Cutoff værdier Perspektivering Konklusion Bibliografi

5 Abstrakt Neutrophil gelatinase associeret lipocalin (NGAL) er et lille protein som er til stede i neutrofile granulocytter og nogle epiteler inklusiv dem i nyretubuli. NGAL er en potentiel markør til at diagnosticere akut nyresvigt. Under normale omstændigheder er NGAL niveauet lavt i plasma og urin, men stiger kraftigt og hurtigt ved akut nyresvigt. NGAL værdierne vil være øget allerede 24 timer før at creatinin værdierne øges. Vi ville opsætte og validere den nye analyse NGAL på Roche Modular P (Modular). Dermed ville vi se om analysen var tilfredsstillende med hensyn til præcision, korrekthed og måleusikkerhed. Derefter ville vi analysere NGAL i urin og plasma, fra nogle udvalgte patientgrupper i Kolding og Fredericia. Prøvematerialet fra Kolding er indsamlet over en periode på 6 måneder og prøvematerialet fra Fredericia er indsamlet over en periode på 3 måneder. Resultaterne viste en stigning i NGAL, hos patienter med akut nyresvigt. Hos den ene patientgruppe kunne vi se en stigning i NGAL, før der forekom en stigning i s-creatinin. Hos denne patientgruppe kunne også observeres en stigning i NGAL uden at dette medførte akut nyresvigt. Hos den anden patientgruppe kunne der ikke observeres en stigning i NGAL før der forekom en stigning i s-creatinin. I valideringen af NGAL analysen på Modular P, blev kravene til analysen kun til dels opfyldt. Men dette bør ikke stå i vejen for, at analysen kan implementeres i Fredericia. NGAL kan blive vigtig del i diagnosticeringen af akut nyresvigt og ved implementering kan der løbende opsamles mere viden om denne potentielle markør for akut nyresvigt. Så det tilrådes, at analysen bliver implementeret hos KBA, Fredericia Sygehus. 5

6 Introduktion Baggrund Neutrophil gelatinase associeret lipocalin (NGAL) er et lille protein som er til stede i neutrofile granulocytter og nogle epiteler inklusiv dem i nyretubuli. NGAL er en potentiel markør til at diagnosticere akut nyresvigt. Under normale omstændigheder er NGAL niveauet lavt i plasma og urin, men stiger kraftigt og hurtigt ved akut nyresvigt. NGAL værdierne vil være øget allerede 24 timer før at creatinin værdierne øges (1). Ved akut nyresvigt (AKI) stiger creatinin efter timer og øges med ca. 50 %. NGAL stiger indenfor 12 timer og øges med ca. 500 % (2). Ved akut nyresvigt bliver nyrernes funktion kraftigt forringet. Det kan betyde at patienten bliver dialysekrævende i en kortere eller længere periode. Ved at måle NGAL allerede ved mistanke om nyresvigt, kan man igangsætte forebyggende behandling og dermed nedsætte antallet at dialysekrævende patienter. Det kan f.eks. dreje sig om patienter med sygdom i den abdomiale aorta, som derfor skal have udskiftet en del af aorta med protesemateriale. Efter operationen kan der ske svigt i nyrerne i forbindelse med reperfusion og derfor kan NGAL være forhøjet hos disse patienter (3). Andre grupper af patienter kan være dem med sepsis, patienter som har fået indgivet kontrastvæske ved CT og patienter med nyresvigt (4). I Fredericia regner man med ca. 60 prøver pr. måned, dvs. ca 720 prøver pr. år (4). Klinikerne efterlyser en analyse der tidligt kan sige noget om nyrefunktionen. Creatinin værdierne øges først når % af nyrefunktionen er mistet (5). NGAL skulle gerne stige tidligere og derved kunne man formentlig undgå at patienterne udvikler nyresvigt og derved bliver mere behandlingskrævende. Dette vil vi gerne undersøge og derfor ser vi på både NGAL og creatinin. Formål Vi vil opsætte og validere den nye analyse NGAL på Roche Modular P (Modular). Dermed vil vi se om analysen er tilfredsstillende med hensyn til præcision, korrekthed og måleusikkerhed. 6

7 Derefter vil vi analysere NGAL i urin og plasma, fra nogle udvalgte patient grupper, hvor det kan være relevant at måle NGAL. Prøverne indsamlet fra Kolding Sygehus er fra patienter der skal have udskiftet en del af aorta med protesemateriale, på grund af sygdom i abdomiale aorta (6). Prøver indsamlet på Fredericia Sygehus, er fra en blandet skare af patienter. F.eks. kan det være fra patienter, der er dehydreret eller fra patienter med kronisk nyresygdom. Derfor kan der heller ikke altid indsamles urin fra disse patienter og der må analyseres på plasma i stedet (4). Det undersøges om NGAL kan bruges i stedet for eller sammen med creatinin og om klinikerne med NGAL, kan påbegynde en behandling tidligere for at undgå nyreskader eller nyresvigt. Problemformulering Hvilke konsekvenser har det for patienten at få målt NGAL i stedet for/sammen med creatinin? Hvilke konsekvenser har det for Klinisk Biokemisk Afd. på Fredericia Sygehus, at indføre analysen? Målformulering Vi vil undersøge: Præcision ved at analysere en patient prøve og en kontrol over 11dage, begge med dobbeltbestemmelse. Patient prøven og kontrollen er på to forskellige koncentrationsniveauer (7) (8). Korrekthed ved at bruge kontrolresultaterne fra præcisionsbestemmelsen. Dermed bliver det 11målinger der bliver dobbeltbestemt (7) (8). Måleusikkerheden, bestemmes ved at lave et usikkerhedsbudget, beregnet efter Sygehus Lillebælts retningslinjer (7). Vi vil analysere en række relevante patientprøver, for at se om vi kan måle en stigning i NGAL før der forekommer en stigning i creatinin. Der vil blive lavet relevant statistik på de målte værdier. Vi vil undersøge, om indførslen af denne analyse har indvirkning på den daglige arbejdsgang på laboratoriet og hvilke økonomiske konsekvenser det måtte have. 7

8 Nærmere bestemt om det vil kræve yderligere forberedelse af prøven, inden analysering, og om antallet af prøver vil betyde noget for arbejdsgangen ved apparatet. 8

9 Teori Analyse og måleprincip NGAL analyseres på Roche Modular P. Modular er et analyseapparat til analysering af biokemiske og immunkemiske analyser. På P modulet måles prøvens absorbans eller absorbansændring/tid fotometrisk. NGAL analysen er en particle-enhanced turbitimetrisk immunoassay for en kvantitativ bestemmelse af NGAL. Reagenskittet består af 2 reagenser, R1 og R2. R1 er en reaktionsbuffer og indeholder murin protein. R2 er en immunopartikel suspension, der indeholder polystyren micropartikler coated med monoklonalt muse antistof mod NGAL. Prøven afpippeteres over i en kuvette. Efter tilsætning af R1 reagens måles en absorbans ved mp1 (18 rotationer). Herefter tilsættes R2 og der måles igen ved mp2 (34 rotationer). Ved interpolering på kalibreringskurven kan koncentrationen bestemmes. Der måles ved to bølgelængder: primær 570 nm og sekundær 800 nm. (9) Ved tilsætning af reaktionsbuffer (R1) stabiliseres prøven og optimal ph opnås. Herefter kan der tilsættes de coatede mikropartikler. Disse partikler vil binde sig til prøvens indhold af NGAL og derved klumpe sammen. Herved bliver prøven mere uigennemsigtig og vil absorbere mere lys og dermed få en højere absorbans. 9

10 NGAL i prøven Antigen/antistof komplekser Coated mikropartikler Mikropartikler i overskud Metodevalidering Intra-og interseriel præcision Definitionen på præcision er, en grad af overensstemmelse mellem uafhængige måleresultater, opnået med samme analysemetode på identisk prøvemateriale i samme laboratorium, men angivet under forskellige målebetingelser (10). Ved at analysere det samme prøvemateriale over flere dage findes den interserielle præcision. Ved at analysere det samme prøvemateriale den samme dag, i den samme serie, findes den intraserielle præcision. Standard deviation (SD) bruges som et udtryk for præcisionen. Formlen til beregning af den interserielle præcision (11): = Antal dage/analyseserier = Gennemsnit af alle resultater fra dag/analyseserie i = Gennemsnit alle resultater fra alle dage/analyseserier 10

11 Formel til beregning af den intraserielle præcision (11): = Total antal dage/analyseserier = Resultat for første dobbeltbestemmelse på dag i = Resultat for anden dobbeltbestemmelse på dag 2 Formel til beregning af den totale præcision (11): B = interseriel præcision N = antal gentagelser pr. kørsel S r = intraseriel præcision Formel til beregning af CV %: Korrekthed Definitionen på korrekthed er grad af overensstemmelse mellem middelværdien for en stor serie af måleresultater og en accepteret referenceværdi (10). For at kvantificere korrektheden skal vi beregne en bias. Definitionen på bias er forskellen mellem uendeligt mange bestemmelser på samme prøve og prøvens sande værdi, f.eks. kontrolmateriale (12). Formel til beregning af bias: 11

12 = Prøvens sande værdi Måleusikkerhed Måleusikkerheden beregnes ud fra Sygehus Lillebælts retningslinjer. Formel til beregning af måleusikkerhed: Hvo a, b, c bidragene til måleusikkerheden i % Krav til analysen Ifølge Overlæge Gudrun Steffensen, Fredericia, vil en måleusikkerhed på 10 % i det lave område og en måleusikkerhed på 25 % i det høje område, være acceptabelt. Der findes ingen eksterne krav til præcision og korrekthed. Materialer og metode Materialer Det anvendte prøvemateriale er EDTA plasma og urin. Prøveindsamlingen i Fredericia er foregået ved at klinikerne har bestilt en projekt NGAL, der er specielt oprettet til dette projekt. Dermed er det klinikeren, der har taget stilling til om patienten kunne være relevant til vores projekt. Prøven er taget af en bioanalytiker og herefter er EDTA glasset centrifugeret, plasma afpipetteret og frosset ved - 80 grader sammen med uringlasset. Ved analysering tøes plasma og urin op, hvorefter de centrifugeres, inden analysering. Prøverne fra patienterne fra Kolding er udvalgt ud fra at de skal have lavet en kirurgisk afklemning af abdominal aorta. Prøverne er efter prøvetagning centrifugeret og afpippeteret og opbevaret i fryser ved 80 grader. Prøverne optøes, og vendes grundigt inden analysering. Reagenset, kalibratorer og kontroller er fra Bioporto. Der kalibreres på 6 niveauer og der er 2 kontroller, en lav og en høj. Lotnr og udløbsdato Lotnr. og udløbsdato gølder for både reagens, kontroller og kalibratore. Reagens, kalibratorer og kontroller er efter åbning, holdbar i 30 dage ved 2-8 grader. 12

13 Metoder NGAL bliver analyseret på Roche Modular P og den anvendte metode er en Particleenhanced turbidimetric immunoassay. Prøveindsamling Urin prøverne fra Kolding er opsamlet i glas fra Sarstedt. De opbevares i fryser ved -80 grader. Umiddelbart inden analysering optøes de ved stuetemperatur hvorefter de vendes grundigt. Prøverne mærkes med prøveid, f.eks. Q10T24 og bestilles manuelt på Modular. Herefter er prøven klar til analysering og den sættes i urinrack og på Modular. Urin prøverne fra Fredericia er opsamlet i glas fra Sarstedt. De opbevares i fryser ved -80 grader. De optøes ved stuetemperatur umiddelbart inden analysering og derefter centrifugeres de ved 2000 g/ 20 o C i 10 min.. Prøverne er mærket med glasnummer, men da der er auto besvaret *taget i BCC, skal de bestilles manuelt og derefter sættes på Modular. Prøverne mærkes med nr Blodprøverne fra Fredericia er opsamlet i K3 EDTA glas fra Terumo. De centrifugeres ved 2000 g/20 o C i 10 min., hvorefter plasma afpipetteres til et nyt rør og derefter nedfryses ved -80 grader indtil de skal analyseres. Umiddelbart inden analysering optøes de ved stuetemperatur hvorefter de centrifugeres igen ved samme hastighed og samme tid. Prøverne er mærket med glasnummer, men da der er auto besvaret *taget i BCC, skal de bestilles manuelt og kan derefter sættes på Modular. Prøverne mærkes med nr Der kalibreres og analyseres kontroller som det første efter analysen er opsat på Modular. Derefter kalibreres ved skift af lot. nr. og der foretages en 1-punkts kalibrering hver 168. time. Kontroller analyseres før prøverne. I forsøgsfasen analyseres jævnligt kontroller, skiftevis lav og høj, for at sikre at resultaterne ikke skrider. For hver 30. prøve ca. Databearbejdning Til litteratursøgning anvendes Pubmed. Der anvendes også litteratur fra producentens hjemmeside og pakningsindlæg. Google anvendes i begrænset omfang. Til de statistiske beregninger benyttes Microsoft Excel Der vil blive beregnet præcision og korrekthed ud fra de resultater vi har fået til disse bestemmelser. Måleusikkerheden bestemmes ved at følge retningslinjerne for Sygehus Lillebælt. 13

14 Resultater Validering Præcision Til at bestemme præcisionen, har vi målt 2 prøver på 2 forskellige niveauer. Der er lavet dobbeltbestemmelse og prøverne er analyseret over en periode på 11 dage. Dermed er der 22 bestemmelser på hvert niveau Prøve Kontrol 921 ng/ml 211 ng/ml SD interseriel 16,40 5,09 CV % 1,78 % 2,42 % SD intraseriel 22,99 8,10 CV % 2,50 % 3,85 % SD total 23,09 7,66 CV % 2,51 % 3,64 % Skema 1 1 Korrekthed Til at bestemme bias, har vi brugt de 22 målinger, der er lavet på kontrollen. Der er ikke beregnet bias for prøven, da der ikke findes en sand værdi. Kontrol Bias % 3,67 % Skema 2 2 Måleusikkerhed I min beregning har jeg estimeret en præanalytisk måleusikkerhed til ca. 2 %. Der findes ingen konkret værdi for denne usikkerhed, da analysen er meget ny. Derfor er den estimeret. Kalibratorusikkerheden er sat til 8 % 3, og er blevet oplyst af producenten. Den totale CV % er på 2,5 % for prøven og 3,6 % for kontrollen. 1 Se bilag 1 for beregninger indledende prøver 2 Se bilag 1 for beregninger indledende prøver 3 Se bilag 6 14

15 Måleusikkerhed Prøve Kontrol Præanalytisk 2 % 2 % Kalibrator 8 % 8 % Total CV % 2,5 % 3,6 % i alt 8,6 % 9,0 % Skema 3 4 Økonomi Til beregning af omkostningerne ved 1 analyse, er der taget højde for, hvor mange prøver der vil blive analyseret pr. måned, hvor mange kontroller og kalibreringer, der skal analyseres og sidst men ikke mindst prisen på reagenset. Prisen på glas er ikke medregnet, da jeg mener posten er ubetydelig i forhold til de faktiske omkostninger. Der er beregnet en pris ved analysering af hhv. 1 og 2 kontroller pr. dag. pris v. pris v. 1 kontrol om dagen 2 kontroller om dagen Kostpris 1 analyse 270,87 kr 370,98 kr Skema Se bilag 1 for beregninger indledende prøver 5 Se bilag 1 for beregninger økonomi og bilag 4 15

16 Jannies prøver Patient Type Q1 1 Q2 0 Q3 1 Q4 1 Q5 0 Q6 0 Q7 0 Q8 1 Q9 1 Q10 1 Q11 1 Q12 1 Q13 1 Q14 1 Q15 0 Q16 1 Q17 0 Q18 0 Q19 0 Q20 0 Q21 0 I alt har vi modtaget prøver fra 21 patienter fra Kolding Sygehus. Disse patienter er blevet opereret for enten okklusive (0) eller aneurisme (1) sygdomme på aorta abdominalis. Der er analyseret 4 prøver på hver patient, t0, t24, t48 og t72. Ved enkelte patienter mangler der dog en prøve 6. Vi har ikke selv målt s-creatinin på patientprøverne, da materialet ikke var til rådighed for os. Resultaterne har vi fået fra Læge Jannie Bisgaard, Kolding Sygehus. Skema 5 6 Se bilag 1 Jannies prøver 16

17 s-creatinin mmol/l U-NGAL ng/ml Q9 Q11 Q Timer Fig 1 Figur 1 viser de 3 patienter, der havde den meste markante stigning i u-ngal Q9 s-crea Q11 s-crea Q12 s-crea Timer Fig 1.1 Figur 1.1 viser s-creatinin over samme periode som u-ngal, på de 3 patienter fra figur 1. 17

18 U-NGAL ng/ml U-NGAL ng/ml Timer Q4 Q14 Q7 Q20 Fig 2 Figur 2 viser de patienter, der havde en mindre markant stigning i u-ngal Q2 Q15 Q Timer Fig 3 Figur 3 viser de patienter, der havde en forhøjet u-ngal ved tiden 0 18

19 U-NGAL ng/ml U-NGAL ng/ml Q19 Q21 Q8 Q13 Q Timer Fig Q1 40 Q3 30 Q Timer Q6 Q17 Q18 Fig 5 Figur 4+5 viser de patienter, der havde lav stigning i u-ngal Gudruns prøve Der er i alt indsamlet prøver fra 25 patienter på Fredericia Sygehus. Denne patientgruppe består af patienter med f.eks. akut nyresvigt oveni kronisk nyresvigt, akut nyresvigt pga. sepsis eller prærenal uræmi som følge af dehydrering. Der er taget minimum 1 prøve pr. patient, dog op til 5 prøver på enkelte 7. Overlæge Gudrun Steffensen, Medicinsk afdeling, Fredericia Sygehus, har været behjælpelig med at inddele patienterne i grupper. 7 Se bilag 1 Gudruns prøver 19

20 U-NGAL ng/ml U-NGAL ng/ml Fig Fig 7 Figur 6 og 7 viser u-ngal værdierne for størstedelen af prøverne i denne gruppe 20

21 NGAL ng/ml U-NGAL ng/ml Fig 8 Figur 8 viser u-ngal værdierne for de 3 mest markante prøver Fælles for figur 6-8 er, at patienterne kun har fået taget NGAL én gang. Derfor er der desværre ikke noget sammenligningsgrundlag. De følgende grafer repræsentere patienter der har fået taget NGAL 2 eller flere gange over en kortere eller længere periode. Det kan være sig over dage eller måneder, dvs. ved flere indlæggelser Prøvenummer 3 urin 3 plasma Fig 9 21

22 NGAL ng/ml NGAL ng/ml NGAL ng/ml p-ngal ng/ml Prøvenummer 4 Fig urin 5 plasma Prøvenummer Fig Prøvenummer 6 urin 6 plasma Fig Prøvenummer 9 urin 9 plasma Fig 13 22

23 NGAL ng/ml NGAL ng/ml NGAL ng/ml Prøvenummer 16 urin 16 plasma Fig Prøvenummer 18 urin 18 plasma Fig Prøvenummer 22 urin 22 plasma Fig 16 Cutoff værdier For at klinikerne skal have nogle værdier at rette sig efter, sætter man nogle grænser for, hvornår en given værdi har klinisk betydning. Overlæge Gudrun Steffensen, Fredericia, er kommet frem til følgende værdier på baggrund af resultaterne: u-ngal: p-ngal: >100 ng/ml >400 ng/ml Det betyder, at hvis en patient har en værdi under de angivne, vil det blive tolket som om, at denne patient ikke har en klinisk signifikant forhøjet NGAL. 23

24 Diskussion Validering Selve processen med at validere analysen, er gået rigtig godt. Det har vist sig at denne metode er meget stabil 8 og kræver derfor sjældent mere end en 1-punkts kalibrering. Formodentlig kun ved skift af lotnr. Præcisionen fandt vi til at være under 4 % både for den interserielle og den intraserielle præcision (se skema 1). Bioporto har bestemt total CV % på den lave kontrol, som vi også analyserede, til at være 3,6 % og for den høje kontrol 2,5 %. Det er præcis det samme resultat som jeg er kommet frem til. I stedet for at analysere den høje kontrol, har vi analyseret en patientprøve, der indeholdt et højere niveau af NGAL, end i kontrollen, men som stadigvæk gav en CV % på 2,5 %. Dermed lever Bioporto Egen CV % lav 3,6 % 3,6 % CV % høj 2,5 % 2,5 % CV % intra 1,2 % 3,85 % Skema 6 9 vores udstyr helt op til forventningerne for denne analyse. Hvis vi ser på den intraserielle præcision, har firmaet en CV % på 1,2 %. Der ligger min på 3,85 %. Grunden til den store forskel kan ligge i, at vi måske ikke har været lige hurtige til at sætte kontrollen på igen til anden omgang. Kontrollen er blevet analyseret i dobbeltbestemmelse, på den samme opdrypning. Dvs. når den første gang er kørt ud af apparatet, blev den sat på igen. Dette skulle gerne ske med det samme, men afhængig af, hvor travlt der har været og hvem der har passet analysepladsen, har der måske været forskel i tiden imellem de to kørsler. Det er umiddelbart den mest sandsynlige forklaring på denne store CV %. Hvis vi skulle lave dette forsøg igen og økonomien ikke havde nogen betydning, ville jeg lave 2 opdrypninger og køre dem i forlængelse af hinanden, for at undgå denne usikkerhed. Vi har desværre ikke noget sammenligningsgrundlag at vurdere præcisionen ud fra, da denne analyse er så ny og der derfor ikke findes nogle data fra Westgard 10 (8). Men fordi de totale CV % er helt magen til producentens, vurdere jeg at, mht. præcision, er resultatet helt tilfredsstillende og acceptabelt. 8 Se bilag Se bilag

25 Bias fandt vi til at være under 4 % (se skema 1) og dette må også siges at være både tilfredsstillende og acceptabelt (8). Og derfor vil der heller ikke blive korrigeret for bias, når analysen bliver sat op. Igen er der ingen sammenlignelige data. Måleusikkerheden har vi beregnet til 8,62 %. Igen findes der ingen sammenlignelige data. Ifølge Overlæge Gudrun Steffensen, Fredericia, vil klinikerne formodentlig godtage en usikkerhed på 25 % på de høje værdier og en usikkerhed på 10 % på de lave værdier. Hvis vi kigger på bias og måleusikkerheden, ser det ud til at vi måske ikke helt kan leve op til kravene for analysen, i hvert ikke i forhold til det lave område. Med en bias på 3,67 % og en måleusikkerhed på 8,62 % tror jeg det bliver svært at komme under de 10 %, som klinikerne gerne vil have. Men det er op til dem, om de vil godtage disse usikkerheder. Mht. det høje niveau, er sagen en helt anden. Her accepteres en måleusikkerhed på 25 % og her falder vores resultater langt inden for grænsen. I og med at både reagens, kontroller og kalibratorer er fra samme firma, Bioporto, er det normal procedure, at der også analyseres en ekstern kontrol engang om dagen /ugen /måneden, som f.eks. kontroller fra DEKS 11. Eftersom denne analyse er så ny som den er, findes der endnu ikke nogen ekstern kontrol på markedet, men det bør tilstræbes at holde øje med markedet og melde sig til lige så snart der findes en. Problematikken i ikke at analysere en ekstern kontrol, består i muligvis ikke at kunne opdage, hvis firmaets, i dette tilfælde Bioporto, kontrol skrider i værdi eller der måske er en fejl på reagenset. Det er derfor yderst vigtigt for at sikre kvaliteten af analysen. Som alternativ til en ekstern kontrol, kan man i en kortere periode, finde en patientprøve, der indeholder et tilstrækkeligt niveau af, i vores tilfælde NGAL, og poole denne prøve ud i passende portioner og fryse dem. Det kræver dog, at man inden ibrugtagning af prøven, som en ko o, ha b m a d væ d og b m g æ fo, hvo m g u a må afv g (8). Dette kan gøres ved at analysere prøven i dobbeltbestemmelse over en periede på mindst 10 dage, ligesom vi har gjort med vores prøve. 11 Dansk Institut for Ekstern Kvalitetssikring for Laboratorier i Sundhedssektoren 25

26 Økonomi Vi vidste godt på forhånd, at denne analyse ville blive rimelig dyr at udbyde, til dels fordi reagenset er dyrt 12 og til dels pga. et lille prøvegrundlag, på ca. 60 prøver i måneden fra Fredericia Sygehus. Kostprisen for 1 analyse har jeg beregnet til ca. 270 kr 13. Her er taget højde for at der vil blive kørt 1 kontrol om dagen. Realistisk set vil der nok ikke komme 1 NGAL prøve hver dag, men måske vil der nærmere komme prøver 4 gange om ugen. Derfor vil det heller ikke være rentabelt at køre 1 kontrol hver dag, men nærmere 1 kontrol hver gang der kommer prøver, dog ikke mere end 1 om dagen. Dvs. at der i realiteten måske kun vil blive kørt 4 kontroller om ugen i stedet for 7 og dermed vil kostprisen også falde. Ideelt set skal vi meget gerne have de andre sygehuse i Region Syddanmark til at få øje på denne analyse og sende prøver til os. Jo flere prøver vi kan analysere, jo billigere bliver det for os at udbyde analysen. Hermed antaget at producenten af reagenset, Bioporto, giver rabat jo mere reagens vi køber. Jannies prøver En teori lyder på, at patienter med okklusiv sygdom i aorta abdominalis, er vant til ikke at have gennemløb i underekstremiteterne og har derfor udviklet kollateral cirkulation via andre arterier. Ved reperfusion, medføre det så ikke et mærkbart inflammatorisk respons, da der har været cirkulation til underekstremiteterne under operationen og der derfor ikke er dannet metabolitter, som f.eks. laktat. Derfor bliver denne patientgruppe ikke specielt påvirket af at have påsat tang i længere tid (3). En anden teori, for patienter med aneurisme sygdomme, går ud på at disse patienter er vant til at have frit løb til underekstremiteterne og derfor bliver påvirket ved reperfusion. Under operationen har der ingen cirkulation været til underekstremiteterne og derfor vil det inflammatoriske respons være meget større end hos den anden gruppe patienter. Der vil blive frigivet en masse metabolitter, der er blevet dannet ved anaerob forbrænding, bl.a. Laktat og frie oxygenradikaler. Disse metabolitter kan påvirke hjertets pumpeevne, karrenes kontraktilitet og permeabilitet og dermed iltforsyningen til vævene. Specielt kan hjerte og nyre tage skade og i værste fald svigte, da disse to organer er meget følsomme overfor disse ændringer (3). 12 Se bilag 4 (regning fra bioporto) 13 Se bilag 1 for beregning økonomi 26

27 Lad os starte med figur 4+5. Her kan vi se de patienter, der havde en lille eller ingen stigning i NGAL. 5 ud af de i alt 11 patienter, er patienter, der er opereret for aneurisme sygdomme. De resterende 6 patienter for okklusive sygdomme. Så for de 6 patienter, der er opereret for okklusive sygdomme passer teorien meget godt, men ikke for de 5 patienter, der er opereret for aneurisme sygdomme. Her burde der, ifølge teorien, have været en stigning i NGAL. Heldigvis har disse patienter ikke oplevet nogen komplikationer. På figur 2 kan vi se, at 4 patienter havde en mindre markant stigning i NGAL. Her er fordelingen ligelig, med 2 okklusive patienter og 2 aneurisme patienter. Hermed ser vi, at de patienter, der har okklusive sygdomme også kan få en målbar nyrepåvirkning. Disse værdier er dog ikke så høje, men det vil jeg diskutere nærmere når jeg kommer ind på cutoff værdierne. Hvis man også kigger på disse 4 patienters s-creatinin 14 kan vi se, at selvom der er en stigning i NGAL, så ændre s-creatinin sig ikke betydeligt. Der ses små stigninger på patient Q4 og Q14, men ikke noget af betydning. På figur 1 er der afbilledet 3 patienter. Disse 3 patienter er alle opereret for aneurismer på aorta abdominalis. Og i alle 3 tilfælde stiger NGAL markant efter timer. Patient Q12 stiger til 1017 ng/ml ved 48 timer. Men denne patient får ikke akut nyresvigt. Han/hun bliver udskrevet og derfor er der ingen værdi for 72 timer. S-creatinin stiger fra 79 til 130 mmol/l, se figur 1.3, men denne stigning finder lægerne ikke signifikant og udskriver derfor patienten (6). Patient Q11 har en meget høj stigning i NGAL efter 48 timer. Stigningen i s-creatinin er ikke lige så markant, se figur 1.2, men dog betydelig. Denne patient blev dialysekrævende, da han/hun fik det dårligt og holdt op med at urinere. Dialysen er opstartet allerede på dag 2, på baggrund af ovennævnte og andre analyser. Det endte desværre med at patienten døde (6). I dette tilfælde, hvis man kun skulle se på NGAL, ville patienten først være kommet i dialyse efter 48 timer og måske allerede havde været død inden da. Patient Q9 har en høj stigning i NGAL allerede efter 24 timer. Denne patient udviklede pancreatit 15 og det medførte dialyse på 3. dagen pga. nyresvigt. Derudover fik patienten også tarmiskæmi 16 med efterfølgende sepsis og måtte opereres igen. Patienten overlevede (6). I dette tilfælde var NGAL allerede forhøjet efter 24 timer. S-creatinin var kun let forhøjet, se figur 1.1, så her burde man kunne reagere på NGAL. 14 Se bilag 1, Jannies prøver 15 Inflammation i pancreas 16 Også kaldet sort (død) tarm 27

28 Om patienten skulle have været i dialyse tidligere, ud fra NGAL resultatet, er jeg ikke sikker på, men med en NGAL værdi på 2473 ng/ml ved 48 timer burde lægerne reagere. Endelig er der 3 patienter, som lægger ud med at have en forhøjet NGAL, se figur 3. Der er 2 patienter med okklusiv sygdom og 1 med aneurisme sygdom. Umiddelbart har jeg ikke nogen god forklaring på, hvorfor graferne ser sådan ud. Måske er der uheldigvis kommet lidt epitelceller med ud, ved den første urinprøve, der er taget fra kateter og der er der sket en falsk stigning i NGAL. Alt i alt har 3 ud af 21 patienter haft meget forhøjet NGAL værdier. To af disse patienter udviklede akut nyresvigt, hvoraf den ene døde. Begge patienter blev dialysekrævende og om dette kunne være forhindret, kan jeg ikke svare på. Men hvis sandsynligheden for at en tidlig opdagelse af forhøjet NGAL, vil gøre lægerne mere opmærksomme på at sætte hurtigt og præventivt ind, mener jeg at det godt kan svare sig at bruge NGAL i forbindelse med disse typer oprationer. Ikke nødvendigvis alene, men sammen med s-creatinin og andre biokemiske markører. I dette forsøg kunne det også have været spændende at have taget en NGAL efter hhv. 2,4,8 og 12 timer oveni de andre prøver. Flere artikler (13) (14) nævner nemlig, at NGAL stiger meget hurtigt efter nyreskade og derved kunne man måske behandle disse patienter endnu tidligere og måske undgå, at de udviklede akut nyresvigt. Gudruns prøver Patientprøverne fra Fredericia er fra en meget blandet gruppe af patienter og derfor kan vi ikke dele dem op på samme måde som vi gjorde med de operative patienter fra Kolding, hvor de var delt op i 2 grupper. Teorien bag, hvorfor man måske kan bruge NGAL ved akut indlagt patienter er derfor også lidt anderledes, men i bund og grund handler det om, hvor hurtigt man kan opdage ændringer i nyrernes funktion og dermed sætte ind med forebyggende behandling. Denne patientgruppe kan både have prærenale og postrenale komplikationer, sepsis og meget andet som kan have indflydelse på nyrernes funktion (4). Resultaterne herfra er meget blandede, mest pga. diversiteten i patientgrundlaget og antallet af patientprøver. Og derfor kan det også være svært at udlede noget af resultaterne. Men jeg prøver alligevel. 28

29 Akut nyresvigt Hos 6 patienter 17 er der en sammenhæng mellem u-ngal og udviklingen af akut nyresvigt. Og p-ngal følger også med. S-creatinin er også forhøjet hos alle 6 patienter 18. Hvis vi kigger på patient nr. 16, kan vi se at u-ngal er meget forhøjet ved ankomst. Men allerede efter knap 24 timer er værdien næsten halveret. Det samme gør sig gældende for både p-ngal og s-creatinin. Det må betyde at patienten er kommet i behandling og at denne virker. Jeg vil mene, at i disse tilfælde, hvor s-creatinin er så meget forhøjet, allerede ved ankomst til sygehuset, er det ikke nødvendigt at tage NGAL, da den ikke vil kunne bidrage med noget nyt til diagnosticering. Men på den anden side, ved klinikerne ikke hvordan patientens værdier ser ud ved ankomst til sygehuset og derfor kunne det være en god ide at tage u-ngal sammen med det første hold prøver, der bliver taget på patienten. Dette ville måske sikre, at et evt. begyndende nyresvigt kunne opdages tidligere. Sepsis P-NGAL kan måske bruges til at hjælpe med at diagnosticere patienter med sepsis. Her vil u-ngal ikke være forhøjet, jf. patient 1. Denne patient har en lav u-ngal, en høj p- NGAL og en lav s-creatinin. Denne patient blev diagnosticeret med sepsis, dog fik patienten efterfølgende akut nyresvigt som følge af sepsis. Det gjorde patient 2 også, men her så tallene lidt anderledes ud. En høj u- NGAL, en høj p-ngal og en høj s-creatinin. Denne patient viste sig også at have en tumor i urinvejene, der afspejlede sig i den høje u- NGAL og s-creatinin. Også denne patient fik akut nyresvigt som følge af sepsis. I disse tilfælde skal klinikerne måske både være observante på u-ngal og p-ngal, da der umiddelbart i forbindelse med sepsis kan opstå akut nyresvigt (4). Prærenal uræmi En del af patienterne, nærmere sagt 5 patienter, er blevet indlagt pga. prærenal uræmi, dehydrering. I teorien burde disse patienter ikke have forhøjede værdier, da problemet ligger før nyrerne ud af de 5 patienter har dog forhøjede u-ngal og s-creatinin. Forklaringen kan i dette tilfælde være, at alle disse patienter har kronisk nyreinsufficiens og derfor kan have forhøjede værdier (13) (4). Hvis vi ser på p-ngal på de samme 3 patienter, kan vi se at den også er forhøjet. Og i disse tilfælde med dehydrering, kan p- NGAL måske bruges til at forudsige en evt. prærenal nyreskade. Et mindre studie har vist en forhøjet p-ngal hos patienter med dehydrering, i forhold til kontrolgruppen (15). 17 Nr Se fig og bilag 1 Gudruns prøver 19 Patient nr

30 Postrenal uræmi 3 patienter 20 er blevet indlagt og diagnosticeret med postrenal uræmi, som følge af prostata hypertrofi. Dette er en tilstand, hvor prostata er forstørret og derfor trykker ind på øverste del af urinrøret og kan medføre obstruktion af urinvejen og dermed ophobning af urin i blæren (16). Da dette er et problem, der ligger efter nyrerne, burde der i teorien ikke være forhøjede NGAL værdier. Patient nr. 22 passer fint ind i den teori, med en nogenlunde normal u-ngal, dog med en lidt forhøjet p-ngal. Patient nr. 8 har en meget forhøjet u- NGAL og det kunne tyde på akut nyresvigt, som følge af postrenal uræmi. Men det er svært at sige mere, når der kun er taget en prøve på patienten. Patient nr. 20 har en let forhøjet u-ngal og burde måske monitoreres, for at se om der sker en yderligere stigning. Alle tre patienter har forhøjet s-creatinin og det stemmer meget godt overens med, at de måske har en kronisk nyrerinsufficiens. Hæmatologiske lidelser 3 21 patienter er blevet diagnosticeret med akut nyresvigt pga. hæmatologiske lidelser. Patient nr. 4 er diagnosticeret med myelomatose 22, som kan give hypercalcæmi og nyrepåvirkning (17). Det har ikke været muligt at fratage urin på denne patient, så i dette tilfælde kan vi kun se på p-ngal og s-creatinin. S-creatinin er meget forhøjet og det tyder på akut nyresvigt. P-NGAL er også forhøjet og det peger også i retning af nyresvigt, men måske har canceren også bidraget til stigningen i p-ngal (18). Patient nr. 10 har en meget forhøjet u-ngal og forhøjet s-creatinin. Denne patient har akut nyresvigt pga. en hæmatologisk lidelse. Det samme gør sig gældende for patient nr. 6. Denne patient har været indlagt af to omgange pga. dehydrering. Første gang bliver der målt en forhøjet u- NGAL og s-creatinin. I anden omgang bliver der målt endnu højere værdier, som efterfølgende falder ved behandling af symptomerne. Ved denne patient er årsagen amyloidose 23 (19). Kronisk nyreinsufficiens To patienter 24 er diagnosticeret med kronisk nyresvigt. Derudover har de fået akut nyresvigt. I disse tilfælde, hvor baseline NGAL kan være forhøjet i forhold til normale patienter, er det ekstra vigtigt at klinikerne er opmærksomme. Patient nr. 7 har en forhøjet 20 Patient nr Patient nr Alvorlig kræftsygdom i knoglemarven 23 En sjælden aflejringssygdom 24 Patient nr

31 u-ngal og p-ngal. I dette tilfælde kan den høje p-ngal formodentlig forklares ved, at patienten har KOL og hjertesvigt (20). Ved patient nr. 9 kan jeg ikke lige gennemskue, hvad klinikerne har brugt som begrundelse for akut i kronisk, men patienten er måske kendt med kronisk nyreinsufficiens og ved at kigge på de gamle værdier og forholde de nye værdier dertil, er de kommet frem til diagnosen. Opsamling At arbejde med så mange forskellige patientgrupper kan godt være lidt uoverskueligt. Jeg har her prøvet at gøre det lidt mere overskueligt, ved at inddele patienter i grupper og jeg synes faktisk det er lykkes meget godt. Endvidere ser det ud til, at stort set alle de patienter, der er blevet taget prøver på i Fredericia, er patienter med akut nyresvigt. Og her mener jeg, at u-ngal kan være en god parameter til at hjælpe klinikerne med at pejle sig ind på, hvad patienten fejler. Cutoff værdier De to værdier, som jeg har anført, er fremkommet efter grundig gennemgang af patientresultaterne fra Fredericia og fastsat af Læge Gudrun Steffensen. Eftersom patientgrundlaget ikke er særlig stort her, vil det være sandsynligt at disse cutoff værdier vil blive modificeret med tiden, som vi får flere data indsamlet. Værdierne skal jo helst tilpasses, så der ikke overses nogen patienter. Vigtigheden af at have disse cutoff værdier, kommer til udtryk, når resultaterne viser, at enten u-ngal eller p-ngal er forhøjet, se figur 2. Disse værdier er forhøjet i forhold til baseline, men ikke så meget, at klinikerne vil reagere på dem. Og dermed ville der sandsynligvis ikke blive taget flere NGAL prøver fra disse patienter, hvis de nu havde væ a m d g d ag pa og kk pa, d va m d fo øg. Perspektivering Efter at have brugt megen tid på at finde læsestof om NGAL og undersøge, hvad det egentlig er for en størrelse, er jeg kommet til den konklusion, at dette område kræver megen forskning endnu. Jeg mener ikke, på baggrund af vores resultater, at vi kan træffe nogle endelige beslutninger, om hvorvidt NGAL er en god markør for akut nyresvigt. Det er patientgrundlaget simpelthen for spinkelt til. Ifølge flere artikler skulle NGAL være en up hu g ma kø fo aku y v g, v d a d a g f 2 m (14) (13). Det har jeg ikke set noget bevis på i vores resultater, men vi har heller ikke haft mulighed for at 31

32 måle NGAL før efter 24 timer. Vores resultater viser, at det først er efter ca. 24 timer eller mere, at NGAL stiger. Det er stadigvæk, i de fleste tilfælde, hurtigere end s-creatinin, men ikke nær så hurtigt som flere undersøgelser viser. Dog skal denne markør ikke stå alene og ikke afløse s-c a om Go d a da d. d ku ma æ pa op, d kunne bestå af forskellige markører. S-creatinin og u-ngal skulle i hvert fald være med og så kunne man kigge på nogle af de andre nyre markører, som forskerne er ved at få øjnene op for. Det kunne f.eks. være cystatin C og/eller KIM 1 (21) (22). Disse markøre, inklusiv NGAL, fortæller hver især noget om, hvor i nyrerne der er noget galt. F.eks. om det er proximalt eller distalt tubulært. Ved at have et panel af forskellige biomarkører kan man hurtigere spore sig ind på, hvad der forårsager akut nyresvigt. Lidt ligesom man har et panel af levermarkører i form af gamma-gt (ggt), alanintransaminase (alat) og bilirubin (bili). Og netop derfor mener jeg at dette område kræver stor opmærksomhed i fremtiden. Det er et område i rivende udvikling, hvor der hele tiden publiceres nye data om forskellige nye biomarkører og deres anvendelse. Derfor mener jeg, at vi skal tage del i denne udvikling og ved at tilbyde NGAL analysen, kan vi indsamle en masse værdifuld viden omkring denne markør og brugen af den til netop vores patienter. Konklusion Hvilke konsekvenser har det for patienten at få målt NGAL i stedet for/sammen med creatinin? Konsekvensen af, at patienten får målt NGAL sammen med creatinin er, at chancerne for, at en ændring i nyrernes funktion vil blive opdaget tidligere, end kun ved at måle creatinin, er højere, da NGAL stiger før creatinin. Derfor er det kun til patientens fordel at få målt NGAL. Hvilke konsekvenser har det for Klinisk Biokemisk Afd. på Fredericia Sygehus, at indføre analysen? Konsekvensen for KBA, Fredericia, er en øget økonomisk belastning. Denne analyse er meget dyr og kræver derfor, at prøveantallet bliver større for at afdelingen kan sænke prisen og dermed gøre analysen mere attraktiv for andre sygehuse. Jo flere analyser vi kan sælge, jo billigere bliver de. 32

33 På personalesiden, har indførslen af analysen ikke nogen mærkbare konsekvenser. Antallet af prøver, der bliver analyseret på apparatet pr. dag vil stige en lille smule, men det er ikke noget mærkbart og har ingen betydning for den daglige arbejdsgang på laboratoriet eller ved apparatet. 33

34 Bibliografi 1. [Online] 2. [Online] 3. Bisgaard, Jannie. Afklemning af abdominale aorta ved elektiv åben kirurgi. Protokol Steffensen, Gudrun; Overlæge, Medicinsk Afdeling, SLB, Fredericia Sygehus. 5. Abassi Z, Sagi O, Armaly Z, Bishara B. [Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NAGL): a novel biomarker for acute kidney injury].;150(2):111-6, 207, Feb. 6. Bisgaard, Jannie; Læge, Kolding Sygehus, Sygehus Lillebælt. 7. Validering af analysemetoder. Klinisk Biokemi, VS. Sygehus Lillebælt. Version Jørgensen, Poul Jørgen, Kemiker, SLB, Kolding Sygehus. 9. Roche. 10-DP. Module - photometric principles. s RL Tholen, Daniel W., et al. Evaluation of precision performance og quantative measurement methods; approved guideline - second edition [Online] 13. Biomarkers in acute kidney injury. Scientific symposium on biomarkers in acute kidney injury. s.l. : Elsevier, Mishra, Jaya, et al. Neutrphil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a biomarker for acute renal injury after cardiac surgery. Lancet. 2005, Årg. 365: Antonopoulos, Constantine N, et al. Neutrolphil gelatinase-associated lipocalin in dehydrated patients: a preliminary report (prostatahypertrofi)/. [Online] [Citeret: ] [Online] [Citeret: ] 18. Smertka, Mike og Chudek, Jerzy. Using NGAL as an early diagnostic test of acute kidney injury. Informa healthcare. 34(1): , [Online] [Citeret: ] 20. Breidthardt, Tobias, et al. A combined cardiorenal assessment for the prediction of acute kidney injury in lower respiratory tract infections. The american journal of medicine

35 21. Nickolas, Thomas L., et al. Diagnostic and prognostic stratification in the emergency department using urinay biomarker of nephron damage. Journal of the American College of cariology. 59, 2012, Waring, W. Stephen og Moonie, Alasdair. Earlier recognition of nephrotoxicity using novel biomarkers of acute kidney injury. Clinical toxicology. 49: , Bashir, Asma. [Online] 35