A f l æ s n i n g a f r e s i s t e n s b e s t e m m e l s e r f o r u r i n p r ø v e r m e d E s c h e r i c h i a c o l i o g K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e e f t e r 6, 9 o g 1 6 t i m e r u d s å e t p å K i e s t r A Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen København Udarbejdet af: Alexandra Hercman Fødselsdagsdato: 22.09.90 Forsøg udført i samarbejde m. Hannah Issa og Maria Ann Nilsson Vejledere: Minna Lladó, PH Metropol, København Khaled Ghathian, KMA, Hvidovre Hospital Projektperiode: 17. april 2014 6. juni 2014 Afleveringsdato: 6. juni 2014 kl. 12.00 24.346 Anslag uden mellemrum:
Resumé Primære resistensbestemmelser for urinprøver, på KMA på Hvidovre Hospital, bliver udsået i InoqulA (KiestrA) og aflæst efter 16 timer. Da de fleste urinvejsinfektioner skyldes Enterobacteriaceae, som er hurtigvoksende bakterier, kunne det være at resistensbestemmelserne kunne aflæses tidligere. Formålet med dette projekt var, at finde ud af om de primære resistensbestemmelser for urinprøver med Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae kunne aflæses, med korrekte hæmningszoner, efter 6 og 9 timer. Til projektet blev der anvendt 675 urinprøver, ud af dem er 372 hospitalsprøver og 303 praksisprøver. Resultaterne viser at 51,6 % af prøverne, med vækst, kunne aflæses efter 6 timer og efter 9 timer kunne 90,7 % af prøverne aflæses. Efter 6 timer var der en afvigelse, i forhold til Golden Standard, med 9,2 %. Ud af de 9,2 % er 1,2 % Very Major Error, 7,7 % Major Error og 0,3 % Minor Error. Efter 9 timer var der en afvigelse på 5,1 %. Ud ad dem var 1,6 % Very Major Error, 3,3 % Major Error og 0,2 % Minor Error. På baggrund af disse resultater har vi konkluderet af de primære resistensbestemmelser ikke kan aflæses efter 6 og 9 timer uden konsekvenser for patienterne. 2
Indholdsfortegnelse Resumé... 2 Problembaggrund... 4 Problemformulering... 5 Teori... 5 Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae... 5 Agar diffusion... 5 Antibiotikagrupper... 7 Metodevalg og afgrænsning... 8 Materialeliste... 10 Apparatur... 10 Materialer... 10 Antibiotika... 11 Kontrol... 11 Metode... 11 Resultater... 13 Diskussion... 16 Konklusion... 22 Litteratur liste... 23 3
Problembaggrund På Klinisk Mikrobiologisk Afdeling (KMA) på Hvidovre Hospital (HVH), følger man retningslinjerne som Eucast har lavet, at der bliver udsået på en Muller Hinton plade (MH-plade) og en biplade (chromagar/5 % blodplade) [1]. På afdelingen udfører man sekundær resistens hvis den primære resistensplade ikke er konfluerende, eller når der er bakteriearter der behøver behandling med andre antibiotika end dem der er i urindispenseren. Eucast (The European Comittee on Antimicrobial Susceptibility Testing) har lavet retningslinjer for resistensbestemmelser i Europa [2]. Retningslinjerne for resistensbestemmelser er, at man bl.a. laver sekundære resistensbestemmelser i hånden med en McFarland på 0,5, efter man har identificeret bakterien, så man også ved, hvilken resistensplade man skal udså på. På baggrund af tanken om at Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae er hurtigt voksende bakterier, kunne det være, at resistensbestemmelserne kunne aflæses tidligere. Derfor er dette projekt blevet stablet på fødderne for at finde ud af, om dette kan bruges i praksis, da det giver mulighed for at patienten kommer tidligere i behandling. Med dette projekt vil vi gerne undersøge om det er muligt at affotografere pladerne efter 6, 9 og 16 timer og få en troværdig zonestørrelse, og om det dermed er muligt at aflæse og resistensbestemme Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae, fra urinprøver, efter 6 og 9 timer i stedet for 16 timer som man gør på KMA.
Problemformulering Hvilken betydning har det for den primære følsomhedsbestemmelse at hæmningszonerne aflæses for Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae efter 6, 9 og 16 timer på urinprøver, udsået direkte på MH-plader på KiestrA i forhold til Golden Standard* (Eucast)? *Golden standard er sekundær følsomhedsbestemmelse (resistensbestemmelse). Teori Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae hører til familien Enterobacteriaceae [6]. De er gram negative stave, fakultativ anaerobe og begge bakterier har normalflora i tarmen [7,8]. E.coli medvirker til, så sygdomsfremkaldende bakterier ikke formerer sig. Bakterien er apatogen, men hvis den kommer uden for normalflora, kan den forekomme patogen [10]. Infektioner forårsaget af Klebsiella har en tilbøjelighed til at forekomme hos personer med et svækket immunforsvar [11]. Agar diffusion Agar diffusions princippet er anvendt til metoden i dette projekt. Princippet er, at antibiotikaene i diskene der er påsat pladen, diffunderer ud i agaren og hæmmer bakteriernes vækst indtil antibiotikadisken. Der er flere faktorer der har indflydelse på agar diffusionen. For at resistensbestemmelsen skal være ens i hele Europa, har Eucast sat retningslinjer for resistensbestemmelser. Agar Agaren skal være 4mm± o.5mm tykt [12]. Hvis agaren fx er for tynd, vil antibiotikamolekylerne, fra antibiotikadiskene, diffundere for langt ud i agaren, da antibiotikamolekylerne rammer bunden af pladen. Dette vil resultere i falske 5
forstørrede hæmningszoner [13]. For at undgå dette, skal agarpladerne opbevares ved den korrekte temperatur, 4-8 C [12]. Der skal være nok næringsstoffer i pladen, da det skal understøtte en god vækst af bakterierne. ph-værdien skal også være korrekt, da den er meget vigtig for både bakterievæksten, men også for antibiotikas effekt [13]. Inokulum For at kunne aflæse hæmningszonerne nøjagtig, har Eucast sat en standardisering af inokulum. Inokulum skal have en tæthed på 0,5 McFarland. Dette opnås ved at tage et par ens kolonier med en vatpind og dyppe i 2 ml NaCl. Derefter tages en ny vatpind, der dyppes i inokulummet. Vatpinden presses for overskydende væske og udsås på agarpladen. Med denne metode får man konfluerende vækst [12]. Antibiotika Antibiotikaene skal opbevares korrekt ved <8 C, og må ikke eksponeres for fugt, da det kan gøre at antibiotikaene diffunderer, inden diskene bliver påsat. For at undgå at hæmningszonerne overlapper hinanden og at antibiotikaene ikke interfererer med hinanden, har Eucast afgrænset antallet af antibiotikadisks til seks pr. plade. Antibiotikadiskene skal påsættes på pladen, maksimalt 15 minutter efter tilsåning, så bakterierne ikke opformerer sig inden antibiotikadiskene påsættes [12]. Inkubation Inkubatoren skal have den korrekte temperatur og eventuelt atmosfære fx CO 2. Hvis temperaturen er for lav, kan bakterievæksten være dårlig og langsom. Pladen inkuberes maksimalt 15 minutter efter antibiotikadiskene er påsat [12]. 6
Antibiotikagrupper Der er fem antibiotikagrupper der inddeles efter deres virkemåder på bakterierne. Nogle af de grupper, er b.la. antibiotika der: - hæmmer cellevægssyntesen (f.eks. AMC 30, MEL 10 og CPD 10) - hæmmer proteinsyntesen (f.eks. F 100) - har en virkning på den cytoplasmatiske membran - har en virkning på DNA- og/eller RNA-syntesen - har en virkning på folinsyresyntesen (f.eks. W 5 og S 300) [2] Hæmning af cellevægssyntesen Fx β-lactamer, der er en fællesbetegnelse for fx penicilliner (AMC 30) og cefalosporiner (CPD 10). Disse antibiotika går ind i bakterien og inaktiverer de enzymer, der er nødvendige for cellevægssyntesen og dermed kan bakterierne ikke dele sig. Derimod vil bakterierne svulme op pga. osmotisk tryk og sprænges [14]. Hæmning af proteinsyntesen Fx aminoglycosider. Aminoglycosider transporteres ind i bakterien og bliver bundet irreversibelt til receptorer på 30S-delen af bakteriernes ribosomer. Dette gør, at der bliver dannet abnorm store proteiner og medføre dysfunktion af bakteriecellen. Derudover bindes aminoglycosiderne til celleoverfladen, hvor de øger cellemembranens permeabilitet [14]. Påvirkning af cytoplasmamembranen Polymxiner påvirker gram negative bakterier. De interagerer med lipopolysaccharider og fosfolipder på den ydre del af cellemembranen. Her forstyrrer de transporten over membranen, men også permeabiliteten [14]. Hæmning af DNA- og/eller RNA-syntesen Fluorquinoloner hæmmer enzymet DNA-gyrase. Dette enzym får DNAdobbeltstrengen i en form, så replikationen og transskriptionen kan foregå. Fluorquinoloner har ingen effekt på det tilsvarende enzym hos mennesket.[14]. 7
Hæmning af folinsyresyntesen F.eks. Trimethoprim hæmmer dihydrofolsyrereduktase i mikroorganismer. Når trimethoprim har afbrudt folinsyresyntesen, hæmmes syntesen af purin og dermed også syntesen af DNA og RNA [14]. Metodevalg og afgrænsning Til dette projekt valgte vi at undersøge urinprøver, da vi vil undersøge E.coli og størstedelen af de inficerede urinprøver er med E.coli. Vi valgte at medtage både hospitals- og praksisprøver. Da der skulle vælges hospitalsprøver, blev der gået efter de uklare, da der måske var større sandsynlighed for at de ville indeholde bakterier. Under vores pilotforsøg, fandt vi ud af, at mange af prøverne var uden vækst af bakterier og vi besluttede os for at også medtage praksisprøver. Da praksisprøverne indeholder borsyre, der stabiliserer bakterierne så de ikke opformerer sig, kunne vi udvælge de prøver, som afdelingen havde identificeret tidligere, der var inficeret med E.coli og K.pneumoniae. På den måde kan man være sikker på at finde nok positive prøver. Normalt ude på afdelingen aflæser man resistens efter 16 timer. Eftersom vi gerne vil reducere svartiden for resistensbestemmelsen, valgte vi at aflæse efter 6, 9 og 16 timer. Som Golden Standard har vi udført sekundær resistensbestemmelse på alle prøverne. Dette gjorde vi for at have en Golden Standard, da det er hvad retningslinjerne siger ifølge Eucast og for at kunne sammenligne de andre prøver der bliver affotograferet efter 6, 9 og 16 timer. Med den sekundære resistens vil man også kende koncentrationen af bakterierne, da man laver en McFarland på 0,4-0,6, så man får konfluerende bakterievækst. Parallelt med vores forsøg, tester bioanalytikerne på KMA, en gang om ugen, en E.coli ATCC stamme (American Type Culture Collection), som er en intern kvalitetskontrol på afdelingen. Dette bruger vi som en ekstra kvalitetskontrol ved 8
siden af vores Golden Standard. En ATCC stamme har kendte hæmningszoner og kan derfor anvendes til at sikre, at forholdene under inkubationen er korrekte, om temperaturen i varmeskabet er korrekt og at mediet og antibiotika fungerer optimalt. For at få et troværdigt billede af, om det er muligt at aflæse resistensen for Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae efter 6 og 9 timer, havde vi et mål om at undersøge 500 prøver. Vi kom op på 675 prøver. Vi valgte at udså på MH-plader, da vi vidste at de bakterier vi ville undersøge ikke er kræsne og ikke behøver den ekstra næring fra MH-F pladen til at opformere sig. Vi valgte også at udså prøverne på biplader, så de kunne kvantiteters. Vi valgte at anvende InoqulA til at udså prøverne, da den udsår prøverne ens med 10 µl prøvemateriale. Vi valgte også at anvende KiestrA, da den automatisk inkuberer de udsåede prøver og affotografere dem efter det indstillede tidspunkt. I vores tilfælde, efter 6, 9 og 16 timer. Disse billeder kan man aflæse ved computerskærme tilhørende KiestrA. Alle vores data blev noteret i et Excel-ark. Derefter blev dataene sat ind i mindre tabeller for at få et større overblik over dem. Den første tabel vil vise antallet af de annullerede prøver og hvorfor de blev annulleret. Derefter er der to antalstabeller. Den første vil vise antallet af disks der kunne aflæses ved hver antibiotikum, og den næste vil vise antallet af hvor mange der blev aflæst til S, I eller R for 6, 9, 16 timer og GS. Herefter bliver der vist hvor mange der f.eks. går fra R til S og S til R i forhold til den primære resistensbestemmelse og GS (sekundær resistens-bestemmelse). Disse resultater bliver også inddelt i grupper efter hvor stor fejlene er. Very Major Error (meget stor uoverensstemmelse) repræsenterer fortolkningerne, der går fra at være sensitiv i den primære resistensbestemmelse, til resistent i den sekundære resistensbestemmelse. Major Error (stor uoverensstemmelse) repræsenterer fortolkningerne, der går fra at være resistent i den primære resistensbestemmelse, til at være sensitiv i den sekundære resistensbestemmelse. Minor Error (små uoverensstemmelser) repræsenterer de fortolkninger, hvor den primære 9
resistensbestemmelse går fra at være intermediær, til enten resistent eller sensitiv i den sekundære resistensbestemmelse, eller fra at være sensitiv eller resistent i den primære resistensbestemmelse, til at være intermediær i den sekundære resistensbestemmelse. Vi satte en grænse for at nå mindst 500 prøver for at få nok data med, som vi kunne arbejde med. For ikke at få alt for meget data med til forsøget, har vi opsat nogle afgrænsninger. Vi valgte kun at anvende E.coli og K.pneumoniae, da der er lavet et studie om, at det er hurtigt voksende bakterier. Desuden er E.coli også den hyppigste bakterie til at forårsage en urinvejsinfektion. Vi har valgt at kun at anvende et slags prøvemateriale (urin), da det er i det prøvemateriale man finder mest E.coli. I modul 13 lavede vi et pilotforsøg, og under det forsøg fandt vi ud af, at når bakterierne kvantiteters til 10 3, er der ikke tilstrækkelig nok bakteriemængde til at man kan aflæse resistensen og derfor valgte vi at annullere prøver der blev 10 3. Ved lige mængder af blandede bakterier, valgte vi at kalde det blandingsflora og dermed annullere prøven, da man først skulle isolere den bakterie man skulle anvende i forsøget. Ved blandingsflora, hvor vi f.eks. havde E.coli 10 5, og få af en anden, valgte vi at aflæse resistens, eftersom man kan se forskellen på resistenspladen. Materialeliste Apparatur KiestrA InoqulA Materialer - Urinprøver: Hospitalsprøver 372 stk. Praksisprøver 303 stk. - MH-plader: 675+215 : 890 stk. - Biplader (chromagar/blodplade): 675x1 : 675 stk. 10
- Disc UP: 6 disk / plade : 6x890 - Spotindol test (DMACA) - NaCl - Densimat - Retro 80 pladespreder - Vatpinde - MALDI TOF XS - MALDI target - Matrix til MALDI TOF - Spotindol (DMACA) Antibiotika Firma: Oxoid Ltd. Basingstoke. Hampshire England Sulfamethizol (S 300) : LOT nr. 1401953, koncentration: 300 µg (100% hæmning) Amoxicillin + clavulansyre (AMC 30): LOT nr. 1426107, koncentration: 30 µg (100% hæmning) Nitrofurantoin (F 100): LOT nr. 1435176, koncentration: 100 µg (100% hæmning) Cefpodoxin (CPD 10) : LOT nr. 1430839, koncentration: 10 µg (100% hæmning) Trimethoprim (W 5) : LOT nr. 1439326, koncentration: 5 µg (100% hæmning) Mecillinam/Pivmecillinam (MEL 10 ) : LOT nr. 1452945, koncentration 10 µg (80% hæmning, ignorer små kolonier) Kontrol - E.coli ATCC 25922 Metode - - Uklare prøver fra hospitalsuriner og grønne monovetteglas tilsat borsyre fra de praktiserende læger (med E.coli og K.pneumoniae), blev udvalgt til projektet. Urinprøver rekvireres elektronisk på afdelingen: Der logges på wwlab, hvorefter urinprøven scannes ind og der printes en 11
label ud, samtidigt med at prøven mærkes med en ny mærkat. Det gamle og det nye nummer opstilles parallelt i et skema. Prøven oprettes under punkt 1. Rekvisition + prøveregistrering - Tryk på Ny prøve à scan det nye nummer ind à vælg afdeling FO1 à ved CPR-nr. laves en ( ) à ved patientidentitet scannes det gamle nr. à Vælg prøvetype Urin (simuleret) à Vælg lokalisation, punkt 2 (.) à Ved undersøgelse skal der stå dyrkning og resistens à Der afsluttes og gemmes på tasten p4 (-) à Til sidst tjekkes om der er overensstemmelse mellem det nye og gamle nummer. - Urinprøver inokuleres via InoqulA på to plader, en MH-plade med seks antibiotika disks, samt en biplade der følger normal procedure med henblik på aflæsning efter 6, 9 og 16 timer. Begge plader med 10µl prøvemateriale. - InoqulA udsår urinprøverne på de to plader. Efter pladerne er blevet inokuleret køres pladerne fra InoqulA til inkubering i ReadA erne. Pladerne bliver kørt ud ved Errorstack og antibiotikadisks påsættes inden 15 minutter. Pladerne påsættes igen på KiestA efter 15 minutter (Det er vigtigt at overholde 15 min, ellers bliver pladerne kørt ud i Errorstack igen). - Pladerne aflæses i ReadA Browseren og wwlab i reading room - - - De primære resistensbestemmelser (MH pladerne) til projektet blev affotograferet efter 6, 9 og 16 timer. Zonestørrelserne for de 3 målinger/aflæsninger registreres og indføres i et skema (Excel-ark) samtidigt kvantiteters bi-pladen og derefter laves en sekundær resistensbestemmelse (Golden Standard) fra bipladen, som aflæses efter 16 timer. E.coli- og Klebsiella lignende stave der ikke er blevet identificeret af afdelingen, identificeres ved at lave indolspot på E.coli lignende stave og MALDI TOF på Klebsiella lignende stave. 12
Resultater Til dette forsøg blev kontrolstammen E.coli ATCC 25922 udført og disse lå indenfor breakpoints. I dette projekt har vi 675 prøver i alt. Ud af dem, måtte 460 prøver annulleres af diverse grunde, som kan ses i tabel 1. Efter 6 timers inkubation, kunne 111 prøver aflæses. Efter 9 timer, kunne 195 prøver aflæses for MEL 10, AMC 30, CPD 10, og S 300. Efter 16 timer var der 215 prøver der kunne aflæses for MEL 10, AMC 30, CPD 10, og S 300. For to af prøverne, lå W 5 og F 100 oven i hinanden og kunne derfor ikke aflæses (tabel 2). Tabel 1: Oversigt over de annullerede Ingen vækst 302 Blandingsflora 60 10 5 (resistens kan ikke aflæses) 2 10 4 (resistens kan ikke aflæses) 13 10 3 (resistens kan ikke aflæses) 50 Andre bakterier 33 Total 460 Tabellen viser antallet af prøver der blev annulleret. Ved ingen vækst har der ikke været bakterier i prøvematerialet og kunne derfor ikke bruges. Ved blandingsflora har mængden af de forskellige bakterier været for stor til at man kunne aflæses resistensen på f.eks. E.coli. 10 5 og 10 4 har der været nok kolonier på bipladen, men der var ikke nok på MH-pladen til at man kunne aflæses resistensen. 10 3 har der ikke været nok kolonier på både bipladen og MH-pladen og vi havde i forvejen afgrænset til at ikke med tage dem. Og andre bakterier har så været når der har været andre bakterier end E.coli og K.pneumoniae. 13
Tabel 2: Antal disks der kan aflæses ved de seks antibiotika, efter 6, 9 og 16 timer 6 timer 9 timer 16 timer MEL 10 111 195 215 AMC 30 111 195 215 CPD 10 111 195 215 S 300 111 195 215 W 5 111 193 213 F 100 111 193 213 I tabellen kan man se hvor mange disks der er blevet aflæst ved hver antibiotikum, for de tre tidsintervaller. Efter 6 timer er der 111 disks der kan aflæses. Efter 9 timer er der 195 disks der kan aflæses ved MEL 10, AMC 30, CPD 10 og S 300. Ved W 5 og F 100 kan der aflæses 193. Efter 16 timer er der 215 disks der kan aflæses ved MEL 10, AMC 30, CPD 10 og S 300. Ved W 5 og F 100 er der 213 disks der kan aflæses. Ud af de 111 prøver der kan aflæses efter 6 timer er 102 udsået med E.coli og 9 med Klebsiella pneumoniae. Af de prøver der kan aflæses efter 9 timer er 10 af dem Klebsiella pneumoniae og 185 E.coli. ud af de 215 prøver der kan aflæses efter 16 timer er 10 af dem Klebsiella pneumoniae og 205 E.coli. Derudover, for at danne et overblik, er dataene sat ind i skemaer der viser afvigelser, for at kunne fortolke dataene bedre. Afvigelserne er beregnet om til procent af det totale antal prøver. Desuden er afvigelserne blevet inddelt i grupperne Very Major Error (VME), Major Error (MAE) og Minor Error (MIE). Den totale afvigelse er når den primære resistensbestemmelse afviger fra den sekundære resistensbestemmelse. Under kolonnen total afvigelse kan man se hvor meget afvigelsen er for hver antibiotika. 14
Tabel 3: Disks aflæst efter 6 timer Sà S Ià I Rà R Sà R Ià R Sà I Rà I Ià S Rà S Total Total (VME) (MIE) (MIE) (MIE) (MIE) (MAE) afvigelse % antal prøver MEL 10 AMC 30 CPD 10 104 0 3 2 0 0 0 0 2 3,6 111 96 0 5 3 0 0 0 0 7 9,0 111 88 0 7 0 0 0 0 0 16 14,4 111 S 300 48 0 40 0 0 0 0 0 23 20,7 111 W 5 77 0 27 2 0 0 0 2 3 6,3 111 F 100 109 0 1 1 0 0 0 0 0 0,9 111 Total 522 0 83 8(1,2%) 0 0 0 2(0,3%) 51(7,7%) 9,2 666 Efter 6 timer kan man se at ud af de aflæste antibiotika disks (n=666) er det 9,2 % der afviger fra den sekundære resistensbestemmelse. 1,2 % (n=8) af dem er VME, 7,7 % (n=51) MAE og 0,3 % (n=2) er MIE. Ud af MAE (n=51) er det CPD 10 (n=16) og S 300 (n=23) der har den største afvigelse. Tabel 4: Disks aflæst efter 9 timer Sà S Ià I Rà R Sà R Ià R Sà I Rà I Ià S Rà S Total Total (VME) (MIE) (MIE) (MIE) (MIE) (MAE) afvigelse % antal prøver MEL 10 AMC 30 CPD 10 184 0 3 6 0 0 0 0 2 4,1 195 176 0 12 3 0 0 0 0 4 3,6 195 171 0 11 3 0 0 0 0 10 6,7 195 S 300 99 0 72 4 0 0 0 0 20 12,3 195 W 5 135 0 51 2 0 0 0 2 3 3,6 193 F 100 187 0 5 1 0 0 0 0 0 0,5 193 Total 952 0 154 19(1,6%) 0 0 0 2(0,2%) 39(3,3%) 5,1 1166 15
Efter 9 timer er afvigelsen af de aflæste antibiotika disks (n=1166) faldet til 5,1 %. Af dem er 1,6 % (n=19) VME, 3,3 % (n=39) MAE og 0,2 % (n=2). MAE er, fra 6 timer til 9 timer, faldet med 4,4 %, og det er CPD 10 (n=10) og S 300 (n=20) der afviger mest ud af MAE (n=39). Tabel 5: Disks aflæst efter 16 timer Sà S Ià I Rà R Sà R Ià R Sà I Rà I Ià S Rà S Total Total (VME) (MIE) (MIE) (MIE) (MIE) (MAE) afvigelse % antal prøver MEL 10 AMC 30 CPD 10 202 0 9 2 0 0 0 0 2 1,9 215 195 0 14 3 0 0 0 0 3 2,8 215 189 0 16 3 0 0 0 0 7 4,7 215 S 300 112 0 85 4 0 0 0 0 14 8,4 215 W 5 149 0 61 1 0 0 0 1 1 1,4 213 F 100 204 0 6 1 0 0 0 0 2 1,4 213 Total 1051 0 191 14(1,1%) 0 0 0 1(0,07%) 29(2,3%) 3,4 1286 Efter 16 timer er afvigelse af de aflæste antibiotika disks (n=1286) faldet med 1,7 % til 3,4 %. Ud af dem er 1,1 % (n=14) VME, 2,3 % (n=29) MAE og 0,07 % (n=1) MIE. Ud af MAE 2,3 % (n=29) er det CPD 10 (n=7) og S 300 (n=14) der har den største afvigelse. Diskussion Formålet med dette projekt var, at finde ud af, hvilken betydning det har for den primære følsomhedsbestemmelse at aflæses hæmningszonerne for Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae efter 6, 9 og 16 timer på urinprøver, udsået direkte på MHplader på KiestrA i forhold til Golden Standard. Og dermed kan få patienter i tidligere antibiotikabehandling. I dette afsnit vil jeg gerne diskutere om det er muligt at aflæse resistensbestemmelser, for E.coli og Klebsiella efter 6-9 timer i forhold til 16 timer, som det gøres på afdelingen. Jeg vil også gerne diskutere udvalgte resultater og om det har nogen indflydelse på om resistensbestemmelserne aflæses før tid. Annullerede prøver ingen vækst 16
I tabel 1 kan der ses, at 460 uf ad 675 prøver blev annulleret. 302 af dem er prøver uden vækst på pladen. 52 af de 302 prøver er praksisprøver. Vi udvalgte specielt praksisprøver der indeholdte E.coli eller K.pneumoniae. Dette burde ikke ske, da vi ved at prøvematerialet indeholder bakterier. Grunden til dette kan være at prøvematerialet ikke blev afpipetteret ordenligt i InoqulA eller at urinprøven ikke blev rystet ordenligt, så bakterierne er faldet til bunds og InoqulA tager prøvemateriale fra overfladen. Dette sætter spørgsmålstegn om InoqulA udsår prøverne korrekt og om andre prøver der ingen vækst har på pladen, i virkeligheden indeholder bakterier. Hvis det er tilfældet, vil det have en konsekvens for, at patienter ikke får en behandling, selvom de har en infektion. 6 timers inkubation I tabel 2 ses der, at ud af 215 prøver der kan aflæses, er der 111 prøver der kan aflæses efter 6 timer. Det er 51,6 % prøver der kan aflæses efter 6 timer. Det vil sige, at ved at benytte denne metode, hvor man aflæser resistensbestemmelser efter 6 timer, vil halvdelen af de patienter, der har en infektion, blive overset og dermed vil de ikke komme i behandling. I artiklen af Weinbren, M. J. et al. [3] er der lavet et forsøg for at undersøge om det var muligt at opdage ESBL producerende bakterier hurtigt i blodkulturer. I dette forsøg blev der taget 22 isolater, af forskellige ESBL producerende Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae og disse blev blandet med hesteblod og derefter inkuberet natten over. De positive kolber blev derefter udsået på Iso- Sensitest agarplader og der blev påsat antibiotikadisks. Forsøget viste at de ESBL-positive bakterier, bortset fra en stamme E.coli, kunne tydligt aflæses efter 3.5-4.6 timer, og at de ESBL-negative bakterier kunne aflæses efter 3.5-5.25 timer. Det forsøgs resultater er meget anderledes end fra dette projekt, hvor ca. halvdelen af de aflæste prøver kunne aflæses efter 6 timer. Forskellen på de to forsøg kunne have en betydning, hvor der er forskel på resistenspladerne og prøvematerialet. Hvor der i det ene forsøg er isolater der blandes op med blod og i vores forsøg er urin fra patienter. Men ifølge Fahim, Q. et al. [4] er ydeevnen for begge plader lige 17
gode. De fleste prøver, der ikke kunne aflæses efter 6 timer, er størstedelen (n=66) 10 4 og resten (n=38) 10 5. Dette tyder på, at kvantiteten af bakterierne har en indflydelse på, hvor hurtigt en prøve kan aflæses. 9 timers inkubation Efter 9 timer, ses der, i tabel 2, at 195 resistensbestemmelser kan aflæses ud af 215. Dette giver en procent på 90,7 %, som er et meget godt resultat, men der er stadig en lille del af positive prøver der vil blive overset. Efter 9 timer er der 20 prøver der ikke kunne aflæses. Alle disse prøver har en kvantitet på 10 4, så igen tyder det meget på, at kvantiteten har en indflydelse på, hvornår en resistensbestemmelse kan aflæses. I Weinbren, M. J. et al. [3] arbejdes der med en bestemt tæthed, McFarland på 0.5, hvorimod de primære resistensbestemmelser i dette forsøg, ikke er standardiseret. Sammenligning med Golden Standard En ting er, om de resistensbestemmelsen kan aflæses, en anden ting er, om det man har aflæst følsomheden til at være, er det korrekte svar. Der blev lavet Golden Standard for at kontrollere om de primære resistensbestemmelser var korrekte. Ved at sammenligne de primære bestemmelser med Golden Standard kan man se, at der er en del afvigelser. I tabel 3 kan man se, at efter 6 timer er der en afvigelse på 9,2 %, ud af dem er 1,2 % (n=8) VME, 0,3 % (n=2) MIE og 7,7 % (n=51) MAE. VME ligger nogenlunde fordelt på de seks antibiotikum, mens størstedelen af MAE er fordelt på CPD 10 14,4 % (n=16) og S 300 20,7 % (n=23). I tabel 4 kan man se, at efter 9 timer er der en afvigelse på 5,1 %, ud af dem er 1,6 % (n=19) VME, MIE er 0,2 % (n=2) og MAE er 3,3 % (n=39). 18
Det antibiotikum med flest VME er MEL og størstedelen af MAE er stadig fordelt mellem CPD 10 6,7 % (n=10) og S 300 12,3 % (n=20). Efter 16 timer kan man se i tabel 5 at afvigelserne er faldet til 3,4 % ud af dem er 1,1 % (n=14) VME, MIE er 0,07 % (n=1) og MAE er 2,3 % (n=29). VME er nogenlunde fordelt mellem de seks antibiotikum og størstedelen af MAE er igen fordelt mellem CPD 10 (n=7) og S 300 (n=14). Afvigelser for 6 og 9 timer er høje for Very Major Error og Major Error og gøre resultaterne for de primære resistensbestemmelser ikke er troværdige. Det man lægger meget mærke til i tabel 3-5 er, at antibiotikaene CPD 10 og S 300 har den største afvigelse i forhold til Golden Standard. Det er især vigtigt at man får de korrekte hæmningszoner for CPD 10, da det er er screeningsdisk for ESBLbakterier (Extended Spectrum β-lactamase enzymproducerende bakterier). Da ESBL er enzymer der har udviklet en resistens overfor antibiotikagruppen β- lactam antibiotika, der f.eks. omfatter cefalosporiner og pencilliner, der er de mest almindelige benyttende antibiotika, er det vigtigt, at det er den korrekte hæmningszone der bliver bestemt. ESBL-bakterier hos raske personer er ufarlige, men hos personer der er svage eller patienter på intensivafdelinger, kan ESBL-bakterier føre til dødsfald, da bakterierne er resistente overfor mange af de almindelig anvendte antibiotika. Det er også derfor vigtigt, at patienter indlagt på sygehuse med infektioner forårsaget af ESBL-bakterier, bliver isoleret, så bakterierne ikke spredes til andre patienter [5]. Derfor er det vigtigt at især CPD 10s hæmningszone er korrekt, da man kan ende med at give en antibiotika, der bliver nedbrudt af bakterierne, som patienten er inficeret af. Dette kan føre til at patienter, der har infektioner med ESBL-bakterier, dør, hvis denne er svag. 19
Faktorer der kan påvirke hæmningszoner Inokulum Til at aflæse hæmningszonerne, er der blevet benyttet et program tilhørende KiestrA. I KiestrA bliver pladerne affotograferet når inkubationen er færdig, og billederne kan ses på computerne tilhørende KiestrA. På billederne kan man afcirkle hæmningszonerne og dermed får man en diameter. Sommetider kan det være svært at se hvor grænsen går og det kan være at man får sat cirklen så den er 1mm større eller mindre end Golden Standard. Det kan være at den 1 mm har gjort, at en antibiotika har skiftet fra f.eks. resistent til sensitiv. Eksempel: AMC (17/17) 15 R 16 R 16 R 17 S Udsåning med InoqulA Da der blev udsået sekundære resistensbestemmelser, blev der det gjort i hånden. Dette blev gjort med kolonier fra den primære resistensbestemmelse og derefter blev der lavet et inokulum med en McFarland på 0.4-0.6, for at få konfluerende vækst på resistenspladen. Man vil opnå konfluerende vækst, da det giver de mest korrekte hæmningszoner. Hvis inokulum er lavt, vil kolonierne ligge for langt fra hinanden og dermed kan hæmningszonerne se større ud og dette kan resultere i falsk sensitiv. Det er det modsatte med et inokulum der er for højt, dette kan resultere i at hæmningszonerne kan være falsk resistente. De sekundære resistensplader blev udsået i hånden og der kunne inokulum kontrolleres, men med de primære resistensplader, der blev udsået på InoqulA, er det en maskine der udsår med 10 µl urin og der er ingen kontrol over tætheden af bakterierne. 20
F.eks. i en af de aflæste prøver med Klebsiella pneumoniae, er hæmningszonen for S 300 resistent, med 6 mm, i den primære resistensbestemmelse. Væksten, på pladen ser meget tyk og meget sammenflydende ud (se billede 1, s. 21). I den sekundære resistensbestemmelse er hæmningszonen for S 300 sensitiv med 20 mm. Dette kan tyde på, at der er for mange bakterier på den primære resistensplade. Billede 1 Primær resistensplade, med Klebsiella pneumoniae, efter 16 timer. Antibiotika Hvis antibiotikadiskene ikke bliver opbevaret korrekt, kan antibiotikaene diffundere ud af diskene. Når diskene så skal benyttes, vil der ikke være antibiotika i diskene eller koncentrationen af antibiotika være for lav. Dette kan resultere i falske hæmningszoner. Det kan også ske, at antibiotikadiskene ikke påsættes ordenligt på agaren og resultere i, at bakterievæksten ikke bliver hæmmet, selvom bakterien måske er sensitiv for antibiotikaen. Eksempel: S3 (15/15) 6 R 6 R 6 R 20 S 21
Konklusion Ud fra resultaterne i projekt, kan det konkluderes at det ikke ville være ansvarligt at aflæses hæmningszoner, på den primære følsomhedsbestemmelse efter 6 timer. Dette skyldes at halvdelen af de prøver, der havde vækst af enten Escherichia coli eller Klebsiella pneumoniae, ikke kunne aflæses efter 6 timer, da der ingen vækst på pladen var. Dette betyder at halvdelen af de patienter der har en infektion ville blive overset og ikke blive behandlet. Det kan have store konsekvenser for patienter med ESBL-bakterier, hvis patienten er meget svag, da det kan føre til dødsfald. Resultaterne efter 9 timer er meget bedre, men enkelte prøver kunne stadig ikke aflæses efter de 9 timer og der for ikke nok til at man kan begynde at aflæse resistensbestemmelserne efter 9 timer. Dette betyder at man ikke kan aflæses de primære resistensbestemmelser for urinprøver med Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae, uden det kan have en konsekvens for patienter med infektioner. 22
Litteratur liste 1. Urinprøver Laboratorieinstruks, KMA Hvidovre Hospital (revisionsdato: 07.11.2011) 2. Resistensbestemmelse, Generelt Laboratorieinstruks, KMA Hvidovre Hospital (revisionsdato: 23.01.2012) 3. Weinbren, M. J. et al. (2005). Rapid detection of extended- spectrum β- lactamase (ESBL)- producing organisms in blood culture. Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2005) 55, 131-132 4. Fahim, Q. et al. (2008). Comparison of two different sensitivity testing agars for detecting methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Journal of the College of Physicians and Surgeons - Pakistan (2008) Jul;18(7), 413-417 5. Toma, Zahra (2008). Cephalosporin- screening og ESBL- detektion. Dbio fagblad (2008) 6, 16-19 Bøger: 6. Degré, Miklos. et al. (2004) Medicinsk mikrobiologi, Gyldendal Akademisk, 2. Udgave, 3. Oplag, s. 158 7. Højby, Niels. (2008) Klinisk Mikrobiologi og Infektionsmedicin, Fadl s Forlag, 3. udgave, 1. oplag, s. 174 8. Degré, Miklos. et al. (2004) Medicinsk mikrobiologi, Gyldendal Akademisk, 2. udgave, 3. oplag, s. 163 Internet links: 9. http://eucast.org/ (6/6-14) 10. https://www.sundhed.dk/borger/sygdomme-a-aa/mave-ogtarm/sygdomme/tarminfektioner/e-coli-tarminfektion/ (6/6-14) 11. http://www.ssi.dk/forskning/forskningsomraader/infektioner/urinvejsinfektion er/klebsiella%20pneumoniae.aspx (6/6-14) 12. http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/pdfs/eucast_files/disk_test_doc uments/slide_show_v_3.0_eucast_disk_test.pdf (6/6-14) 23
13. http://www.google.dk/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=3&ved=0c D0QFjAC&url=http%3A%2F%2Fnet.biolyt.dk%2FpowerPoints%2FS4%2FMik robiologi%2fagardiffusion.ppt&ei=1lgdu5_tf4j_4qtw74gwaq&usg=afqj CNFGegIfM3hCSvy0g8U4xQnIFTcecQ (6/6-14) 14. http://pro.medicin.dk/laegemiddelgrupper/grupper/315712 (6/6-14) 24
25