Capillarys 2 FlexPiercing

Transkript

1 Bioanalytikeruddannelsen UNIVERSITY COLLEGE LILLEBÆLT Capillarys 2 FlexPiercing Kvantificering af HbA1c ved kapillærelektroforese Capillarys 2 FlexPiercing quantification of HbA1c by capillary electrophoresis Elektroferogram fra Capillarys 2 Flexpiercing for en normal prøve (1). Trine Lyberth Christensen Stud.nr.: Hold SB Anslag: Professionsbachelorprojekt ved bioanalytikeruddanelsen University College Lillebælt Teoretisk vejleder: Brit Naldahl Pourroy, Bioanalytikeruddannelsen University College Lillebælt Klinisk vejleder: Knud Erik Lynnerup, Afdeling for klinisk biokemi og farmakologi, Odense Universitetshospital

2 Resume Introduktion Måling af glykeret hæmoglobin, HbA1c, anvendes til monitorering og diagnosticering af diabetes mellitus. På Afdeling for klinisk biokemi og farmakologi, Odense Universitetshospital udføres HbA1c-analysen vha. HPLC på Tosoh HLC-723 G8 (Tosoh). Det er kendt at hæmoglobinvarianter kan interferere med HbA1c-analysesvaret ved forskellige analysemetoder. Formål Formålet med dette projekt er at undersøge konkordansen mellem HbA1c-koncentrationen målt på hhv. Tosoh og Capillarys 2 FlexPiercing (Capillarys), samt at undersøge hvordan separeringsprofilerne for patientprøver med hæmoglobinvarianter analyseret på disse to apparater adskiller sig fra en typisk separeringsprofil for prøver med fænotypen HbAA med henblik på at vurdere interferensen fra disse varianter på HbA1c-analysesvaret. Materialer og metoder Konkordansen mellem apparaterne blev undersøgt for 64 patientprøver med fænotypen HbAA, og vurderes ud fra et differensplot. Separeringsprofilerne opnået på de to apparater for 29 patientprøver med hæmoglobinvarianter blev visuelt sammelignet med separeringsprofilerne for fem prøver med de fire hyppigste hæmoglobinvarianter HbS, HbE, HbC, HbD og en prøve med forhøjet mængde HbF. Resultater I konkordansundersøgelsen opnåedes relative afvigelser mellem HbA1c-koncentrationen målt på hhv. Tosoh og Capillarys på mellem -1,1% og 5,2% (i gennemsnit 1,8%) for alle prøver undtagen én, som havde en relativ afvigelse på 26%. På Capillarys var HbF den eneste variant, der ikke var fuldstændigt separeret fra HbA1c og HbA0. På Tosoh elueres HbE og HbF før HbA0, hvilket påvirker det totale hæmoglobinareal. Konklusion Der opnåedes god konkordans mellem Tosoh og Capillarys for alle patientprøver undtagen én. HbF er den eneste variant, der interfererer med HbA1c-koncentrationen på Capillarys. HbE og HbF interfererer på Tosoh. Keywords: HbA1c, hæmoglobinvarianter, Tosoh G8, HPLC, Capillarys 2 FlexPiercing, kapillærelektroforese. Side 2 af 52

3 Forord Dette professionsbachelorprojekt er udført på Afdeling for klinisk biokemi og farmakologi (KBF) på Odense Universitetshospital. Det praktiske arbejde i laboratoriet er udført i perioden fra 7. oktober - 8. november Rapporten henvender sig til bioanalytikerstuderende og -undervisere, bioanalytikere samt andre interesserede i diabetes og HbA1c-analysen. Jeg vil gerne sige tak til personalet på KBF for hjælp med indsamling af særlige prøver og specielt til Lotte Foegt Poulsen, faglig specialist ved hæmatologi og sporstof på KBF, for at besvare de spørgsmål vi har haft til analysen på KBF. Tak til Lars Melholt Rasmussen, professor og overlæge på KBF, for svar på spørgsmål ang. diabetes mellitus og klinisk relevante grænser for HbA1ckoncentrationen. Tak til min kliniske vejleder Knud Erik Lynnerup og min teoretiske vejleder Brit Naldahl Pourroy for vejledning gennem hele forløbet. Jeg vil gerne takke ILS Laboratories Scandinavia for at stille apparatur, reagenser og teknisk support til rådighed, og en særlig tak til Lars Bendixen, kundechef/crm og faglig specialist ved ILS, for gode råd og vejledning. Til sidst vil jeg gerne takke familie og venner for at have båret over med mig i de mest stressede perioder af forløbet. En helt særlig tak til Trine Simone Mortensen for godt samarbejde gennem hele projektperioden, og ikke mindst den store hjælp og støtte i forbindelse med udarbejdelsen af selve rapporten. Trine Lyberth Christensen Side 3 af 52

4 Indholdsfortegnelse Resume... 2 Introduktion... 2 Formål... 2 Materialer og metoder... 2 Resultater... 2 Konklusion... 2 Forord... 3 Introduktion... 7 Diabetes mellitus... 7 HbA1c... 7 Hæmoglobinvarianter... 8 HbA1c-analysen på KBF, OUH Problemformulering Analyseprincipper Tosohs HLC-723 G Sebias Capillarys 2 FlexPiercing Enheder for HbA1c Metodiske overvejelser Prøveindsamling Konkordansundersøgelsen Analyse af prøver med varianter og holdbarhedsforsøg Materialer Apparatur Reagenser Prøvemateriale Side 4 af 52

5 Metoder Konkordansstudie Holdbarhedsforsøg Analyse af hæmoglobinvarianter Statiske redskaber Resultater Konkordansstudie Afvigelse på dobbeltbestemmelser Sammenligning af Tosoh og Capillarys Holdbarhedsforsøg Frasortering af prøver pga. ikke valide resultater Påvirkning af HbA1c-koncentrationen før og efter nedfrysning Ændring af elektroferogrammer efter nedfrysning Prøver med hæmoglobinvarianter Diskussion Tosoh og Capillarys som diagnostiske apparater Konkordans mellem Tosoh og Capillarys Prøve nr Holdbarhedsforsøg Varianter Prøver med HbS, -E, -C, -D og forhøjet HbF Andre varianter Anvendte materialer og metoder Konklusion Perspektivering Litteratur Side 5 af 52

6 Bilag 1 Den maksimale tilladte afvigelse på dobbeltbestemmelser på hhv. Tosoh og Capillarys Bilag 2 Friedmantesten Bilag 3 Elektroferogrammer for prøve nr. 1 i holdbarhedsforsøget efter hhv. 14, 21 og 28 dages nedfrysning Bilag 4 Beregning af intraseriel analyseusikkerhed på Capillarys 2 FlexPiercing Bilag 5 KBFs HbA1c-analyseresultater på udsendte Labqualitykontroller Bilag 6 Tro og love-erklæring Side 6 af 52

7 Introduktion Diabetes mellitus Diabetes mellitus er et stigende problem i Danmark. I de seneste år er prævalensen af diabetes mellitus steget hvert år siden 1996 fra pr indbyggere til pr indbyggere i 2011 (2,3). Overordnet kan diabetes deles op i type 1 og type 2-diabetes, men fælles for de to typer er, at kroppens celler har problemer med at optage glukose. Dette kan føre til hyperglykæmi, som kan forårsage en række komplikationer som f.eks. ødelæggelse af nethinden, koldbrand og ketoacidose (2,4). Måling af glykeret hæmoglobin (HbA1c) bruges i monitoreringen af diabetespatienters middel plasmaglukose, og i 2011 indførtes analysen endvidere som et kriterium i diagnosticeringen af diabetes mellitus (se HbA1c nedenfor) (5,6). HbA1c Hæmoglobin er det iltbærende molekyle i blodet. Hæmoglobin findes i erythrocytterne og er et protein bestående af fire globinkæder, der hver danner et kompleks med en hæmgruppe indeholdende et jernatom. Den hyppigste hæmoglobinvariant hos raske, voksne individer kaldes hæmoglobin A (HbA) og består af to α-kæder og to β-kæder ( ) 2 2 (4). Der arves anlæg for hæmoglobinvarianter fra begge forældre. Hvis man har arvet HbA fra begge forældre har man fænotypen HbAA. Når der er glukose til stede i blodet, vil det kunne bindes irreversibelt til β-kæden i HbA, som så betegnes HbA1c. Bindingen mellem glukose og HbA sker i to trin og er en ikke-enzymatisk glykosylering. I det første, hurtige trin dannes en kovalent binding mellem glukosens aldehydgruppe og valin i β-kædens N-terminal. Det dannede produkt, kaldet labilt HbA1c, er en aldimin og er ikke stabilt, dvs. der er tale om en reversibel proces. Andet trin i glykosyleringen er en langsom proces, hvor aldiminen irreversibelt omdannes til en ketoamin ved en såkaldt Amadoriomlejring, og produktet er stabilt HbA1c (4). Se figur 1. Side 7 af 52

8 Figur 1 Dannelsen af HbA1c sker i to trin og er en ikke-enzymatisk glykosylering af HbAs β-kæde. I første trin dannes en aldimin (også kalet en Schiffbase) ved, at der sker en kovalent binding mellem glukose og valin i β-kædens N-terminal. Dette er en både hurtig og reversibel proces, og produktet kaldes labilt HbA1c. Andet trin af glykosyleringen er derimod langsom og irreversibel. Her omdannes aldiminen til en ketoamin via en såkaldt amadoriomlejring, og der er nu tale om stailt HbA1c (7). Mængden af HbA1c er direkte proportional med glukosekoncentrationen i blodet, og da det er en stabil forbindelse, forsvinder det først fra blodet, når hæmoglobinet bliver nedbrudt. Dannelsen af HbA1c sker gennem hele erythrocyttens levetid, som normalt er ca. 120 dage, og det er derfor muligt at estimere den gennemsnitlige glukosekoncentration i blodet over de sidste 6-8 uger, ved at måle HbA1c-koncentrationen (4). Når der ikke er bundet glukose eller andre molekyler til HbA betegnes denne HbA0. HbA1c-koncentrationen beregnes afhængigt af analysemetoden i forhold til HbA0 eller HbA total (8,9). Hæmoglobinvarianter HbA er ikke den eneste hæmoglobinvariant der findes. Normalt ser fordelingen af hæmoglobinvarianter hos raske, voksne mennesker således ud: HbA 96-98%, HbF 0,5-0,8% og HbA2 1,5-3,2%. HbF (føtalt hæmoglobin) består af to α-kæder og to γ-kæder ( 2 2), og HbA2 består af to α-kæder og to δ-kæder ( 2 2) (4,10). Udover disse findes mere end 1200 kendte hemæglobinvarianter i verden, hvor de fire hyppigste er i rækkefølge HbS, HbE, HbC og HbD (10,11). Side 8 af 52

9 Hæmoglobinvarianter, også kaldet hæmoglobinopatier, opstår pga. forskellige mutationer i hæmoglobingenerne. Disse mutationer kan komme til udtryk enten kvalitativt eller kvantitativt. HbS, HbC og HbD er eksempler på kvalitative mutationer i genet, der koder for β-globin, som findes på kromosom 11 (10). Ved HbS sker der en punktmutation i det 6. codon på β-genet. Dette fører til en aminosyresubstitution, hvor valin erstatter glutaminsyre i det translaterede protein. Det ændrede β-globin medfører en strukturændring, der gør at hæmoglobinet udkrystalliserer i erythrocytten, når det er af-iltet. Erythrocytten bliver rigid og kan forårsage obstruktion af kapillærerne, når det har afgivet sit ilt ude i vævet. Disse celler kaldes seglceller, og da de har nedsat levetid ifht. normale erythrocytter, opstår der ved homozygoti anæmi, som betegnes seglcelleanæmi. Heterozygoti med HbA (HbAS) kan forårsage mild anæmi, men er oftest asymptomatisk. HbS kommer altså til udtryk kvalitativt, da der produceres abnorme β-globiner, men i normal mængde (10). HbC skyldes også en punktmutation i codon nr. 6 på β-genet. I dette tilfælde forårsager mutionen en substitution af glutamin til lysin. HbC er asymptomatisk ved homozygoti og heterozygoti med HbA, men ved heterozygoti med eksempelvis HbS ses svær anæmi (10). Ved HbD udskiftes glutaminsyre med glutamin pga. en punktmutation i codon 121 på β-genet. HbD er asymptomatisk ved heterozygoti med HbA og kan give mild hæmolytisk anæmi ved homozygoti (11,12). HbE adskiller sig fra de førnævnte varianter idet en punktmutation i codon 26 både forårsager en aminosyresubstitution fra glutaminsyre til lysin i det translaterede β-globin og dannelsen af et alternativt splice site på det transkriberede mrna. Dette nye splice site medfører i 40% af tilfældene dannelsen af et trunkeret, ikke funktionelt protein. I de resterende 60% af tilfældene dannes et modificeret β-globin; der er altså både tale om en kvantitativ og en kvalitativ abnormalitet (10). HbF er den primære form for hæmoglobin i fostre. Op til fødslen inaktiveres γ-generne og β- generne aktiveres. Dette medfører at mængden af HbF falder til normalt voksenniveau (0,5-0,8%) inden for de første 6 måneder efter fødslen og erstattes af HbA. Hos nogle mennesker falder andelen af HbF dog ikke. Dette kan f.eks. skyldes deletioner i δ- og β-generne eller punktmutationer i promoterregionen af et af γ-generne, som gør at det ikke inaktiveres som normalt. Forhøjet Side 9 af 52

10 mængde HbF er asymptomatisk, da den funktionelle forskel på HbA og HbF er, at HbF har anelse højere iltaffinitet (4,10). I forbindelse med HbA1c-analysen vil det også være relevant at være opmærksom på hæmoglobinopatier, der ændrer erythrocyttens levetid. Hvis erythrocytterne lever længere end normalt kan det ses som en falsk forhøjet HbA1c-måling, mens en forkortet levetid som regel vil forårsage en falsk lav HbA1c-fraktion. Eksempler på hæmoglobinopatier som mindsker erythrocyttens levetid er α- og β-thalassæmi, der begge skyldes mutationer som kommer til udtryk kvantitativt. α-thalassæmi skyldes som regel deletionener i et eller flere af de fire α-gener, som fører til nedsat mængde dannet α-globin. Symptomerne ved α-thalassæmi kan variere fra mild anæmi til dødfødsel eller tidlig neonatal død afhængigt af omfanget af deletionerne (10). β-thalassæmi forårsages af nedsat mængde β-globin. Til forskel fra α-thalassæmi kan β-thalassæmi skyldes et næsten uendeligt antal forskellige mutationer i de to β-gener. Sygdommen deles op i β- thalassæmi major, der kræver blodtransfusioner, hvis patienten skal overleve, β-thalassæmi intermedia, der forårsager anæmi i en grad som ikke kræver transfusion og β-thalassæmi minor, der er asymptomatisk (10). Ved β-thalassæmi major er mængden af HbA meget nedsat og delvist erstattet med HbF. Ved β-thalassæmi minor ses ofte forhøjede mængder HbA2 (13). Hæmoglobinvarianter kan have forskellig indflydelse på HbA1c-analysen. Selv små ændringer i aminosyresekvensen kan ændre globinernes tertiære struktur og overordnede ladning. Analysemetoder, der separerer hæmoglobinfraktionerne vha. deres ladning og/eller størrelse vil således muligvis blive påvirket af tilstedeværelsen af en hæmoglobinvariant (9,11,14). HbA1c-analysen på KBF, OUH På Afdelingen for klinisk biokemi og farmakologi (KBF) på Odense Universitetshospital (OUH) udføres HbA1c-analyser på patientprøver både fra OUH og fra lægepraksis på Fyn. Den danske befolkning er meget sammensat og består i højere grad end tidligere af folk med anden etnisk baggrund end dansk. Da folk fra Asien, mellemøsten og Afrika er i særlig høj risiko for at udvikle type 2-diabetes (2), vil der på KBF være en større andel af blodprøver, der skal analyseres for HbA1c, fra disse mennesker, end den andel de udgør i befolkningen generelt. Da der samtidig er større forkomst af HbS og C i Afrika, HbD i Indien og HbE i Sydøstasien (10,15) vil der sandsynligvis være en større andel af prøver, der indeholder en variant, der som nævnt ovenfor kan Side 10 af 52

11 have indflydelse på HbA1c-analyseresultatet. Det vil derfor være interessant at undersøge, hvilken indflydelse hæmoglobinvarianter har på HbA1c-analysen på KBF og i hvilket omfang, samt om en anden analysemetode evt. kunne være bedre. Problemformulering Hvad vil et konkordansstudie af HbA1c-analysen på hhv. Sebias Capillarys 2 FlexPiercing og Tosohs HLC-723 G8 vise? Hvis prøvemateriale i form af EDTA-stabiliseret fuldblod nedfryses ved -20 o C i op til fire uger, hvordan vil det så påvirke HbA1c-koncentrationen målt på Capillarys 2 FlexPiercing, og hvordan adskiller elektroferogrammerne for de nedfrosne prøver sig fra elektroferogrammerne for prøver, der ikke har været nedfrosset? Hvordan adskiller separeringsprofilerne for prøver med hæmoglobinvarianter analyseret på disse to apparater sig fra en typisk separeringsprofil for prøver med fænotypen HbAA? Analyseprincipper Tosohs HLC-723 G8 I rutinen på KBF anvendes Tosohs HLC-723 G8 (Tosoh) til analysering af HbA1c. Det er et apparat, der kom på markedet i 2008, og som anvender high performance liquid chromatography (HPLC) til at bestemme HbA1c-koncentrationen i EDTA-stabiliseret fuldblod direkte fra vakuumrør med prop. Analysen foregår ved at 3 µl fuldblod fortyndes med hæmolysebuffer, hvorefter det under højt tryk injiceres i en kolonne. Kolonnen, TSK gel Glyco HSi, er en nonporøs kationbytterkolonne, der er pakket med en gel bestående af resinpolymerer, der måler 2,5µm i diameter. Disse resinmolekyler er negativt ladede og de positivt ladede hæmoglobinfragmenter vil derfor bindes til dem. Kolonnen er 3,5cm lang og måler 4,6mm i indre diameter. Efter injicering af prøven elueres hæmoglobinfragmenterne trinvist vha. tre ravsyrebuffere med stigende saltkoncentration. Eluenterne afgasses inden de under tryk passerer gennem kolonnen, da gas vil Side 11 af 52

12 kunne forstyrre aflæsningen i detektoren. Hæmoglobinfragmenterne separeres på baggrund af deres ladning og dermed affinitet til kolonnen. Efter separeringen detekteres hæmoglobinfragmenterne fotometrisk i en flowcelle ved en detektionsbølgelængde på 415nm og en referencebølgelængde på 510nm. Trykket falder gennem kolonnen, og i flowcellen er trykket næsten faldet til atmosfærisk tryk. HPLC-systemets opbygning er vist på figur 2. Figur 2 Skematisk opbygning af HPLC-systemet. Den fortyndede prøve sluses via injektoren ind i kolonnen. Pumpen opretholder det høje tryk i systemet, og eluenten passerer via pumpen og injektoren gennem kolonnen. De eluerede fragmenter detekteres efterhånden som de passerer detektoren, og for enden af systemet opsamles spild (16). Absorbansen målt i flowcellen afbildes i et kromatogram som funktion af retentionstiden, og der integreres under kurven for at bestemme koncentrationen af de forskellige hæmoglobinfragmenter. Retentionstiden er den tid, der går fra elueringen startes til et stof detekteres i flowcellen. Ud fra de forskellige retentionstider kan Tosoh ifølge producenten genkende hæmoglobinfragmenterne A1a, A1b, F, latent A1c (L-A1c), stabilt A1c (s-a1c) og A0. Producenten oplyser desuden at Tosoh kan separere HbC, -D og -S fra de normale hæmoglobinfragmenter, men ikke HbE. HbA1ckoncentrationen beregnes først som forholdet mellem arealet for s-a1c og arealet af alle toppe til og med HbA0. Dette forhold bliver herefter korrigeret vha. kalibreringsligningen, hvorved det endelige HbA1c-svar fås. Hæmoglobinvarianter, der optræder på kromatogrammet efter HbA0, vil derfor ikke interferere med HbA1c-analysesvaret (9,17,18). Figur 3 viser et normalt kromatogram for en prøve med fænotypen HbAA. Den procentvise andel af de forskellige hæmoglobinfraktioner er afbildet som funktion af retentionstiden i minutter. Side 12 af 52

13 Figur 3 Kromatogram for en normal patientprøve repræsenterende fænotypen HbAA analyseret på Tosoh i den daglige rutine. Absorbansen målt ved 415nm afsættes som funktion af retentionstiden. Tosoh genkender hæmoglobinfragmenterne A1a, A1b, F, latent A1c (L-A1c), stabilt A1c (s-a1c) og HbA0 i nævnt rækkefølge ud fra deres respektive retentionstider (18). Sebias Capillarys 2 FlexPiercing Det andet apparat til konkordansstudiet er Sebias Capillarys 2 FlexPiercing (Capillarys), som kom på markedet i Capillarys anvender kapillærzoneelektroforese til at bestemme HbA1ckoncentrationen i EDTA-stabiliseret fuldblod direkte fra vakuumrør med prop ligesom Tosoh. Prøven vendes automatisk, inden 20 µl fortyndes med hæmolysebuffer og injiceres i en siliciumkapillær. Kapillæren er 17-cm lang og 25µm i diameter (19). Hver ende af kapillæren er forbundet til et kar med buffer, og der sættes en høj spænding på 9400V over kapillæren, hvorved hæmoglobinfraktionerne separeres på baggrund af deres ladning og størrelse. I katodeenden af kapillæren detekteres hæmoglobinfraktionerne spektrofotometrisk ved 415nm (se figur 4). Side 13 af 52

14 Figur 4 Skematisk opbygning af et kapillærelektroforesesystem. Hver ende af kapillæren er forbundet med kar med buffer, og via disse sættes en høj spænding over kapillæren. Pga. denne spænding separeres molekylerne i prøven efter størrelse og ladning; de mindste og mest positivt ladede vandrer hurtigst. For enden af kapillæren detekteres de forskellige fragmenter spektrofotometrisk efterhånden som de passerer detektoren (20). Absorbansen afbildes på et elektroferogram, og der integreres under kurven for at bestemme koncentrationen af de forskellige fraktioner. På Capillarys adskilles hæmoglobinfraktionerne i følgende rækkefølge fra katode til anode: A2/C, E, S, D, F, A0, Other Hb (inkl. HbA1a og HbA1b) og HbA1c. Elektroferogrammet skrives fra højre mod venstre, så denne rækkefølge er modsat læseretningen. Figur 5 forestiller et typisk elektroferogram for en prøve med fænotypen HbAA. På X-aksen er angivet en arbitrær skala som ikke er migrationstiden. Det er dog ikke tilfældige vædier, der er angivet, så de forskellige fraktioner kan genfindes ud for den samme værdi. Absorbansen ved 415 nm er angivet på Y-aksen. Capillarys beregner HbA1c-koncentrationen som forholdet mellem HbA1c-arealet og HbA0+HbA1c-arealet inden den korrigeres ifht. kalibreringen. Capillarys medtager derfor ikke HbA1a, HbA1b og HbF som Tosoh gør (14). Ved kapillærelektroforese opnås en højere opløsning end ved HPLC. Dette vil kunne ses som bedre adskillelse af toppene på elektroferogrammet i fht. toppene på et kromatogram (se figur 3 og 5). Ved kapillærelektroforese modsat HPLC undgås laminart flow i kapillæren/kolonnen, hvor væsken bremses ud mod kanten ifht. midten (se figur 6). Side 14 af 52

15 Figur 5 Elektroferogram for en normal prøve (prøve nr. 1 i holdbarhedsforsøget), der udviser fænotypen HbAA. Elektroferogrammet skrives fra højre mod venstre, så det første der detekteres er HbA2 ved værdien 240 på x-aksen, så HbA0 mellem 140 og 180, andre HbA (inkl. HbA1a og HbA1b) mellem 100 og 140 og til sidst HbA1c mellem værdierne 60 og 80. Højden på toppene repræsenterer absorbansen målt ved 415nm. Figur 6 Til venstre er vist laminart flow, også kaldet parabolsk flow, som ses ved HPLC. Her er hastigheden støre i midten af kolonnen end ud mod væggen. Højre del af figuren er et eksempel på hvordan elektroendosmotisk flow, som er et fladt flow, ser ud. Dette kan opnås ved kapillærelektroforese (CE). Her er hastigheden af væsken i kapillæren ens på tværs af kapillæren (21). Når der sættes en høj spænding over kapillæren, vil der udvikles varme. For at undgå en temperaturgradient og dermed en viskositetsgradient på tværs af kapillæren, er det vigtigt at varmen ledes væk. På Capillarys sørger et Peltiermodul for en meget præcis temperaturregulering. Derudover anvendes en basisk buffer med en ph på 9,4, som sørger for at siliciumoverfladen på indersiden af kapillæren negativt ladet. Positive ioner i bufferen vil sammen med den negative siliciumoverflade danne et dobbeltlag af ioner. Spændingen over kapillæren vil trække i laget af positive ioner, som vil forårsage en nettobevægelse af væsken i kapillæren mod katoden, og der Side 15 af 52

16 opnås dermed samme hastighed ud mod kæpillærvæggen som i centrum af kappilæren. Dette kaldes det elektroendoosmotiske flow, og forhindrer sammen med additiver i bufferen adsorption af proteiner til kapillærvæggen. For at sikre at kapillæren hele tiden er negativt ladet, vaskes kapillæren mellem hver prøve med en vaskeopløsning med en ph på ca. 12. Ved tilstedeværelse af et elektroendosmotisk flow kan også negativt ladede fraktioner nå katodeenden. (22) Enheder for HbA1c Det amerikanske National Glycohemoglobin Standardization Program (NGSP) blev dannet med det formål at standardisere målingen af HbA1c internationalt, så resultater opnået i kliniske laboratorier kan sammenlignes med dem, der rapporteres i de to store studier Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) og United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS). I disse studier blev sammenhængen mellem forhøjet middel plasmaglukose og senkomplikationer af diabetes fastslået. NGSP anbefaler at HbA1c-koncentrationen angives i %, også kaldet NGSP- eller DCCT-enheden (4,23,24). The International Federation for Clinical Chemistry (IFCC) har udviklet en referencemetode til måling af HbA1c. Vha. et enzym kløver de det N-terminale hexapeptid fra β-kæden på HbA. Det glykosylerede og det ikke glykosylerede hexapeptid separeres vha. HPLC, hvorefter de to fragmenter kvantificeres vha. massespektrometri eller kapillærelektroforese. Denne metode er både dyr og tidskrævende, og den er derfor ikke tænkt som en rutineanalysemetode, men som en referencemetode som producenter af HbA1c-analyseapparater kan anvende til kalibrering af deres apparater. IFCC angiver HbA1c-koncentrationen i mmol/mol, som derfor også betegnes IFCCenheden. HbA1c-resultater er 1,5-2% lavere i IFCC-enheden end NGSP-enheden (4,23). I 2004, 2007, 2009 og 2011 afholdtes konsensusmøder om den verdensomspændende standardisering af HbA1c-målingen. Blandt mødedeltagerne fandtes folk fra amerikanske, europæiske, internationale og japanske diabetesorganisationer. Det blev besluttet at anbefale at HbA1c-resultater angives både i IFCC-enheden (mmol/mol) uden decimaler og DCCT-enheden (%) med én decimal (5). På Tosoh angives HbA1c-svaret i både IFCC-enheden, mmol/mol, med en decimal og DCCTenheden, %, med to decimaler. Begge svar angives altså med en decimal mere end internationalt anbefalet. Når svaret afgives i computersystemet (BCC) til den rekvirerende læge, afgives det i IFCC-enheden samt som estimated average glucose (eag), der angives i mmol/l. eag er en Side 16 af 52

17 teoretisk beregnet størrelse, der er tænkt som en hjælp for diabetikere, da det er en enhed de er vant til og derfor lettere vil kunne forholde sig til, hvis de jævnligt måler/får målt deres plasmaglukose (9,18). Capillarys er kalibreret efter IFCC-standarden, og prøver og kontroller måles derfor i IFCCenheden, hvorefter de vha. den internationalt anerkendte master equation omregnes til DCCTenheden (25,26). Capillarys angiver ligesom Tosoh HbA1c-koncentrationen i både IFCC- og DCCT-enheder, men angiver kun svaret med det anbefalede antal decimaler (14). Metodiske overvejelser Prøveindsamling Det ønskes at indsamle patientpøver taget i vacuumglas indeholdende K 2 EDTA til alle tre dele af dette projekt, da Sebia anbefaler analyse på EDTA-stabiliseret fuldblod, og det er denne prøvetype, der anvendes til den daglige rutineanalyse af HbA1c på KBF. Stikprøvestørrelsen estimeres ud fra teststyrken til at skulle være minimum 55 til konkordansundersøgelsen (27). For at undgå at have for få prøver i stikprøven pga. frasortering af evt. outliers ønskes 64 prøver indsamlet. Baggrunden for de ni ekstra prøver er desuden, at der ønskes minimum fem ekstra prøver, og at det samlede prøveantal går op med otte. Der analyseres altid i alle otte kapillærer på Capillarys, og det ønskes derfor at fylde de medfølgende prøveracks til otte prøver op for at undgå at spilde reagens på tomme pladser. For at sikre at alle prøver ikke opbevares i mere end 18 timer ved stuetemperatur fra prøvetagning som anbefalet af Sebia, sættes det kriterium, at prøverne maksimalt må have været opbevaret 10 timer fra prøvetagning til prøveindsamling (14). Prøverne skal indeholde mindst 2mL fuldblod, for at sikre at der er rigeligt prøvemateriale, Tosoh må ikke have detekteret nogen hæmoglobinvarianter og analysesvaret skal være afgivet til rekvirenten fra Tosoh, så patientprøven er afsluttet og afdelingen ikke får yderligere brug for prøven. Til variantanalysen ønskes det at indsamle alle prøver der i perioden fra d. 28/ til d. 22/ ifølge Tosoh indeholder en variant eller har forhøjet HbF, som på KBF defineres som koncentrationer over 5%. Det ønskes at indsamle 25 prøver til holdbarhedsforsøget plus minimum fem ekstra prøver. Da dette prøveantal også skal være deleligt med otte, indsamles i alt 32 prøver. Disse prøver bliver som prøverne til konkordansundersøgelsen indsamlet højst 10 timer efter prøvetagning af samme årsag Side 17 af 52

18 som opgivet ovenfor, men de skal indeholde minimum 4mL fuldblod, for at der er nok prøvemateriale til alle fire uger. Her er det særlig vigtigt, at prøven er helt afsluttet på KBF, da prøven efter indsamling bliver delt og nedfrosset ved -20 C. Konkordansundersøgelsen Acceptgrænser for afvigelse på dobbeltbestemmelserne sættes til et konfidensinterval på 99%, for i videst muligt omfang at undgå frasorteringen af valide data. Differensen mellem målingerne på de 64 prøver analyseret på Tosoh og Capillarys fremstilles i et differensplot som funktion af koncentrationen målt på Tosoh, så konkordansen mellem de to apparater kan vurderes. Analyse af prøver med varianter og holdbarhedsforsøg Da langt de fleste prøver, der analyseres for HbA1c på KBF ikke indeholder hæmoglobinvarianter, vil det være nødvendigt at indsamle disse særlige prøver over en længere periode, end der er til rådighed i laboratoriet til dette projekt. Indsamlingen af prøverne startes derfor knap seks uger før det praktiske arbejde i laboratoriet. Da prøverne altså ikke bliver analyseret umiddelbart efter indsamling som i konkordansstudiet, bliver de nedfrosset ved -20 C i et forsøg på at bremse nedbrydningen af hæmoglobinet. For at undersøge hvilken betydning denne nedfrysning har for udseendet af elektroferogrammerne og den målte HbA1c-koncentration, udføres tillige et holdbarhedsforsøg. Ud fra tidsrammerne givet projektet kan nedfrysning i op til 28 dage undersøges. Inden prøver nedfryses måles HbA1ckoncentrationen på Capillarys, og disse målinger samt de tilhørende elektroferogrammer bruges som reference for de frosne prøver. Holdbarhedsprøverne analyseres igen efter hhv. 7, 14, 21 og 28 dages nedfrysning. Grunden til, at prøverne til holdbarhedsforsøget analyseres i alt fem gange og ikke kun før og efter nedfrysning, er, at prøverne til variantanalysen samles ind op til syv uger før analyse og derfor har været opbevaret ved -20 C i varierende tidsrum. Formålet med holdbarhedsforsøget er derfor både at undersøge om selve nedfrysningen af prøverne har en indvirkning, samt om der er forskel på om en prøve nedfryses i en, to, tre eller fire uger (28). Der sættes et 99% acceptinterval for afvigelsen på dobbeltbestemmelserne i holdbarhedsforsøget ligesom ved konkordansundersøgelsen. For at kunne vurdere om der sker en ændring af HbA1ckoncentrationen over tid, fremstilles data i et XY-plot, hvor HbA1c-koncentrationen plottes som funktion af antal dage prøven har været nedfrosset. Der vil desuden fremstilles i alt fire differensplots mellem dag 0 og hhv. dag 7, 14, 21 og 28 for tydelige at kunne se forskellen før og Side 18 af 52

19 efter nedfrysning. Det formodes at data ikke vil være normalfordelt, da der er tale om patientprøver. Derfor undersøges det vha. en Friedmantest, der er en nonparametrisk test til sammenligning af mere end to stikprøver, om der er en signifikant forskel ( 0,05) på HbA1c-koncentrationen før og efter frysning på de fem stikprøver repræsenterende dag 0, 7, 14, 21 og 28. Derudover vil der blive udført en Friedmantest, hvor stikprøven fra dag 0 udelukkes, for at undersøge om der er en signifikant forskel på HbA1c-koncentrationerne alt efter hvor lang en periode prøverne har været nedfrosset. Det ønskes at vurdere Capillarys og Tosohs evne til at separere hæmoglobinvarianter fra HbA0 og HbA1c vha. separeringsprofilen på elektroferogrammerne og kromatogrammerne for prøverne med hæmoglobinvarianter. Ved at anvende separeringsprofilerne for de fem mikroprøver udleveret af Sebia som referencer, vil det desuden være muligt at identificere patientprøver, der sansynligvis har fænotypen HbAC, HbAD, HbAE eller HbAS. Det anbefales at anvende DCCT-enheden, til sammenligning af apparater (8), og da der for Tosoh desuden kun er oplyst variationskoefficienter (CV) for denne enhed, anvendes kun data i DCCTenheden til sammenligningen af de to apparater. Da Tosoh angiver analysesvaret med en decimal mere end Capillarys, afrundes Tosohs svar i DCCT-enheder til én decimal ligesom Capillarys, for at der er samme grundlag for sammenligningen på de to apparater. Materialer Apparatur Der blev anvendt kapillærelektroforeseapparatet Capillarys 2 FlexPiercing produceret af Sebia (Lisses, Frankrig) og leveret af ILS (Allerød, Danmark) samt HPLC-apparatet HLC-723 G8 produceret af Tosoh (Tokyo, Japan). Reagenser Til HbA1c-analysen på Capillarys 2 FlexPiercing anvendtes Sebias Capillarys HbA1c-kit leveret af ILS (Allerød, Danmark) som indeholder hæmolysevæske, vaskeopløsning og migrationsbuffer. Desuden anvendtes HbA1c Capillary Calibrator 1 og 2 og HbA1c Capillary Control 1 og 2, alle fra Sebia og leveret af ILS samt ekstra filtreret, demineraliseret vand (Milli-Q). Til mikroprøver anvendtes Sebias kapillærprøvekit A1c/CE Capillary blood sample kit (ILS, Allerød, Danmark). Side 19 af 52

20 Til HbA1c-analysen på Tosoh anvendtes hemolysis-wash solution og elution buffer His, No. 1, 2 og 3 (Tosoh, Tokyo, Japan), Deks kalibratorer i to niveauer, Deks High og Deks Low (Glostrup, Danmark) samt Biorad Lyphochek Diabetes Control level 1 og 2 (Hercules, Californien, USA). Prøvemateriale Der er anvendt patientprøver i form af EDTA-stabiliseret fuldblod indsamlet i vacuumrør. Til konkordanssforsøget indsamledes 64 prøver. Disse prøver blev efter indsamling opbevaret ved 4 C indtil analyse dagen efter. Til holdbarhedsforsøget indsamledes 32 prøver som blev analyseret første gang umiddelbart efter indsamling. Efter analyse blev prøverne udportioneret i spidsglas i fire hold. Disse spidsglas med tilhørende propper er produceret af Sebia og beregnet til analyse af kontroller eller små prøvemængder. I alt indsamledes 29 prøver til variantanalysen over perioden d. 28/ til d. 22/ , og de blev opbevaret ved -20 C umiddelbart efter indsamling, indtil analyse d. 23/ Fra Sebia blev der udleveret fem mikroprøver med fænotyperne HbAC, HbAD, HbAE, HbAS og HbAA med forhøjet HbF. Disse blev sendt på tøris fra Frankrig og blev efter modtagelse opbevaret ved -80 C indtil analyse. Metoder HbA1c-analysen på Tosoh er fuldt automatiseret. Der anvendes kun én type racks, og de manuelt fortyndede kontroller sættes direkte i samme racks som patientprøverne. Tosoh anvender direkte identifikation af prøver og kontroller vha. stregkoder. Alle racks er mærket med numre. Det er vigtigt at notere, hvilket rack Tosoh er nået til, hvis det er nødvendigt at afbryde en serie for f.eks. at opfylde reagens, da Tosoh altid vil registrere det første rack som rack nr. 1, når analysen genoptages. Der suges ca. 3µL fuldblod direkte fra primærrøret med prop. Alle analyser på Tosoh blev udført efter KBF s gældende forskrifter (9,18). Capillarys er også et fuldt automatiseret analyseapparat. Her anvendes modsat Tosoh forskellige racks til kontroller, kalibratorer, vedligehold af kapillærerne og prøver. Alle racks er mærket med en stregkode, der læses af apparatet, som så kan skelne mellem de forskellige racks, ligesom der anvendes direkte identifikation af prøver og kontroller vha. stregkoder. Inden Capillarys suger 20µL fuldblod direkte fra primærrøret med prop vendes racket med prøver syv gange (14,29). Side 20 af 52

21 Alle analyser på Capillarys blev udført efter producentens forskrifter med undtagelse af opbevaringstemperatur ved holdbarhedsforsøget, hvor prøver blev nedfrosset ved -20 C og ikke - 80 C som anbefalet af Sebia (14). Konkordansstudie De 64 prøver til konkordansforsøget blev først analyseret på Capillarys i dobbeltbestemmelser i én serie med de to kontroller først og sidst i serien. Herefter blev prøverne på samme måde analyseret på Tosoh. Holdbarhedsforsøg Første analyse af de 32 prøver til holdbarhedsforsøget blev udført umiddelbart efter prøveindsamling. Prøverne blev analyseret på Capillarys i dobbeltbestemmelser i én serie med de to kontroller først og sidst i serien. De fire nedfrosne hold holdbarhedsprøver blev optøet og opblandet efter hhv. 7, 14, 21 og 28 dage og analyseret som inden nedfrysningen. Analyse af hæmoglobinvarianter Fem mikroprøver med kendte hæmoglobinvarianter udleveret af Sebia og 29 patientprøver, hvor Tosoh havde detekteret en variant, blev analyseret i dobbeltbestemmelser på Capillarys i én serie med to kontroller først og sidst i serien. Herefter blev prøverne fra Sebia analyseret på Tosoh i én serie med to kontroller først og sidst i serien. Statiske redskaber Der er anvendt Excel til statistiske beregninger og grafisk fremstilling af data. Resultater Konkordansstudie Afvigelse på dobbeltbestemmelser Grænserne for afvigelsen mellem dobbeltbestemmelserne bliver med et konfidensinterval på 99% Amax Tosoh 3, 4% for Tosoh og Amax Capillarys 5,1% for Capillarys. Se bilag 1 for beregninger. Af de 64 prøver afveg én fra de angivne grænser og denne prøve er derfor ikke medtaget i de videre beregninger. Side 21 af 52

22 (Tosoh-Capillarys)/Tosoh, [%] Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen Trine Lyberth Christensen Sammenligning af Tosoh og Capillarys Tosoh Capillarys Som vist på figur 7 er den procentvise afvigelse fra Tosoh, A 100%, generelt Tosoh større end 0, dvs. Tosoh generelt har målt højere HbA1c-koncentrationer end Capillarys på de 63 patientprøver. På en enkelt prøve, prøve nr. 7, er der en afvigelse på 26% mellem målingerne på Tosoh og Capillarys (hhv. 6,8% og 5,0%), hvilket er betydeligt højere end resten af prøverne, der alle har afvigelser mellem -1,1% og 5,2%. Figur 8 viser differensplottet for alle prøver undtagen prøve 7. Kromatogrammet for prøven så normal ud (figur 9), men på elektroferogrammet var toppen for Other HbA højere end normalt i venstre side omkring værdien (figur 10). På figur 7 og 8 er indsat en grænse på ±6%. Det er den grænse American Diabetes Association (ADA) i samarbejde med College of American Pathology (CAP) har sat som grænse for, hvor meget et laboratories måling af HbA1c-koncentrationen i en prøve med en værdi fastsat af NGSP må afvige fra den fastsatte værdi. 30,00 Differensplot 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 4,00-5,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00-10,00 HbA1c-koncentration (Tosoh) [%] Figur 7 Differensplot. Den procentvise afvigelse fra Tosoh plottet som funktion af HbA1c-koncentrationen målt på Tosoh for 63 patientprøver (blå ruder) samt grænser på ±6% (røde linjer). Side 22 af 52

23 (Tosoh-Capillarys)/Tosoh, [%] Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen Trine Lyberth Christensen 8,00 Differensplot 6,00 4,00 2,00 0,00 4,00-2,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00-4,00-6,00-8,00 HbA1c-koncentration (Tosoh), [%] Figur 8 Differensplot. Den procentvise afvigelse fra Tosoh plottet som funktion af HbA1c-koncentrationen målt på Tosoh for 62 patientprøver (blå ruder, prøve nr. 7 er udeladt) samt grænser på ±6% (røde linjer). Figur 9 Kromatogram for prøve nr. 7 i konkordansundersøgelsen. Kromatogrammet ser umiddelbart normalt ud. Side 23 af 52

24 Figur 10 Elektroferogram for prøve nr. 7 i konkordansundersøgelsen (til venstre) og eksempel fra Sebia på et elektroferogram for en prøve indeholdende acetyleret hæmoglobin (30). På begge elektroferogrammer er venstre del af toppen for Other HbA omkring værdien større end normalt (markeret med pile). Holdbarhedsforsøg Frasortering af prøver pga. ikke valide resultater Til holdbarhedsforsøget blev de 32 patientprøver analyseret i dobbeltbestemmelser på Tosoh og Capillarys. Der blev anvendt samme acceptgrænser for afvigelsen på dobbeltbestemmelserne på Capillarys som ved metodesammenligning, Amax Capillarys 5,1%. For prøve nr. 23 var der en afvigelse større end A max på dobbeltbestemmelserne på dag 7, hvorfor denne prøve er udeladt i den videre databehandling. Derudover blev prøve nr. 4, 12, 20 og 28 sorteret fra, da de alle blev analyseret i kapillær nr. 4, hvor den høje kontrol først i serien ikke kunne godkendes, samt prøve nr. 14 og 24 pga. manglende resultat for enten første eller anden måling dag 0. I alt er der 25 prøver tilbage i datasættet. Side 24 af 52

25 Koncentration [%] Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen Trine Lyberth Christensen Påvirkning af HbA1c-koncentrationen før og efter nedfrysning Til at vurdere, om der var forskel på HbA1c-koncentrationerne i de 25 prøver før og efter nedfrysning af prøverne, laves et diagram hvor HbA1c-koncentrationerne plottes som funktion af tiden i antal dage fra nedfrysning (figur 11). Holdbarhedsforsøg 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4, Dag Figur 11 HbA1c-koncentrationen i 25 patientprøver plottet som funktion af antal dage de har været nedfrosset ved -20 C. HbA1c-koncentrationen for dag 0 er målt ved stuetemperatur inden prøverne blev nedfrosset. Ud fra figur 11 kan der ikke umiddelbart ses en forskel af betydning på HbA1c-koncentrationerne mellem dag 0, 7, 14, 21 og 28. I differensplots, hvor differensen mellem dag 0 og hhv. dag 7, 14, 21 og 28 plottes mod HbA1c-koncentrationen dag 0, ses tydeligere, at koncentrationen dag 0 ligger en smule højere end de andre dage (figur 12-15). Ved denne metode kan stikprøverne kun sammenlignes to og to ad gangen. For at sammenligne alle stikprøverne på én gang uden én stikprøve som reference anvendes en Friedmantest. Side 25 af 52

26 Relativ afvigelse [%] Relativ afvigelse [%] Relativ afvigelse [%] Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen Trine Lyberth Christensen 4,0 Holdbarhedsforsøg dag 7-0 2,0 0,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0-2,0-4,0 HbA1c-koncentration dag 0 [%] Figur 12 Differensplot. Den relative forskel mellem HbA1c-koncentrationerne målt i % hhv. dag 7 og dag 0 i forhold til dag 0 plottet som funktion af HbA1c-koncentrationen dag 0. 6,0 4,0 2,0 0,0-2,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0-4,0-6,0 Holdbarhedsforsøg dag 14-0 HbA1c-koncentration dag 0 [%] Figur 13 Differensplot. Den relative forskel mellem HbA1c-koncentrationerne målt i % hhv. dag 14 og dag 0 i forhold til dag 0 plottet som funktion af HbA1c-koncentrationen dag 0. 6,0 4,0 2,0 0,0-2,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0-4,0-6,0 Holdbarhedsforsøg dag 21-0 HbA1c-koncentration dag 0 [%] Figur 14 Differensplot. Den relative forskel mellem HbA1c-koncentrationerne målt i % hhv. dag 21 og dag 0 i forhold til dag 0 plottet som funktion af HbA1c-koncentrationen dag 0. Side 26 af 52

27 Relativ afvigelse [%] Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen Trine Lyberth Christensen Holdbarhedsforsøg dag ,0 4,0 2,0 0,0-2,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0-4,0-6,0 HbA1c-koncentration dag 0 [%] Figur 15 Differensplot. Den relative forskel mellem HbA1c-koncentrationerne målt i % hhv. dag 28 og dag 0 i forhold til dag 0 plottet som funktion af HbA1c-koncentrationen dag 0. Friedmantest Da data ikke er normalfordelt anvendes en Friedmantest for at vurdere, om der er en statistisk signifikant forskel på HbA1c-koncentrationerne målt hhv. før nedfrysning og efter 7, 14, 21 og 28 dages nedfrysning. Der anvendes et signifikansniveau på 95% ( 0,05 ) og hypoteserne H 0 : Der er ingen forskel, H 1 : Der er en signifikant forskel. Ifølge tabelopslag fås, at ved 2 større end 9, forkastes H 0. Ved beregning af teststørrelsen fås at 2 13,6 og 0 H forkastes, altså er der en signifikant forskel mellem HbA1c-koncentrationerne målt i prøverne dag 0, 7, 14, 21 og 28. Derudover undersøges det, om der ses en signifikant forskel mellem prøverne, der har været nedfrosset i hhv. 7, 14, 21 og 28 dage, for at se om varigheden af nedfrysningen har haft en betydning. Her sammenlignes altså ikke med HbA1c-koncentrationen dag 0. Der anvendes samme signifikansniveau og hypoteser som ovenfor. Ud fra tabelopslag fås, at hvis 2 er større end 7,81473 forkastes H 0. Ved beregning af teststørrelsen fås 2 6,156 og 0 H accepteres, hvilket altså betyder at der ikke er en signifikant forskel på HbA1c-koncentrationen i prøver, der har været nedfrosset i hhv. 7, 14, 21 og 28 dage. Se bilag 2 for beregning af teststørrelsen. Ændring af elektroferogrammer efter nedfrysning Udover at sammenligne HbA1c-koncentrationen sammenlignes elektroferogrammerne for prøverne før og efter nedfrysning. På elektroferogrammerne for prøver, der har været nedfrosset, ses en lille ekstra top til højre for HbA2, samt som en større top end normalt ved Other HbA. Der sås ingen forskel af betydning på størrelsen af disse toppe mellem dag 7, 14, 21 og 28 (se bilag 3). Toppene for HbA1c, HbA0 og HbA2 ser ikke ud til at blive ændret. Når Capillarys registrerer flere toppe end Side 27 af 52

28 HbA1c, Other HbA, HbA0 og HbA2 giver den meddelelsen Atypical profile. Elektroferogrammerne på figur 16 repræsenterer ændringerne i elektroferogrammerne pga. frysning for langt de fleste prøver i holdbarhedsforsøget. Der var dog enkelte tilfælde, hvor Capillarys ikke registrerede en ekstra top. I disse tilfælde havde blodet en lysere rød farve end de andre prøver og lignede mere prøver, der ikke havde været nedfrosset. Figur 16 Elektroferogrammer for patientprøve nr. 1 i holdbarhedsforsøget inden nedfrysning (dag 0) og efter 7 dages nedfrysning ved -20 C. Ændringer i elektroferogrammet ifht. dag 0 pga. nedbrydningsprodukter er markeret med blå ringe. Prøver med hæmoglobinvarianter I én af de 29 patientprøver meddelte Capillarys, at den optiske densitet i prøven var for lav. Denne prøve er derfor ikke medtaget i den videre bahandling af datasættet. Elektroferogrammerne og kromatogrammerne fra de resterende 28 patientprøver sammenlignedes med elektroferogrammerne og kromatogrammerne for de fem prøver udleveret af Sebia. I vurderingen af elektroferogrammerne med henblik på at identificere en variant er der taget højde for, at der, som beskevet ovenfor, kan forekomme flere mindre toppe pga nedbrydnindprodukter, som opstår når prøverne fryses. Af de 28 patientprøver viste resultaterne fra både Capillarys og Tosoh at én prøve sandsynligvis havde fænotypen HbAC, to prøver HbAD, syv prøver HbAE, otte prøver HbAS og fem prøver havde forhøjet HbF. Toppene på elektroferogrammerne er godt adskilt fra HbA1c og HbA0 for alle hæmoglobinvarianterne (figur 17-20) bortset fra, hvor der ses forhøjet F (figur 21). For de resterende 5 prøver var det ikke muligt entydigt at identificere en variant. Se tabel 1. Ved prøve 25 var der en uidentificeret top på kromatogrammet til højre for HbA0 ved retentionstiden 0,75. På elektroferogrammet ses ingen toppe udover de sædanlige bortset fra en lille top, omkring værdien 180, hvor HbF plejer at være, men den er så lille, at der ikke engang er registreret en koncentration (figur 22). Prøve 24 havde en top ved retentionstiden 1,13 og lignede derfor en HbAS på kromatogrammet. En top omkring værdien 220, som er mellem der hvor HbE og HbS plejer at ligge på elektroferogrammet, tydede på en anden ukendt variant på elektroferogrammet (figur 23). Side 28 af 52

29 Prøve 3 havde de samme toppe både på elektroferogrammet og kromatogrammet som prøve 24, men havde desuden en ekstra lille top til højre for HbA0 på elektroferogrammet omkring værdien 190 samt en højere Other HbA. Prøverne 1 og 26 indeholdt toppe på både kromotogrammerne og elektroferogrammerne, som ikke kunne identificeres ud fra de udleverede prøver. Prøve 1 ser ud til at indeholde meget lidt HbA, da toppene for HbA0 er usædvanligt små både på kromatogrammet og elektroferogrammet, og samtidig er der ingen top for HbA1c på elektroferogrammet og kun en ganske lille top på kromatogrammet. Derudover ses en stor top ved værdien 180 på elektroferogrammet og ved retentionstiden 0,45 på kromatogrammet, hvor HbF normalt findes. Ved retentionstiden 1,19 yderst til højre på kromatogrammet ses desuden en meget stor top (figur 25). På elektroferogrammet for prøve 26 ses to umiddelbart ens toppe både omkring værdierne 60-80, hvor HbA1c normalt ses og omkring værdien 240, hvor HbA2 normalt ligger. Bortset fra en stor front peak og en lille top længst til højre på kromatogrammet omkring retentionstiden 1,25 ser kromatogrammet normalt ud (figur 26). Mulig variant Capillarys Mulig variant Tosoh Antal prøver Er toppene tydeligt adskilt fra HbA1c og HbA0? (Capillarys) C C 1 Ja D D 2 Ja E E 7 Ja F F 5 Nej S S 8 Ja? 1 Ja?? 2 Ja? S 2 Ja Tabel 1 Fordelingen af 28 patientprøvers hæmoglobinvarianter defineret ud fra referenceelektroferogrammer og - kromatogrammer for fem prøver, der repræsenterer hhv. HbAC, HbAD, HbAE, HbAS og HbAA med forhøjet HbF. Der ses ingen ekstra toppe på elektroferogrammet, der kunne tyde på en variant.? På elektroferogrammet/kromatogrammet ses en ekstra top/ekstra toppe, som tydede på en variant, men som ikke kunne identificeres som variant C, D, E eller S. Side 29 af 52

30 HbC Figur 17 Elektroferogram (til venstre) og kromatogram (til højre) for en prøve der repræsenterer fænotypen HbAC. På elektroferogrammet ses HbC ved værdierne og på kromatogrammet omkring retentionstiden 1,20. Bemærk at der ikke ses en top for HbA2 på elektroferogrammet, da denne normalt ligger omkring værdien 240. HbA1c-toppen er mørkt skraveret på elektroferogrammet og rød på kromatogrammet. HbD Figur 18 Elektroferogram (til venstre) og kromatogram (til højre) for en prøve der repræsenterer fænotypen HbAD. På elektroferogrammet ses HbD ved værdien 200 og på kromatogrammet omkring retentionstiden 1,02. HbA1c-toppen er mørkt skraveret på elektroferogrammet og rød på kromatogrammet. HbE Figur 19 Elektroferogram (til venstre) og kromatogram (til højre) for en prøve der repræsenterer fænotypen HbAE. På elektroferogrammet ses HbE ved værdierne og på kromatogrammet omkring retentionstiden 0,71. HbA1c-toppen er mørkt skraveret på elektroferogrammet og rød på kromatogrammet. Side 30 af 52

31 HbS Figur 20 Elektroferogram (til venstre) og kromatogram (til højre) for en prøve der repræsenterer fænotypen HbAS. På elektroferogrammet ses HbS ved værdierne og på kromatogrammet omkring retentionstiden 1,17. HbA1c-toppen er mørkt skraveret på elektroferogrammet og rød på kromatogrammet. HbF Figur 21 Elektroferogram (til venstre) og kromatogram (til højre) for en prøve der repræsenterer fænotypen HbAA og høj HbF. På elektroferogrammet ses HbF ved værdien 180 og på kromatogrammet ved retentionstiden 0,4. HbA1c-toppen er mørkt skraveret på elektroferogrammet og rød på kromatogrammet. Figur 22 Elektroferogram (til venstre) og kromatogram (til højre) for prøve nr. 25 i variantanalyseforsøget. Elektroferogrammet ser normalt ud med en smule HbF, mens der ses en stor ekstra top til venstre for HbA0 på kromatogrammet omkring retentionstiden 0,75. HbA1c-toppen er mørkt skraveret på elektroferogrammet og rød på kromatogrammet. Side 31 af 52

32 Figur 23 Elektroferogram (til venstre) og kromatogram (til højre) for prøve nr. 3 i variantanalyseforsøget. På elektroferogrammet ses en lille ekstra top til højre for HbA0 omkring værdien 190 samt en ekstra top til venstre for HbA2 ved værdien 220, hvilket er mellem der hvor HbE og HbS normalt ses (markeret med pile). På kromatogrammet ligner fænotypen HbAS med en ekstra top omkring retentionstiden 1,15. HbA1c-toppen er mørkt skraveret på elektroferogrammet og rød på kromatogrammet. Figur 24 Elektroferogram (til venstre) og kromatogram (til højre) for prøve nr. 24 i variantanalyseforsøget. På elektroferogrammet ses en ekstra top til venstre for HbA2 ved værdien 220, hvilket er mellem der hvor HbE og HbS normalt ses (markeret med en pil). På kromatogrammet ligner fænotypen HbAS med en ekstra top omkring retentionstiden 1,13. HbA1c-toppen er mørkt skraveret på elektroferogrammet og rød på kromatogrammet. Figur 25 Elektroferogram (til venstre) og kromatogram (til højre) for prøve nr. 1 i variantanalyseforsøget. Toppen for HbA0 usædvanligt lille på elektroferogrammet, HbA1c-toppen findes slet ikke og der ses en stor top ved værdien 180, hvor HbF normalt findes (markeret med en pil). HbA0-toppen er også meget lille på kromatogrammet og den ser ud til at bestå af to toppe. HbA1c-toppen er usædvanligt lille (markeret med rødt), der ses en stor top ved retentionstiden 0,45, som svarer til HbF og der ses desuden en meget stor, ekstra top ved retentionstiden 1,19 længst til højre på kromatogrammet (markeret med pilen). Side 32 af 52

33 Figur 26 Elektroferogram (til venstre) og kromatogram (til højre) for prøve nr. 26 i variantanalyseforsøget. På elektroferogrammet ses to små toppe af ca. samme størrelse både ved værdierne 60-80, hvor HbA1c normalt findes, og omkring 240, hvor HbA2 normalt findes (markeret med pile). Kromatogrammet ser bortset fra en stor front peak og lille top længst til højre omkring retentionstiden 1,25 (markeret med pile) umiddelbart normalt ud. HbA1c-toppen er rød på kromatogrammet. Diskussion Tosoh og Capillarys som diagnostiske apparater Da WHO i 2011 udmeldte at HbA1c-analysen kunne anvendes til diagnostik af diabetes mellitus undersøgte Dansk selskab for klinisk biokemis (DSKBs) videnskabelige udvalg for kvalitetssikring (VUK) analysekvaliteten for HbA1c til diagnostik i Danmark. De kom frem til, at en analysemetode anses for at have opfyldt alle kravene til diagnostik, hvis den har en maksimal, kombineret, relativ standardusikkerhed (CV komb ) på 2,5%, eller en maksimal relativ bias fra referencemetodeværdien fastsat af European Reference Laboratory for Glycohemoglobin (ERL) i DCCT-enheder på 1,8% samt en maksimal relativ dag til dag variation på 1,8% (26). Ifølge VUK vil en analytisk dag til dag variation på 2,6% leve op til det medicinske monitoreringskrav. Kravene til diagnostik er altså højere end til monitorering, så hvis en analysemetode lever op til kravene til diagnostik, vil den også have opfyldt kravene til monitorering. CV komb inkluderer analyseusikkerheden mellem serier, laboratorier, analysemetoder og kalibrator- og reagenslots. Ud fra tilgængelige data for Tosoh og Capillarys fra videnskabelige artikler samt produktoplysninger fra producenterne vil CV komb kunne vurderes, og dermed om de lever op til VUKs krav til apparater, der skal anvendes til diagnostik. Relativ bias fra ERL samt relativ dag til dag variation vil ikke blive diskuteret, da der ikke foreligger data for relativ bias fra ERL for apparaterne, og det kun er nødvendigt at apparater til diagnostik overholder det ene af de to kriterier nævnt ovenfor (26). Alle nævnte analyseusikkerheder er opgivet for DCCT-enheden medmindre andet er angivet. Side 33 af 52

34 Ifølge Tosohs Technical report ligger den maksimale CV for Tosoh på 0,93% (intra-assay) og 0,70% (inter-assay) (18), hvilket er langt under grænsen på de 2,5%. Der oplyses ikke en total CV, der inkluderer dag til dag variation og analyse på flere forskellige apparater med forskellige reagens- og kalibratorlots, som vil kunne sammenlignes direkte med CV komb. Et studie foretaget på Tosoh G8-apparater i fire forskellige laboratorier i Holland og Belgien i 2010 opgiver til gengæld inter-assay præcisionen til at være mellem 0,4% og 1,82% (31). Ud fra disse oplysninger overholder Tosoh VUKs krav til diagnostik. Sebia oplyser en maksimal total analyseusikkerhed, der inkluderer måling på tre forskellige apparater med tre forskellige reagenslot, for Capillarys på 2,6% (14). Dette er ifølge VUK godt nok til monitorering, men ikke godt nok til diagnostik. Den første eksterne evaluering af Capillarys som analyseapparat til måling af HbA1c foretages i Frankrig i Her opnås en inter-assay præcision på 1,45% for patientprøver og 1,66% for interne kvalitetskontroller (8). I et Italiensk studie fra 2013, hvor Capillarys afprøves i tre forskellige laboratorier, opnås en inter-assay præcision på mellem 1,4% og 2,0% (19). Begge disse studier har altså opnået en CV komb for Capillarys, der ligger under VUKs maksimale grænse på 2,5% til diagnostik. For dette projekt kan den intraserielle analyseusikkerhed (CV intra ) for Tosoh og Capillarys beregnes ud fra dobbeltbestemmelserne i konkordansundersøgelsen. For Tosoh fås CV intra = 0,34% og for Capillarys CV intra = 1,12% (se bilag 4 for beregningseksempel). Disse analyseusikkerheder kan ikke sammenlignes direkte med grænsen på 2,5% for diagnostiske apparater, da der ikke er tale om en total analyseusikkerhed. Det er dog tydeligt at Capillarys i dette projekt generelt har en større usikkerhed på dobbeltbestemmelser end Tosoh på trods af, at der ved kapillærelektroforese opnås en højere opløsning (22). Konkordans mellem Tosoh og Capillarys HbA1c-koncentrationerne målt på Tosoh er i gennemsnit 2,2% højere end HbA1ckoncentrationerne målt på Capillarys. Kun prøve nr. 7 afviger betydeligt mere end dette med 26%. Dette tyder på, at der er et interfererende stof til stede i denne prøve. Resten af prøverne afviger mellem -1,1% og 5,2%, og hvis prøve nr. 7 udelades, ligger Tosohs målinger gennemsnitligt 1,8% højere end Capillarys. På KBF har de i den daglige rutine bemærket, at Tosoh måler en anelse for højt, og at dette sandsynligvis skyldes, at Deks kalibratorer har en lavere koncentration ifht. angivet (32,33) (se Side 34 af 52

35 bilag 5). De målte HbA1c-koncentrationer på patientprøver og kontroller vil derfor ligge for højt, hvilket kan være en forklaring på, at Tosohs resultater ligger højere end Capillarys. Om denne fejl vil udligne forskellen mellem målingerne på de to apparater (med undtagelse af prøve nr. 7), er svært at sige. I arbejdet med dette projekt har det været utroligt svært at finde en klinisk relevant grænse for, hvor meget HbA1c-målinger må afvige mellem analyseapparater, når apparaterne skal anvendes til diagnostik. VUK skriver dog også, at de: ikke har kunnet identificere relevante medicinske krav som udgangspunkt for fastsættelsen af analyseusikkerheden ved diagnostik. (26). American Diabetes Associoation (ADA) har i samarbejde med College of American Pathology (CAP) i 2013 fastsat en grænse på 6% som en prøve med en HbA1c-koncentration fastsat af NGSP analyseret på et laboratorium maksimalt må afvige fra denne fastsatte værdi (34). Hvis ADAs grænse på 6% anvendes som grænse for den maksimale tilladte afvigelse mellem HbA1c-koncentrationer målt på hhv. Tosoh og Caillarys, ses det, at alle målinger bortset fra prøve nr. 7 ligger inden for denne grænse. Altså er der kun god konkordans mellem Tosoh og Capillarys, hvis prøver indeholdende samme interferens som prøve nr. 7 udelukkes. Prøve nr. 7 Prøve nr. 7 i konkordansundersøgelsen er særligt interessant. Ifølge Tosoh havde den en HbA1ckoncentration på 6,8%, mens Capillarys målte HbA1c-koncentrationen til 5,0%, hvilket svarer til en relativ afvigelse på 26%. Så stor en forskel tyder på, at et interfererende stof eller hæmoglobinvariant er til stede, og at den ene eller begge metoder har målt en forkert HbA1ckoncentration (35). WHO anbefaler, at cut-off-værdien for diagnosticering af diabetes sættes ved en HbA1c-koncentration på 6,5% (6). Denne grænse betyder at det ikke kun er størrelsen på forskellen på de to målinger, der er problematisk, men også konklusionen på målingen, da patienten ifølge Tosoh har forhøjet HbA1c, mens han/hun ifølge Capillarys har en HbA1c-koncentration, der ligger inden for normalområdet. Der er altså tale om to scenarier: enten har Tosoh målt en falsk høj værdi, eller også har Capillarys målt en falsk lav værdi. For at kunne stille diagnosen diabetes mellitus, kræves som minimum to HbA1c-analysesvar (6). Ser vi på analysesvaret for prøve nr. 7 i diagnostisk øjemed, vil en falsk forhøjet HbA1ckoncentration målt på Tosoh, være årsag til at patienten kunne blive fejldiagnosticeret med diabetes. Dette gør sig gældende, hvis Tosoh også anvendes til den konfirmerende måling af HbA1ckoncentrationen, og patienten stadig har det evt. interfererende stof i blodet på Side 35 af 52

36 prøvetagningstidspunktet. Hvis det modsatte derimod er tilfældet og HbA1c-svaret fra Capillarys er falsk lavt, ville patientens mulige diabetes ikke blive diagnosticeret med denne analysemetode, hvilket ubehandlet vil kunne føre til bl.a. kadiovaskulære komplikationer (24). Hvis prøve nr. 7 derimod var en prøve fra en patient allerede diagnosticeret med diabetes, og prøven derfor var taget i forbindelse med monitoreringen af sygdommen, kan analysesvaret fra Tosoh være skyld i en fejlagtig ændring af behandling af patienten, da det ser ud til at patientens plasmaglukose generelt har ligget for højt de sidste 6-8 uger. En sådan fejlbehandling kan resultere i hypoglykæmi. Modsat vil et falsk lavt svar kunne være årsag til en fejlbehandling, som resulterer i hyperglykæmi. Forklaringen på forskellen i HbA1c-koncentrationerne for prøve nr. 7 målt på hhv. Tosoh og Capillarys kan muligvis findes ved at se på elektroferogrammet og kromatogrammet for prøven. Hvis elektroferogrammet sammenlignes med et for en prøve indeholdende en forhøjet mængde acetyleret hæmoglobin (AcHb) er ligheden slående (se figur 10). På elektroferogrammet vil AcHb kunne ses i venstre del af toppen Other HbA, og det vil derfor ikke interferere med hverken HbA1c eller HbA0, som er de eneste fraktioner, der anvendes til beregningen af HbA1ckoncentrationen. Normalt vil AcHb vandre med HbA1c, når hæmoglobinfraktionerne adskilles vha. HPLC og dermed give en forhøjet HbA1c-værdi. Ifølge Tosohs Technical report, skulle tilstedeværelsen af acetylsalicylsyre i koncentrationer op til 50mg/dL dog ikke påvirke HbA1c-analysesvaret på Tosoh. Dette må betyde at AcHb separeres fra HbA1c-toppen på kromatogrammet, men som nævnt tidligere ser kromatogrammet normalt ud der ses ingen ekstra toppe (se figur 9). På Tosoh er HbA1a og HbA1b angivet til at udgøre 1,64% tilsammen, mens Other Hb udgør 7,6% på Capillarys. Dette tyder alt sammen på, at en forhøjet mængde AcHb i prøven har været årsag til afvigelsen på 26% mellem målingerne på Tosoh og Capillarys, og at HbA1c-værdien målt på Tosoh derfor er falsk forhøjet. Som regel skyldes en forhøjet mængde AcHb i blodet behandling med acetylsalicylsyre, som er det aktive stof i bla. Kodimagnyl og Aspirin. Stoffet kan bruges smertestillende, men anvendes også i højere doser til behandling af f.eks. reumatoid arthrit. Desuden ses en øget mængde AcHb ved bla. graviditet og alkoholisme (25). Hvis AcHb ikke er årsag til afvigelsen, skyldes den sandsynligvis en hæmoglobinvariant, som elueres samtidigt med HbA1c ved HPLC. Side 36 af 52

37 Da prøve nr. 7 så normal ud på kromatogrammet, ville den falskt forhøjede HbA1c-koncentration ikke være blevet opdaget, hvis ikke den var blevet analyseret på Capillarys. Tosoh er altså god til at analysere HbA1c-koncentrationen på normale prøver, men for prøver med forhøjet AcHb vil et falsk højt analysesvar kunne afgives. Derfor er denne prøve særligt vigtig i dette forsøg. Holdbarhedsforsøg Baggrunden for at nedfryse prøver, der ikke skulle analyseres umidddelbart efter indsamling, er som nævnt tidligere at bremse nedbrydningen af proteinerne i prøven. Nedbrydningen foregår stadig i de nedfrosne prøver bare langsommere, end den ville ved stuetemperatur. Når prøverne fryses lyseres cellerne i blodet, og cellernes cytoplasma og plasmaproteiner blandes med den ekstracellulære væske, plasmaet. Dette kan ses på prøverne, ved at de, efter de er blevet optøet, er mørkere i farven og mindre viskøse end før nedfrysningen. I et Italiensk studie fra 2012 sammenlignedes HbA1c-koncentrationen i prøver, der havde været nedfrosset ved -80 C i et år med koncentrationen før nedfrysning. De kunne konkludere, at der sås en større relativ forskel i HbA1c-koncentrationen på prøver med høj HbA1c-koncentration, end i prøver med lav HbA1c-koncentration. De kender ikke den molekylære årsag til dette, men mener ikke at lysering af erythrocytterne ved nedfrysningen er grunden (28). Under holdbarhedsforsøget blev der observeret prøver, der ikke så hæmolyserede ud efter optøning, da de var både lysere i farven og mere viskøse end de andre optøede prøver. Dette kom også til udtryk på elektroferogrammerne for disse prøver, der ikke viste nedbrydningsprodukter i form af en større top for Other HbA og en ekstra top til højre for HbA2 i lige så høj grad som de andre prøver. Dette viser, at det ikke nødvendigvis er opbevaringen i op til fire uger, der er skyld i ændringerne på elektroferogrammerne. Det kan være at selve nedbrydningsprocessen af hæmoglobinet ændres, når cellerne er lyseret, og det er pga. forholdene efter hæmolysen, at HbA1ckoncentrationen ændres og ikke pga. selve hæmolysen. Dette bekræftes af Friedmantesten der ved et signifikansniveau på 0,05 viser, at der er en statistisk signifikant forskel på HbA1ckoncentrationerne i prøverne før og efter nedfrysning, men ingen signifikant forskel på om prøverne havde været nedfrosset 7, 14, 21 eller 28 dage. Desværre blev HbA1c-koncentrationen ikke undersøgt specifikt for de prøver, der ikke så hæmolyserede ud. Hvis ændringen i HbA1c-koncentrationen før og efter nedfrysning i disse prøver Side 37 af 52

38 var mindre end i de hæmolyserede, kunne det muligvis være en del af forklaringen på ændringen af HbA1c-koncentrationen ved nedfrysning. Varianter Prøver med HbS, -E, -C, -D og forhøjet HbF Capillarys betegnede separeringsprofilerne for alle prøverne i variantanalyseforsøget som Atypical profile. Ud fra separeringsprofilerne for de fem prøver fra Sebia med kendte hæmoglobinvarianter (HbAS, HbAE, HbAC, HbAD og HbAA med forhøjet HbF) blev fænotyperne for 23 af de 28 patientprøver bestemt. Der findes mere end 1200 kendte hæmoglobinvarianter, og det skal understreges, at det vil kræve en genotypering at bestemme hæmoglobinvarianterne i disse prøver med sikkerhed, og at prøvernes tildelte fænotype blot er et kvalificeret gæt ud fra sammenligning af separeringsprofilerne. Med dette for øje er HbS, -E, -C og -D de hyppigste hæmoglobinvarianter i verden næstefter HbA, så sandsynligheden for at prøverne har fået tildelt den rette fænotype er stor, da både størrelsen og placeringen af toppene for varianterne blev vurderet nøje på både elektroferogrammerne og kromatogrammerne (10). Både Tosoh og Capillarys registrerede fem prøver med forhøjet HbF. Begge apparater er i stand til at genkende HbF ud fra hhv. retentions- og migrationstider. Producenterne af begge apparater oplyser en øvre grænse for, hvor meget HbF en prøve kan indeholde, før det påvirker HbA1canalysesvaret. Tosoh beregner som nævnt HbA1c-koncentrationen som forholdet mellem HbA1carealet og det totale areal til og med HbA0. Dette totale areal inkluderer HbF (se figur 21), og Tosoh oplyser at koncentrationer op til 5% HbF ikke interfererer med HbA1c-analysesvaret (18). Højere koncentrationer vil give en falsk lav HbA1c-koncentration. Hvis det ønskes at vide den præcise HbF-koncentrationen i en prøve analyseret på Tosoh, er det vigtigt at bemærke at HbFtoppen ved høje koncentrationer helt kan overlappe toppen for labilt HbA1c, hvilket vil give en falsk højere HbF-koncentration (31). Da Capillarys derimod udelukkende beregner HbA1ckoncentrationen på baggrund af HbA1c-arealet og HbA0-arealet, er grunden, til at HbF kan interferere med analysesvaret på Capillarys, at HbF som den eneste top ikke er fuldstændigt adskilt fra disse to toppe (se figur 21). Sebia oplyser at Capillarys kan afgive et korrekt HbA1c-analysesvar for prøver indeholdende helt op til 15% HbF (14). Da der kun er analyseret fem prøver med mere end 5% HbF, der iøvrigt er patientprøver med en ukendt HbA1c-koncentration, er det ikke muligt at konkludere, om grænserne for HbF-koncentrationen fastsat for hhv. Tosoh og Capillarys er rimelige. I det franske studie fra 2012, der afprøver Capillarys, bekræftes det, at HbF- Side 38 af 52

39 koncentrationer op til 15% ikke påvirker HbA1c-analysesvaret (8). I et amerikansk studie også fra 2012 konkluderes det, at HbA1c-analysesvaret opnået på Tosoh ikke påvirkes klinisk signifikant (relativ afvigelse >7%) af HbF-koncentrationer helt op til 30%, når der vel at mærke sammenlignes med Tosohs forgænger G7 (36). Andre varianter På kromatogrammet for prøve nr. 25 ses en meget stor top til venstre for HbA0 omkring retentionstiden 0,75, som er ca. den samme retentionstid som for HbE. Mutationen, der forårsager HbE kommer som sagt til udtryk både kvalitativt (som ses på den ændrede retentionstid) og kvantitativt (som kan ses på størrelsen af toppen). Der kan altså ikke være tale om HbE, da toppen repræsenterer 41,9% af den samlede mængde hæmoglobin, som er langt mere end HbE ville gøre ved fænotypen HbAE. Dette bekræftes på elektroferogrammet, der ser normalt ud, og hvor der ikke ses en top omkring værdien 225, hvor HbE-toppen ville findes. Der kan altså muligvis være tale om en variant, der ved kapillærelektroforese vil vandre med HbA0, og som derfor ikke kan detekteres på elektroferogrammet (se figur 22 og figur 19). Prøve nr. 3 og nr. 24 udviste næsten samme separeringsprofiler. På kromatogrammet ses en ekstra top ved retentionstiden 1,13-1,15, hvilket er ca. samme retentionstid som for HbS, men dette stemmer ikke overens med elektroferogrammet. Her ses en mindre top omkring værdien 220, som er lige imellem hvor HbE og HbS, så det kan ikke være HbS. Der kan muligvis være tale om en anden type HbS end referencen, hvor mutationen også kommer til udtryk kvantitativt, men dette er blot et gæt, og en helt anden variant kan lige så sandsynligt være tilfældet. Den eneste forskel på elektroferogrammerne for de to prøver er en ekstra lille top omkring værdien 190 samt en højere Other HbA for prøve nr. 3. Da Other HbA også er forhøjet kan det tænkes at den ekstra top ifht. prøve 24 skyldes nedbrydningsprodukter. På elektroferogrammet for prøve nr. 26 kan de to toppe der ses både ved HbA1c og HbA2 muligvis forklares med α-kædemutationer. I et belgisk studie fra 2009 undersøgtes 18 forskellige hæmoglobinvarianter, der alle var identificeret ved genotypering, på Sebias Capillarys II med Capillarys hemoglobin kit. Capillarys II er forgængeren til Capillarys 2 FlexPiercing. Hæmoglobinvarianterne HbG Philadelphia og Hb Stanleyville er begge eksempler på varianter, der skyldes mutationer i α-generne, og som på elektroferogrammerne fra Capillarys II har en HbA2-top, der er delt i to (13). Det tyder altså på at prøve nr. 26 indeholder en hæmoglobinvariant, der er opstået pga. mutationer i α-generne, men om der er tale om hæmoglobinvarianterne HbG Side 39 af 52

40 Philadelphia, Hb Stanleyville eller en helt tredje variant, kan ikke vurderes ud fra separeringsprofilen på Capillarys alene. Her vil det igen være nødvendigt at udføre en genotypering, for endeligt at kunne fastslå varianten (37). Prøve nr. 1 er usædvanlig ifht. de andre prøver med ukendte varianter idet den indeholder en langt mindre mængde HbA (33% ifølge Capillarys). Dette ses på separeringsprofilerne fra begge apparater, hvor HbA0-toppen er meget lille og toppen for HbA1c slet ikke findes på elektroferogrammet og kun udgør 1,05% på kromatogrammet. Dette kunne tyde på β-thalassæmi major, hvor β-globin syntetiseres i langt mindre mængde end normalt. Der kan derfor ikke dannes en normal mængde HbA, der består af to α- og to β-kæder ( 2 2). Ved β-thalassæmi major vil kroppen normalt konpensere ved at syntetisere en større mængde HbF ( 2 2) og i visse tilfælde også en øget mængde HbA2 ( 2 2) (10,13). Capillarys har målt HbA2-koncentrationen til 3%, hvilket er grænsen for, hvornår den betegnes som forhøjet (14), og detekteret en variant ved værdien 180, hvor HbF normalt findes, som udgør 60,1%. Det må siges at være en voldsomt høj mængde, hvis der er tale om HbF, og dette sammen med HbA2-koncentrationen og den generelle lave mængde HbA stemmer overens med mistanken om β-thalassæmi major (13,37). På KBF ønskes det på sigt at kunne screene for β-thalassæmi ved at måle HbA2-koncentrationen. Dette vil på nuværende tidspunkt være muligt på Tosoh, hvis der anvendes en anden kolonne med længere retentionstid samt tilhørende reagenser. Capillarys registrerer imidlertid også HbA2 ved HbA1c-analysen. Det vil derfor være muligt at screene alle HbA1c-prøver for β-thalassæmi uden at skulle udføre yderligere analyser hvis Capillarys anvendes (25). Anvendte materialer og metoder Det har været svært at vurdere, om 63 prøver har været tilstrækkeligt i konkordansundersøgelsen. Teststyrken blev oprindeligt estimeret ud fra analyseusikkerheden på de to metoder i form af spredningen, (et gæt på) den mindste relvante difference og stikprøvestørrelse (27). Den mindste stikprøvestørrelse, der gav teststyrken 1 ved flere estimater i træk, blev valgt. Denne sammenhæng mellem stikprøvestørrelse og teststyrke gælder dog for en t-test med to parrede stikprøver, som er en parametrisk test, og da data i konkordansundersøgelsen i dette forsøg ikke er normalfordelte, vil denne teststyrke derfor ikke kunne bruges. I dette tilfælde vil det være mere relevant at fokusere på typen frem for antallet af prøver. Der kunne have været undersøgt flere prøver, med et kendt indhold af interfererende stoffer. Dette ville Side 40 af 52

41 have givet et billede af, om Tosoh og Capillarys lever op til, hvad der oplyses af producenterne om interferens. Det ville dog ikke have givet et billede af, hvor mange prøver fra den daglige rutine, der rent faktisk indeholder stoffer/varianter i koncentrationer, som kan interferere med HbA1canalysesvaret på Tosoh, og som evt. ikke ville interferere på Capillarys, som tilfældet var med prøve nr. 7 i konkordansundersøgelsen. Dette kunne undersøges ved at analysere flere tilfældigt udvalgte patientprøver med normale kromatogrammer fra den daglige rutine. Da indsamlingen af prøver med varianter blev begyndt i slutningen af august, havde vi endnu ikke modtaget dokumenter fra Sebia med anbefalinger om opbevaring af prøvemateriale. Vi havde heller ikke fundet nogen artikler, der handlede om opbevaring af fuldblod til HbA1c-analyse og var derfor ikke klar over, at prøverne burde være blevet opbevaret ved -80 C frem for ved -20 C. Da vi blev opmærksomme på problematikken, valgte vi at fortsætte med opbevaring af variantprøverne ved - 20 C for at sikre så ens betingelser som muligt for alle prøverne. Et andet argument for at fortsætte som hidtil var, at det vha. holdbarhedsforsøget skulle være muligt at identificere ændringer i prøverne før og efter nedfrysning. Skulle variantforsøget udføres igen kunne det være interessant at samle flere prøver ind ved at starte indsamlingen endnu tidligere end i dette forsøg. Det ville desuden være optimalt at analysere prøverne på Capillarys umiddelbart efter analyse på Tosoh. Hvis dette ikke ville være muligt, ville det være oplagt at opbevare prøverne nedfrosset ved -80 C indtil analyse, og samtidig udføre et holdbarhedsforsøg, der strakte sig over lige så lang tid og ved samme temperatur som variantanalyseforsøget. Interferens fra de forskellige varianter blev i dette projekt kun vurderet visuelt ud fra elektroferogrammer og kromatogrammer. Skjult interferens fra evt. glykerede varianter ville kunne vurderes vha. differensplots for HbA1c-koncentrationerne målt på de to apparater. Konklusion Der opnåedes en god konkordans mellem Tosoh HLC-723 G8 (Tosoh) og Sebia Capillarys 2 FlexPiercing (Capillarys) for 62 af de 63 undersøgte prøver, når den maksimale grænse for den relative afvigelse mellem målinger på de to apparater sættes til 6%. Den sidste prøve blev ud fra elektroferogrammet fra Capillarys vurderet til at indeholde en forhøjet mængde acetyleret hæmoglobin (AcHb), som på trods af oplysninger fra producenten resulterede i en HbA1ckoncentration, der var 26% højere end den målt på Capillarys. Underforudsætning af, at det Side 41 af 52

42 interfererende stof er AcHb, er der således ikke god konkordans mellem de to apparater, for prøver med en forhøjet mængde AcHb. I holdbarhedsforsøget sås en signifikant forskel ( 0,05 ) på HbA1c-koncentrationen i EDTAstabiliseret fuldblod før og efter nedfrysning ved -20 C ( n 25). Om prøverne blev opbevaret ved - 20 C i 7, 14, 21 eller 28 dage havde derimod ingen signifikant betydning for HbA1ckoncentrationen. På elektroferogrammerne for prøver, der havde været frosset, sås en lille, ekstra top til højre for HbA2 og toppen Other HbA var en smule større end på elektroferogrammerne for prøverne før de blev nedfrosset. Disse ændringer af elektroferogrammerne havde ingen betydning ifht. vurderingen af ekstra toppe fremkommet pga. hæmoglobinvarianter. Ændringerne må formodes at skyldes nedbrydningsprodukter opstået ifm. nedfrysningen, men en decideret molekylær forklaring kan dog ikke bestemmes ud fra dette forsøg og er ikke beskrevet i litteraturen. Capillarys registrede en variant i 27 af de 28 analyserede patientprøver indeholdende varianter detekteret på Tosoh. Ud fra elektroferogrammerne og kromatogrammerne for disse prøver kan det konkluderes, at hæmoglobinvarianterne HbS, HbC og HbD elueres efter HbA0 på Tosoh og er fuldstændigt separeret fra HbA1c eller HbA0 på Capillarys, og de interfererer derfor ikke med HbA1c-analysesvaret, hvis de findes heterozygot med HbA. Dog ses en højere opløsning på Capillarys, hvor alle toppe (undtagen HbF) adskilles helt fra hinanden. Capillarys kan derfor ikke beregne en korrekt HbA1c-koncentration ved HbF-koncentrationerne over 15%. På Tosoh indgår HbF i det totale areal, som HbA1c-koncentration beregnes ud fra, og høje HbF-koncentrationer vil derfor kunne give en falsk lav HbA1c-koncentration. Det blev påvist, at HbE elueres før HbA0 og derfor indgår i det totale Hb-areal, og at et validt analysesvar derfor ikke kan afgives fra Tosoh, for prøver der indeholder denne variant. HbE er tydeligt separeret fra både HbA1c og HbA0 på Capillarys, og interfererer derfor ikke med HbA1c-analysesvaret her. Disse observationer stemmer overens med oplysninger fra producenterne. Der var fem patientprøver i variantanalyseforsøget, som ikke kunne identificeres som enten HbS, - E, -C eller -D. Af disse registreredes der i ét tilfælde ingen variant på Capillarys, selvom der sås en ekstra top ved analyse på Tosoh. Ifølge Tosoh kunne varianten på to af prøverne identificeres som HbS, men dette stemte ikke overens med resultaterne fra Capillarys, hvor varianten ikke kunne identificeres ud fra referencerne. En enkelt prøve indeholdt en variant, der hverken kunne identificeres Tosoh eller Capillarys. For den sidste prøve sås på begge apparater, hvad der tilsyneladende er β-thalassæmi major. Side 42 af 52

43 Fordelene ved Capillarys ifht. Tosoh er, at der opnås en højere opløsning, at HbE og tilsyneladende AcHb ikke interfererer med HbA1c-analysesvaret, og at der kan afgives valide HbA1c-analysesvar ved HbF-koncentrationer op til 15% mod 5% på Tosoh. Desuden vil der ved HbA1c-analysen på Capillarys samtidigt kunne screenes for β-thalassæmi, da HbA2 også separeres, hvor der på Tosoh skal anvendes en anden søjle. Tosoh har til gengæld lavere analyseusikkerhed end Capillarys. Perspektivering Hvis dette projekt skulle uddybes, kunne det være interessant at undersøge interferens fra AcHb på Tosoh nærmere. I en sådan undersøgelse skulle prøver med kendte AcHb-koncentrationer analyseres på både Tosoh og Capillarys. Samtidigt kunne interferens fra andre stoffer som f.eks. carbamyleret hæmoglobin også undersøges. Det ville desuden være relevant at undersøge, om der ses en signifikant forskel på HbA1c-koncentrationen i prøver indeholdende varianter eller andre interferenser målt på Tosoh og Capillarys. I et holdbarhedsforsøg kunne det også være interessant at sammenligne HbA1c-koncentrationerne i prøver der havde været frosset, men som umiddelbart ikke er hæmolyserede med HbA1c-koncentrationerne i prøver der er hæmolyserede ved nedfrysning. Desuden kunne det være spændende at undersøge validiteten af HbA2-målingen på Capillarys med HbA1c-assayet til brug ved β-thalassæmiscreening over for HbA2 målt på Tosoh. Side 43 af 52

44 Litteratur (1) Christensen TL, Mortensen TS. Fra egne resultater, som er fundet i forbindelse med dette bachelorprojekt (2) Hilsted J, Borch-Johnsen K, Sandahl Christiansen J. Diabetes: sygdom, behandling og organisation. 2011:403 sider, ill. (nogle i farver). (3) Statens Seruminstitut. Diabetes - tal på diabetes ; Available at: Accessed 21. november, (4) Lyngbye J, Kjær A, Ladefoged SA, Nissen PH. Lyngbyes laboratoriemedicin. 2010:739 sider, ill. (nogle i farver). (5) Sacks DB consensus meeting on the worldwide standardization of hemoglobin A(1c) measurement. Clin.Chem May;59(5): (6) World Health Organisation. Use of Glycated Haemoglobin (HbA1c) int the Diagnosis of Diabetes Mellitus Abbreviated Report of a WHO Consultation (7) Marchetti P. Advanced glycation end products (AGEs) and their receptors (RAGEs) in diabetic vascular disease. 2009; Available at: Accessed 29/10-13, (8) Jaisson S, Leroy N, Meurice J, Guillard E, Gillery P. First evaluation of Capillarys 2 Flex Piercing(R) (Sebia) as a new analyzer for HbA1c assay by capillary electrophoresis. Clin.Chem.Lab.Med Oct 1;50(10): (9) Afdeling for klinisk biokemi og farmakologi,odense universitetshospital. Hb(Fe;B)- HæmoglobinA1c(Fe). D4 infonet: Afdeling for klinisk biokemi og farmakologi. (10) Gelehrter TD, Collins FS, Ginsburg D, Principles of medical genetics. 2nd ed. Baltimore: Williams & Wilkins; (11) Little RR, Rohlfing CL, Hanson S, Connolly S, Higgins T, Weykamp CW, et al. Effects of hemoglobin (Hb) E and HbD traits on measurements of glycated Hb (HbA1c) by 23 methods. Clin.Chem Aug;54(8): (12) Little RR, Roberts WL. A review of variant hemoglobins interfering with hemoglobin A1c measurement. J.Diabetes Sci.Technol May 1;3(3): (13) Cotton F, Malaviolle X, Vertongen F, Gulbis B. Evaluation of an automated capillary electrophoresis system in the screening for hemoglobinopathies. Clin.Lab. 2009;55(5-6): Side 44 af 52

45 (14) Sebia. CAPILLARYS Hb A1c Ref (15) Hoffbrand AV, Moss PAH, Pettit JE. Essential haematology. 6. ed. ed. Malden, Mass.: Wiley- Blackwell; (16) Mortensen TS. Illustration af HPLC-system. Figuren er stærk inspireret af ligende figur i bogen Analyseteknik: instrumentering og metoder af F. Simonsen, H. Jeppesen og MN. Bergsøe (17) Simonsen F, Jeppesen H, Bergsøe MN. Analyseteknik: instrumentering og metoder. 2010:384 sider, ill. (18) Tosoh. Tosoh automated glycohemoglobin analyser HLC-723 G8 - Technical report. (19) Marinova M, Altinier S, Caldini A, Passerini G, Pizzagalli G, Brogi M, et al. Multicenter evaluation of hemoglobin A1c assay on capillary electrophoresis. Clin.Chim.Acta 2013 Sep 23;424: (20) UCDavis ChenWiki. =592&height=275&revision= ; Available at: =592&height=275&revision=1. Accessed 12/03, (21) UCDavis ChenWiki. th=373&height=148&revision= ; Available at: th=373&height=148&revision=1. Accessed 12/03, (22) Wehr T, Rodríguez-Díaz R, Zhu M. Capillary electrophoresis of proteins. 1999:286 s., ill. (23) Little RR, Sacks DB. HbA1c: how do we measure it and what does it mean? Curr.Opin.Endocrinol.Diabetes Obes Apr;16(2): (24) Sacks DB. Measurement of hemoglobin A(1c): a new twist on the path to harmony. Diabetes Care 2012 Dec;35(12): (25) Urrechaga E. High-resolution HbA(1c) separation and hemoglobinopathy detection with capillary electrophoresis. Am.J.Clin.Pathol Sep;138(3): (26) Felding P, Brandslund I, Plum I, Pedersen M, Ødum L, Gerdes U. DSKB VUKs analysekvalitetskrav til HbA1c ved brug til diagnostik og monitorering af diabetes (27) Bendsen T. Beregning af teststyrke for to parrede stikprøver. 2013; Available at: Accessed 8. december, Side 45 af 52

46 (28) Liotta L, Di Franco A, Pazzagli M, Luconi M. Glycated hemoglobin (HbA1c) measurement in frozen whole blood depends on baseline values of fresh samples. Anal.Bioanal Chem Jan;405(1): (29) Sebia. Instruktionsmanual Capillarys 2 FlexPiercing Ref (30) F. Catteau fra Sebia editor. HbA1c Sebia præsentation, powerpoint præsentation. Modificeret af Lars Bendixen, kundechef/crm, fagligspecialist, ILS Laboratories Scandinavia ed.; (31) Chapelle JP, Teixeira J, Maisin D, Assink H, Barla G, Stroobants AK, et al. Multicentre evaluation of the Tosoh HbA1c G8 analyser. Clin.Chem.Lab.Med Mar;48(3): (32) Lotte Foegt Poulsen, Faglig Specialist - Hæmatologi og Sporstof, Afdeling for Klinisk Biokemi og Farmakologi. (33) Afdeling for klinisk biokemi og farmakologi,odense universitetshospital. HbA1c Labquality kontroller (34) Milojkovic R. A heightened awareness: hemoglobin variants and HbA1c. MLO Med.Lab.Obs May;45(5):50, 52, 54. (35) Behan KJ, Storey NM, Lee HK. Reporting variant hemoglobins discovered during hemoglobin A1c analysis - common practices in clinical laboratories. Clin.Chim.Acta 2009 Aug;406(1-2): (36) Little RR, Rohlfing CL, Hanson SE, Schmidt RL, Lin CN, Madsen RW, et al. The effect of increased fetal hemoglobin on 7 common Hb A1c assay methods. Clin.Chem May;58(5): (37) Cotton F, Wolff F, Gulbis B. Automated capillary electrophoresis in the screening for hemoglobinopathies. Methods Mol.Biol. 2013;984: Side 46 af 52

47 Bilag 1 Den maksimale tilladte afvigelse på dobbeltbestemmelser på hhv. Tosoh og Capillarys I Tosohs Technical Report angives den intraserielle variationskoefficient til CV[%] 0,93% for HbA1c-koncentrationen opgivet i DCCT-enheden, % (18). I HbA1c-manualen for Capillarys angives den intraserielle variationskoefficient til CV[%] 1, 4% for prøver kørt i samme kapillær i DCCT-enheden (14). Ligningen for den maksimale afvigelse er: A z CV CV. Da der er 2 2 max 1 2 tale om dobbeltbestemmelser er CV1 CV2. Med et konfidensinterval på 99% ( z 2,06) bliver grænserne for afvigelsen mellem dobbeltbestemmelserne derfor: 2 Amax Tosoh 2, , 93 3, 4% og 2 Amax Capillarys 2,06 2 1, 4 5,1%. Side 47 af 52

48 Bilag 2 Friedmantesten Er der en signifikant forskel på HbA1c-koncentrationerne målt i DCCT-enheden hhv. dag 0, 7, 14, 21 og 28? 1. Definer hypoteser H0 Der er ingen forskel på HbA1c-koncentrationerne målt de forskellige dage H1 Der er forskel på HbA1c-koncentrationerne målt de forskellige dage 2. Definer signifikansniveau: 0,05 3. Beregn frihedsgrader: df k 1 4 k : antal stikprøver 4. Beslutningsgrundlag 2 Hvis 9, forkastes H 0 5. Friedmantesten Ranger data i rækker Tag summen af alle rangene for hver stikprøve/kolonne. Beregn teststørrelsen R 3 n( k 1) nk( k 1) ( ) (6) 2 13,6 n : antal prøver i stikprøven R: Summen af rangene for hver stikprøve Teststørrelsen for de fire stikprøver repræsenterende dag 7, 14, 21 og 28 beregnes på samme måde. Side 48 af 52

49 Bilag 3 Elektroferogrammer for prøve nr. 1 i holdbarhedsforsøget efter hhv. 14, 21 og 28 dages nedfrysning. Side 49 af 52

50 Bilag 4 Beregning af intraseriel analyseusikkerhed på Capillarys 2 FlexPiercing SD intra n 63 SD CV intra n i 1 X 2n 2 i 0,58 0, SD 0,07 100% 1,12% X 6,07 intra intra CV intra for Tosoh beregnes på samme måde. Side 50 af 52

51 Bilag 5 KBFs HbA1c-analyseresultater på udsendte Labqualitykontroller Bemærk at afvigelserne er opgivet for IFCC-enheden mmol/mol. Udsendelse Tosoh Target Målt Middelværdi % afvigelse fra target G1 56,4 % afvigelse fra tosoh gr. (Middelværdi gr.) G2 52,60 55,4 55,6 3,3 2,21 G3 55,7 (54,4) G4 55,0 G1 76, G2 77,1 76,4 4,89 1, G3 71,9 75,8 (75,4) G4 75,7 G1 54, G2 55,1 55,0-0,2-1,26 G3 54,9 (55,7) G4 55,2 G1 32, G2 33,2 32,7-1,5-0,91 G3 32,5 (33,0) G4 33,2 G1 55, G2 55,1 54,0 54,8-0,5-2,32 G3 55,1 (56,1) G4 55,0 G1 86, G2 83,5 86,1 85,7 2,6-1,27 G3 85,4 (86,8) G4 84,9 G1 48, G2 44,8* 48,2 48,4 8,0-0,4 G3 48,5 (48,6) G4 48,7 G1 41, G2 40,1* 42,6 42,7 6,5 0,0 G3 42,8 (42,7) G4 43,7 HbA1c Labquality kontroller (mmol/mol) Kalibreret m/hæmalysat på alle intrumenter * Prøverne har været længe undervejs til bestemmelse af targetværdi. (33) Side 51 af 52

52 Bilag 6 Tro og love-erklæring Bioanalytikeruddannelsen Retningslinjer for aflevering af skriftlige opgaver Uretmæssig hjælp For at kunne aflevere din opgave, skal du acceptere nedenstående: Jeg bekræfter hermed ved min accept, at den skriftlige opgave jeg har skrevet/været med til at skrive, er udfærdiget uden brug af uretmæssig hjælp. ( 18 i BEK nr. 714 af 27/06/2012; Bekendtgørelse om prøver og eksamen i erhvervsrettede uddannelser) Jeg bekræfter endvidere ved min accept, at den skriftlige opgave jeg har skrevet/været med til at skrive, overholder det antal anslag, som er angivet i eksamenskriterierne Jeg accepterer ovenstående Jeg accepterer ikke ovenstående Offentliggørelse af eksamensopgave Opgaven må offentliggøres eksternt på UC Viden Opgaven må offentliggøres internt i UC Lillebælt Opgaven må ikke offentliggøres Navn: Trine Lyberth Christensen Underskrift: Side 52 af 52