PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. SK tests til anvendelse sammen med Autostainer Link 48. Indholdsfortegnelse

Transkript

1 PD-L1 IHC 22C3 pharmdx SK tests til anvendelse sammen med Autostainer Link 48 Indholdsfortegnelse 1. Tilsigtet anvendelse Resumé og forklaring NSCLC Melanom Princip for proceduren Medfølgende materialer Nødvendige materialer, der ikke medfølger Forholdsregler Opbevaring Klargøring af præparater Paraffinindstøbte snit Anbefalinger for opbevaring af udskårne snit Klargøring af reagens Farvningsprocedure på Autostainer Link 48-løsningen Kvalitetskontrol Kontrol af analysen Scoringsfortolkning NSCLC Melanom Evaluering af objektglas Generelle begrænsninger Produktspecifikke begrænsninger Evaluering af præstation Evaluering af ikke-klinisk præstation: Normalt og neoplastisk væv Evaluering af klinisk præstation: NSCLC Evaluering af ikke-klinisk præstation: NSCLC Evaluering af ikke-klinisk præstation: Melanom Fejlfinding Referencer P03928DK_05/SK / s. 1/19

2 PD-L1 IHC 22C3 pharmdx SK tests til anvendelse sammen med Autostainer Link Tilsigtet anvendelse Til in vitro-diagnostisk brug. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx er en kvalitativ immunhistokemisk analyse, der bruger Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3, og er beregnet til brug til visualisering af PD-L1-protein i formalinfikseret, paraffinindstøbt væv (FFPE-væv) fra ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og melanom ved brug af visualiseringssystemet EnVision FLEX på Autostainer Link 48. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) Ekspression af PD-L1-protein påvises ved at bruge TPS (Tumor Proportion Score, pointsystem for tumoromfang), som beskriver den procentdel af levedygtige tumorceller, der udviser delvis eller komplet membranfarvning ved en given farveintensitet. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx er indiceret som en hjælp til at identificere NSCLC-patienter, der kan behandles med KEYTRUDA (pembrolizumab). Ønskes vejledning til behandlingsvalg for specifikke kliniske forhold, findes værdierne for ekspressionsafskæring på KEYTRUDA -produktbladet. 2. Resumé og forklaring Binding af PD-1-liganderne, PD-L1 og PD-L2, til PD-1-receptoren, der findes på T-celler, hæmmer T-celleproliferation og cytokinproduktion. Opregulering af PD-1-ligander forekommer i visse tumorer, og signalering gennem denne pathway kan bidrage til at hæmme aktive T-cellers immunovervågning af tumorer. KEYTRUDA er et humaniseret, monoklonalt antistof, der binder sig til PD-1- receptoren og blokerer dens interaktion med PD-L1 og PD-L2, som udløser PD-1-pathway-medieret hæmning af immunresponsen, herunder anti-tumor-immunresponsen. I modeller med tumorer hos syngeniske mus medførte blokering af PD-1-aktivitet mindsket tumorvækst (1). 2.1 NSCLC Et klinisk studie, sponsoreret af Merck Sharp & Dohme, KEYNOTE-024 (KN024), undersøgte den kliniske validitet af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx ved identifikation af PD-L1-eksprimerende (TPS 50%) tidligere ubehandlede NSCLC-patienter, som muligvis vil reagere på KEYTRUDA-behandling. PD-L1-eksprimerende (TPS 50%) NSCLC-patienter, som blev behandlet med KEYTRUDA, udviste forbedrede resultater sammenlignet med standardkemoterapi. Se afsnittet Evaluering af klinisk præstation (NSCLC) nedenfor for oplysninger om KN024-studiet. Et klinisk studie sponsoreret af Merck Sharp & Dohme, KEYNOTE-010 (KN010), undersøgte den kliniske validitet af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx ved identifikation af PD-L1-eksprimerende (TPS 1%) tidligere behandlede NSCLC-patienter, som muligvis vil reagere på KEYTRUDA-behandling. PD-L1-eksprimerende (TPS 1%) NSCLC-patienter, som blev behandlet med KEYTRUDA, udviste forbedrede resultater sammenlignet med docetaxel. Se afsnittet Evaluering af klinisk præstation (NSCLC) nedenfor for oplysninger om KN010-studiet. 2.2 Melanom PD-L1 IHC 22C3 pharmdx kan benyttes til at bestemme PD-L1-status hos melanom-patienter, som overvejes til behandling (2). 3. Princip for proceduren PD-L1 IHC 22C3 pharmdx indeholder optimerede reagenser og den påkrævede protokol til at udføre en IHC-farvningsprocedure på FFPE-præparater ved brug af Autostainer Link 48. Efter inkubation med det primære monoklonale antistof mod PD-L1 eller Negative Control Reagent (NCR) inkuberes præparaterne med et linker-antistof, der er specifikt for det primære antistofs værtsart, og de inkuberes derefter med et brugsklart visualiseringsreagens bestående af sekundære antistofmolekyler og peberrodsperoxidasemolekyler koblet til en dextranpolymerbase. Den enzymatiske omdannelse af det efterfølgende tilsatte kromogen medfører udfældning af et synligt reaktionsprodukt på antigenstedet. Den kromogene reaktions farve modificeres med et reagens til kromogen forbedring. Præparatet kan derefter kontrastfarves og forsynes med dækglas. Resultaterne fortolkes ved hjælp af et lysmikroskop. 4. Medfølgende materialer Hvert sæt inkluderer 19,5 ml PD-L1 primært antistof (cirka 3 µg/ml proteinkoncentration) og omfatter de nødvendige reagenser til at udføre 50 test i op til 15 individuelle kørsler. De nedenfor anførte materialer rækker til 50 analyser (50 objektglas inkuberet med primært antistof mod PD-L1 og 50 objektglas inkuberet med det tilsvarende Negative Control Agent, i alt 100 objektglas). Antallet af analyser er baseret på anvendelse af 2 x 150 µl pr. objektglas for hvert reagens bortset fra DAB+ og Target Retrieval Solution. Sættet indeholder materialer til maks. 15 individuelle farvninger. Mængde Beskrivelse 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Bufferopløsning, der indeholder hydrogenperoxid, detergent og 0,015 mol/l natriumazid. P03928DK_05/SK / s. 2/19

3 1 x 19,5 ml Primært antistof: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3 Monoklonalt muse-(igg 1 ) anti-pd-l1 i en bufferopløsning, der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 15 ml Negative Control Reagent NEGATIVE CONTROL REAGENT Monoklonalt muse-kontrol-igg-antistof i en bufferopløsning, der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 34,5 ml Mouse LINKER LINKER, ANTI-MOUSE Sekundært kaninantistof mod museimmunoglobuliner i en bufferopløsning, der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextran koblet med peroxidasemolekyler og sekundære gedeantistofmolekyler mod kanin- og museimmunoglobuliner i en bufferopløsning, der indeholder stabiliserende protein og et antimikrobielt stof. 15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Bufferopløsning, der indeholder hydrogenperoxid og et antimikrobielt stof. 1 x 5 ml DAB+ kromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3'-diaminobenzidin-tetrahydrochlorid i organisk opløsningsmiddel. 1 x 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Cuprisulfat i vand. 6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Bufferopløsning, ph 6,1, der indeholder detergent og et antimikrobielt stof. 15 objektglas PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Control Slides CONTROL SLIDES Hvert objektglas indeholder vævssnit af to pelleterede, formalinfikserede, paraffinindstøbte cellelinjer: NCI-H226* med moderat PD-L1-proteinekspression og MCF-7 med negativ PD-L1-proteinekspression. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1-negativ NCI-H226: PD-L1-positiv *Dr. AF Gazdar and Dr. JD Minna ved NIH har modtaget anerkendelse for deres bidrag til udviklingen af NCI-H226 (ATCC-nummer: CRL-5826 ) (3). Bemærk: Alle reagenser, som medfølger, er formuleret specifikt til anvendelse sammen med dette sæt. Hvis analysen skal fungere som angivet, må disse ikke erstattes med andet end EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (kode K8005). PD-L1 IHC 22C3 pharmdx er skræddersyet til brug sammen med Autostainer Link 48. Der henvises til brugsanvisningerne til Autostainer Link 48 og PT Link for yderligere oplysninger. 5. Nødvendige materialer, der ikke medfølger PT Link Pre-treatment Module (kode PT100/PT101/PT200) Autostainer Link 48 (kode AS480) P03928DK_05/SK / s. 3/19

4 EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (kode K8007) Hematoxylin (kode K8008) Destilleret eller deioniseret vand (vand af reagenskvalitet) Timer Positive og negative vævsprøver til brug som proceskontroller (se afsnittet Kvalitetskontrol) Objektglas: Dako FLEX IHC Microscope Slides (kode K8020) eller Fisherbrand Superfrost Plus-ladede objektglas Dækglas Permanent monteringsmedium og andre reagenser, der er nødvendige til montering af dækglas Lysmikroskop (4x-40x objektivforstørrelse) 6. Forholdsregler 1) Til in vitro-diagnostisk brug. 2) Må kun anvendes af uddannet personale. 3) Dette produkt indeholder natriumazid (NaN 3 ), et kemikalie, som er meget giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er klassificeret som farlig, kan NaN 3 reagere med bly og kobber og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Efter bortskaffelse skylles med rigelige mængder vand for at hindre ophobning af metalazid i afløb (4). 4) Primært antistof, negativt kontrolreagens, linker og visualiseringsreagens indeholder materialer af animalsk oprindelse. 5) Før og efter fiksering skal præparater og alle materialer, der kommer i berøring med disse, håndteres som værende i stand til at overføre smitte og bortskaffes med de korrekte foranstaltninger (5). 6) Andre inkubationstider, -temperaturer eller -metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. 7) Reagenserne er optimalt fortyndede. Yderligere fortynding kan medføre tab af antigenfarvning. 8) Visualiseringsreagens, flydende DAB+ kromogen og klargjort DAB+ substratkromogenopløsning kan blive påvirket negativt, hvis de udsættes for stærke lyskilder. Undlad at opbevare systemkomponenter eller udføre farvning i kraftig belysning, f.eks. direkte sollys. 9) Paraffinrester kan medføre forkerte negative resultater. 10) Brug af andre reagensvolumener end de anbefalede kan føre til tab af synlig PD-L1-immunreaktivitet. 11) Resultaterne fra en lille undersøgelse viste et lignende dynamisk område af PD-L1-ekspression i primære og metastatiske NSCLCpræparatpar. Der kan muligvis være forskelle i PD-L1-ekspression i primære tumorer kontra metastatiske områder i den samme patient. 12) Store vævssnit kan kræve 3x150 µl reagens. 13) Som hovedregel gælder det, at personer under 18 år ikke må arbejde med dette produkt. Brugerne skal omhyggeligt vejledes i den korrekte arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsanvisninger. Se yderligere oplysninger i sikkerhedsdatabladet (SDS). 14) Brug passende personlige værnemidler for at undgå, at materialet kommer i kontakt med øjne og hud. 15) Ubrugt opløsning skal bortskaffes i henhold til lokal, national og EU-retlig lovgivning. 16) Sikkerhedsdatablade til professionelle brugere kan rekvireres. Fare DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammoniumtetrachlorid H350 Kan fremkalde kræft. H341 Mistænkt for at forårsage genetiske defekter. P201 Indhent særlige anvisninger før brug. P202 Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst og forstået. P280 Bær beskyttelseshandsker. Bær øjenbeskyttelse eller ansigtsbeskyttelse. Bær beskyttelsestøj. P308 + P313 VED eksponering eller mistanke om det: Søg lægehjælp. P405 Opbevares under lås. P501 Indholdet/beholderen bortskaffes i overensstemmelse med alle lokale, regionale, nationale og internationale bestemmelser. Advarsel EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1-5% citronsyre H319 Medfører øjenirritation. H411 Giftig for vandlevende organismer, med langvarige virkninger. P280 Bær øjenbeskyttelse eller ansigtsbeskyttelse. P273 Undgå udledning til miljøet. P264 Vask hænderne grundigt efter brug. P305 + P351 + P338 VED KONTAKT MED ØJNENE Skyl grundigt med vand i adskillige minutter. Fjern kontaktlinser, hvis den tilskadekomne bærer kontaktlinser, og de er lette at fjerne. Fortsæt skylningen. P337 + P313 Ved vedvarende øjenirritation: Søg lægehjælp. P501 Indholdet/beholderen bortskaffes i overensstemmelse med alle lokale, regionale, nationale og internationale bestemmelser. 7. Opbevaring Alle komponenter fra PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, deriblandt kontrolobjektglas, skal opbevares mørkt ved 2-8 C, når ikke de er i brug på Autostainer Link 48. Sættet må ikke anvendes efter udløbsdatoen, der er trykt udvendigt på æsken. Hvis reagenserne opbevares under andre forhold end dem, der er nævnt i denne indlægsseddel, skal disse forhold først bekræftes og godkendes af brugeren. P03928DK_05/SK / s. 4/19

5 Der er ingen synlige tegn på, at produktet er ustabilt. Derfor skal der udføres positive og negative kontroller samtidig med patientpræparater. 8. Klargøring af præparater Præparaterne skal behandles, så vævet bevares til IHC-farvning. Der skal anvendes standardmetoder til vævsbehandling til alle præparater. 8.1 Paraffinindstøbte snit Formalinfikserede, paraffinindstøbte vævsprøver er velegnede til brug. Alternative fikseringer er ikke blevet vurderet og godkendt, og kan give forkerte resultater. En fikseringstid på timer i 10% neutralt bufferet formalin (NBF) anbefales, men en undersøgelse med et begrænset antal prøver viste, at fikseringstider på timer i 10% NBF ikke ændrede visualisering af PD-L1 systematisk. Fikseringstider på 3 timer kan medføre forskelle i visualisering af PD-L1. Præparaterne skal skæres ud i blokke med en tykkelse på 3 eller 4 mm, fikseres i formalin og dehydreres og renses i en række alkoholer og xylen, efterfulgt af infiltrering med smeltet paraffin. Paraffintemperaturen må ikke overstige 60 C. FPPE-vævsblokke, som er 5 år gamle eller ældre, kan medføre tab af PD-L1-immunreaktivitet. Vævsprøver skal opskæres i snit med en tykkelse på 4-5 µm. Efter udskæring skal vævssnittene monteres på Dako FLEX IHC mikroskop-objektglas (kode K8020) eller Fisherbrand Superfrost Plus objektglas, for derefter at placeres i en 58 ± 2 C ovn i 1 time. 8.2 Anbefalinger for opbevaring af udskårne snit For at bevare antigeniciteten skal vævssnittene, når de er monteret på objektglas, opbevares i mørke ved 2-8 C (foretrækkes) eller ved stuetemperatur op til 25 C. Objektglassenes opbevaringsforhold og håndteringsforhold må ikke overstige 25 C på noget tidspunkt efter montering af hensyn til sikring af vævsintegriteten og antigeniciteten Anbefalinger for opbevaring af udskårne NSCLC-snit Udskårne snit skal farves inden for 6 måneder, når de opbevares ved 2-8 C (foretrækkes), eller ved 25 C Anbefalinger for opbevaring af udskårne melanomsnit Udskårne snit skal farves inden for 4 måneder, når de opbevares ved 2-8 C (foretrækkes), eller inden for 2 måneder, hvis de opbevares ved 25 C. 9. Klargøring af reagens Følgende reagenser skal klargøres forud for farvning: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) Klargør en passende mængde 1x Target Retrieval Solution, Low ph ved at fortynde Target Retrieval Solution, Low ph, 50x 1:50 med destilleret eller deioniseret vand (vand i reagenskvalitet). ph-værdien for 1x Target Retrieval Solution skal være 6,1 ± 0,2. 1x Target Retrieval Solution med ph under 5,9 kan give fejlbehæftede resultater. Én 30 ml-flaske med Target Retrieval Solution, Low ph (50x) fortyndet 1:50 giver 1,5 L 1x reagens, hvilket er tilstrækkeligt til at fylde ét PT Link-kar, som kan behandle op til 24 objektglas pr. anvendelse. Bortskaf 1x Target Retrieval Solution efter brug tre gange, og brug det ikke senere end 5 dage efter fortynding. Er der brug for mere EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) kan det bestilles med kode K8005. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Klargør en passende mængde vaskebuffer ved at fortynde Wash Buffer (20x) 1:20 med destilleret eller deioniseret vand (vand i reagenskvalitet) til brug i vasketrinnene. Opbevar ubenyttet 1x opløsning ved 2-8 C i højst en måned. Kasser bufferen, hvis den er uklar. Se brugsanvisningen til Autostainer Link 48 for yderligere oplysninger. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) leveres som kode K8007. DAB+ substratkromogenopløsning Denne opløsning skal blandes grundigt inden brug. En eventuel udfældning, der dannes i opløsningen, påvirker ikke farvningskvaliteten. DAB+ substratkromogenopløsning klargøres ved at tilsætte 1 dråbe flydende DAB+ kromogen pr. ml DAB+ substratbuffer og blande. Klargjort substratkromogen er stabilt i 5 dage, når det opbevares i mørke ved 2-8 C. Vigtige bemærkninger: Hvis der bruges en hel flaske DAB+ substratbuffer, skal der tilsættes 9 dråber DAB+ kromogen. Selvom der står 7,2 ml på mærkaten, er dette et udtryk for brugsvolumen og medregner ikke "dødvolumenet" i flasken. Farven på det flydende DAB+ kromogen i flasken kan variere fra klar til lavendelbrun. Dette påvirker ikke produktets effektivitet. Fortynd i henhold til ovenstående retningslinjer. Hvis der tilsættes for meget flydende DAB+ kromogen til DAB+ substratbufferen, vil det medføre en forringelse af det positive signal. 10. Farvningsprocedure på Autostainer Link 48-løsningen Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning grundigt og gøre sig fortrolig med alle komponenter og instrumenter inden brug (se Forholdsregler). P03928DK_05/SK / s. 5/19

6 Alle reagenser skal have stuetemperatur (20-25 C) inden immunfarvningen. Desuden skal alle inkubationer foregå ved stuetemperatur. Vævssnittene må ikke tørre ud under farvningsproceduren. Udtørrede vævssnit kan udvise øget, uspecifik farvning. Alle de påkrævede trin og inkubationstider for farvning er forprogrammeret i Dako Link-softwaren. Der henvises til brugsanvisningerne til Autostainer Link 48 og PT Link for yderligere oplysninger om programmeringsprotokoller og isætning af objektglas og reagenser. Bemærk: Reagenserne og vejledningen, der følger med dette system, er udviklet til at yde optimalt ved brug sammen med de anbefalede reagenser og materialer. Yderligere fortynding af sættets reagenser eller ændring af inkubationstiderne eller - temperaturerne kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Farvningsprotokol Vælg farvningsprotokollen for PD-L1 IHC 22C3 pharmdx i indstillingerne i rullemenuen i Dako Link. Alle de påkrævede trin og inkubationstider for farvning er forprogrammeret i Autostainer Link 48. Hvis de korrekte PD-L1 IHC 22C3 pharmdx-protokoller ikke findes på serveren, skal du kontakte den lokale servicerepræsentant med henblik på at anskaffe protokollerne. Trin 1: Procedure for afparaffinering, rehydrering og target-retrieval (3-i-1) Der henvises til brugervejledningen for PT LINK. Indstil forvarmnings- og nedkølingstemperatur på PT Link (kode PT100/PT101/PT200) til 65 C. Indstil opvarmning til 97 C i 20 minutter. Fyld PT Link-karrene med 1,5 L Target Retrieval Solution, Low ph, 1x brugsopløsning pr. kar til at dække vævssnittene. Forvarm Target Retrieval Solution til 65 C. Nedsænk Autostainer-holderne med de monterede FFPE-vævssnit i den forvarmede Target Retrieval Solution, Low ph (1x brugsopløsning) i PT Link-karret. Inkuber i 20 minutter ved 97 C. Når target-retrievalinkuberingen er fuldført og temperaturen er faldet til 65 C, skal du fjerne hver enkelt Autostainer-objektglasholder med objektglas fra PT Link-karret og straks anbringe Autostainer-holderen med objektglas i et kar (f. Eks. PT Link Rinse Station, kode PT109), der indeholder fortyndet vaskebuffer (kode K8007) ved stuetemperatur. Inkuber objektglassene i 5 minutter i den fortyndede vaskebuffer med stuetemperatur. Trin 2: Farvningsprocedure Efter afparaffinering, rehydrering og target-retrievalproceduren, (3-i-1-proceduren) placeres Autostainer-holderne med objektglas på Autostainer Link 48. Instrumentet vil udføre farvningsproceduren ved at påføre det korrekte reagens, overvåge inkubationstiden og skylle objektglas mellem de forskellige reagenser. Reagenstiderne er forprogrammeret i Dako Link-softwaren. Trin 3: Kontrastfarve Objektglassene skal kontrastfarves med Hematoxylin (Link) (kode K8008) i 5 minutter. Inkubationstiden i Hematoxylin er forprogrammeret i protokollen. Trin 4: Montering Ikke-vandigt permanent monteringsmedie er påkrævet. Bemærk: Der kan opstå en vis falmning af de farvede objektglas afhængigt af flere faktorer, der omfatter, men ikke begrænses til, kontrastfarvning, monteringsmaterialer og -metoder samt objektglassenes opbevaringsforhold. Dette kan mindskes, hvis objektglassene opbevares mørkt ved stuetemperatur (20-25 C). 11. Kvalitetskontrol Reagenser i PD-L1 IHC 22C3 pharmdx er kvalitetskontrolleret med immunhistokemi ved hjælp af den ovenfor angivne target retrievalog farvningsprocedure. Afvigelser fra de anbefalede procedurer for vævsfiksering, behandling og indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt. For hver farvningskørsel skal der medtages kvalitetskontroller. Disse kvalitetskontroller er angivet i tabel 1 og omfatter: et farvet H&E-patientvævspræparat, positive og negative kontrolvæv leveret af laboratoriet og et kontrolcellelinje-objektglas (6) leveret af Dako. I USA henvises til retningslinjerne for kvalitetskontrol i College of American Pathologists (CAP) Accreditation Program for Immunohistochemistry, se også CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (6, 7, 8) i litteraturlisten for yderligere oplysninger. 12. Kontrol af analysen Før et farvningssystem anvendes første gang i en diagnostisk procedure, skal brugeren kontrollere analysens effektivitet ved at teste den på en række væv leveret af laboratoriet, som har kendte IHC-resultatkendetegn, der repræsenterer kendte positive og negative væv. Se procedurerne for kvalitetskontrol, som er beskrevet i afsnittet om kvalitetskontrol ovenfor. Disse kvalitetskontrolprocedurer skal gentages for hvert nyt antistofparti, eller når analyseparametrene ændres. Muligheder for fejlfinding ved potentielle problemer, problemernes årsager og forslag til afhjælpning beskrives i tabel Scoringsfortolkning Se den specifikke indikation for at få oplysninger om fortolkningen af den respektive scoring NSCLC Alle levedygtige tumorceller på hele objektglasset skal evalueres og medtages i PD-L1-scoringsvurderingen. Der skal være mindst 100 levedygtige tumorceller til stede i det PD-L1-farvede objektglas, før præparatet anses for at være egnet til PD-L1-vurdering. En patolog skal evaluere objektglassene ved hjælp af et lysmikroskop. Et objektiv med en forstørrelse på 10-40x er velegnet til evaluering af den immunhistokemiske farvning og scoring. Enhver synlig membranfarvning af tumorceller skal medtages i scoringen. P03928DK_05/SK / s. 6/19

7 Ekspression af PD-L1-protein påvises ved at bruge TPS (Tumor Proportion Score, pointsystem for tumoromfang), som beskriver den procentdel af levedygtige tumorceller, der udviser delvis eller komplet membranfarvning ved en given farveintensitet. Delvis eller komplet membranfarvning ( 1+), som er synligt forskellig fra cytoplasmisk farvning, skal gives point (scores). Cytoplasmisk farvning skal anses for at være uspecifik farvning og udelukkes fra vurderingen af farvningens intensitet. Normale celler og tumor-associerede immunceller såsom infiltrerende lymfocytter eller makrofager skal ikke medtages i scoringen med henblik på bestemmelse af PD-L1-positivitet. Tumorpræparater, der er farvet med NCR, skal have 0 specifik farvning og 1+ baggrundsfarvning. Hvis TPS 1% af de levedygtige tumorceller udviser membranfarvning ved hvilken som helst intensitet, skal præparatet anses for at være PD-L1-positivt. Hvis TPS 50% af de levedygtige tumorceller udviser membranfarvning ved hvilken som helst intensitet, skal præparatet anses for at være PD-L1-positivt. Pointsystem for tumoromfang PD-L1- ekspressionsniveauer Status for PD-L1- ekspression TPS <1% TPS = 1-49% TPS 50% Ingen PD-L1-ekspression PD-L1-ekspression Høj PD-L1-ekspression Elementer, som medtages og/eller udelukkes ved bestemmelse af scoren for tumoromfang, kan findes i nedenstående tabel. Element Medtaget i TPS-scoring for NSCLC Udelukket fra TPS-scoring for NSCLC Tumorceller Immunceller Øvrige Overbevisende delvis eller komplet cellemembranfarvning (ved en hvilken som helst intensitet) af levedygtige tumorceller Ikke medtaget Ikke medtaget Udeluk enhver cytoplasmisk farvning Udeluk enhver farvning af immunceller, såsom: Mononukleære inflammatoriske celler (store lymfocytter, monocytter, pulmonære makrofager) Plasmaceller Neutrofiler Udeluk eventuel farvning af: Normale celler, som støder op til tumorceller Stromale celler (fibroblaster) Nekrotiske celler og/eller cellerester Antrakotisk pigment For at bestemme farvningskørslens gyldighed og muliggøre en vurdering af præparaternes farvning for hver farvningskørsel skal objektglassene undersøges i den rækkefølge, der vises i tabel 1. Se fortolkningsvejledningen til PD-L1 IHC 22C3 pharmdx for at få yderligere vejledning Melanom Alle levedygtige tumorceller på hele objektglasset skal evalueres og medtages i PD-L1-scoringsvurderingen. Der skal være mindst 100 levedygtige tumorceller til stede i det PD-L1-farvede objektglas, før præparatet anses for at være egnet til PD-L1-vurdering. En patolog skal evaluere objektglassene ved hjælp af et lysmikroskop. Et objektiv med en forstørrelse på 10-40x er velegnet til evaluering af den immunhistokemiske farvning og scoring. PD-L1-proteinekspression bestemmes ved brug af en melanom-score (MEL-score), som er andelen af tumorceller og associerede immunceller, som udtrykker PD-L1 ved en hvilken som helst intensitet (svag, moderat eller kraftig farvning), i forhold til alle levedygtige tumorceller og PD-L1-positive associerede immunceller. MEL-scoren rapporteres som: MEL-score MEL-score 0 MEL-score 1 MEL-score 2 MEL-score 3 MEL-score 4 MEL-score 5 % farvede celler 0% <1% 1%-<10% 10%-<33% 33%-<66% 66% Delvis eller komplet membranfarvning af tumorceller skal medtages i MEL-scoren. Cytoplasmisk farvning af tumorceller skal anses for at være uspecifik farvning og udelukkes fra vurderingen af farvningens intensitet. Delvis eller komplet cellemembran- og/eller cytoplasmisk farvning af tumor-associerede immunceller skal medtages i MEL-scoren. Tumor-associerede immunceller er mononukleære inflammatoriske celler, som er interkalerede i eller støder op til tumorreder. P03928DK_05/SK / s. 7/19

8 Bemærk: Ved fortolkning af melanompræparater fra patienter kan der forekomme brun melanin-pigmentering. Baselinemelaninindhold kan forekomme i både tumorceller og makrofager (melanofager) og kan medføre vanskeligheder ved fortolkning. Melanin skal udelukkes ved scoring af cellemembranfarvning. Det anbefales på det kraftigste, at et PD-L1-farvede objektglas sammenlignes med et sekventielt snit, som er farvet med NCR, for at identificere og udelukke melaninindhold. Hvis kraftigt forhøjet melanin forhindrer scoring af cellemembranfarvning af tumorceller, kan evalueringen af PD-L1-ekspression være ubestemmeligt. Tumorpræparater, der er farvet med NCR, skal have 0 specifik farvning og 1+ baggrundsfarvning. Elementer, som er medtaget og/eller udelukket ved bestemmelse af MEL-scoren, kan findes i nedenstående tabel. Element Medtaget i MEL-score for melanom Udelukket fra MEL-score for melanom Tumorceller Immunceller Øvrige Overbevisende delvis eller komplet cellemembranfarvning (ved hvilken som helst intensitet) af levedygtige tumorceller Membranøs og/eller cytoplasmisk farvning (ved en hvilken som helst intensitet) af immunceller eller mononukleære inflammatoriske celler (MIC) i tumorreder og tilstødende understøttende stroma (tumorinfiltrerende), såsom: Store lymfocytter (lymfocytaggregater) Monocytter Ikke medtaget Udeluk eventuel cytoplasmisk farvning Udeluk enhver farvning af: Immunceller i stromaen, som adskiller sig fra tumorreder Plasmaceller Neutrofiler Udeluk eventuel farvning af: Normale celler, som støder op til tumorceller Stromale celler (fibroblaster) Nekrotiske celler og/eller cellerester Endogent melanin For at bestemme farvningskørslens gyldighed og muliggøre en vurdering af præparaternes farvning for hver farvningskørsel skal objektglassene undersøges i den rækkefølge, der vises i tabel 1. Se fortolkningsvejledningen til PD-L1 IHC 22C3 pharmdx for at få yderligere vejledning. 14. Evaluering af objektglas Tabel 1. Anbefalet rækkefølge for vurdering af objektglassene Præparater Rationale Krav Først evalueres en farvning af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx- H&E-farvningen skal udføres på snit skåret efter 1. H&E vævspræparaterne med hinanden fra samme paraffinblok af vævspræparatet. hæmatoxylin og eosin (H&E) for at (leveres af vurdere histologi og bevarelse af Vævspræparaterne skal være intakte, velbevarede og skal bekræfte laboratoriet) væv. tumorindikation. Ét kontrolcellelinje-objektglas skal farves med det primære antistof for PD-L1 i hver farvningskørsel. 2. Kontrolcellelinjeobjektglas (leveres af Dako) 3. Objektglas med positivt kontrolvæv (leveres af laboratoriet) Det positive kontrolcellelinjeobjektglas med PD-L1 primært antistof fra PD-L1 IHC 22C3 pharmdx skal først undersøges med henblik på at sikre, at alle reagenser fungerer korrekt. Kontrolcellelinje-objektglasset indeholder den PD-L1-positive cellelinje-pellet og den PD-L1- negative cellelinje-pellet. Objektglassene med positivt kontrolvæv, der er farvet med både PD-L1 primært antistof og Negative Control Reagent, skal undersøges derefter. Disse objektglas bekræfter, at fikseringsog epitop-retrieval-processen er effektiv. Kendte positive vævskontroller må kun anvendes til overvågning af, om det behandlede væv og testreagenser NCI-H226 (PD-L1-positiv kontrolcellelinje), acceptkriterier: Cellemembranfarvning af 70% af cellerne ved 2+ gennemsnitlig farvningsintensitet. Ikke-specifik farvning <1+ intensitet. MCF-7 (PD-L1-negativ kontrolcellelinje), acceptkriterier: Uspecifik farvning. Ikke-specifik farvning <1+ intensitet. Bemærk, at der lejlighedsvis kan observeres farvning af nogle få celler i MCF-7-cellepillen. Følgende acceptkriterier skal anvendes: tilstedeværelsen af 10 celler i alt med tydelig farvning af plasmamembran eller cytoplasmisk farvning med 1+ intensitet inden for grænserne af MCF-7-cellepillen er acceptabelt. Hvis en af kontrolcellelinjerne ikke opfylder disse kriterier, skal alle resultater for patientpræparaterne betragtes som ugyldige. Kontrollerne skal være friske biopsi-/kirurgiske præparater fra samme tumorindikation som patientprøven, der er fikseret, behandlet og indstøbt så hurtigt som muligt på samme måde som patientprøven (-prøverne). Anvend intakte præparater til fortolkning af farvningsresultaterne, da nekrotiske eller degenererede celler ofte farves uspecifikt. De væv, der vælges til anvendelse som positive vævskontroller, skal give svag til moderat farvning ved farvning med PD-L1 som en hjælp til detektering af små forandringer analysens sensitivitet. Der skal medtages to positive vævskontrolobjektglas i hver farvningskørsel. P03928DK_05/SK / s. 8/19

9 4. Objektglas med negativt kontrolvæv (leveres af laboratoriet) 5. Tonsillært kontrolvæv (valgfrit) (leveres af laboratoriet) 6. Objektglas med patientvæv, der er farvet med Negative Control Reagent 7. Objektglas med patientvæv, der er farvet med PD-L1 primært antistof fungerer korrekt IKKE som en hjælp til formuleringen af en specifik diagnose for patientprøverne. Objektglassene med negativt kontrolvæv (som vides at være PD-L1-negative), som er farvet med både PD-L1 primært antistof og Negative Control Reagent, skal derefter undersøges for at kontrollere specificiteten af det primære antigens mærkning af målantigenet. Alternativt kan negative områder i det positive kontrolvæv bruges som negativt kontrolvæv, men dette bør kontrolleres af brugeren. Brug humant tonsilvæv, fikseret, behandlet og indlejret på samme vis som patientprøven(erne), som ekstra kontrolmateriale for at bekræfte følsomhed, specificitet og uspecifik baggrundsfarvning af testen. Undersøg patientpræparater, der er farvet med Negative Control Reagent fra PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Negative Control Reagent bruges i stedet for det primære antistof og er en hjælp i fortolkningen af specifik farvning på antigenstedet. Hele objektglasset med patientpræparaterne, der er farvet med PD-L1 primært antistof fra PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, skal undersøges til sidst. Der henvises til Resumé og forklaring, Begrænsninger samt Resultatkendetegn for specifikke oplysninger om immunreaktiviteten for PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Objektglas farvet med PD-L1: Der skal ses brunfarvning af plasmamembranen. Ikke-specifik farvning skal være 1+. Objektglas farvet med Negative Control Reagent: Ingen membranfarvning. Ikke-specifik farvning skal være 1+. Hvis de positive vævskontroller ikke udviser en passende, positiv farvning, skal resultaterne fra de analyserede præparater betragtes som ugyldige. Kontrollerne skal være friske biopsi-/kirurgiske præparater fra samme tumorindikation som patientprøven, der er fikseret, behandlet og indstøbt så hurtigt som muligt på samme måde som patientprøven (-prøverne). Der skal medtages to negative vævskontrolobjektglas i hver farvningskørsel. Objektglas farvet med PD-L1: Ingen membranfarvning i tumorceller. Ikkespecifik farvning skal være 1+. Objektglas farvet med Negative Control Reagent: Ingen membranfarvning. Ikke-specifik farvning skal være 1+. Hvis objektglassene med det negative kontrolvæv udviser specifik cellemembranfarvning, skal resultaterne med patientpræparatet betragtes som ugyldige. Der skal kunne registreres intens positiv farvning i dele af kryptepitelet og svag til moderat farvning af de follikulære makrofager i kimcentrene. Der skal kunne registreres negativ farvning i endoteliet og i overfladeepitelet. Fravær af cellespecifik membranfarvning verificerer den specifikke mærkning af målantigenet med det primære antistof. Ikke-specifik farvning skal være 1+. Positiv farvningsintensitet skal vurderes i relation til en eventuel observeret uspecifik baggrundsfarvning på patientens objektglas med Negative Control Reagent i samme kørsel. Som det er tilfældet med enhver immunhistokemisk analyse, betyder et negativt resultat, at antigenet ikke blev detekteret, ikke nødvendigvis at antigenet ikke var til stede i de analyserede celler/væv. Alle levedygtige tumorceller på hele det PD-L1-farvede patientobjektglas skal evalueres og medtages i PD-L1-scoringsvurderingen. Der skal være mindst 100 levedygtige tumorceller til stede, før præparatet anses for at være egnet til PD-L1-vurdering. Se afsnit 13 vedrørende retningslinjer for scoringsfortolkning ved PD-L1- ekspression. 15. Generelle begrænsninger 1) Immunhistokemi er en diagnostisk proces i flere trin, der kræver specialuddannelse i udvælgelse af passende reagenser og væv, fiksering og behandling, klargøring af objektglas til immunhistokemi samt fortolkning af farvningsresultaterne. 2) Vævsfarvningen afhænger af håndteringen og behandlingen af vævsprøverne inden farvningen. Ukorrekt fiksering, nedfrysning, optøning, vask, tørring, opvarmning, sektionering eller kontaminering med andre vævsprøver eller væsker kan medføre artefakter, antistof-trapping eller fejlagtigt negative resultater. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings- og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 3) For kraftig eller ufuldstændig kontrastfarvning kan påvirke en korrekt fortolkning af resultaterne. 4) Den kliniske fortolkning af enhver positiv farvning eller mangel på samme skal evalueres i sammenhæng med den kliniske fremtræden, morfologien og andre histopatologiske kriterier. Den kliniske fortolkning af enhver farvning eller mangel på samme skal suppleres med morfologiske undersøgelser og egnede kontroller samt med andre diagnostiske test. En kvalificeret patolog, som er fortrolig med antistofferne, reagenserne og de anvendte metoder, skal være ansvarlig for fortolkningen af det farvede præparat. Farvningen skal udføres på et certificeret laboratorium under overvågning af en patolog, som er ansvarlig for gennemgangen af de farvede objektglas og sikring af, at de positive og negative kontroller er tilstrækkelige. 5) Vævspræparater fra personer, som er inficeret med hepatitis B-virus, og som indeholder hepatitis B overfladeantigen (HBsAg), kan udvise non-specifik farvning med peberrodsperoxidase (8). 6) Reagenser kan udvise uventede reaktioner i vævstyper, der ikke tidligere er blevet testet. Muligheden for uventede reaktioner selv i testede vævstyper kan ikke fuldstændig elimineres på grund af den biologiske variabilitet, der er forbundet med antigenekspression i neoplasmer eller andet patologisk væv. Kontakt teknisk support hos Dako med eventuelle dokumenterede uventede reaktioner. P03928DK_05/SK / s. 9/19

10 7) Falsk positive resultater kan forekomme på grund af ikke-immunologisk binding af proteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan også skyldes pseudoperoxidaseaktivitet (erytrocytter) og endogen peroxidaseaktivitet (cytochrome C) (8). 8) Reagenserne og vejledningen i dette system er udviklet til at yde optimalt. Yderligere fortynding af sættets reagenser eller ændring af inkubationstiderne eller -temperaturerne kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. 16. Produktspecifikke begrænsninger 1) Falsk negative resultater kan skyldes nedbrydning af antigenet i vævene med tiden. Præparaterne skal farves inden for de anbefalede opbevaringsforhold for udskårne snit (se afsnit 8.2). 2) For at opnå optimale og reproducerbare resultater kræver PD-L1-proteinet target retrieval-forbehandling, når vævene fikseres (neutralt bufferet formalin) og paraffinindstøbes rutinemæssigt. 3) Udskift ikke med reagenser fra produkter med forskellige lotnumre eller fra sæt fra andre producenter. Den eneste undtagelse er EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x), som om nødvendigt kan leveres som kode K ) Farvede kontrolcellelinjer skal kun anvendes til validering af farvningskørslen og ikke til bedømmelse af farvningsreaktionen i vævssnit. 5) Brug af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx på væv med andre fiksativer end formalin er ikke blevet valideret. 6) Brug af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx på finnålsaspirater er ikke blevet valideret. 7) Anvendelse af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx på afkalkede væv er ikke blevet valideret og frarådes. 17. Evaluering af præstation 17.1 Evaluering af ikke-klinisk præstation: Normalt og neoplastisk væv Normalt væv: Tabel 2 giver en oversigt over immunreaktiviteten for Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3, på det anbefalede panel af normalt væv. Plasmamembranfarvning blev observeret på immunceller og celler af epiteloprindelse. Cytoplasmisk farvning blev observeret i nogle celletyper, men blev ikke registreret som positiv farvning. Alle væv blev formalinfikseret og paraffinindstøbt samt farvet med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx i henhold til vejledningen i denne indlægssedlen. Der blev ikke observeret uventede resultater i de testede celle- eller vævstyper. Den observerede farvning stemte overens med data fra litteraturen med hensyn til PD-L1 IHC-ekspression i normale væv (9, 10). Tabel 2: Oversigt over reaktivitet af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx i normalt væv Vævstype (antal analyserede) Positiv plasmamembranfarvning: Vævselementer Positiv cytoplasmisk farvning: Vævselementer Uspecifik farvning Binyre (3) 0/3 1/3 medullære celler 0/3 Bryst (3) 0/3 0/3 0/3 Cerebellum (3) 0/3 0/3 0/3 Cerebrum (3) 0/3 0/3 0/3 Cervix (3) 1/3 epitel 0/3 0/3 Colon (3) 2/3 Makrofager 0/3 0/3 Hud (3) 0/3 0/3 0/3 Hypofyse (3) 1/3 Anterior hypofyse 1/3 Anterior hypofyse 0/3 1/3 Posterior hypofyse 1/3 Posterior hypofyse Knoglemarv (3) 3/3 megakaryocytter 3/3 megakaryocytter 0/3 Lever (3) 1/3 Makrofager 0/3 0/3 1/3 Hepatocytter Lunge (3) 3/3 alveolære makrofager 0/3 0/3 Mavesæk (3) 2/3 Lymfocytter 1/3 Funduskirtler 0/3 1/3 Funduskirtler Mesotelceller (2) 0/2 0/2 0/2 Milt (3) 2/3 Makrofager 0/3 0/3 Muskel, hjerte (3) 0/3 0/3 0/3 Muskel, skelet (3) 0/2 0/2 0/2 Nerve, perifert (3) 0/3 1/3 Bindevæv/kar 0/3 Nyre (3) 1/3 cylinderepitel 0/3 0/3 Oesophagus (3) 0/3 0/3 0/3 Ovarie (3) 0/3 0/3 0/3 Pancreas (3) 0/3 0/3 0/3 Parathyroidea (3) 1/3 Kirtelepitel 0/3 0/3 Prostata (2) 2/2 epitel 0/2 0/2 Spytkirtel (3) 0/3 0/3 0/3 Testis (3) 0/3 0/3 0/3 Thymus (3) 3/3 medullært epitel 0/3 0/3 Thyroidea (3) 0/3 0/3 0/3 Tonsil (3) 3/3 kryptepitel 0/3 0/3 2/3 Germinalcenter (makrofager) Tyndtarm (3) 0/3 0/3 0/3 Uterus (3) 0/3 0/3 0/3 Neoplastisk væv: Tabel 3 giver en oversigt over immunreaktivitet for Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3, på et panel af neoplastisk væv. Plasmamembranfarvning blev observeret på immunceller og celler af epiteloprindelse. Cytoplasmisk farvning blev observeret i nogle celletyper, men blev ikke registreret som positiv farvning. Alle væv blev formalinfikseret og paraffinindstøbt samt farvet med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx i henhold til vejledningen i denne indlægssedlen. Der blev ikke observeret uventede resultater i de testede tumorpræparater. Den observerede farvning stemte overens med data fra litteraturen med hensyn til PD-L1 IHC-ekspression i neoplastiske væv (9-12). P03928DK_05/SK / s. 10/19

11 Tabel 3: Oversigt over reaktivitet af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx i neoplastisk væv Tumortype Placering PD-L1-positiv/total N=159 Appendix 0/1 Bryst, DCIS 0/2 Bryst, invasiv duktal 0/7 Bryst, invasiv duktal, metastatisk til lymfeknude 0/1 Cervix, endocervikal type 0/1 Colon 0/5 Colon, metastatisk til lever 0/1 Colon, mucinøs 0/1 Galdeblære 1/5 GI, metastatisk til lunge 0/1 Hoved og hals, hårde gane 0/1 Lunge 1/4 Mave 0/6 Mavesæk, mucinøs 0/1 Adenokarcinom Oesophagus 0/1 Ovarie 0/1 Ovarie, endometrioid 0/1 Ovarie, mucinøs 0/1 Ovarie, serøs 0/1 Pancreas 0/2 Pancreas, duktal 0/3 Prostata 0/5 Rectum 0/4 Spytkirtel/parotis 0/2 Thyroidea, follikulær 0/1 Thyroidea, follikulær-papillær 0/1 Thyroidea, papillær 0/3 Tyndtarm 0/2 Uterus, clear cell 0/1 Uterus, endometrium 0/3 Adrenokortikalt karcinom Adrenal 0/1 Astrocytom Cerebrum 0/3 Basalcellekarcinom Hud 0/1 Chondrosarkom Knogle 0/1 Chordom Bækkenhule 0/1 Embryonalt karcinom Testikel 0/1 Ependymom Hjerne 0/1 Glioblastom Hjerne 0/1 Hepatoblastom Lever 0/1 Hepatocellulært karcinom Lever 0/5 Colon 0/1 Interstitialom Rectum 0/1 Tyndtarm 0/1 Karcinom Nasofaryngeal, NPC 0/1 Leiomoysarkom Blære 0/1 Bløddele, brystvæg 0/1 Lymfom Anaplastiske storcellet Lymfeknude 0/1 Diffus B-celle Lymfeknude 0/4 Hodgkin Lymfeknude 2/2 Non-Hodgkin Lymfeknude 1/1 Medulloblastom Hjerne 0/1 Medullært karcinom Thyroidea 0/1 Melanom Næsehule 0/1 Melanom Rectum 0/1 Meningiom Hjerne 0/2 Mesotheliom Peritoneum 0/1 Neuroblastom Retroperitoneum 0/1 Neurofibrom Bløddele, nedre ryg 0/1 Osteosarkom Knogle 0/2 Adrenal 0/1 Cervix 2/5 Pheochromocytom Hoved og hals 0/2 Hud 0/2 Lunge 1/2 Oesophagus 0/7 Pladecellekarcinom i oesophagus Pladecellekarcinom metasteret til lymfeknude 0/1 Uterus 0/1 Primitiv neuroektodermal tumor (PNET) Retroperitoneum 0/1 Renalt cellekarcinom Clear cell Nyre 0/6 Papillær Nyre 0/1 P03928DK_05/SK / s. 11/19

12 Tumortype Placering PD-L1-positiv/total N=159 Bløddele, embryonal 0/1 Rhabdomyosarkom Prostata 0/1 Retroperitoneum 0/1 Seminom Testikel 0/2 Colon 0/1 Signetringcellekarcinom Signetringcellekarcinom i colon metasteret til ovarie 0/1 Småcellet karcinom Lunge 0/1 Spermatocytisk seminom Testikel 0/2 Synovialt sarkom Bækkenhule 0/1 Thymom Mediastinum 1/1 Transitionalt cellekarcinom Blære 0/6 Nyre 0/1 Øcelletumor Pancreas 0/ Evaluering af klinisk præstation: NSCLC KEYNOTE-024: Kontrolleret forsøg med NSCLC-patienter, der ikke før er blevet behandlet Uskadeligheden og virkningen af pembrolizumab blev undersøgt i KEYNOTE-024, som er et kontrolleret multicenterstudie af behandlingsresultater for tilfælde af metastatisk NSCLC, der ikke tidligere har været udsat for behandling. Patienterne udviste PD-L1- ekspression med 50% Tumor Proportion Score (TPS) baseret på PD-L1 IHC 22C3 pharmdx (14). Patienterne modtog efter randomisering (1:1) enten pembrolizumab ved dosis 200 mg hver 3. uge (n=154), eller undersøgerens eget valg af platinindeholdende kemoterapi (n=151; deriblandt pemetrexed+carboplatin, pemetrexed+cisplatin, gemcitabin+cisplatin, gemcitabin+carboplatin, eller paclitaxel+carboplatin. Patienter med ikke-pladecellet udvikling kunne fortsætte med pemetrexedbehandlingen). Patienterne blev behandlet med pembrolizumab indtil en ikke-acceptabel grad af forgiftningsvirkning (toksisitet) indtraf, eller indtil sygdommen udviklede sig videre. Det blev tilladt at behandlingen fortsatte udover sygdomsprogression hvis patienten forblev klinisk stabil og undersøgeren vurderede at patienten drog klinisk nytte af behandlingen. Undersøgelsen udelukkede patienter med EGFR- eller ALK-genomiske tumorafvigelser, autoimmunsygdomme der ville kræve systematisk behandling indenfor 2 år, en sygdomstilstand der ville kræve immunosuppression, eller som havde fået mere end 30 Gy stråling i brystkasseområdet inden for 26 uger op til undersøgelsen. Der blev foretaget vurderinger af tumorstatus hver 9. uge. De patienter i kemoterapigruppen, der oplevede sygdomsprogression (som kunne bekræftes fra uafhængig side), kunne skifte gruppe og modtage pembrolizumab. Baseline-karakteristika for de 305 patienter i KEYNOTE-024: median-alder 65 år (54% var 65 år eller ældre); 61% mænd, 81% hvide og 15% asiater; og ECOG-scoren var enten 0 (35%) eller 1 (65%). Sygdomskarakteristika var pladecellet (18%) og ikke-pladecellet (82%); M1 (99%); og hjernemetastaser (9%). Den primære målenhed for virkningsresultat var progressionsfri overlevelse (PFS, Progression-Free Survival), vurderet via blinde og uafhængige centralbedømmelser (BICR, Blinded Independent Central Review) i henhold til RECIST version 1.1 (Response Evaluation Criteria on Solid Tumors Version 1.1). De sekundære måleenheder for virkningsresultat var samlet overlevelse (OS) og objektiv responsrate (ORR) som bedømt af BICR ved brug af RECIST 1.1. Tabel 4 giver en oversigt over hovedmålene for virkning for hele ITT (intent to treat)-populationen. Tabel 4: Virkningsresultater i KEYNOTE-024 Endepunkt KEYTRUDA 200 mg hver 3. uge n=154 Kemoterapi n=151 PFS* Antal (%) patienter med hændelse 73 (47%) 116 (77%) Hazard-ratio 0,50 (0,37, 0,68) --- p-værdi <0, Median i måneder 10,3 (6,7; NA) 6,0 (4,2; 6,2) OS Antal (%) patienter med hændelse 44 (29%) 64 (42%) Hazard-ratio 0,60 (0,41; 0,89) --- p-værdi 0, Median i måneder Ikke opnået (NA; NA) Ikke opnået (9,4; NA) Objektiv responsrate* ORR % 45% (37; 53) 28% (21; 36) Fuld respons % 4% 1% Delvis respons % 41% 27% Responsvarighed Median i måneder (interval) Ikke opnået (1,9+; 14,5+) % med varighed 6 måneder 88% 59%# 6,3 (2,1+; 12,6+) * Bedømt med BICR vha. RECIST 1.1 Hazard ratio (KEYTRUDA sammenlignet med kemoterapi) baseret på den stratificerede "Cox Proportional Hazard"- model Baseret på stratificeret log rank-test Baseret på patienter med enten bekræftet fuld eller delvis respons som bedste overordnede respons Baseret på Kaplan-Meier-estimater; omfatter 43 patienter, der havde respons på 6 måneder eller mere # Baseret på Kaplan-Meier-estimater; omfatter 16 patienter, der havde respons på 6 måneder eller mere NA = Ingen tilgængelige data P03928DK_05/SK / s. 12/19

13 Figur 1: Kaplan-Meier-kurve over samlet overlevelse i KEYNOTE Samlet overlevelse (%) Overall Survival (%) Behandling Treatment arm KEYTRUDA Kemoterapi Chemotherapy Time in Months Antal Number i risiko Tid i måneder at Risk KEYTRUDA KEYTRUDA: Kemoterapi Chemotherapy: KEYNOTE-010: Kontrolleret forsøg med NSCLC-patienter, der tidligere er blevet behandlet med kemoterapi Den kliniske nyttevirkning af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx blev undersøgt i KEYNOTE-010, et åbent, randomiseret, klinisk multicenterstudie, som blev udført med henblik på at vurdere sikkerheden og virkningen af KEYTRUDA hos patienter med fremskreden NSCLC, som tidligere havde fået behandling med platin-indeholdende kemoterapi (15). Patienterne udviste PD-L1- ekspression med 1% TPS baseret på en klinisk forsøgsassay (CTA)-version af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Patienter med EGFRaktiveringsmutation eller ALK-translokering havde, også inden de modtog pembrolizumab, oplevet sygdomsprogression efter godkendt behandling for disse mutationer. Patienterne modtog efter randomisering (1:1:1) pembrolizumab ved en dosering på 2 (n=344) eller 10 mg/kg (n=346) hver 3. Uge, eller docetaxel ved en dosering på 75 mg/m 2 hver 3. uge (n=343) indtil der blev observeret sygdomsprogression eller ikke-acceptabel forgiftningsvirkning (toksisitet). Undersøgelsen udelukkede patienter med autoimmunsygdomme, eller en sygdomstilstand der ville kræve immunosuppression, eller som havde fået mere end 30 Gy stråling i brystkasseområdet inden for 26 uger op til undersøgelsen. Der blev foretaget vurderinger af tumorstatus hver 9. uge. Måleenheder for de primære virkningsresultater var OS og PFS vurderet med BICR i henhold til RECIST 1,1. På baggrund af CTA blev i alt NSCLC-patienter randomiseret i studiet. For at vurdere den kliniske anvendelighed af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx blev arkiverede prøver fra kliniske studier testet retrospektivt med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx på et referencelaboratorium i USA. Af de patienter blev tumorvæv fra 529 patienter testet retrospektivt med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx-testen. Præparater fra 413 patienter var positive for PD-L1-ekspression ( 1% af levedygtige tumorceller der udviste membranfarvning med en hvilken som helst intensitet), og prøver fra 94 patienter var negative for PD-L1-ekspression (<1% af levedygtige tumorceller der udviste membranfarvning med en hvilken som helst intensitet). Blandt disse 413 patienter med positiv PD-L1-ekspression havde præparater fra 163 patienter høj PD-L1-ekspression ( 50% af levedygtige tumorceller der udviste membranfarvning med en hvilken som helst intensitet). Det opnåede overensstemmelsesniveau mellem CTA og PD-L1 IHC 22C3 pharmdx er anført i tabel 5. Tabel 5: Overensstemmelse mellem CTA og PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Overensstemmelsesrater PD-L1 Afskæring Negativ procentoverensstemmelse (95% konfidensinterval (CI)) Positiv procentoverensstemmelse (95% konfidensinterval (CI)) CTA vs. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx TPS 1% 94,5% [91,4%-96,6%] 80,0% [76,9%-82,8%] TPS 50% 98,3% [97,1%-99,0%] 73,2% [67,9%-77,9%] Blandt randomiserede patienter, der var positive iht. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, var demografien og andre baseline-karakteristika velafbalancerede behandlingsgrupperne imellem. Median-alderen var 63 år (44% var 65 år gamle eller ældre). Hovedparten af patienterne var hvide (77%) og mænd (58%), og ECOG-scoren ved baseline var 0 (29%) eller 1 (71%). Otteoghalvfjerds procent (78%) af patienterne var tidligere/nuværende rygere. Toogtyve procent (22%) af patienterne udviste pladecellehistologi, og 69% udviste ikke-pladecellehistologi. Baseline og de demografiske karakteristika var ligeledes velafbalanceret mellem pembrolizumabog docetaxel-grupperne i det samlede kliniske studie. Virkningsresultaterne er opsummeret i tabel 6 og 7. Der blev påvist længerevarende klinisk nyttevirkning af KEYTRUDA hos NSCLC-patienter, der udviste PD-L1-ekspression (TPS 1%), og forøget nyttevirkning hos patienter der udviste høj PD-L1- ekspression (TPS 50%), bestemt via PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Nytteværdiens størrelse var sammenlignelig med den for det overordnede kliniske forsøg. Tabellerne nedenfor opsummerer hovedmålene for nyttevirkningen i den overordnede population, der udviste PD-L1-ekspression (TPS 1%), og i den undergruppe, der udviste høj PD-L1-ekspression (TPS 50%) for den overordnede kliniske undersøgelse (TPS 1% fra CTA), samt i populationen med PD-L1-ekspression fra PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Kaplan-Meier-kurven over OS (TPS 1%), som påvist ved PD-L1 IHC 22C3 pharmdx) er afbildet i figur 2. Virkningsresultaterne var sammenlignelige for 2 mg/kg- og 10 mg/kg- KEYTRUDA behandlingsgrene. P03928DK_05/SK / s. 13/19