Påvisning af p16 på celleblokke fra cervixcytologisk materiale

Transkript

1 Påvisning af p16 på celleblokke fra cervixcytologisk materiale Immunfarvning med p16(jc8) fra ASC-H 8(2) forstørrelse x40 Forsøg udført af: Anne Obling Madsen og Marie Kjøller-Hansen Professionsbachelorrapport skrevet af: Marie Kjøller-Hansen, Professionsbachelorprojektsted: Patologiafdelingen Hillerød Hospital, Region Hovedstaden Periode: uge 12, 2012 uge 25, 2012 Uddannelsessted: Bioanalytikeruddannelsen København Vejledere: Marianne Brandt og Susanne Wahl Side 6 af 44

2 Resume Problembaggrund Betydningen, af p16(jc8) immunfarvning på celleblokke fremstillet af cervixcytologisk restmateriale fra SurePath med diagnosen ASC-H, samt hvilken betydning det vil have for opfølgningen ved diagnosen ASC-H, er blevet undersøgt i dette professionsbachelorprojekt. At udføre p16(jc8) immunfarvning på celleblokke kan være et velegnet supplement til tidligere at vurdere hvilke patienter, der skal henvises til gynækologisk speciallæge med henblik på KBC til videre udredning af sværhedsgraden af celleforandringer diagnosticeret ASC-H. Metode Der er anvendt 27 prøver der ved PAP-smear har fået diagnosen ASC-H. Af prøvematerialet er der fremstillet koagler og celleblokke, som derefter er immunfarvet med p16(jc8). Resultatet af immunfarvningen er sammenlignet med den efterfølgende histologiske diagnose, og den diagnostiske sensitivitet og specificitet er beregnet for at vurdere anvendeligheden af den undersøgte metode. Der blev desuden udført McNemar s test for at vurdere, hvorvidt der var statistisk signifikant forskel på hhv. p16(jc8) immunfarvning på celleblokke og den histologiske diagnose. Resultater Af de 27 undersøgte prøver blev 15 ved p16(jc8) immunfarvning vurderet positive, og 12 af de 27 prøver vurderet negative. Der var histologisk opfølgning på 20 af de 27 undersøgte prøver. Af prøverne med histologisk opfølgning, udgjorde sandt positive 10, sandt negative udgjorde 5, falsk positive udgjorde 1, og falsk negative udgjorde 4 prøver. Den diagnostiske sensitivitet var 71,43 % og den diagnostiske specificitet var 83,33 %. Resultatet af McNemar s test viste at der ikke var statistisk signifikant forskel på de to metoder. Konklusion På baggrund af resultaterne kan det konkluderes, at p16(jc8) immunfarvning på celleblokke med diagnosen ASC-H er et velegnet supplement til at bestemme hvilke kvinder, der skal henvises til gynækologisk speciallæge med henblik på KBC.

3 Indholdsfortegnelse Resume Liste over forkortelser Introduktion... 6 Problembaggrund... 6 Fremgangsmåde patologiafdelingen Hillerød Hospital... 6 Problemformulering... 7 Metodevalg... 8 Prøvemateriale... 8 Antallet af prøver... 9 Koagler... 9 Immunfarvning Kontroller Resultatvurdering Resultatbehandling Teori Klassificering af hhv. cytologiske og histologiske diagnoser Human Papillomavirus (HPV) p16ink4a ASC-H Fiksering Analyseprincip for p16(jc8) immunfarvning på Leica Bond Diagnostisk sensitivitet og specificitet McNemar s test Kappa Materialer og Metode Prøvemateriale Materialer Metode Fremstilling af koagel og celleblokke Skæring af snit HE-farvning... 20

4 Immunfarvning Resultater Resultatskema Resultatskema Resultatskema Diagnostisk sensitivitet og specificitet McNemar s test Kappa Diskussion Præanalytiske forhold Opbevaring i præserveringsvæske Fremstilling af koagel, fiksering, paraffinindstøbning samt skæring af snit Analytiske forhold Kontroller Postanalytiske forhold Resultatvurdering Resultatbehandling Falsk negative og falsk positiv McNemar s test Diagnostisk sensitivitet og specificitet Diagnostiske kvalitetsparametre Ændring af kriterier p16(jc8) immunfarvning på celleblokke som gylden standard Konklusion Perspektivering Litteraturliste Bilag 1: Sundhedsstyrrelsens flowdiagram for opfølgning (2) Bilag 2: Skema over steps i Bond en... 43

5 Liste over forkortelser AIS: Adenocarcinom in situ ASCUS: Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance ASC-H: Atypical Squamous Cells cannot exclude HSIL CIN I: Cervikal Intraepitelial Neoplasi grad I CIN II: Cervikal Intraepitelial Neoplasi grad II CIN III: Cervikal Intraepitelial Neoplasi grad III E-region: Early region HC2: Hybrid Capture 2, anvendes til HPV test HPV: Human Papilloma Virus HSIL: High-grade Squamous Intraepithelial Lesion HE: Hæmatoxylin/Eosin Y H: Høj KBC: kolposkopi, biopsi, cervixskrab K/C ratio: Kerne/Cytoplasma ratio L-region: Late region L: Lav LSIL: Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion N: Negativ p16ink4a: Antigenet p16ink4a p16(jc8): p16 antistof klon JC8 Papanicolau: PAP P: Positiv Rb: retinoblastom Rpm: Rounds per minute SCC: Squamous Cell Carcinoma URR: Upstream Regulatory Regi

6 Introduktion Problembaggrund Cervixcancer er den anden mest udbredte kræftform for kvinder verden over (1). I Danmark er der et screeningsprogram for forstadier til cervixcancer. Deltagelse i screeningsprogrammet tilbydes til alle kvinder i alderen år. Kvinder mellem 23 og 49 år tilbydes screening hvert tredje år, og kvinder mellem 50 og 64 år tilbydes screening hvert femte år (2). Globalt er dødeligheden for cervixcancer faldet markant, siden screeningsprogrammer med Papanicolaufarvning (PAP-farvning) af smears fra cervix blev indført (3). I Danmark konstateres der i gennemsnit 382 nye tilfælde af cervixcancer årligt. Dette kan skyldes manglende deltagelse i screeningsprogrammet, fejlfortolkning af prøver eller manglende opfølgning på abnorme prøvesvar (2). Celleforandringer der kan føre til cervixcancer skyldes overvejende infektion med Human Papillomavirus (HPV) (4). Fremgangsmåde patologiafdelingen Hillerød Hospital På patologiafdelingen på Hillerød Hospital anvendes væskebaseret metode fra SurePath efterfulgt af PAPfarvning som primær screening. Afdelingen modtager celleprøver fra cervix fra praktiserende læger og gynækologiske speciallæger i Region Hovedstaden Nord, Grønland, Færøerne og Bornholm. Er en kvinde to gange i træk blevet klassificeret som low-grade intraepiethelial lesion (LSIL) eller atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS), eller fået diagnosen atypical squamous cells cannot exclude HSIL (ASC-H) eller high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL), sendes kvinden til gynækolog for videre udredning. Hos gynækologen bliver der udført kolposkopi, portiobiopsi og cervixskrab (KBC). Snit fra portiobiopsien bliver farvet med Hæmatoxylin/Eosin y (HE-farvning) og immunfarvet med p16 klon JC8 (p16(jc8)) på patologi afdelingen. Resultatet af disse to farvninger vurderes mikroskopisk, og derved kan graden af dysplasi klassificeres. For klassifikation af hhv. cytologiske- og histologiske diagnoser henvises til teoriafsnittet. Immunfarvning med p16 er en sensitiv markør for celler med dysplastiske forandringer, afhængig af hvor fremskredne forandringerne er (5). Ved den histologiske opfølgning kan det be- eller afkræftes hvorvidt der er tale om dysplastiske forandringer, og det viser sig ofte at mange af de kvinder, der bliver henvist til gynækolog med henblik på at få foretaget KBC, ikke har dysplastiske forandringer (2). På baggrund af dette har jeg en formodning om, at mange kvinder bliver overdiagnosticerede. Især diagnosen ASC-H volder problemer. Oftest viser det sig, at der ikke er dysplastiske celler ved immunfarvning med p16 på vævssnit fra biopsien, men i de tilfælde hvor der er dysplastiske celler, vil det være af en grad svarende til HSIL for cytologisk materiale(5). At udføre immunfarvning med p16(jc8) på celleblokke fremstillet af cervixcytologisk restmateriale kan måske hjælpe til at be- eller afkræfte diagnosen ASC-H fra PAP-smear hurtigere. Immunfarvning med p16(jc8) på celleblokke kan derfor være en god indikator for om patientens diagnose ASC-H skyldes dysplastiske forandringer(5). Metoderne, der i dag anvendes til primær screening for cervixcancer, har stadig en høj rate af falsk positive og falsk negative diagnoser, og der er derfor stor interesse for at udvikle metodens validitet (5). Side 6 af 44

7 Immunfarvning med p16(jc8) kan anvendes som indikator for dysplastiske forandringer ved ASC-H, og derved hjælpe til at mindske overdiagnosticeringen, idet kvinder, hvis histologiske opfølgning viser sig ikke at udtrykke p16ink4a, kunne have undgået at blive sendt til gynækolog (5). Man vil kunne nedsætte overdiagnosticeringen og dermed overbehandlingen af celleforandringer, hvis man kunne indføre en teknik, der dels opdager dysplastiske forandringer hurtigere, dels anvender det prøvemateriale, man allerede har og dels nedbringer antallet af falsk positive (5). Yu et. al. og Liu et. al. (3,5) beskriver metoder til at fremstille kunstige koagler fra cervixcytologisk materiale. Det beskrives, at immunfarvning med p16 på snit fra celleblokke, kan anvendes som et supplement til PAP-smear, og herved øge den diagnostiske sensitivitet, og derved nedsætte andelen af falsk positive diagnoser. For at forbedre den diagnostiske specificitet for ASC-H på PAP-smear og nedsætte antallet af kvinder der får foretaget KBC, vil jeg undersøge anvendeligheden af immunfarvning med p16(jc8) på celleblokke fremstillet af væskebaserede cervixcytologiske prøver fra SurePath. I dette professionsbachelorprojekt vil jeg derfor fremstille koagler af cervixcytologisk restmateriale fra patienter med diagnosen ASC-H, og derefter udføre immunfarvning med p16(jc8) på den fremstillede celleblok. Ved at lave immunhistokemi med p16(jc8) på celleblokke fra cervixcytologisk restmateriale, kan man adskille de normale celler fra celler med dysplastiske forandringer, og dermed eventuelt nedsætte overdiagnosticeringen samt antallet af kvinder der bliver sendt til gynækolog. Dermed kan mange kvinder måske undgå at få foretaget KBC. Dette leder mig frem til følgende problemformulering: Problemformulering Hvilken betydning vil den diagnostiske sensitivitet og specificitet få ved indføring af p16(jc8) immunfarvning på celleblokke fremstillet af cervixcytologisk restmateriale fra SurePath i forhold til diagnosen ASC-H, og hvilken betydning vil det have for opfølgningen ved diagnosen ASC-H? Side 7 af 44

8 Hvis den undersøgte metode kan anvendes og implementeres i det primære screeningsprogram, kan forløbet for cytologisk opfølgning ved diagnosen ASC-H, se ud som i figur 1. For nuværende flowdiagram henvises til bilag 1, Sundhedsstyrelsens anbefalinger for screening for livmoderhalskræft 2012 (2). ASC-H p16(jc8) immunfarvning på celleblok p16(jc8) positiv p16(jc8) negativ Henvisning til gynækologisk speciallæge med henblik på KBC Ny cytologi om 12 måneder Normale celler Abnorme celler, følg skema forfra (bilag1) Retur til screeningsprogram Figur 1 viser mit forslag til flowdiagram for opfølgning ved diagnosen ASC-H Metodevalg På baggrund af problemformuleringen har jeg valgt at anvende cytologisk restmateriale fra SurePath systemet med diagnosen ASC-H. Dette er den mest interessante diagnose, idet der ved denne kategori er stor risiko for overdiagnosticering, da den histologiske opfølgning ofte viser sig at være negativ (5). Prøvemateriale Indsamling af prøvemateriale og fremstilling af koagler startede i uge og varede til og med uge Jeg valgte at starte indsamlingen af prøver og fremstille koagler inden bachelorperioden for at være sikker på at have nok prøver med diagnosen ASC-H, og desuden for at sikre at koaglet blev fremstillet og paraffinindstøbt af friskt materiale. Dette har jeg gjort for at sikre, at cellematerialet ikke er blevet påvirket af den præserveringsvæske, cellematerialet opbevares i. Prøvematerialet opbevares i præserveringsvæske ved stuetemperatur i maksimum 14 dage inden fremstilling af celleblokken. Jeg har Side 8 af 44

9 desuden noteret, hvornår hver enkelt prøve er blevet lavet til celleblok for at kunne holde øje med, hvor længe cellematerialet har stået i præserveringsvæske, fra det blev modtaget, til det blev lavet til koagel, da det ikke vides, om opbevaring i længere tid kan påvirke cellematerialet og dermed resultatet af immunfarvningen. Dette er med til at give et så realistisk og virkelighedstro billede som muligt, idet man i rutinen ikke vil fremstille koagler og udføre immunfarvning flere måneder efter modtagelse af prøvematerialet. Jeg har valgt kun at anvende restmateriale fra prøver, der allerede er svaret ud, for ikke at komme til at bruge materiale, der skulle være lavet ekstra analyser på. Idet der er indsamlet prøvemateriale over længere tid, vil der være større sandsynlighed for at patienten har fået lavet en biopsi, jeg efterfølgende kan sammenligne med resultaterne for immunfarvningen af celleblokkene. Idet der kun anvendes cellemateriale med diagnosen ASC-H, kan jeg alene udtale mig om sensitiviteten og specificiteten for resultaterne fra immunfarvning med p16(jc8) på celleblokke med diagnosen ASC-H, og ikke anvendeligheden af immunfarvning med p16(jc8) på celleblokke med andre diagnoser. Antallet af prøver Da dette er et professionsbachelorprojekt med begrænsede økonomiske midler, og tiden til udførelse af projektet og resultatbehandling er en begrænsende faktor, har jeg anvendt 27 patientprøver med diagnosen ASC-H. Dette professionsbachelorprojekt kan ses som et pilotforsøg til at vurdere anvendeligheden af p16(jc8) immunfarvning på celleblokke, da der kun er blevet anvendt 27 patientprøver. Det ville kræve et større studie med flere patientprøver, og desuden immunfarvning på celleblokke på et bredere spektrum af diagnoser, hvis der skulle ændres i procedurerne på patologiafdelingerne og Sundhedsstyrelsens anbefalinger for screening for cervixcancer. Koagler Fremstilling af koagler fra restmateriale diagnosticeret ASC-H har jeg valgt at udføre med plasma og CaCl 2, da en medstuderende som eksamensprojekt på modul 11 udførte et forsøg, hvor forskellige metoder til dannelse af koagler af cervixcytologisk restmateriale blev afprøvet. Metoderne, der blev afprøvet til dannelse af koagler, var plasma og trombin, Histogel TM, og plasma og CaCl 2. Dette forsøg viste, at plasma og CaCl 2 var den bedste og nemmeste metode til fremstilling af celleblokke og samtidig bedst bevarede cellernes morfologi. Yu et. al. (3) har ligeledes arbejdet med plasma og CaCl 2 til fremstilling af celleblokke fra cervixcytologisk materiale. CaCl 2 er billigere at anvende end trombin, der oftest anvendes til fremstilling af kunstige koagler, og resultatet, der opnås, er lige så godt. Celleblokkene blev fremført til paraffin på vævsfremføringsmaskinen Tissue-Tek VIP, og herefter blev cellekoagelerne indstøbt i paraffinblokke. De fremstillede celleblokke er klar til skæring af snit til objektglas og immunfarvning med p16(jc8) og oversigtsfarvning med HE. Fra hver celleblok blev der skåret fire snit: Et snit til HE-farvning for at få et morfologisk billede af cellerne i snittet samt for at kunne vurdere celletætheden, for at kunne bedømme anvendeligheden af snittet, da der skal være nok celler til at man kan stole på resultatet af immunfarvningen. Et snit til immunfarvning med p16(jc8) De to sidste snit forbliver ufarvede, hvis jeg får brug for at lave en ekstra farvning. Side 9 af 44

10 Immunfarvning Jeg har valgt at lave immunfarvning med p16(jc8) på snit fra de fremstillede celleblokke, da p16ink4a udtrykkes 100 % ved diagnoserne HSIL og squamous cell carcinom (SCC) (5). Liu et. al.(5) beskriver at p16 immunfarvning kan anvendes som indikator for dysplastiske forandringer ved ASC-H, og derved kan man frasortere patientprøver, der ikke indeholder celler med dysplastiske forandringer. Immunfarvningerne udføres på en Bond immunfarvningsmaskine. Kontroller En medstuderende har udført p16(jc8) immunfarvning på et snit fra en celleblok med diagnosen HSIL vurderet fra PAP-smear. Denne farvning viste en kraftig brunfarvning af cellerne ved HSIL. Jeg har derfor en formodning om, at p16(jc8) er god til at adskille normale celler fra celler med svære dysplastiske forandringer i prøvemateriale, der ved PAP-smear har fået diagnosen ASC-H. Som positiv kontrol ved hver immunfarvning anvendes derfor en celleblok fremstillet af en celleprøve med diagnosen HSIL ved PAPfarvning, idet forsøg har vist at 100 % af HSIL celler udtrykker p16ink4a (5). Kontrolblokken er fremstillet på samme måde som de 27 patientprøver og har fået samme forbehandling, for at sikre, at de reagerer ens. Kontrollerne anvendes til at vurdere p16(jc8) immunfarvningerne fra forsøget. Fra kontrolblokken skæres 12 snit. To til HE-farvning og 10 til immunfarvning. HE-snittene skæres som snit 1 og 7 i serien af 12. Dette gøres for at kunne bedømme, om celletætheden er bevaret i alle snittene, så jeg derved kan stole på mine kontroller. Kontrolsnittet ved hver immunfarvning skal være positivt, før jeg kan regne med mine resultater fra hver immunfarvning. Der er ikke anvendt negative kontroller, da dette ikke er praksis på afdelingen, hvor projektet udføres. Resultatvurdering For at vurdere en prøve positiv vil jeg tage udgangspunkt i Yu et. al. s (3)og Meyer et. al s (6) kriterier: Der skal være brunfarvning af kernen eller kerne og cytoplasma for at udelukke uspecifik baggrundsfarvning. Cytoplasmafarvning alene vil være udtryk for uspecifik baggrundsfarvning. Farveintensiteten vurderes som 0, + eller ++. Ffor at en celle kan tælles med som p16ink4a positiv, skal det være en pladeepitelcelle med morfologiske kerneforandringer. Celletætheden skal ligeledes vurderes, idet der skal være et repræsentativt antal celler i snittet. Liu et. al. (5) vurderer celletætheden mikroskopisk med lav, moderat og høj cellularitet (5). Celletætheden vurderes fra mine HE-snit, og vurderes som høj (H) eller lav (L). Kriterierne er inspireret af Yu et. al., Liu et. al. og Meyer et. al. (3, 5, 6), og for at vurdere anvendeligheden af metoden og resultatet af immunfarvningen, vurderes HE-snittene og immunfarvningen med p16(jc8) ud fra nedenstående kriterier: HE- snit: Hvor stor er celletætheden? Dette er afgørende for om snittet kan anvendes. Er celletætheden lav, men der ses >10 suspekte pladeepitel celler kan snittet stadig anvendes. Høj (H) pladeepitel celler per snit Lav (L) - < 100 pladeepitel celler per snit Side 10 af 44

11 Antal suspekte pladeepitel celler i HE-snit: Der skal være 3 suspekte pladeepitelceller repræsenteret i snittet, for at dette kan anvendes. < 3 suspekte pladeepitel celler 3-10 suspekte pladeepitel celler >10 suspekte pladeepitel celler p16(jc8)- snit: Farveintensiteten vurderes. Brunfarvning af kerne eller kerne og cytoplasma: 0 ingen farvning + - brunfarvning Kraftig brunfarvning. Antal p16ink4a positive pladeepitel celler: * < 3 positive pladeepitel celler ** 3-10 positive pladeepitel celler *** >10 positive pladeepitel celler For at et snit kan vurderes positivt eller negativt for p16ink4a anvendes skemaet i tabel 1. Positivt resultat indikerer dysplastiske celleforandringer. Et negativt resultat betyder ingen dysplastiske celleforandringer, men at diagnosen ASC-H fra PAP-smearet kan skyldes reaktive forandringer. Positiv (P) Negativ (N) + og *** 0 og * ++ og *** 0 og ** ++ og ** 0 og *** + og * + og ** ++ og * Tabel 1, kriterier for hvornår et p16(jc8) immunfarvet snit er hhv. positiv og negativ. Der skal desuden være de samme typer celler repræsenteret i snittet fra celleblokken, som i det PAP-smear den pågældende prøve blev diagnosticeret fra. Hvis en HE-farvning eller p16(jc8) immunfarvning ikke indeholder nogle suspekte celler, vil jeg desuden finde det oprindelige PAP-smear frem for at se på cellerne ved PAP-farvningen, for at vurdere antallet af suspekte celler i prøven. Dette gøres for at vurdere, hvor mange p16ink4a positive celler det kan forventes at finde i snittet fra celleblokken. På de prøver, hvor det er muligt, vil jeg holde resultatet af immunfarvningen med p16(jc8) på celleblokken op mod efterfølgende diagnose på histologiske snit fra biopsi fra samme patient, for at finde ud af om mine resultater stemmer overens med den histologiske opfølgning. Jeg vil derfor anvende den histologiske opfølgning som gylden standard for diagnosen. Side 11 af 44

12 Resultatbehandling For at vurdere de diagnostiske data fra mit forsøg, vil jeg beregne den diagnostiske sensitivitet og specificitet. Hvis diagnosen fra biopsierne bliver betragtet som den gyldne standard, kan det vise sammenhængen mellem mine resultater og den gyldne standard, og herved kan validiteten af metoden vurderes. For at beregne den diagnostiske sensitivitet og den diagnostiske specificitet vil jeg anvende de histologiske diagnoser til sammenligning. Den diagnostiske sensitivitet og specificitet beregnes ud fra formlerne (7): Jeg vil desuden anvende McNemar s test for at vurdere, hvorvidt der er statistik signifikant forskel på resultatet af p16(jc8) immunfarvning på celleblokke og de histologiske diagnoser. McNemar s test anvendes til at behandle parrede kategoriske data, da det er den samme patients diagnoser på forskelligt materiale der anvendes. For at styrke de opstillede kriterier til resultatvurdering af p16(jc8) immunfarvning, kan overensstemmelsen mellem to bedømmeres vurdering af samme prøvemateriale beregnes ved hjælp af Kappastatistik. Teori Klassificering af hhv. cytologiske og histologiske diagnoser Terminologien for inddeling af stadierne for celleforandringer i pladeepitel mod cervixcancer er ifølge Bethesda-klassifikationen for cytologi: (4) ASCUS atypical squamous cells of undetermined significance ASC-H atypical squamous cells - cannot exclude HSIL LSIL low-grade squamous intraepithelial lesion HSIL high-grade squamous intraepithelial lesion SCC squamous cell carcinoma (5) Histologisk materiale kan klassificeres efter Cervikal Intraepitelial Neoplasi (CIN) -klassifikationen og inddeles efter sværhedsgrad i: (4) Normal CIN I svarende til let dysplasi efter WHO CIN II svarende til moderat dysplasi efter WHO CIN III Svarende til svær dysplasi eller carcinom in situ efter WHO Ved anvendelse af CIN klassifikationen vurderes cellernes modenhedsgrad, sværhedsgraden af kerneforandringer samt antallet af abnorme celler. Underinddelingen afspejler potentialet for udvikling af karcinom (4). Side 12 af 44

13 Human Papillomavirus (HPV) Der findes over 100 forskellige typer af HPV, hvoraf de typer har affinitet til anogenitalområdet. Disse HPV-typer kan inddeles i lavrisiko- og højrisikotyper efter deres evne til at udvikle cervixcancer. Infektion med HPV er den hyppigst overførte seksuelle sygdom. Livsstidsrisikoen for at blive smittet med HPV udgør ca. 80 %, hvorimod risikoen for at udvikle cervixcancer kun er 1 %. En årsag til dette kan være at de fleste HPV-infektioner er kortvarige, samt den inficerede celles evne til at reparere sig selv uden at risikoen for cervixcancer øges (4). HPV genomet kan inddeles i tre regioner, the upstream regulatory region (URR), the early region (Eregionen) og the late region (L-regionen). E-regionen koder for en gruppe af proteiner der er vigtige for virusreplikationen, disse er E1, E2, E4, E5, E6 og E7. I forhold til dette professionsbachelorprojekt er E7 af størst betydning. E7 koder for zink-bindende proteiner der kan binde sig til tumorsupressor proteinet retinoblastom (Rb). Ved infektion med HPV, binder E7 sig til Rb proteinet, og Rb s funktion hæmmes. Koncentrationen af aktivt E2F vil dermed stige, og cellen vil uhæmmet dele sig, og cellecyklus vil forløbe ukontrolleret. Høj-risiko HPV typernes E7 menes at have en større affinitet til Rb end lav-risiko HPV typernes E7. Høj-risiko HPV typer har derved større evne til at hæmme det celleregulatoriske protein Rb og derved ødelægge eller blokere denne. Dette menes at være en årsag til, at høj-risiko HPV typer udviser karcinogen effekt (4). Det er især i den produktive virusinfektion at E7 spiller en rolle, idet proteinet kan aktivere intermediære og superficielle celler så HPV kan udnytte replikationsvejen for værtscellens DNA. Transskriptionen af E7 er ikke længere velreguleret efter HPV er integreret i værtscellen, og E7 vil derved overekspressioneres (4). p16ink4a p16ink4a findes i normale celler i lav koncentration. Celler med høj-risiko HPV typer inficeret i værtscellens DNA har som nævnt en høj koncentration af E7, der hæmmer Rb. Rb virker regulerende på p16ink4a, og celler inficeret med HPV vil derfor udtrykke meget p16ink4a. p16ink4a kan påvises immunhistokemisk, og viser om der er en persisterende infektion med HPV. Udover dysplastiske pladeepitelceller, der udtrykker p16ink4a, kan immunfarvning med p16(jc8) også ses positiv i inflammatoriske celler. p16ink4a kan desuden udtrykkes i atypiske cervikale cylinderepitelceller, og der ses ofte uspecifik positiv reaktion i normale metaplastiske- og parabasale pladeepitelceller, når markøren anvendes på cytologisk materiale(4). Side 13 af 44

14 Figur 2 viser de normale cellecyklus mekanismer, og mekanismerne ved overekspression af p16ink4a i forstadier til cervixcancer og cervixcancer ved integration af HPV i cervixceller. Figur 2: mekanismer ved overekspression af p16ink4a (8). ASC-H ASC-H betegner atypiske pladeepitelceller kan ikke udelukke HSIL, og anvendes ved tvivl om sværhedsgraden af de cytologiske forandringer. Ved ASC-H ligner cellerne umodne parabasale celler eller umodne metaplastiske celler med ændret kernemorfologi og forstørret kerne/cytoplasma (K/C)ratio. K/C ratioen kan være som ved HSIL eller med en kernestørrelse 2-3 gange større end en normal intermediær cellekerne. ASC-H celler kan ligge i små grupper, i mikrobiopsier med kerneoverlap eller være enkeltliggende. Når diagnosen ASC-H gives, er det fordi, de cytologiske forandringer ikke helt opfylder kriterierne ved HSIL. Ved HSIL er der flere abnorme celler med mere udtalte kerneforandringer og uregelmæssige kernemembraner (4). Fiksering Fiksering anvendes for at bevare celler og vævsmorfologi efter at disse er udtaget fra kroppen. Den mest anvendte fiksering er fiksering med formaldehyd, da dette giver en god bevaring af vævskonformitet og en moderat grad af tværbinding. Fiksering med formaldehyd er gelerende, og ved gelerende fiksering låses proteinfaser i cellen fast med methenbroer. Ved formalinfiksering ødelægges nogle antigeners epitoper, mens andre maskeres af eksempelvis methenbroer og kompleksbinding af calciumioner (9). Cytologisk materiale fikseres ofte med ethanol, hvilket giver en koagulerende fiksering. Den præserveringsvæske cellematerialet opbevares i, inden der fremstilles koagler og celleblokke, består af % ethanol, <1 % isopropylalkohol, < 1 % methanol og 0,1 % formaldehyd (10). For at der er tale om koagulerende fiksering, skal ethanol-koncentrationen være over 60 % (11). Når cellemateriale opbevares i præserveringsvæske, er der altså ikke tale om en egentlig fiksering, men kun en præservering af cellerne. Det er først efter fremstilling af cellekoaglerne at disse fikseres, når de opbevares i formalin inden fremføring til paraffin. Analyseprincip for p16(jc8) immunfarvning på Leica Bond Det første trin i immunfarvning er dewax hvor infiltreret paraffin i snittet og omkring snittet smeltes af. Epitop demaskering Varmeinduceret epitop demaskering blotlægger antigene epitoper, der ved fiksering kan være blevet maskerede, så de atter er immunreaktive. Dette foregår ved, at glassene, der skal immunfarves med ex. p16(jc8), opvarmes på kogeplader i immunfarvningsmaskinen, samtidig med, at der tilsættes et Side 14 af 44

15 kogemedie (9). Ved immunfarvning med p16(jc8) er det anvendte kogemedie Bond epitope retrieval solution ph 9. Efter epitop demaskering er der en række vasketrin inden det primære antistof tilsættes. Primært antistof Det primære antistof tilsættes og inkuberes i 15 minutter, så antistoffet kan binde sig til de demaskerede epitoper. Efter inkubationen med antistoffet, er der en række vasketrin hvor overskydende antistof skylles af. Blokering af endogen aktivitet Det næste trin i immunfarvningen er blokering af endogen aktivitet. Dette sker ved at der tilsættes H 2 O 2, som derved blokerer ex. granulocytters peroxidase aktivitet og erytrocytters pseudoperoxidase aktivitet. Den endogene aktivitet blokeres for at minimere falsk positiv reaktion, da detektionssystemet anvender peroxidase (9). Overskydende H 2 O 2 skylles af ved vasketrin. Post primary Det sekundære antistof, post primary, er rettet mod det primære antistof. Ved den anvendte p16(jc8) immunfarvning er post primary kanin-anti-mus IgG (12). Overskydende post primary skylles af ved vasketrin. Polymer/detektionssystem Detektionssystemet, der anvendes, er en indirekte 3-lagsteknik. Polymeren er anti-kanin poly-hrp IgG (12), og til dextran polymerkæden er altså tilknyttet et tertiært antistof rettet mod det sekundære. At anvende indirekte 3-lagsteknik er med til at øge sensitiviteten (9). Ved denne teknik er det primære antistof umærket, men dextran polymerkæden er mærket med horse-radish peroxidase for at forstærke reaktionen yderligere. Der kan derved anvendes en mindre mænge antistof, da signalet er kraftigere, og metoden er mere sensitiv på grund af mærkning med flere peroxidase enzymer (9). Overskydende polymer skylles af. På figur 3 ses antigen-antistof reaktionen ved den anvendte immunfarvningsprotokol. Figur 3 viser antigen-antistof reaktionen og detektionssystemet ved den anvendte immunfarvning. Tegnet efter EnVision + figur fra forelæsningsnoter (13). DAB Visualiseringssystemet er chromogenet DAB. Et chromogen er et stof, der kan omdannes til pigment eller farvestof. Ved tilsætning fungerer DAB som H-donor og reagerer med H 2 O 2. Denne reaktion oxiderer DAB, Side 15 af 44

16 som polymeriserer og der opnås en brun udfældning. Overskydende DAB skylles af med deioniseret vand, inden der kernefarves med hæmatoxylin og monteres med dækglas (9). Visualiserings-reaktionen med DAB kan ses på figur 4. Figur 4 viser visualisering med DAB (13). Diagnostisk sensitivitet og specificitet Den diagnostiske sensitivitet anvendes til at vurdere, hvor god metoden er til at identificere hvilke patienter, der har den pågældende sygdom. Den diagnostiske sensitivitet kan beregnes ud fra formlen: Den diagnostiske specificitet giver udtryk for hvor god metoden er til at udelukke hvilke patienter, der ikke har den pågældende sygdom. Den diagnostiske specificitet kan beregnes ud fra formlen: Den diagnostiske sensitivitet og specificitet er udtryk for metodens evne til at finde sandt positive prøver og sandt negative prøver, og derved kan metodens anvendelighed vurderes (7). McNemar s test McNemar s test anvendes for at vurdere hvorvidt der er statistik signifikant forskel på parrede kategoriske data, hvis en gruppe forsøgspersoner for eksempel først får en behandling og derefter en anden behandling. Det kan derefter beregnes om der er forskel i de to metoder eller behandlingers resultater. Ved McNemar s test interesserer man sig kun for de resultater hvor der er forskel. Da z er normalfordelt kan den oversættes til en p-værdi, og der anvendes et p-niveau på 0,05, z skal være >1,96 for at der er tale om statistisk signifikant forskel på de to metoder (14). Tabel 2 viser opstilling for McNemar s test. Metode B Metode + - A + a b - c d Tabel 2, McNemars test Side 16 af 44

17 Kappa Kappastatistik anvendes til at vurdere hvor god overensstemmelse der er mellem ex. to bedømmeres resultater af det samme prøvemateriale (14). Tabel 3 viser opstilling for beregning af Kappa. Bedømmer I alt Bedømmer 2 + a b a + b - c d c + d I alt a + c b + d a + b + c + d Tabel 3, beregning af overensstemmelse (Kappa) Først beregnes overensstemmelsen, derefter beregnes antallet af de tilfældige overensstemmelser. Antallet af tilfældige overensstemmelser = x + x Kappa = Kappa mellem 0,61 og 0,80 er god overensstemmelse, og kappa større end 0,81 er meget god overensstemmelse (15). Materialer og Metode Prøvemateriale Prøvematerialet der er anvendt til dette professionsbachelorprojekt, er cervixcytologisk restmateriale fra væskebaseret teknik fra SurePath systemet. Prøverne har ved PAP-farvning fået stillet diagnosen ASC-H, og der er anvendt materiale fra 27 kvinder. Kontrolblokken der er anvendt fremstilles og behandles på samme måde som patientprøverne, og er diagnosticeret HSIL ved PAP-farvning. Tabel 4 viser materialer, der er anvendt til forsøget. Side 17 af 44

18 Materialer Apparatur/reagens/utensilier Producent/mærke Lotnr. Apparatur: Bond-Max Leica Visionbiosystems Bond TM Leica HE Farvemaskine Leica ST 5020 Dækglasmaskine Leica CV 5030 Varmeskab til HE-snit Binder VWR international Varmeskab til immunsnit Binder Serie mikrotom Thermo sceintific Microm HM 3555 Varmt vandbad Kunz instruments HIR-3 Kuldeplade Kunz instruments CPB-2 Centrifuge Hettich zentrifuge Rotina 46 S Mikroskop Olympus BX51TF VIP (Vævsfremføringsmaskine) Sakura Tissue-Tek Xpress TM Paraffin indstøber Leica EG 1150 H Kuldeplade til indstøber Leica EG 1150 C Reagenser til immunfarvning Antistof: Monoklonalt mus antihuman Santa Cruz p16(jc8)(jc8): sc Bondreagenser: Bond Polymer Refine Detection, Anti-Rabbit Leica Microsystems A/S poly-hrp-igg Bond Primary Antibody Diluent Leica Microsystems A/S Bond Post primary, Rabbit anti-mouse-igg Bond dewax solution Leica Microsystems A/S Bond Epitope Retrieval Solution 2 (ph 9) Leica Microsystems A/S ER20043 Bond Aspirating Probe Cleaning System Leica Microsystems A/S Bond Wash Solution 10x Concentrate Leica Microsystems A/S W0028 Bond Enzyme Pretreatment kit Leica Microsystems A/S Hæmatoxylin (Sur Mayer) Leica Microsystems A/S Demineraliseret vand Mixed DAB refine Leica Microsystems A/S Utensilier Superfrost + immunglas Thermo scientific Menzel-Gläser / Dækglas Hounisen Laboratorieudstyr A/S Reagenser til HE-farvning: Tissue-Clear Sakura Tissue-Tek % Alkohol Kemetyl 96 % Alkohol Kemetyl Sur Mayer Region H Apotek 0,12 % Eosin Kemetyl H 2 O Utensilier: Superfrost GREEN Hounisen Laboratorieudstyr A/S Superfrost PINK Hounisen Laboratorieudstyr A/S Dækglas Hounisen Laboratorieudstyr A/S Vugger Chip til farvemaskine Side 18 af 44

19 Reagenser til koagel/celleblok Plasma 2 % CaCl 2 Region H Apoteket 4 % Neutral buffed formalin Hounisen Laboratorieudstyr A/S Paraffin Utensilier: Engangspipetter Engangshandsker Biopsiposer Kapsler Tabel 4, anvendte materialer til forsøget Bio Optica Metode Fremstilling af koagel og celleblokke Der fremstilles koagler og celleblokke af kontrollen og de 27 patientprøver ud fra nedenstående procedure: Spidsglassene med prøvemateriale centrifugeres i 10 minutter ved 2155 rpm. Supernatanten hældes fra, så kun cellematerialet er tilbage i spidsglasset. Seks dråber optøet friskfrosset plasma tilsættes, og blandingen resuspenderes, for at sikre at cellematerialet er jævnt fordelt i opløsningen. Der tilsættes to dråber 2 % CaCl 2 og blandes forsigtigt. Blandingen inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur. Koaglet hældes over i en biopsipose og pakkes i en kapsel. Kapslerne med koaglerne opbevares i 4 % neutral buffet formalin indtil fremføring til paraffin på Tissue-Tek Vip. Efter klaring på Tissue-Tek Vip indstøbes koaglerne i paraffin. Skæring af snit Fra hver af de fremstillede celleblokke skæres fire snit på mikrotom, med en snittykkelse på 1 ½ µm. Et snit til HE-farvning, et snit til immunfarvning med p16(jc8), og to snit til evt. omfarvning. Alle HE-glas stilles i varmeskab i 15 minutter ved 80 C for at tørre snittene samt hæfte disse til glassene. Tiden i varmeskab smelter desuden infiltreret paraffin og paraffin udenom snittet. De glas, der ikke skal HEfarves med det samme, stilles i køleskab. Immunglassene, der skal farves med p16(jc8), blev stillet i varmeskab i 40 minutter ved 60 C. De glas, der ikke skal p16(jc8) immunfarves med det samme, blev stillet i køleskab uden at komme i varmeskab. Fra kontrolblokken skæres 12 snit. To til HE-farvning og 10 til immunfarvning. HE-snittene skæres som snit 1 og 7 i serien af 12. Side 19 af 44

20 HE-farvning HE- farvningen udføres på alle 27 patientprøver samt snit 1 og 7 fra kontrolblokken, HE-farvningen følger forskriften for Leica ST x 4 minutter i Tissue-clear 2 x 1 ½ minut i 99 % alkohol 1 ½ minut i 96 % alkohol 1 ½ minut i rindende vand 5 minutter i Sur Mayer 5 minutter i rindende vand 2 minutter i 0,12 % Eosin 10 sekunder i 96 % alkohol 20 sekunder i 99 % alkohol 3 x ½ minut i 99 % alkohol Montering med dækglas på Leica CV 5030 Side 20 af 44

21 Immunfarvning Immunfarvning med p16(jc8) udføres efter forskriften ved Leica Bond, se bilag 2, og udføres på alle 27 patientprøver samt et kontrolsnit for hver gang, der immunfarves. Steps, hvor der ikke er nævnt tider og temperatur, er skylletrin Step 1-3: Dewax Solution ved 72 C Step 4-6: Alkohol Step 7-8: Wash Solution Step 9: Wash Solution 5 minutter Step 10-11: Epitope Retrieval Solution 2 ved ph9 Step 12: Epitope Retrieval Solution 2 ved ph9 i 20 minutter ved 100 C Step 13: Epitope Retrieval Solution 2 ved ph9 i 12 minutter Step 14-16: Wash solution ved 35 C Step 17: Wash Solution i 3 minutter Step 18: Primary antibody P16(JC8) i 15 minutter Step 19: Wash Solution Step 20: Wash Solution i 2 minutter Step 21-22: Wash Solution Step 23: Peroxidase Block i 5 minutter Step 24 Wash Solution Step 25: Wash Solution i 2 minutter Step 26: Wash Solution Step 27: Post primary i 8 minutter Step28-30: Wash Solution i 2 minutter Step 31:Polymer i 8 minutter Step 32-34: Wash Solution i 3 minutter Step 35: Deionized Water Step 36: Mixed DAB Refine Step 37: Mixed DAB Refine i 10 minutter Step 38-40: Deioniseret Water Step 41: Kernefarvning med hæmatoxylin i 5 minutter Step 43: Wash Solution Step 44: Deionized Water Glassene blånes i rindende postevand i 5 minutter og dehydreres manuelt samt monteres med dækglas i dækglasmaskinen Leica CV Side 21 af 44

22 Resultater Resultatskema 1 Resultatskema 1 viser vurderingen af resultaterne for hhv. HE-snit og p16(jc8) immunfarvning, samt den histologiske diagnose på de prøver, hvor det var muligt at fremskaffe histologisk opfølgning. Prøve nr. HE-snit P16(JC8) P/N Histologisk diagnose fra portiobiopsi Celletæthed Antal suspekte celler Farveintensitet Antal positive celler ASC-H 1 H + * N ASC-H 2 H + *** P CIN II ASC-H 3 H ++ *** P ASC-H 4 H + *** P CIN II ASC-H 5 (2) H + * N CIN II ASC-H 6 H + *** P ASC-H 7 (3) H + *** P CIN II ASC-H 8 (2) H ++ *** P CIN III ASC-H 9 H ++ *** P CIN II ASC-H 10 H + *** P CIN I ASC-H 11 H + * N CIN I ASC-H 12 H + ** N Negativ ASC-H 13 H + * N ASC-H 14 H + *** P Negativ ASC-H 15 (2) H + ** N Negativ ASC-H 16 H 0 * N Negativ ASC-H 17 H ++ *** P CIN III ASC-H 18 H ++ *** P CIN III ASC-H 19 (2) H + * N Negativ ASC-H 20 L + * N Negativ ASC-H 21 H ++ *** P CIN I ASC-H 22 (2) L + * N ASC-H 23 H + * N Ugraderbar dysplasi (klassificeret CIN I ved efterfølgende konus) ASC-H 24 H + ** N CIN II ASC-H 25 H + *** P CIN III ASC-H 26 H ++ *** P ASC-H 27 (4) H ++ *** p ( ) seriesnit i blokke der er skåret om. Ex. ASC-H 5 (2) =blok 5 snit fra serie 2. Negativ Positiv Falsk positiv/falsk negativ Side 22 af 44

23 Resultatskema 2 p16(jc8) farveresultat for kontrolblokken samt den daglige p16(jc8) kontrol score kørt sammen med patientprøverne: Dato Daglig kontrol score HSIL kontrolblok 2 Farveintensitet Antal positive P/N for P16(JC8) celler 26/ Kontrol 2 (3) ++ *** P 30/ Kontrol 2 (5) + *** P 11/ Kontrol 2 (6) ++ *** P 12/ Kontrol 2(11) ++ *** P ( )snit nr. i serie af 12. Ex. Kontrol 2 (3) = kontrol 2 snit 3 Positiv Side 23 af 44

24 Resultatskema 3 Resultatskema 3 viser to faggruppers vurdering af p16(jc8) immunfarvning samt den histologiske diagnose på prøver, hvor det var muligt at fremskaffe histologisk opfølgning. Bioanalytikerstuderendes vurdering Farveintensitet Antal positive celler Patologs vurdering P/N Farveintensitet Antal positive celler ASC-H 1 + * N + ** N ASC-H 2 + *** P + *** P CIN II ASC-H 3 ++ *** P + *** P ASC-H 4 + ** * P + *** P CIN II ASC-H 5 (2) + * N 0 0 N CIN II ASC-H 6 + *** P + *** P ASC-H 7 (3) + *** P + ** N CIN II ASC-H 8 (2) ++ *** P ++ *** P CIN III ASC-H 9 ++ *** P + *** P CIN II ASC-H 10 + *** P + *** P CIN I ASC-H 11 + * N + * N CIN I ASC-H 12 + ** N + *** P Negativ ASC-H 13 + * N + ** N ASC-H 14 + *** P + *** P Negativ ASC-H 15 (2) + ** N + ** N Negativ ASC-H 16 0 * N 0 0 N Negativ ASC-H *** P + *** P CIN III ASC-H *** P ++ *** P CIN III ASC-H 19 (2) + * N + ** N Negativ ASC-H 20 + * N 0 0 N Negativ ASC-H *** P ++ *** P CIN I P/N Histologisk diagnose fra portiobiopsi ASC-H 22 (2) + * N + * N ASC-H 23 + * N + * N Ugraderbar dysplasi (klassificeret CIN I ved efterfølgende konus) ASC-H 24 + ** N + ** N CIN II ASC-H 25 + *** P + *** P CIN III ASC-H *** P ++ *** P ASC-H 27 (4) ++ *** p ++ *** P ( ) seriesnit i blokke der er skåret om. Ex. ASC-H 5 (2) =blok 5 snit fra serie 2. Negativ Positiv Falsk positiv/falsk negativ Uoverensstemmelse i vurdering Side 24 af 44

25 Diagnostisk sensitivitet og specificitet Den diagnostiske sensitivitet og specificitet er beregnet ud fra resultaterne i resultatskema 1. McNemar s test Ved hjælp af McNemar s test er beregnet hvorvidt der er statistisk signifikant forskel på diagnoserne ved hhv. cytologisk og histologisk metode. Tabel 5 viser opstilling af McNemar s test, med resultater af p16(jc8) immunfarvning og de histologiske diagnoser. Histologisk diagnose p16(jc8) + - immunfarvning på celleblokke + Sandt positive 10 Falsk positive 1 - Falsk negative 4 Sandt negative 5 Tabel 5, McNemar s test for resultaterne af p16(jc8) immunfarvning Z < 1,96 Kappa Tabel 6 viser opstilling til beregning af kappa. Patologs vurdering Bioanalytikerstuderendes vurdering Positiv Negativ I alt Positiv Negativ I alt Tabel 6, Kappa Overensstemmelse: = 0,9259 Antallet af tilfældige overensstemmelser: x + x = + = 13,66 Tilfældig overensstemmelse: = 0,5059 Kappa: = 0,85 Side 25 af 44

26 Diskussion Formålet med dette professionsbachelorprojekt har været at undersøge hvilken betydning immunfarvning med p16(jc8) på celleblokke fremstillet af cervixcytologisk restmateriale fra SurePath, har på den diagnostiske sensitivitet og specificitet ved diagnosen ASC-H, samt hvilken betydning det har for opfølgning ved diagnosen ASC-H. I resultatskema 1 ses det, at ud af de 27 undersøgte patientprøver er der 15 p16ink4a positive og 12 p16ink4a negative prøver. Ud af de 27 prøver har det været muligt at få histologisk opfølgning på 20 af prøverne. Da den histologiske opfølgning bruges som gylden standard for diagnosen i dette projekt, er der 10 sandt positive, 5 sandt negative, 1 falsk positiv og 4 falsk negative. Ifølge resultatskema 1 er der overensstemmelse mellem 15 ud af 20 prøver med histologisk opfølgning. Overensstemmelsen mellem p16(jc8) immunfarvning og den histologiske metode er altså 75 %. For at diskutere resultaterne og betydningen af disse vil jeg komme ind på hvilke præanalytiske, analytiske samt postanalytiske forhold, der kan have en indflydelse på den diagnostiske sensitivitet og specificitet for resultaterne. Jeg vil desuden diskutere hvordan resultaterne vil påvirke kvinderne, hvis metoden blev indført som supplement til diagnosticeringen af celleforandringer ved diagnosen ASC-H, samt hvilken indflydelse det vil have på opfølgning ved diagnosen ASC-H. Præanalytiske forhold De præanalytiske forhold, der kan spille en rolle for resultaterne, er den tid prøvematerialet har været opbevaret i præserveringsvæsken, fiksering, fremstilling af koagel, samt indstøbning i paraffin. Opbevaring i præserveringsvæske Prøvematerialet er opbevaret i præserveringsvæske inden fremstilling af koagler og celleblokke. Det vides ikke om længere tids opbevaring i præserveringsvæske påvirker cellerne, og i hvilken grad cellerne påvirkes. Producenten oplyser, at cervixcytologiske celler kan opbevares i præserveringsvæske i op til fire uger ved stuetemperatur, med henblik på andre analyser, eksempelvis immunfarvning eller Hybrid Capture 2 (HC2) (16). Da præserveringsvæsken blandt andet består af 20 % ethanol (10), sker der ikke en fiksering af cellerne, men kun en præservering (11). Det er derfor ikke utænkeligt, at der kan ske autolyse af cellerne ved længere tids opbevaring, hvilket muligvis kan give et dårligere resultat af immunfarvningen, da man kan forestille sig, at autolyse kan svække eller ødelægge antigene epitoper i cellerne (11), på trods af at producenten oplyser en holdbarhed på op til fire uger ved stuetemperatur (16). Selvom der under metodevalg er fastsat en grænse på 14 dage fra modtagelse af celleprøve til der blev fremstillet koagel, er det ikke til at vide, hvor længe den enkelte prøve har været undervejs fra den blev taget, til den blev modtaget på patologiafdelingen. Har prøverne været i præserveringsvæske i over fire uger, kan det tænkes at dette kan have en effekt på resultatet af immunfarvningen. ASC-H 23 og AC-H 24 er to af de fire prøver med falsk negativt resultat, og har stået på patologiafdelingen i 14 dage inden der blev fremstillet koagel, og en tredje, ASC-H 11, har stået i ni dage, men kommer fra Bornholm, så det er usikkert, hvor længe denne prøve har været undervejs. Det kan derfor diskuteres om dette kan have en effekt på resultatet af immunfarvningen, i og med antigeniciteten kan være faldende med opbevaringstiden på grund Side 26 af 44

27 af eventuel autolyse af cellerne. Det er derfor ikke til at sige, om de falsk negative resultater for ASC-H 11, ASC-H 23 og ASC-H 24 skyldes opbevaringstiden i præserveringsvæske eller andre faktorer, eksempelvis at der ikke er skåret dybt nok i celleblokken, og det sande antal suspekte celler derved ikke er repræsenteret. Dette er der så vidt muligt taget højde for ved vurdering af de enkelte HE-snit, og det skal nævnes, at alle HE-snit fra de falsk negative prøver er vurderet til høj cellularitet og der er set over 10 suspekte pladeepitelceller i hvert snit. Ydermere har der ikke været uoverensstemmelse med de prøver fra Grønland, hvor der er histologisk opfølgning. Det kan pege i retning af, at opbevaringstiden i præserveringsvæsken ikke har en negativ effekt på cellerne på grund af eventuel autolyse, da disse prøver må formodes at have været længere tid undervejs. Når producenten oplyser en holdbarhed på op til fire uger ved stuetemperatur (16), må man desuden gå ud fra at denne grænse er fastsat på baggrund af kliniske forsøg og afprøvninger, og derved stole på resultaterne af immunfarvningen på trods af at længere tids opbevaring i præserveringsvæske. Det skal desuden nævnes at på trods af eventuel autolyse som følge af længere tids opbevaring i præserveringsvæske, ser cellebilledet generelt pænt ud for størstedelen af prøverne. Billede 1 og 2 viser hhv. HE-snit og p16(jc8) immunfarvning fra ASC-H 9. Billede 1, HE-snit fra ASC-H 9. Forstørrelse x 40 Billede 2, p16(jc8) immunfarvning fra ASC-H 9. forstørrelse x 40 Fremstilling af koagel, fiksering, paraffinindstøbning samt skæring af snit Ved fremstilling af koagler er der anvendt plasma og CaCl 2. Det er ikke utænkeligt, at den tilsatte mængde CaCl 2 kan forstærke eller øge antallet af kompleksbundne calciumioner. Kompleksbundne calciumioner kan maskere antigene epitoper og derved svække antigeniciteten (11). Det må derfor overvejes, om der eventuelt skal ændres i demaskeringstrinnet i immunfarvningen for at sikre, at nok epitoper er blotlagte for at opnå en tilfredsstillende immunfarvning med et resultat, man kan stole på. Formalinfiksering kan også have en negativ effekt på resultatet af immunfarvningen. Ifølge teorien (11) maskeres antigene epitoper ved formalinfiksering, idet aldehydgrupper danner methenbroer mellem aminogrupper, dog kan bundet formalin fraspaltes ved behandling med vand. Ved paraffinindstøbning er der desuden risiko for, at der sker en denaturering af proteiner i cellerne, idet paraffinen har en temperatur Side 27 af 44

28 på cirka 60 grader. En denaturering af proteinerne i cellen kan få cellerne til at skrumpe, og desuden være epitop-ødelæggende og epitopmaskerende (11). Alle ovennævnte præanalytiske trin kan have en indflydelse på resultatet af immunfarvningen, hvis ikke der tages højde for disse under immunfarvningsprotokollen. Analytiske forhold De analytiske forhold der gør sig gældende for resultaterne, er immunfarvning med p16(jc8). Resultaterne ses i resultatskema 1. Den anvendte immunfarvningsprotokol er en standardiseret metode til histologisk materiale fra cervix på afdelingen, hvor projektet er udført. Celleblokkene, der er anvendt til forsøget, er cytologisk materiale, men har fået histologisk forbehandling, idet de er lavet til koagler, fikseret i formalin og paraffinindstøbt. I forhold til immunhistokemiske metoder går mange af de immunkemiske egenskaber tabt under de præanalytiske trin. Det er derfor vigtigt at tage højde for den præanalytiske forbehandling, for at opnå et brugbart resultat af immunfarvningen. Især epitop demaskering spiller en vigtig rolle, idet antigener kan være blevet mere eller mindre fastlåst, eller antigenets aktive-site kan være blevet ændret kemisk ved tværbinding med fiksativet, hvilket kan vanskeliggøre antigen-antistofbindingen (11). Utilstrækkelig epitop demaskering kan derfor være en fejlkilde ved immunfarvning, idet antistoffet ikke kan binde sig til antigenet, og der vil ikke ses en positiv reaktion eller kun en svagt positiv reaktion, hvis de antigene epitoper ikke er blevet demaskeret tilstrækkeligt (11). Utilstrækkelig epitop demaskering kan være en årsag til at det er falsk negativ reaktion ved ASC-H 5 (2), ASC-H 11, ASC-H 23 og ASC-H 24. Antigene epitoper kan maskeres ved formalin fiksering idet der dannes methenbroer mellem aminogrupper. Der kan ligeledes kompleksbindes calciumioner (11). Ved fremstilling af koaglerne blev der tilsat CaCl 2, og det er ikke utænkeligt, at den ekstra mængde calcium kan øge mængden af kompleksbundne calciumioner. Demaskeringstrinnet skal måske være længere for at sikre, at alle kompleksbundne calciumioner fjernes. Den anvendte kogebuffer ved demaskeringstrinnet i immunfarvningen er epitope retrieval solution 2, og består af EDTA-buffer ved ph 9. Denne kogebuffer virker metal-chelatiserende, og kan muligvis opløse og derved modvirke de kompleksbundne calciumioners demaskerende virkning (11). At der anvendes CaCl 2 til fremstilling af koagler burde derfor ikke være en influerende faktor ved immunfarvningen. Mængden, der anvendes, er desuden meget lille, idet der kun tilsættes to dråber ved fremstilling af hvert koagel. Blokering af endogen aktivitet kan også være en mulig fejlkilde, idet der kan opstå falsk positiv reaktion i form af uspecifik farvning, hvis den endogene aktivitet ikke er blokeret tilstrækkeligt (9). Dette kan være årsag til at ASC-H 14 er falsk positiv i resultatskema 1. Inkubationstiden med antistof kan også være en mulig fejlkilde. Dog er inkubationstiden styret af immunfarvningsprotokollen, og det må formodes, at denne er programmeret mest hensigtsmæssigt. Det kan desuden være en fejlkilde hvorvidt de anvendte coverslip tiles er placeret korrekt på glasset, der skal immunfarves, eller om der er luft i slangerne der påfører de enkelte reagenser, idet disse faktorer kan have en indflydelse på mængden af reagens og antistof, der tilføres snittet. Side 28 af 44