Fosterceller i gravides blod

Transkript

1 Fosterceller i gravides blod Forskningsmetodologisk opgave Aarhus Universitet, forårssemesteret 2011 Anne Sigaard Ferreira, årskortnr Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Aarhus Universitet Hovedvejleder: Niels Uldbjerg, Professor, overlæge, dr.med. Medvejleder: Jacob Mørup Schlütter, dr.med, PhD-studerende Gynækologisk Obstetrisk afd.y, Skejby Universitetshospital

2 Indhold 1. Resumé...s.3 2. Abstract...s.3 3. Introduktion...s.5 4. Baggrund...s.6 5. Metode...s.7 6. Resultater...s.9 7. Diskussion...s Konklusion...s Litteraturliste...s.13 Fosterceller i gravides blod 2

3 1. Resumé Formål: At undersøge om der findes en sammenhæng mellem mekanisk manipulation af placenta vha. en ultralydsscanner og et øget antal føtale placentaceller i den gravide kvindes blod. Metode: 10 gravide kvinder blev rekrutteret til deres uge 12-scanning. Der blev taget blodprøver(36 ml) lige før og efter scanning, som blev udført både abdominalt og vaginalt. Cellerne blev identificeret, isoleret og talt samt kønsbestemt af firmaet FCMB-Aps. Resultater: 5 kvinder faldt i antal af celler, 3 steg og 2 kvinder forblev uændrede på 0 celler. Der fandtes ingen sammenhæng mellem den mekaniske manipulation af placenta og en efterfølgende stigning af antal føtale placentaceller p = 0,5032. Blandt gravide kvinder med drengefostre observeredes en tendens til højere antal føtale placentaceller i forhold til gravide kvinder med pigefostre p = 0,066, men denne forskel var ikke signifikant. Konklusion: Forsøget viste ingen sammenhæng. Et interessant sidefund var dog tendensen til et højere antal føtale placentaceller ved drengefostre i forhold til pigefostre. 2. Abstract Objective: To examine whether mechanical manipulation of the placenta with the aid of an ultrasound scanner has a positive effect on the number of fetal pacental cells in the blood of a pregnant woman. Methods: 10 pregnant women was included at their elective first-trimester screening programme. Blood samples were drawn(36 ml) just before and after the scanning performed at both the abdomen and vagina. The cells were identified, isolated and counted plus the gender was determined by the firm FCMB-Aps. Results: 5 women had a reduced number of cells, 3 increased and 2 women had no alteration with 0 cells. No correlation could be confirmed between the mechanical manipulation of the placenta and subsequently an increase in fetal placental cells p = 0,5032. Pregnant women carrying a male fetus had a tendency to have a higher number of fetal placental cells compared to women carrying a female fetus p = 0,066, but this observation was not significant. Fosterceller i gravides blod 3

4 Conclusion: The study did not show any correlation. An extra finding was the interesting tendency of a higher number of fetal placental cells among women carrying a male fetus campared to women carrying a female fetus. Keywords: number of fetal placental cells, maternal blood, mechanical manipulation Fosterceller i gravides blod 4

5 3. Introduktion Det har længe været kendt, at der under en graviditet foregår en betydelig trafik af celler mellem placenta og den gravide kvindes blod. Dette har afstedkommet megen forskning, da muligheden for en fremtidig non-invasiv fosterdiagnostik af disse celler, ligger lige for. Firmaet FCMB-Aps har haft et stort gennembrud, idet de er i stand til at isolere føtale celler der stammer fra placenta. Problemet er dog desværre stadig, hvordan man sikrer et stort nok antal føtale celler til at kunne udføre sikker diagnostik. Endnu upublicerede interne data indikerer, at coitus før blodprøvetagning har en gunstig effekt på den føtomaternelle celletrafik. Dette har ført til den hypotese, at mekanisk manipulation kunne spille en rolle for antallet af føtale celler i maters blod. Formålet med forsøget var derfor at undersøge hvorvidt, der er en sammenhæng mellem mekanisk manipulation, i dette forsøg udført vha. en ultralydsscanner abdominalt og vaginalt, og et øget antal føtale celler i maters blod. Projektet har været en utrolig lærerig proces, hvor jeg har været med til at lave protokol, rekruttere deltagere, indsamle og analysere data. Opgaven består af en gennemgang af baggrunden 1 for non-invasiv prænatal fosterdiagnostisk forskning, et metodeafsnit, resultatgennemgang der er illustreret med figurer og tabeller samt diskussion med endelig konklusion. Igennem opgaven er der blevet brugt følgende forkortelser: fpcmb: føtale placentaceller i 36 ml maternelt blod. Disse placentaceller er en specifik undergruppe af føtale celler, hvorimod fosterceller eller føtale celler ikke præciserer hvilken føtal celletype der er tale om. IQR: percentil min.: minutter GA: gestationsalder 1 Litteratur til baggrund er søgt i databasen PubMed. Der er brugt søgeordene fetal cells og non-invasive prenatal diagnosis samt number of isolated fetal cells i kombination med et af følgende søgeord maternal blood og nucleated red blood cells (NRBC). Der er endvidere brugt related citations -funktionen i databasen. Fosterceller i gravides blod 5

6 4. Baggrund Gennem mange år har der været fokus på, om den ændrede demografi, hvor særligt den forøgede gennemsnitlige reproduktionsalder er forbundet med en højere risiko for Down syndrom[1], og den stadigt stigende mængde udsættelse for toksiske stoffer 2 i miljøet, kan indvirke på den menneskelige reproduktion. Der mistænkes en øgning af udviklingsabnormaliteter fremover[6]. Risikoen for, at et levendefødt barn har kromosomale abnormaliteter eller strukturelle misdannelser, er før blevet beregnet til et sted mellem 3-5%[1]. Sikker prænatal fosterdiagnostik udføres i dag med invasive metoder, som moderkagebiopsi og fostervandsprøve, til afdækning af kromosomalt og genetisk betingede sygdomme. Indikationerne for disse indgreb er kromosomfejl ved kendte arvelige sygdomme, hvis kvinden tidligere har født et barn med kromosomanomali eller hvis den kombinerede risikovurdering er større end 1:300 udover at kvinder over 40 år kan tilbydes undersøgelsen efter ønske[7]. Sammenlagt får ca. 4% af alle gravide kvinder i Danmark foretaget en moderkagebiopsi. Da disse invasive procedurer indebærer en abortrisiko på ca. 0,5-1%[8], er der stigende interesse for og stor efterspørgsel på en forbedring af de nuværende prænatale diagnostiske tilbud. Allerede tilbage i 1893 påviste den tyske patolog Schmorl, som den første, føtale trophoblaster i afdøde gravide kvinders lungevener[9]. Siden 1959, hvor Douglas et al.[10] påviste trophoblaster i maters blod, har interessen for disse celler været stor grundet den mulige non-invasive prænatale fosterdiagnostik. Det har dog ikke været den nemmeste opgave at undersøge disse celler. Dels er fostercellerne sjældne og varierer meget, dels har de tekniske metoder begrænset processen. F.eks. har man kun indtil for nylig været i stand til at finde føtale celler farvet for Y-kromosomet, hvilket har udelukket diagnostik på pigefostre[11]. Dette har ført til, at man mange steder i verden har valgt at fokusere på frit føtalt DNA og RNA i stedet. Fordelen ved frit føtalt DNA og RNA blandt andet, er, at 2 F.eks. perflourerede forbindelser som PFOS og PFOA. Af de få humane studier der findes på området, fandt man at kvinder med relativt høje niveauer i blodet tog længere tid om at blive gravide, havde tendens til at føde mindre børn samt havde en øget risiko for præterm fødsel. Derudover fandtes en noget forringet sædkvalitet hos mænd med høje niveauer af disse stoffer [2-5]. Fosterceller i gravides blod 6

7 koncentrationen af disse er blevet estimeret til at være gange større end fostercellerne og er dermed et mere tilgængeligt materiale at analysere. Ulempen er dog, at det forudsætter korrekt identifikation, hvilket stadigt ikke udføres tilfredsstillende[12]. Rundt om i Europa har man nu i et stykke tid kunnet tilbyde kønsbestemmelse og en Rhesus D status ved undersøgelse af netop denne acellulære fraktion[13]. De føtale celler er dog stadig mest interessante, da der knytter sig en del fordele til disse. Det drejer sig især om trophoblaster, føtale leukocytter og føtale erythrocytter. For med føtale celler kan både den paternelle og den maternelle allel blive analyseret[14]. Derudover er der cytoplasma til rådighed, hvilket potentielt kan åbne op for nye forskningsmuligheder. Specielt erythrocytterne har vist sig fordelagtige. Der er store mængder til stede i den føtale cirkulation i starten af graviditeten, celletypen dominerer den føto-maternelle celletrafik og så er de føtale celler mononukleære og relativt veldifferentierede. De har en begrænset proliferationskapacitet[15] samt kort halveringstid, f.eks. i forhold til lymfocytter der tidligere er blevet påvist 27 år efter endt graviditet[16], hvilket gør dem mere specifikke for den aktuelle graviditet. Ulempen er dog stadig den flaskehalsproblematik de få celler udgør samt korrekt identifikation. Tidligere er det blevet vist, at antallet af fosterceller stiger igennem graviditeten[17], og at graviditeter med aneuploidi giver flere fosterceller formentlig pga. ændret placentastruktur[18-19]. Men hvorfor der er så stor variation blandt, også raske, gravide kvinder, vides ikke. De seneste år er det dog lykkedes firmaet FCMB-Aps at udvikle en metode til identificering og isolering af en undergruppe af føtale placentaceller fra både pige- og drengefostre vha. specifikke antistoffer allerede i GA uge 12[20]. 5. Metode 14 gravide kvinder blev rekrutteret på Gynækologisk/obstetrisk afdeling, Skejby Sygehus, efter ankomst til den tilbudte uge 12-kontrolscanning. Der blev givet både skriftlig og mundtlig information om projektet. Efter indsamlet samtykkeerklæring blev den første blodprøve(36 ml) taget. Herefter blev scanningen udført, både Fosterceller i gravides blod 7

8 abdominalt og vaginalt, hvorefter den sidste blodprøve blev taget(36 ml). Der blev registreret scanningstider. To kvinder blev ekskluderet grundet for tidlig gestationsalder, én pga. forhøjet risikovurdering og en anden grundet manglende foster. De 10 kvinder der deltog i forsøget var i alderen år med en gennemsnitsalder på 31,6 år. Forsøget blev dobbelt-blinded og det var den samme sonograf der udførte alle scanningerne, godkendt af The Fetal Medical Foundation (FMF) i London, UK. Blodprøverne er ikke behæftet med nogen risiko ud over det ubehag indstikkene måtte indebære. Heller ikke ultralydsscanningen er forbundet med nogen risiko for hverken den gravide kvinde eller fosteret. Forsøget er blevet godkendt af den Videnskabsetiske Komite for Region Syd. Blodprøverne Alle blodprøver blev indsamlet i heparinholdige glas og umiddelbart herefter fragtet på køl til FCMB-Aps til videre analyse. Til føtalcelletællingen blev de 36 ml blod fikseret i PFA og lyseret i Triton X-100. De nu samlede kerneholdige celler blev, via en behandling med koldt methanol, gjort permeable efterfulgt af centrifugering og vask. Derefter blev der tilsat MACS buffer(miltenyi, Germany). Cellerne blev nu beriget af MACS (Miltenyi, Germany) ved at bruge en patentsikret metode, internt udviklet af FCMB-Aps, på en undergruppe af føtale placentaceller. De berigede celler blev da udstrøget på plader og de føtale celler blev identificeret vha. immunfarvning, der helt specifikt farver den føtale placentacelle. Positivt farvede føtale celler blev fundet med flourescence mikroskopi enten i hånden eller ved brug af en automatiseret scanner. Føtale celler, der er blevet isoleret ved hjælp af denne metode og herefter blevet kønsbestemt via XY-FISH, har vist at korrelere i 99% af tilfældene, når man sammenligner kønsbestemmelserne ved analysering af frit føtalt DNA[20]. Statistik De statistiske analyser blev udført vha. Stata/IC version 11,1 til Mac (64-bit Intel), StataCorp. Signifikansniveauet blev valgt til 5%. Fosterceller i gravides blod 8

9 6. Resultater Til analyse af data er der blevet brugt Wilcoxon signed-rank testen, da vores data er parrede, og differencen i antal fpcmb ikke kunne vurderes som normalfordelte. I Tabel 1 og Figur 1 ses det, at 5 kvinder faldt i antal af celler, mens 3 steg og 2 forblev uændrede på 0 celler. Den største stigning var på 4 celler. Det største fald var ligeledes på 4 celler. Medianværdien for differencen var på -1 (IQR -3;1). Der er ingen signifikant forskel i antal fpcmb før og efter scanning da p = 0,5032. Deltager Fosterkøn Antal fpcmb før scanning Antal fpcmb efter scanning Abdominal scanningstid (min.) Vaginal scanningstid (min.) Total scanningstid (min.) 1 xx xy xy xx xx xy xx xy xx xx Tabel 1: Antal fpcmb før og efter scanning med tidsangivelser i minutter hhv. abdominalt og vaginalt. Der er ligeledes angivet køn af foster. Fosterceller i gravides blod 9

10 Figur 1: Grafisk illustration af antal fpcmb før og efter scanning. På x-aksen er 1 = før og 2 = efter. 5 deltagere falder i antal af fpcmb, 3 stiger og 2 er uændrede. Da køn endvidere er blevet bestemt, er det også blevet undersøgt, om der evt. er en sammenhæng mellem antal fpcmb i forhold til køn før ultralydsscanning. Dette er blevet bestemt vha. Mann-Whitney testen, da interne data viser, at antallet af fpcmb ikke er normalfordelte, og at der bliver brugt to sæt uparrede data (figur 2). Figur 2: Antallet af fpcmb blandt 4 gravide der ventede et drengefoster sammenlignet med 6 gravide der ventede et pigefoster. Der ses en tendens til at kvinder der venter drengefostre har flere fpcmb (p=0,066). Vi fandt en tendens til flere antal celler inden scanningen, hvis kvinden bar et drengefoster (median: 5,5, IQR: 3,5;10 vs. 1, IQR: 0,3). Denne tendens var ikke signifikant; p=0,066. Den gennemsnitlig scanningstid var 14 min. for den abdominale scanning, 9 min. for den vaginale scanning. Den samlede gennemsnitlige scannningstid var 23 min.. Fosterceller i gravides blod 10

11 Blandt de deltagere der blev scannet i kortest tid ses både et fald og en stigning i fpcmb, mens de to deltagere der blev scannet i længst tid begge stiger (tabel 1). 7. Diskussion Hovedfundet i dette forsøg er, at ultralydsscanning ikke har en signifikant indflydelse på antallet af føtale placentaceller i maters blod. Så vidt vides, er dette forsøg det første af sin slags der har beskæftiget sig med, om ultralydsscanning kan have en positiv effekt på antal fpcmb. Styrker ved studiet var, at det var dobbelt-blinded, og alle scanningerne blev udført af den samme sonograf, så dels den mekaniske påvirkning og dels den tid der blev brugt, blev søgt ensartet. Blodprøverne blev taget lige før og lige efter scanning og videresendt til FCMB-Aps i Vejle med kurer. Rekrutteringen foregik randomiseret, dog begrænset til 93,2% af de gravide kvinder der deltager i 1 trimester screeningen[21]. Da forsøget ikke inkluderede mere end 10 deltagere, er dette en meget lille population at undersøge sammenhænge ud fra, hvilket er en begrænsning i studiets design. Inklusionskriteriet var raske gravide kvinder med rette GA og uden tvillingegraviditeter, hvorfor der ikke blev taget hensyn til evt. forskellig placering af placenta, tidligere graviditeter med evt. tidligere komplikationer, aldersvariation samt mulige arvelige faktorer eller andre sygdomme hos mater. Antallet af fpcmb kan være multifaktoriel, og en så lille og heterogen gruppe kan da muligvis maskere en mulig sammenhæng. En mulig fejlkilde kan endvidere være, trods samme sonograf, at der var en forskel i kraften, hvormed alle deltagerne blev scannet f.eks. grundet forskellig BMI. En risiko ved dette studie er desuden type 2 fejl. Som tidligere nævnt indikerer endnu upublicerede interne data, at der er en mulig sammenhæng mellem coitus og forøget antal fpcmb, hvilket gav anledning til dette forsøg. Forsøget viste ikke nogen signifikant effekt, men om det skyldes at manipulationen ikke har været tilstrækkelig sammenlignet med fysisk påvirkning ved coitus, er en mulighed, der kan undersøges nærmere. I følge sonografen var den længere scanningstid, der var forbundet med nogle af scanningerne, grundet et øget BMI. Her kan det tænkes, at et højt BMI kan nedsætte den mekaniske manipulation. To af de ti kvinder havde ingen celler hverken før eller Fosterceller i gravides blod 11

12 efter manipulationen. Da jeg ikke har kunnet skaffe data vedrørende deltagernes BMI, er det blot spekulationer, men det kunne være interessant at undersøge. En interessant observation ved studiet var, at gravide der venter et drengefoster har tendens til at have et højere antal fpcmb i forhold til gravide der venter et pigefoster. Forskellen var dog ikke signifikant, men interessant, da denne sammenhæng er blevet signifikant påvist ved et andet internt studie endnu ikke publiceret. Sammenhængen passer desuden godt overens med andre studier, der har vist at HLAantistoffer er signifikant mere frekvent ved gentagen abort, hvis den førstefødte er en dreng, hvilket reducerer chancen for et levendefødt barn[22]. Dette kunne skyldes immunisering pga. et øget antal føtale celler. At antallet af fpcmb er højere hos gravide der venter en dreng, kan muligvis også skyldes kønsforskelle i forhold til placentas funktion. Andre studier har nemlig vist, at drengekønnet var associeret med forøget risiko for præeklamsi[23], og at abruptio placentae forekommer tidligere ved kvinder der venter en dreng[24]. Da de tekniske udfordringer i høj grad er blevet imødekommet af FCMB-Aps s internt udviklede metoder, er den store udfordring aktuelt, hvordan man garanterer nok fosterceller. Er der faktorer vi ikke har taget højde for som f.eks. høj puls og nervøsitet før scanning i forhold til efter, der kunne have en indflydelse på antallet af celler? Hvorfor varierer det sådan blandt gravide kvinder? Nogle har et rigtig højt antal celler mens andre har ingen. Interessant, men hvorfor? For at komme disse spørgsmål nærmere, kræver det flere forsøg. Her kunne det være interessant at inkludere flere deltagere og evt. se nærmere på den initielle mistanke om sammenhæng mellem coitus og øget antal fpcmb, eftersom scanningen i dette studie ikke har kunnet påvise nogen effekt. 8. Konklusion Formålet med forsøget/opgaven var, at undersøge om man kan påvise en sammenhæng mellem ultralydsscanning af placenta abdominalt og vaginalt og et stigende antal føtale placentaceller i den gravides blod. Dette studie viste ingen sammenhæng. Som et interessant sidefund fandt vi en tendens til højere antal fpcmb ved drengefostre i forhold til pigefostre, men dette var ikke signifikant. Fosterceller i gravides blod 12

13 9. Litteraturliste [1] Hook EB. Down syndrome: frequency in human populations and factors pertinent to variation in rates. In: de la Cruz FF, Gerald PS, eds. Trisomy 21(Down syndrome): research perspectives. Baltimore: University Park Press, 1981:3-18. [2] Fei C, McLaughlin J K, Tarone R E et al. Perfluorinated chemicals and fetal growth: A study within the Danish National Birth Cohort. Environ Health Perspect 2007;115: [3] Fei C, McLaughlin J K, Lipworth L et al. Fetal growth indicators and perfluorinated chemicals: A study in the Danish National Birth Cohort. Am J Epidemiol 2008;168: [4] Fei C, McLaughlin J K, Lipworth L et al. Maternal levels of perfluorinated chemicals and subfecundity. Hum Reprod 2009;1(1):1-6 [5] Joensen U N, Bossi R, Leffers H et al. Do perfluoroalkyl compounds impair human semen quality? Environ Health Perspect. doi: /ehp (available at Online 2 March [6] Anthony N. Imudia, Sanjeev Kumar, Michael P. Diamond, Alan H. DeCherney et D. Randall Armant. Transcervical retrieval of fetal cells in the practice of modern medicine: A review of the current litterature and future direction. Fertil Steril.2010 April; 93(6): [7] [8] Ann Tabor, Zarko Alfirevic. Update on Procedure-Related Risks for Prenatal Diagnosis Techniques. Fetal Diagn Ther 2010;27:1-7. [9] Lapaire O, Holzgreve W, Oosterwijk JC, Brinkhaus R, Bianchi DW. Georg Schmorl on Trophoblast in Maternal Circulation. Placenta 2007; 28(1):1-5. [10] Douglas GW, Thomas L, Carr M et al. Trophoblast in the circulating blood during pregnancy. Am J Obstet Gynecol 1959;78: [11] Bianchi DW, Simpson JL, Jackson LG, Elias S, Holzgreve W, Evans MI, et al. Fetal gender and aneuploidy detection using fetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I data. National Institute of Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study. Prenat Diagn 2002 Jul;22(7): [12] Mark I. Evans, Michael Kilpatrick. Noninvasive Prenatal Diagnosis: Clin Lab Med 30 (2010) [13] Sinuhe Hahn, Lyn S. Chitty. Noninvasive prenatal diagnosis: current practice and future perspectives. Current Opinion in obstetrics and Gynecology 2008, 20: Fosterceller i gravides blod 13

14 [14] A.Kolialexi, C. Vrettou, J. Traeger-Synodinos et al. Noninvasive prenatal diagnosis of beta-thalassaemia using individual fetal erythroblasts isolated from maternal blood after enrichment. Prenat Diagn 2007; 27: [15] Yuditiya Purwosuno, Akihiko Sekizawa, Keiko Koide et al. Clincal Potential for Noninvasive Prenatal Diagnosis through Detection of Fetal Cells in Maternal Blood. Taiwanese J Obstet Gynecol 2006; 45 (1): [16] Diana W. Bianchi, Gretchen K. Zickwolf, Gary J. Weil, Shelley Sylvester. Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum. Medical Sciences, Vol.93, pp , January [17] Hamada H, Arinami T, Kubo T et al. Fetal nucleated cells in maternal peripheral blood: frequency and relationship to gestational age; Hum Genet 1993; 91(5): [18] Krabchi K, Gadji M, Forest J-C, Drouin R. Quantification of all fetal nucleated cells in maternal blood in different cases of aneuploidies. Clin Genet 2006: 69: [19] A. Mavrou, E. Kouvidi, A. Antsaklis et al. Identification of nucleated red blood cells in maternal circulation: A second step in screening for fetal aneuploidies and pregnancy complications. Prenat Diagn 2007; 27: [20] Brinch M, Hatt L, Singh R, Møller K, Lauridsen RH, Kristensen H, et al. Fetal cells from maternal blood: A powerfil tool for prenatal diagnosis. Prenat Diagn 2010;30((Suppl. 1)):42. [21] Petersen, O. B., Holsting, M. Q., Gjørup, V., Ersbak, V., Stornes, I., Pedersen, F. H. and Salvig, J. D. (2010), OP04.05: Public 1st and 2nd trimester prenatal screening to all women: participation and satisfaction in a Danish region. Ultrasound in Obstetrics & Gynecology, 36: doi: /uog [22] Nielsen HS, Witvliet MD, Steffensen R, Haasnoot GW, Goulmy E, Christiansen OB, et al. The presence of HLA-antibodies in recurrent miscarriage patients is associated with a reduced chance of a live birth. J Reprod Immunol 2010 Jul 3. [23] Elsmen E, Kallen K, Marsal K, Hellstrom-Westas L. Fetal gender and gestational-age-related incidence of pre-eclampsia. Acta Obstet Gynecol Scand 2006;85(11): [24] Tikkanen M, Metsaranta M, Gissler M, Luukkaala T, Hiilesmaa V, Ylikorkala O, et al. Male fetal sex is associated with earlier onset of placental abruption. Acta Obstet Gynecol Scand 2010 Jul;89(7): Fosterceller i gravides blod 14