Hearttype fatty acid binding protein

Hearttype fatty acid binding protein Implementering og validering af analysemetoden til detektion af hjertemarkøren H-FABP Ditte Straarup Christensen Hold 15 Studienr: 155662 Bioanalytikerunderviser Jette Kofod- Nielsen Lektor,cand.scient Karen Hulgaard Antal tegn inkl. Mellemrum: 74.183

Indhold 1. Forord... 5 2. Abstrakt... 6 2.1 Baggrund... 6 2.2 Formål... 6 2.3 Materialer og metoder... 6 2.4 Resultater... 6 2.5 Konklusion... 6 3. Indledning... 7 3.1Baggrund... 7 3.2 Formål... 9 3.3 Problemformulering... 9 3.4 Målformulering... 9 4. Teori... 11 4.1Cobas 6000... 11 4.2 Ishæmiske hjertesygdomme... 11 4.2.1 Hjertet... 11 4.2.2 Akut koronar syndrom... 12 4.2.3 Angina pectoris... 13 4.2.4 Akut myokardieinfarkt... 13 4.3 HsTnT... 14 4.3.1 ctnt... 14 4.3.2 Tolkning... 14 4.4 H-FABP... 15 4.4.1 H-FABP princip Randox... 16 4.5 Validering... 16 5. Materialer... 17 5.1 Apparatur:... 17 5.2 Prøveindsamling:... 17 5.2.1 Søgning af analyserede ctnt prøver:... 18 5.2.2 Finde ctnt glasnr på cobas 6000(PSM)... 18 5.2.3 Søgning af resultat i Labka II... 18 5.2.5 Patientprøver:... 18 Side 2/51

5.3 kalibreringer og kontroller... 19 5.4 Reagens... 20 6. Metode:... 21 6.1 Forsøget:... 21 6.2 Bestilling af kalibreringer og kontroller... 21 6.2.1Kalibrering... 21 6.2.2 Kontroller:... 21 6.3 Metodevalidering... 22 6.3.1 Intermediære impræcision... 22 6.3.2 Referenceinterval... 22 6.3.3 Prøveafsmitning... 22 6.3.4 Genfindingsforsøg... 22 6.3.5 Linearitet... 24 6.3.6 Måleusikkerhedsbudget... 24 6.4 Patientprøver... 24 7. Resultater... 25 7.1 Kontroller og kalibreringer... 25 7.1.1Kalibreringer... 26 7.1.2 Kontroller... 26 7.2 Metodevalideringsresultater... 28 7.2.1Intermediær impræcision... 28 7.2.2 Referenceinterval... 30 7.2.3 Prøveafsmitning... 30 7.2.4 Genfindingsforsøg... 32 7.2.5 Linearitet... 34 7.2.6 Måleusikkerhedsbudget... 34 7.3 Patientresultater:... 35 8. Diskussion... 37 8.1 Diskussion af resultater... 37 8.1.1 Kalibreringer og kontroller... 38 8.1.2 Valideringsforsøg... 38 8.1.3 Patientforsøg... 42 8.2 Diskussion af materiale og metoden... 43 Side 3/51

9. Konklusion... 44 10. Perspektivering... 46 Referenceliste... 47 Side 4/51

1. Forord Til dette bachelorprojekt vil jeg gerne takke alt personale på Regionshospitalet Silkeborg KBA for deres hjælp med indsamlingen af prøvemateriale. Jeg vil også sige en stor tak til afdelingsbioanalytikeren Line Christensen, og kemiker Lise Bjerre Husted for deres fantastiske arbejde med opsætningen af analysen på Cobas 6000. En stor tak skal også gives til It bioanalytiker Hanne Solvejg Pedersen og EKG specialist Jeanett Hollænder Larsen for den nødvendige undervisning i EKG g IT på afdelingen. En særlig tak skal gives til vores kontaktperson og leverandør fra Randox Cardiology Steen Lovmand, som fra start har ydet en stor hjælp til hele projektet, og leveret materialer og de nødvendige oplysninger til forsøget. Man kan sige at dette projekt har rettes fokus på en ny analysemetode til detektion af hjertemarkøren H-FABP og dens muligheder for at blive brugt i rutinen i den nærmeste fremtid, til diagnosticering af AKS. Ditte Straarup Christensen Side 5/51

2. Abstrakt 2.1 Baggrund På nuværende tidspunkt anvendes High Sensitivity Troponin T (hstnt) på klinisk biokemisk afdeling (KBA) RSI, som analysemetode for hjertemarkøren ctnt for patienter indlagt med AKS. En ny analysemetode udviklet af Randox Cardiology kan måske være med til at diagnosticere AKS og AMI tidligere efter smertedebut, og dermed hurtigere få en udredning og rette behandling. 2.2 Formål Formålet med dette bachelorprojekt er at undersøge om H-FABP kan etableres på Cobas 6000, og om denne hjertemarkør kan detekteres tidligere end hjertemarkøren ctnt. 2.3 Materialer og metoder Vi udførte en validering af analysens 6 metoder, dette skulle give os et indtryk af hvor stor usikkerheden og spredningen var på vores resultater. Der blev også udført kalibreringer og kontroller. I kontrollerne undersøgte vi om vores målinger ikke afvej mere end 2SD fra den sande værdi I patientforsøget analyserede vi på 4 forskellige patienter, hvor vi havde baggrund informationer såsom ctnt resultater, diagnose og symptomdebut. 2.4 Resultater I vores kvalitetsforsøg afvej kontrollerne mere end 2SD, men de blev godkendt da vi ikke havde de præcise nedre og øvre værdier specifikt rettet til vores analyseapparat. I vores valideringsforsøg viste analyseresultaterne en lav usikkerhed og spredning, og ingen betydelig bias, eller prøveafsmitning. Desværre kunne vi ikke sige noget konkret ud fra vores patientforsøg, da vi havde nogle problemer med at skaffe det rigtige prøvemateriale. Ud fra de resultater vi havde, så det ud til at H-FABP kan detekteres tidligere end ctnt set ud fra symptomdebut. 2.5 Konklusion Analysemetoden til at detektere H-FABP kunne godt implementeres på Cobas 6000, dog var der nogle fordele og ulemper ved dette. Hvis man så på egnetheden af H-FABP var den ikke særlig specifik i forhold til den nuværende markør ctnt, og inde for det økonomiske kunne H-FABP måske spare penge, ved at bruge færre sengepladser på de mindre sygehuse, altså hvis der blev stillet en diagnose hurtigere. Dog skal man tage hensyn til at, reagenset til metoden desværre var rimelig dyr. En kombination af ctnt og H-FABP kunne være med til at give patienten en hurtigere diagnose, da der så var en høj sensitivitet, i hele tidsrummet fra patienten blev indlagt og frem. Side 6/51

3. Indledning 3.1Baggrund Ved Akut Koronart Syndrom (AKS) kan der ses symptomer som kvalme, kvælningsfornemmelse og brystsmerter evt. med udstråling ud i venstre arm (1). Hvis en borger oplever nogle eller alle af disse symptomer, vil de enten tage til deres egen praktiserende læge, eller ringe til alarmcentralen. Hvis alarmcentralen mener, at der er mistanke om AKS, vil der udsendes både lægeambulance og ambulanceredder for at udrede patienten. Lægen udfører en objektiv undersøgelse, hvor der måles blodtryk, puls og der lyttes på hjertet. Derefter gennemgår de patientens anamnese (2). Hvis der er tegn på AKS, udføres der i ambulancen et elektrokardiogram (EKG), og derefter måles en blodprøve på et Point of Care Testing (POCT) apparat for hjertemarkøren kardialt Troponin T (ctnt) (3), som en hjælp til lægen til patientens videre forløb. EKG et bliver sendt elektronisk til et Telemedicinsk Center. Den vagthavende telekardiologiske læge vurderer om patienten skal indlægges (4). På Regionshospitalet Silkeborg (RSI) bliver medicinsk visiterede patienter med et EKG som viser non-st-elevation (non-stemi), ingen forhøjelse af hjertemarkøren ctnt, men med vedvarende symptomer på AKS, indlagt på Medicinsk Afsnit (M1) til videre udredning (4,5). Ved indlæggelse på M1 udføres der igen et EKG og hjertemarkøren ctnt bliver målt (4). Dansk Selskab for klinisk Biokemi (DSKB) og Dansk Cardiologisk Selskab (DCS) anbefaler, at hjertemarkøren ctnt måles ved ankomst, efter 6-9 timer og yderligere efter 12-24 timer hvis der fortsat er mistanke om AKS og de første to prøver er negative (6). Disse blodprøver er altafgørende, da en hurtig og/eller stor stigning i koncentration af hjertemarkøren ctnt kan være tegn på Akut Myokardieinfarkt (AMI), og vil resultere i anden behandling, hvor patienten bliver videresendt til et hospital med specialafdeling for hjertekirurgi (7). På Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA) RSI anvendes High Sensitivity Troponin T (hstnt), som analysemetode for hjertemarkøren ctnt for patienter indlagt med AKS. Hjertemarkøren ctnt kan detekteres i plasma 3-4 timer efter symptomdebut, og findes i blodbanen i op til 2 uger efter (8). Hjertemarkøren ctnt kan typisk ikke detekteres i blodet i de første 3 timer efter smertedebut, og sensitiviteten vil ikke nå sit maximum før efter 6 timer (9). Det kan være svært for klinikeren at stille diagnosen AMI, da hstnt s diagnostiske grænseværdi øger detekteringen af skader i myokardiet, som ikke er forbundet Side 7/51

med AKS. Derfor kan hjertemarkøren ctnt blive forhøjet af andre sygdomme end AMI, fx nyreinsufficiens, hvor hjertet også bliver overbelastet (6). Dette kan give falske diagnoser for AMI (10). Bachelorgruppen har fundet frem til en ny analysemetode, udviklet af Randox Cardiology, som kan detektere hjertemarkøren Hearttype-Fatty Acid Binding Protein (H-FABP) i plasma 30 minutter efter smertedebut (11). En analysemetode som måske kan mindske de falske diagnoser, forbedre sensitiviteten, og diagnosticere AMI hurtigere efter smertedebut, og dermed hurtigere udredning til den rette behandling. Analysemetoden H-FABP er på nuværende tidspunkt ikke blevet indført i rutinen på nogen hospitaler i Danmark. Kardiologiske afdelinger på Bispebjerg Hospital, Aarhus Universitetshospitalet og Hillerød hospital, har dog udført forskningsprojekter (bilag 1). Derfor undrer vi os over at denne analysemetode endnu ikke er indført i rutinen, og dermed synes vi det kunne være interessant at undersøge om hjertemarkøren H-FABP kan detekteres i plasma tidligere end hjertemarkøren ctnt. Analysemetoden til at detektere H-FABP kan opsættes på mange forskellige apparaturer, bl.a. Cobas 6000 (11). På KBA, RSI, hvor vi skal udføre vores professionsbachelorprojekt, har de i forvejen dette apparatur. Analysen skal opsættes på Cobas 6000, og derefter valideres. Når en ny analysemetode skal tages i brug, skal man ud fra en validering af metoden, kunne konstatere en række tilfredsstillende resultater, inden analysen kan anvendes til medicinsk undersøgelse. Ved validering tager man hensyn til, om metoden er CE-mærket, da diagnostikproducenten så vil have udført dele af valideringen. Analysemetoden H-FABP er CE-mærket, og hvis de dokumenterede egenskaber er tilgængelige fra leverandøren, vil man kunne anvende disse oplysninger omkring valideringen. Inden brug skal eget laboratorium som minimum verificere disse egenskaber: intermediære impræcision korrekthed måleusikkerhed referenceinterval Vi har anvendt vejledninger fra DSKB og den Internationale Organisation for Standardisering (ISO) til at beslutte hvilke metodeegenskaber vi ville undersøge (13). Derudover har vi anvendt KBA, RSI s vejledning (14). Side 8/51

3.2 Formål Vi vil i projektet undersøge om H-FABP kan etableres på Cobas 6000, og ved hjælp af en metodevalidering vil vi undersøge om metoden kan opfylde de opstillede krav. Herudover vil vi undersøge, om hjertemarkøren H-FABP kan detekteres i blodet tidligere end hjertemarkøren ctnt. 3.3 Problemformulering Hvilke fordele og ulemper vil det give hvis analysemetoden H-FABP implementeres på KBA RSI? Hvilke muligheder vil det åbne, hvis analysemetoden H-FABP og hstnt anvendes sammen til diagnosticering af patienter som er indlagt på M1, RSI med AKS? 3.4 Målformulering 1.1: Vi vil opsætte analysemetoden H-FABP på Cobas 6000 med hjælp fra afdelingsbioanalytikeren med ansvar for Cobas 6000. 1.2: Vi vil udføre 6-punkts kalibrering for at beskrive sammenhængen mellem det målte signal og koncentrationen af hjertemarkøren H-FABP 1.3: Vi vil kvalitetssikre analysemetoden ved at: 1. udføre daglige kontroller på en høj og lav værdi (før og efter analysering af prøver for H-FABP) 1.4: Vi vil opstille følgende krav til metoden: 1. at analysemetoden H-FABP på Cobas 6000 c501 kan detektere H-FABP 2. at den intermediære impræcision omkring referenceintervallet ikke er for høj 3. at der er linearitet i området omkring referenceintervallet 1.5: Efter gennemgang af vejledninger (15,16) til metodevalidering, har vi udvalgt nedenstående egenskaber til validering, som vi mener, er relevante i forhold til vores projekt om analysemetoden H-FABP. Vi vil: 1. undersøge den intermediære impræcision ved at analysere kontroller i 2 koncentrationsniveauer 2. udføre et genfindingsforsøg for at undersøge korrektheden 3. verificere Randox s referenceinterval ved 95 % < 3,55 ng/ml og/eller 99 % < 6,32 ng/ml 4. undersøge lineariteten omkring referenceinterval 5. undersøge prøveafsmitning Side 9/51

1.6: Hvis analysemetoden opfylder kravene som er opstillet i punkt 1.4, vil vi udføre et måleusikkerhedsbudget, som klinikeren kan bruge til at vurdere patienternes resultater dvs. resultaterne som er analyseret for hjertemarkøren H-FABP fra KBA (14) 1.7: Vi vil indsamle allerede analyserede ctnt-blodprøver. Herefter vil vi: 1. udvælge patientprøver, vha. LABKA II, fra patienter som har været/er indlagt på M1, RSI til observation for AMI, hvor første blodprøve er negativ, dvs. under referenceintervallet, som er < 14 ng/l (8) med stigning i de efterfølgende blodprøver 2. analysere de ovenstående negative blodprøver (1.7.1) for koncentrationen af hjertemarkøren H-FABP i plasma 3. vurdere om frigivelsen af hjertemarkøren H-FABP til blodbanen kan detekteres tidligere end frigivelsen og detektion af hjertemarkøren ctnt Side 10/51

4. Teori 4.1Cobas 6000 Dette analyseapparat består af to typer moduler. Det ene er c 501 modul, fotometrisk måleenhed, det anden e 601 modul electrochemilluminescense (ECL). På disse to moduler bliver der analyseret mange forskellige analyser på forskelligt materiale såsom serum, plasma, urin og cerebrospinalvæske (CSF). Arbejdsområdet strækker sig over immunologi og klinisk kemiske analyser. (14) På cobas 6000 e 601 modul bliver der bl.a. analyseret high sensittivity troponin T(hsTnT) som analysemetode for hjertemarkøren ctnt. Og c 501 modulet kan anvendes til en ny analysemetode udviklet af Roche Cardiology, den kan detektere hjertemarkøren hearttype- fatty acid binding protein (H-FABP).(15) 4.2 Ishæmiske hjertesygdomme Ishæmiske hjertesygdomme er betegnelsen for åreforkalkning i hjertets kranspulsårer, og kan skyldes aflejring af kolesterol i kranspulsårens væg. Dette vil mindste kranspulsårernes indvendige diameter, og der kan opstå tilstande som akut angina pectoris eller Akut myokardieinfarkt.(16) I 2010 fandtes der ca. 200.000 mennesker i Danmark som har en ishæmiske hjertesygdom(17) 4.2.1 Hjertet Hjertet er en kraftig muskel, der fungere som en central pumpe, som sørger for at den vigtige blodforsyning når ud til alle kroppens dele. Hjertet er delt op i fire kamre, to forkamre og to hjertekamre. Hjerteforkamrene indeholder ikke meget muskel, da væggene er meget tynde. Det er hjertekamrene der er den egentlige pumpe, den sørger for at føre blodet ud til lungerne og resten af kroppen. (18) Det såkaldte iltfattige blod føres tilbage fra alle dele af kroppen, og samles i højre forkammer. Derfra bliver det transporteret ned i højre hjertekammer, herfra pumpes det ud i lunkekredsløbet, via den store lungepulsåre. I lungerne forgrener lungepulsåren sig i mindre pulsårer, disse ender i en stor mængde af små hårrør,(kapillærer) disse hårrør omkranser de mikroskopiske luftblæner (alveoler) i lungerne. På den måde vil erytrocytterne komme i nær kontakt den iltholdige indåndingsluft i alveolen, og ilten optages på denne måde i de helt små blodårer, som til sidst samles til store blodårer. Disse Side 11/51

blodårer ender i venstre forkammer, og føres videre til venstre hjertekammer, derfra pumpes det iltede blod via hovedpulsåren(aorta) ud i hele kredsløbet. Fordi hjertet er en muskel der arbejder uafbrudt, behøver den konstant tilførsel af ilt og næring.(18) På højre side af hovedpulsåren afgår to kranspulsårer, (højre og venstre koronararterie) disse forløber på ydersiden af hjertemuskulaturen, de deler sig herefter i mindre grene, som kan trænge ind i hjertemuskulaturen, og sørge for blodforsyning til alle dele af hjertet. (18) 4.2.2 Akut koronar syndrom Akut koronar syndrom som forkortes AKS dækker over en samlet betegnelse af forskellige grader af skade i hjertet. Dette er hyppigst forsaget af åreforkalkning eller en rift/skade på indersiden af koronararterien med dannelse af blodprop(trombe). Der kan både være tale om en real blodprop i hjertet stor, eller lille. Det kan også være en såkaldt truende blodprop altså advarselssignaler om at der er noget galt. Symptomerne kan være alt fra brystsmerter, med udstråling i armen, kvælningsfornemmelse, kvalme eller træthed.(1) Som jeg nævnte tidligere vil åreforkalkningen typisk være i koronararterierne eller kranspulsårerne. Det er disse blodårer der forsyner hjertemusklen med iltet blod. Hvis der sker en forkalkning eller forsnævring vil blodstrømmen i disse blodårer blive utilstrækkelig, specielt under fysisk aktivitet, hvor hjertet bliver belastet.(1) Inde under betegnelsen AKS kan man sige der hører tre tilstande ind under: Ustabil angina pectoris Myokardieinfarkt med EKG fund af ST elevation (STEMI) Myokardieinfarkt med EKG fund af ingen ST elevation (non STEMI) Dvs. AKS kan udvikle sig i forskellige retninger, enden som en lille eller stor blodprop eller en forløber til dette. Udfaldet afhænger også af hvilken koronararterie der bliver forsnævret, da forskellige dele af hjertemuskulaturen bliver forsynet med iltholdigt blod fra hver deres arterie. Figur 1: hjerte med iskæmi i venstre kranspulsåre. Side 12/51

Ca. 9000 personer i Danmark rammes årligt af AKS. Forekomsten af nye tilfælde er ganske stabil de seneste år(1) 4.2.3 Angina pectoris Angina pectoris eller hjertekramper kan skyldes mangel på ilt og næringsstoffer til hjertets muskulatur, dette kan skyldes forsnævring af blodkar der forsynder hjertes muskulatur. Angina pectoris kan opdeles i stabil og ustabil. Stabil opstår når hjertes muskulatur arbejder hårdt, f.eks. ved løbetur eller andet fysisk hårdt arbejde. Ustabil angina pectoris opstår hvis tilstanden forværres, dvs. hvis du får denne tilstand når du ikke anstrenger dig. Dette kan være en tidlig forløber for en egentlig blodprop i hjertet.(18) Årsagen til angina pectoris er at hulrummet i koronararterierne, kan med årerne blive mindre på grund af aflejringer på indersiden af blodkarrene, enden på grund af aterosklerose eller arteriosklerose. Dette betyder at mindre mængder blod kan strømme gennem arterierne over et vist tidsrum. I hviletilstand, eller når vi anstrenger os er dette ikke noget problem. Problemet opstår hvis vi anstrenger os, og blodstrømmen bliver for lille til at de forskellige områder af hjertet, så musklen ikke får tilstrækkelig med ilt og næringsstoffer. Symptomerne er brystsmerter i op til 15 min varighed.(18) 4.2.4 Akut myokardieinfarkt Akut myokardieinfarkt forkortes AMI eller MI hvis det er myokardieinfarkt. AMI betegnes som en blodprop i hjertet. Dette er den forværrede tilstand af akut angina pectoris dvs. hvor forsnævringen i koronararterien, har ført til en tillukning af en koronararterie, eller dens forgreninger. Tillukningen fører til utilstrækkelig blodforsyning og dermed skade på en del af hjertet. Graden af skade afhænger af hvilken blodåre som forsynder hjertet er blokeret. (19) Blodproppen som forsnævringen danner i koronararterien kaldes også en trombose, denne trombose, gør at den del af hjertemusklen som modtager blod fra koronararterie svækkes og dør, afhængig af blodproppen størrelse. Over dage og uger erstattes det døde væv af arvæv, dette mangler evnen til at trække sig sammen. Efter en stor blodprop kan hjertet blive permanent svækket, omfanget af svækkelsen afhænger af hvor meget muskelvæv der er gået tabt. Symptomerne kommer pludseligt, hvor du kan føle en klemmende eller snørende smerte i brystet, ofte med udstråling i venstre arm, hals eller underkæbe. Årligt bliver der registreres 10.000-15.000 tilfælde af myokardieinfarkt i Danmark.(19) Side 13/51

4.3 HsTnT Analysen High Sensitivity Troponin T(hsTnT) er et immunoassay, til in vitro bestemmelse af kardinalt Troponin T I både serum og plasma. Analysen kan bruges som et hjælpemiddel til diagnosen af akut koronar syndrom(aks) Det kunne være ved identifikation af nekrose i tilfælde af akut myokardieinfarkt. Analysen kan også anvendes til patienter i risikogruppen for AKS, eller kronisk nyreinsufficiens. Måleprincippet som er nævnt tidligere er electrochemilluminescense (ECL)(8) 4.3.1 ctnt Troponin T(TnT) er et protein i den tværstribede muskulatur. Funktionen af TnT er ens i alle de tværstribede muskler, kardinal Troponin (ctnt) adskiller sig tydeligt fra f.eks. TnT i skelet muskulaturen. Forskellen ses i den høje vævs specificitet som kun ctnt har. Ud fra det kan man sige at den er kardio specifik, og kan beregnes som en meget sensitiv markør for skader i myokardiet. Hvis vores hjerte på en eller anden måde tager skade vil ctnt blive frigivet ud i vores blodstrøm. ctnt koncentrationen stiger 3-4 timer efter symptomdebut, ved f.eks. myokardieinfarkt(ami) det kan forblive i blodbanen i op til 2 uger efter. (8) I de tilfælde hvor ctnt kan have en afgørende rolle i diagnosticeringen af patienten, er i tilfælde med MI med en EKG der viser non STEMI. Her er resultatet af ctnt meget afgørende for en diagnose, og en hurtig behandling. CTnT er en uafhængig prognostisk markør, dvs. den kan bruges til at forudsige resultater på kort, og langt sigt ved patienter med AKS. Lave koncentrationer kan dog også påvises hos klinisk stabile patienter med iskæmisk, eller non iskæmisk hjertesygdom, patienter med diabetes, sepsis og nyresvigt.(8) 4.3.2 Tolkning Som det er nævnt tidligere anvendes denne analyse til diagnosticering af AMI. Referenceintervallet ligger på: 18 år 200 år: <14 ng/l. ved vurdering af ctnt resultaterne skal koncentrationen falde eller stige signifikant fra første til anden måling, for at ctnt kan tages som udtryk for AMI. Ved værdier tæt på den diagnostiske grænseværdi 14 ng/l kræves der en stigning på minimum 50 % før dette anses som signifikant. (20) Side 14/51

Ved et ukompliceret AMI begynder ctnt typisk at stige 3-10 timer efter symptomdebut, og når sit maksimum efter 15-20 timer. Som jeg har nævnt tidligere kan ctnt, forblive i blodet op til 2 uger efter symptomdebut, men ved et større og mere alvorlig AMI kan ctnt værdierne forblive forhøjet i mere end 2 uger. Hvis der ses en signifikant stigning i ctnt værdier kræves diagnosen AMI, også klinisk evidens for myokardie iskæmi, det kan være symptomer, EKG ændringer eller billeddiagnostiske kendetegn. (20) 4.4 H-FABP Heart- type fatty acid binding protein (H-FABP) er et lille cytosolisk protein(12-15kda), det findes i store mængder i væv med aktiv syre stofskifte herunder myocardium. H-FABP er særlig vigtig for den myocardial homostase fordi 50-80 % af hjertes energi, fås via lipid oxidation, og her spiller H-FABP en vigtig rolle, da det er dette protein som transportere de uopløselige fedtsyrer fra cellemembranen, til mitrokondierne for oxidation. Diagnosticering og udelukkelse af akut koronar syndrom(aks) deriblandt myocardiel infarktion (MI) og ustabil angina pectoris (UA) udgør ofte en diagnostik udfordring for klinikerne. Dette kan føre til forøget sygelig, og i nogle tilfælde dødelighed for patienter med AKS. Dette kunne være undgået med optimal behandling i rette tid. Den nuværende biomarkør kardinal tromponin(ctnt), har været den fortrukne indtil nu, men pga. den forsinkede reaktion i serum og plasma er den ikke så pålidelig. (21) Igangværende studier er kommet frem til at H-FABP muligvis kan være en potentiel markør ved tidlige tilfælde af AKS. Det er blevet bevidst at efter myocardie cellebeskadigelse diffunderer H-FABP hurtigere ud i blodbanen, end ctnt og kan måles i blodcirkulationen så tidlig som 90 minutter efter symptomerne, og når sit højdepunkt inden for 6 timer. Det er dog ude af blodbanen igen efter 24 timer. Disse funktioner ved H-FABP gør den til en fremragende kandidat markør for myocardieskade. Nyere data og resultater tyder på at den kan give en tidligere diagnose end ctnt i de tidlige timer af akut koronar syndrom (AKS) og myocardial infarction (MI) (21,22) Figur 2: Denne graf viser tiden for hvornår de forskellige hjertemarkører kan måles i blodbanen Side 15/51

Biomarkøren H-FABP er ikke blevet taget i brug i rutinen i Danmark endnu, men i juli 2010 blev målingen af H-FABP godkendt i Japan til diagnosticering af tidlig myokardieinfarkt(mi)(22) 4.4.1 H-FABP princip Randox Buffer og anti-h-fabp(lagret på latex) tilsættes til en patientprøve, og der sker en reaktion. Dannelsen af antistof/antigen (antigen er patientprøve) under reaktionen resulterer i forøgelse af uklarheden. Graden af dette måles ud fra hvor meget lys er absorberet af 700nm. Ud fra vores standardkurve som er lavet ud fra kalibreringsserie kan vi ud fra den målte absorbans måle koncentrationen af H-FABP i patientprøven. (bilag 2) 4.5 Validering Ved validering bekræfter man ved undersøgelse og objektiv vidnesbyrd, at de specielle krav til den givne anvendelse er opfyldt. Disse krav er dem som bliver stillet i den tekniske og kliniske sammenhæng, hvori metoden anvendes.(13) Laboratoriet skal validere ikke standardiserede metoder, selvudviklede metoder og standardiserede metoder, hvis de anvendes uden for deres utilsigtede anvendelsesområde. Valideringen vil give laboratoriet en bekræftelse på at metoden er egnet til det givne formål. Efter validering skal laboratoriet registrere de fundne resultater, proceduren der er anvendt, og hvorvidt metoden er egnet til formålet inden den kan verificeres til medicinsk undersøgelse. Der kan være forskel på hvor omfattende en validering, man skal udføre på en bestemt metode/procedure.(13) Siden december 2003 har diagnostikproducenten været forpligtet til selv at udføre en omfattende validering, hvorfra laboratoriets egen praktiske undersøgelser kan reduceres. Et af de tilfælde er hvis analysen er CE - mærket. Dette betyder at metoden er valideret af leverandøren til det opstillede formål. Ved CE - mærkede analyser er det normalt tilstrækkeligt at udføre en verifikation af om leveret udstyr/analysemetode lever op til de opstillede krav. Som det blev nævnt tidligere kræves det også at der ved CE- mærkede analyser bliver verificeret bestemte punkter inden analysen kan tages i brug. Side 16/51

Hvis analysen ikke er CE mærket udføres der en fuld validering, det indebærer validering af: metrologisk sporbarhed måleinterval detektionsgrænse analytisk specificitet linearitet robusthed afsmitning præanalytiske forhold dette gøres også ved CE mærkede analyser, som på nogen måde brydes ved anvendelsen eksempelvis hvis kit udføres på et andet instrument, end det producenten har valideret. (13) 5. Materialer 5.1 Apparatur: Til måling af H-FABP koncentration anvendes Cobas 6000 fra Roche Diagnostics. Reagenser, kontroller og kalibreringer er købt via Randox Cardiology. 5.2 Prøveindsamling: Forsøget blev påbegyndt med indsamling af prøvemateriale, fra d. 1 marts til slutningen af maj. Indsamlingen i de første par uger blev udført af 1 gruppemedlem, som i den periode var i praktik på afdelingen. Da gruppen var blevet samlet fra d. 17 marts blev indsamlingen udført af alle medlemmer, med hjælp fra afdelingens bioanalytikere. Prøvematerialet var analyserede hstnt prøver på Cobas 6000, taget i heparin prøvetagningsrør.(8) I prøveindsamlingsperioden var der lagt en forespørgsel, og vejledning ud i laboratorierne, så afdelingens bioanalytikere kunne hjælpe med prøveindsamlingen i de timer hvor gruppen ikke var til stede. (bilag 3)Hjælpen fra afdelingens bioanalytikere var meget vigtig, da troponin T hs prøver kun kunne holde sig 8 timer i køleskabet ved 20-25 C (23) Side 17/51

5.2.1 Søgning af analyserede ctnt prøver: I laboratoriet fik vi en bioanalytiker til at logge ind på Labka II, da studerende ikke har adgang til resultatet for godkendte prøver. Analyseplads godkendelse søgekriterier(ret dato og tid+ ving alle af) ok sorter efter tidspunkt først sortere analyser find ctnt. Glasnr på ctnt skrives ned tryk på godkendelse igen (dato og tid retter sig tilbage til det rigtige) ret fra alle til godkendelse til sidst 5.2.2 Finde ctnt glasnr på cobas 6000(PSM) Workarea glasnr på ctnt prøve del af maskinen og rack prøven står på Prøverne findes på de anførte rack halvdelen af plasmaet afpippeteres over i et andet glas med prøvens glasnr på. den originale ctnt prøve sættes tilbage i det samme rack som det stod i. Det afpippeterede plasma sættes i fryseren. (23) Efter hver prøveindsamlingsrunde søgte vi i Labka II efter ctnt resultat. Vores bedste ctnt resultat var en negativ værdi som senere steg kraftigt i løbet af nogle timer. 5.2.3 Søgning af resultat i Labka II Søg svar skriv glasnr. resultat skrives på stregkoden fra afpippetringsglas - søg - søg på CPR nr kumuleret søgning TnT markør findes sortere andre prøve resultater fra ved at markere TnT og tryk sortere andre prøver fra. resultat printes I slutningen af maj blev der stoppet med at indsamle analyserede ctnt prøver, der havde vi 419 prøver, hvor mange af dem var fra de samme patienter. Undervejs havde vi udskrevet resultaterne på disse prøver. Vi sorterede prøverne efter deres koncentration af ctnt i første og anden prøve. Vi havde nogle problemer med at finde patienter den rigtige koncentration af ctnt og efterfølgende stigning. 5.2.5 Patientprøver: I første sorteringsrunde fik vi udvalgt 10 patienter med enden lav ctnt for første prøve, og efterfølgende kraftig stigning i anden prøve, eller høj ctnt og meget kraftig stigning. For at indsnævre patientantallet yderligere, og finde de patienter med den rigtige diagnose og symptomdebut, opsøgte vi personalet på medicinsk afdeling M1 med en Side 18/51

forespørgsel.(bilag 4) Vi håbede på at kunne få oplysninger såsom diagnose, og symptomdebut på disse 10 patienter, som selvfølgelig ville blive anonymiseret i opgaven. Ud fra disse oplysninger kunne vi sortere 6 ud af de 10 patienter fra, fordi diagnosen ikke havde relation til en tilstand i hjertet, som vi skulle bruge for at kunne konkludere noget ud fra vores H-FABP resultater. 5.3 kalibreringer og kontroller Som kontrolmateriale til analysering af H-FABP på cobas 6000 anvendes H-FABP kontrol niveau 1(lot nr. 052FB) og 2(lot. Nr. 053FB) fra Randox Cardiology. Inden brug skulle kontrollerne klargøres ifølge Randox, det var den samme fremgangsmåde både ved niveau 1 og 2. Denne kan ses i (24,25) Vi modtog 3 flasker af kontrol 1 og 2 fra Randox Cardiology, der var 1 ml i hver. For at undgå spild fra de oprindelige flasker samlede vi de tre flasker af hver kontrol i en engangskop og fordelte 1 ml materiale i 3 cobaskopper. Kontrol 1 værdi: 5,31 ng/ml 3,98 6,64 ng/ml (24) Kontrol 2 værdi: 31,30 ng/ml 25,04 37,56 ng/ml (25) Til kalibrering af Cobas 6000 i forbindelse med analysering af H-FABP anvendes H-FABP kalibrerings serie fra Randox Cardiology. Inden brug skulle kalibreringerne klargøres. Fremgangsmåden kan ses i analyseforskrift Sibka- Fremstilling af kalibratorer til Cobas 6000 E-modul (26) Under fremstillingen var vægten meget upræcis pga. statisk elektricitet, dette forbedrede vi ved afelektricificere vægten med en jernsaks. Kalibrerings værdier: Std. No Lot.No Koncentration Udløbsdato 1 065FB 0,00 ng/ml 2015-10 2 066FB 7,10 ng/ml 2015-10 3 067FB 12,28 ng/ml 2015-10 4 068FB 26,39 ng/ml 2015-10 5 069FB 55,20 ng/ml 2015-10 6 070FB 112,91 ng/ml 2015-10 Side 19/51

5.4 Reagens Til analysering af H-FABP på Cobas 6000 c modul anvendes der sodium azide som buffer og antistof reagens, som består af monoklonalt mus antistof rettet mod H-FABP.(bilag 2) Afdelingsbioanalytikeren udregnede mængden vi skulle bruge af hver komponent, da hun opsatte analysen. Da vi skulle overføre vores buffer og reagens i nogle bestemte flasker der passede på Cobas 6000. Vi skulle tage hensyn til at der var dødvolume, så ud af de 100 test vi fik fra Randox, havde vi kun 85 test som vi kunne bruge. Under udregninger blev ligninger for reagens R1 og R3 brugt fra analyseforskrift cobas c pack multi (bilag 5) Udregning af antal test til rådighed med hensyn til dødvolume N = antal test Udregning af mængde buffer der skulle påfyldes i flasken. Udregning af mængde reagens der skulle påfyldes i flasken. Side 20/51

6. Metode: 6.1 Forsøget: Dette forsøg er bygget op som et klinisk forsøg, der undersøger muligheden for implementering af hjertemarkøren H-FABP, som undersøgelsesmetode for patienter med mistanke for AKS ved Regionshospitalet Silkeborg (RSI). Ved opsætningen af denne analyse på Cobas 6000 fik vi hjælp af afdelingsbioanalytikeren, og en medarbejder fra Roche Diagnostics. I løbet af dette forsøg udførte vi forskellige metodevalideringsforsøg og analysering af patientprøver, og vurdering af kalibreringer og kontroller, for at kunne konkludere om analysen kunne bruges på afdelingen. 6.2 Bestilling af kalibreringer og kontroller 6.2.1Kalibrering Inden vi kunne analysere kalibreringsserier og kontroller på Cobas 6000 skulle de bestilles. Fremgangsmåden kan ses i apparaturforskrift SIBKA-Cobas 6000 under manuel bestilling af kalibreringer(27). Vores kalibreringsserie blev ophældt i cobaskopper, og placeret i et sort kalibreringsrack som angivet i calibration load list. Vores første kalibrering blev ikke gennemført, da der under opsætningen var sket en fejl, i placeringen af de forskellige niveauer i kalibreringen. Den næste kalibrering vi udførte blev godkendt. 6.2.2 Kontroller: Vi skulle også bestille vores kontroller manuelt inden de kunne analyseres. Fremgangsmåde ses i apparaturforskrift SIBKA-Cobas 6000 under manuel bestilling af kontroller(28). Vi udførte 2-3 kontroller hver dag i niveau 1 og 2. Side 21/51

6.3 Metodevalidering 6.3.1 Intermediære impræcision Dette forsøg blev udført samtidig med vores daglig analysering af kontrol 1 og 2, ifølge vores vejledning (13) skulle vi mindst have 15 målinger af hver kontrol, for at kunne sige at resultaterne var pålidelige. Ud fra de 30 kontrolmålinger beregnede vi SD og CV %. Dette vil kunne fortælle os noget om spredningen mellem vores resultater og området omkring vores referenceinterval. Efter udregning af SD kunne vi også opsætte nye nedre og øvre værdier for vores kontroller, som passede specifikt til vores forsøg. 6.3.2 Referenceinterval Vi kunne allerede fra starten af forsøgsperioden udregne at vi ikke havde nok reagens til at lave vores egen referenceinterval, så vi bestemte os for at bruge Randox 95 percentile interval, til vurdering af vores patientresultater. Dette interval ville vi verificere først ved at måle på flere raske personer, hvori resultaterne helst skulle ligge i den raske kategori. Vi tog blodprøve på to af gruppemedlemmerne studerende 1 og 2, og analyserede på dem. (13) 6.3.3 Prøveafsmitning I prøveafsmitning analyserede vi prøver med en koncentration i rækkefølgen: 3*lav koncentration, 3* høj koncentration, 3*lav koncentration. Vi brugte plasma med en lav koncentration af H-FABP fra to af gruppemedlemmerne. Plasma til den høje koncentration fik vi fra patient 3 som havde en høj koncentration af ctnt i anden prøve, her måtte vi gå ud fra at H-FABP også var høj, da vi desværre ikke havde nok reagens til at analysere først. Vi udførte prøveafsmitning for at undersøge om der var afsmitning fra prøver med koncentration lav til høj og høj til lav koncentration, og om der var afsmitning imellem de enkelte målinger. Dette gjorde vi med hjælp fra vores udregnede SD. (13) 6.3.4 Genfindingsforsøg I Dette forsøg ville vi lave 4 fortyndinger som spredte sig nogenlunde omkring vores referenceinterval. Vi startede med at udvælge en prøve med en høj koncentration af H- Side 22/51

FABP og en med lav. vi valgte at bruge de samme personer som i prøveafsmitning, da vi havde tre resultater i forvejen. Den høje koncentration blev patient 3, hvor vi i forvejen havde tre H-FABP resultater. Ved den lave koncentration kunne vi vælge mellem studerende 1 og 2 da de begge havde en lav H-FABP. Det endte med at vi beregnede SD på studerende 1 og 2 H-FABP resultater da vi gerne ville have den med den laveste SD. Ud fra beregningen brugte vi studerende 1 som lav koncentration.(bilag 6) Prøve: Volume: H-FABP resultater Studerende 1 5 ml 2,48, 1,96, 2,24 ng/ml Patient 3 900 µl 32,38, 33,68, 33,72ng/ml Studerende 2 5 ml 1,11, 1,78, 1,48ng/ml Tabel: 1Det med grønt, er de personer og resultater vi har brugt. Gennemsnit af SD af resultater resultater 2,22 ng/ml 0,26 33,26 ng/ml 0,76 1,46 ng/ml 0,34 Som det kan ses i tabel 1 beregnede vi også gennemsnittet på de tre målinger analyseret i prøveafsmitning, da det er denne værdi vi senere ville bruge i vores fortyndinger. Det der også var meget vigtig i dette forsøg var hvor meget materiale vi havde at arbejde med, da vi jo selvfølgelig havde mere ved den studerende end ved patienten. Næste skridt var at lave en fortyndingsrække for både den lave koncentration og den høje, så vi kunne beregne den sande værdi for hver fortynding. Studerende 1: Patient 2: Ud fra disse fortyndingsrækker kunne vi på en overskuelig måde lave 4 fortyndinger med deres sande værdi så tæt omkring vores referenceinterval som muligt, og stadig være sikker på at vi havde nok plasma. Fortyndinger: 1: 2: 3: 4: Side 23/51

Formålet med dette forsøg, var at se hvor meget analysen kunne genfinde af den sande værdi, når vi analyserede på de 4 fortyndinger. Ud fra disse tal ville vi beregne korrektheden i form af bias. (bilag 6) 6.3.5 Linearitet I dette forsøg ville vi undersøge om der var linearitet omkring vores referenceinterval. Dette gjorde vi samtidig med at vi udførte vores genfindingsforsøg dvs. vi brugte de målte værdier fra de 4 fortyndinger og deres sande værdi til at lave et X/Y plot. Denne graf ville kunne vise os om der var linearitet omkring vores interval, da det er det område som er vigtigt ved analysering af patientprøver. (13) 6.3.6 Måleusikkerhedsbudget Dette forsøg udføres ikke som et klinisk forsøg i laboratoriet, men som udregninger i Excel. I udregningen kan vi bruge 4 bidrag. Præanalytiske bidrag bliver fundet i artiklen U. Gerdes Blodprøvetagning som kilde til præanalytisk variation, Klinisk biokemi i norden Analytiske bidrag dette bidrag fik vi under vores intermediære impræcision i form af enden SD eller Cv %.(31) Kalibreringsbidrag Fik vi fra Randox producenten Biasbidrag - fik vi fra vores genfindingsforsøg SDmåle= (29) Der udregnes to resultater, en for den lave kontrol og en for den høje. Med dette resultat kan man give et mål for i hvilken udstrækning klinikeren kan have tillid til resultaterne fra KBA. 6.4 Patientprøver Som jeg beskrev i mit materiale afsnit, fik vi til sidst udvalgt 4 patienter som havde diagnose, symptomdebut og den rigtige ctnt koncentration i deres første prøve, som passede til hvad vi gerne ville undersøge. Vi analyserede de 4 patienters H-FABP koncentration i deres første prøve, efter de blev indlagt. Vi havde desværre ikke nok reagens til at undersøge deres senere prøver. Disse Side 24/51

resultater vil blive sammenlignet med timerne siden symptomdebut, og om deres resultat ligger over, eller under referenceintervallet, og indtegne dette i en graf. Vores patientprøver skulle bestilles manuelt inden analysering. Fremgangsmåden kan ses i apparaturforskrift SIBKA-Cobas 6000 under manuel bestilling på Cobas 6000 uden barkode(30) 7. Resultater 7.1 Kontroller og kalibreringer I dette bachelorprojekt implementerede vi analysen H-FABP på Cobas 6000. For at bevise at apparatet godt kunne analysere dette protein udførte vi kalibreringer, kontroller, og metodevalidering inde for 6 metoder. Vores fokuspunkt var at bevise at denne nye analyse kunne analysere F-FABP koncentrationer over hele vores referenceinterval, og hvor stor en usikkerhed analysen og resultaterne var beskæftiget med. Vi undersøgte også 4 forskellige patienter med diagnosen UA eller AMI, for deres H-FABP niveau ved indlæggelse. (bilag 7) Side 25/51

Absorbans Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen Ditte S. Christensen 7.1.1Kalibreringer Ved kalibreringer anvendes dobbeltbestemmelse til at finde absorbansen af de 6 kalibreringer som vi satte på apparatet. kalibreringen beskriver sammenhængen mellem det målte signal og koncentrationen af hjertemarkøren H-FABP. På grund af den dårlige kvalitet af kalibrerings linje fra apparatet konstruerede jeg en graf i Excel med middelværdien af de dobbeltbestemte absorbanser, i forhold til koncentrationen af de tildelte kalibreringsværdier. 5000 4000 Kalibrering 2 bestået y = 36,766x + 185,4 R² = 0,9758 3000 2000 1000 0 0 20 40 60 80 100 120 Tildelte kalibrering værdier Kalibrering 2 bestået Linear (Kalibrering 2 bestået ) Figur 3: Vurdering af kalibrering kurve. Der ses i denne graf en relativ ret linje, dette giver sig udtryk i R 2, da dette tal skal ligge så tæt på 1 som muligt. X - aksen angiver de tildelte kalibreringsværdier og y - aksen angiver absorbansen. Vores første kalibrering blev ikke godkendt, da der var sket en fejl ved opsætningen af forsøget. Dvs. at de forskellige kalibreringer blev sat i de forkerte pladser i racket, det resulterede i at apparatet analyserede i den forkerte rækkefølge. (bilag 8 ark 1) 7.1.2 Kontroller Til analysering af kontroller anvendte vi H-FABP kontroller niveau 1 og 2. Disse koncentrationer blev sat ind i et Levey-Jennings-kontrolkort, hvor man kunne holde øje med om kontrollerne spredte sig mere end 2SD fra den sande værdi. Kontrollerne er med til at kontrollere at vores kalibrering kurve stadig er aktuel for analysering. Både den sande værdi og den nedre og øvre værdier fik vi fra producenten Randox sammen med analysekittet. Side 26/51

kontrolmålinger Kontrolværdier Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen Ditte S. Christensen kontrol 1 (lav) 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 2 4 6 8 Dage kontrol 1 nedre værdi øvre værdi Middelværdi Figur 4: Vurdering af kontrolkort for kontrol 1. X - værdien angiver antallet af dage kontrollerne er taget over, og Y - aksen angiver de målte kontrolværdier. Som det kan ses i dette figur 2 ligger de fleste af vores kontrol 1 målinger omkring eller under den nedre grænse. (bilag 9 ark 2). Kontrol 2 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 0 2 4 6 8 Dage Kontrol 2 høj værdi Nedre værdi øvre værdi middelværdi Figur 5: Vurdering af kontrolkort for kontrol 2. X- værdien angiver antallet af dage kontrollerne er taget over og Y værdien angiver de målte kontrolværdier I figur 3 ses der at størstedelen af målinger også ligger omkring den nedre grænse, dog er der ikke så mange af dem som ligger under i forhold til kontrol 1 (bilag 9 ark 3). Side 27/51

Målte kontrolværdier kontrol 1 og 2 Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen Ditte S. Christensen Kontrol 1 og 2 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 Dage Nedre værdi level 1 Øvre værdi level 1 Nedre værdier level 2 Øvre værdier level 2 kontrolværdier level 2 Kontrol værdier 1 Figur 6: vurdering af kontrolkort med både kontrol 1 og 2.. X- værdien angiver antallet af dage kontrollerne er taget over og Y værdien angiver de målte kontrolværdier Som det blev forklaret tidligere ligger både kontrol 1og 2 under eller omkring grænsen til den nedre værdi dvs. målingerne spreder sig mere end 2SD som er maksimum. Både kontrol 1 og 2 lå lavt fra første måling. Vi valgte dog ikke at tage kontrollerne om da vi vidste at de nedre, og øvre værdier som vi havde fået fra producenten var udregnet ud fra målinger taget på andre apparater, pga. dette kan man ikke undgå en lille ændring fra apparat til apparat. En anden grund til at vi godtog vores målinger kan ses i figur 4 som viser kontrol 1 og 2 indsat i samme kontrolkort. Hvis vi sammenligner hvordan vores kontroller ligger i forhold til hinanden kan vi nemlig udelukke, at afvigelsen hverken skyldes forurening eller en luftbobbel i kontrol materialet. Hvis det var sket ville der have været nogle punkter som skred meget mere udenfor end der ses her. (bilag 9 ark 4). 7.2 Metodevalideringsresultater 7.2.1Intermediær impræcision Kontrol 1 Kontrol 2 SD 0,285 0,989 CV % 7,023 3,696 Tabel 1: beregning af SD og CV % for kontrol 1 og 2 Vores beregnede CV % er faktisk bare vores SD i procent. Dette tal vil vi kunne bruge i senere udregning deriblandt vores måleusikkerhedsbudget. Tommelfinger reglen for CV % er højest 10 % (bilag 9 ark 1) Side 28/51

Kontrolmålinger Kontrolværdier Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen Ditte S. Christensen Kontrol 1 (beregnet) 5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0 2 4 6 8 Dage Kontrol 1 Nedre værdi Øvre værdi Middelværdi Figur 7: Vurdering af nye kontrolværdier beregnet ud fra intermediære impræcision SD. X- aksen angiver dage hvor kontrollerne er målt. y- aksen angiver de målte kontrolværdier. I figur 5 ses et Levey-Jennings-kontrolkort, hvor værdierne nedre, øvre og middelværdi er beregnet i vores intermediære impræcision. Disse nye værdier giver et bedre billede af vores målinger, og som det kan ses ligger vores målinger for kontrol 1 bedre, der er kun nogle få som ligger omkring den nedre værdi og ingen der ligger under altså mere end 2SD. (bilag 9 ark 1). Kontrol2 (beregnet) 29,00 28,50 28,00 27,50 27,00 26,50 26,00 25,50 25,00 24,50 0 2 4 6 8 Dage Kontrolmålinger Nedre værdi Øvre værdi Middelværdi Figur 8: Vurdering af nye kontrolværdier for kontrol 2, beregnet ud fra intermediære impræcision SD. X aksen angiver dage hvor kontrollerne er målt. y-aksen angiver de målte kontrolværdier. Side 29/51

konc af H-FABP ng/ml Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen Ditte S. Christensen I figur 6 ses Levey-Jennings-kontrolkort for kontrol 2, i denne figur er der også blevet brugt nye værdier ligesom i figur 5 beregnet ud fra resultaterne af vores intermediære impræcion. Som der tydeligt kan se i denne figur ligger målingerne for kontrol 2 meget bedre med nye beregnede værdier. Størstedelen af målingerne ligger omkring middelværdien som er det bedste forslag til den sande værdi. Vi har kun en enkel måling som ligger lige på den nedre værdi, men ingen som ligger over de 2SD som er grænsen. (bilag 9 ark 1) 7.2.2 Referenceinterval Som en del af vores valideringsproces ville vi verificere Randox referenceinterval, sådan at vi havde en lille indsigt i om vi kunne stole på det eller ej. 7 6 5 4 3 2 1 0 Verificering af Refernceinterval 99 percentile studerende 1 studerende 2 0 1 2 3 4 målinger Figur 9: verificering af 95 percentile interval fra Randox. X- aksen angiver antal målinger og y- aksen angiver koncentrationen af H-FABP i ng/ml i blodet. Vi kan se på figur 7 at alle 6 målinger taget på studerende 1 og 2 er negative ifølge vores referenceinterval. Det ville have givet et mere præcist resultat hvis vi havde målt på flere raske personer, men det havde vi desværre ikke reagens til. Det vigtigste var at der var sammenhæng mellem de to studerendes koncentration af H-FABP i blodet, sådan at den ene ikke var ekstrem høj, mens den andens var ekstrem lav.(bilag 9 ark 2) 7.2.3 Prøveafsmitning Koncentrationsniveau Forsøgspersoner Koncentration af H- af H-FABP FABP målt ng/ml Lav: Studerende 1 2,48 Side 30/51

Studerende 1 1,96 Studerende 1 2,24 Høj: Patient 3 32,38 Patient 3 33,68 Patient 3 33,72 Lav: Studerende 2 1,11 Studerende 2 1,78 Studerende 2 1,48 Tabel 2: Forsøgspersoner og deres koncentration af H-FABP. I tabel 2 kan man med det blotte øje, se at der ingen afsmitning var fra lav til høj koncentration. Hvis det havde været tilfældet ville den første høje koncentration for patient 3 havde været meget lav, da prøven med den lave koncentration for studerende 1 ville have fortyndet vores høje prøve. Der ses også at der ingen afsmitning er fra høj koncentration til lav, da den lave koncentration for studerende 2 ville have været meget højere end den er nu. (bilag 9 ark 3) Koncentrationsniveau af H-FABP Lav Brugt kontrol 1 SD brugt Koncentration af H- 1SD 0,285 2SD 0,57 Høj Brugt kontrol 2 1SD 0,989 2SD 1,97 Lav Brugt kontrol 1 1SD 0,285 2SD 0,57 Side 31/51 FABP målt ng/ml 2,48 1,96 2,24 32,38 33,38 33,72 1,11 1,78 1,48 Tabel 3: Undersøgelse af om der var afsmitning mellem de enkelte målinger. Interval for målinger 1,91 3,05 30,402 34,35 0,54 1,68 I tabel 3 kan man se at målinger for den lave koncentrations niveau altså studerende 1, alle lå inde var det interval som jeg havde beregnet ud fra den lave SD. Så her ses der ingen afvigelse, eller afsmitning fra prøve til prøve. Målinger med det høje koncentrations niveau patient 3 lå også alle sammen inde for det beregnede interval, så heller ingen afvigelse eller afsmitning her mellem målingerne. Ved målingerne med den sidste lave koncentrationsniveau studerende 2 ligger et af målinger ikke inden for intervallet. Dette betyder at der er en større afvigelse end 2SD mellem målinger, men om det betyder

afsmitning er ikke til at sige med sikkerhed, da vi jo udelukkede afsmitning fra den høje til den lave. Grunden til at jeg brugte forskellige SD til beregninger, var fordi målingerne med de lave koncentrationer skulle passe med den lave SD og omvendt. Under udførelsen af forsøget blev de tre første prøver med lav koncentration af H-FABP ikke udført i rækkefølge, så de resultater er ikke pålidelige, da det er muligt at Cobas 6000 kunne have kørt andre analyser ind imellem. (bilag 9 ark 3) 7.2.4 Genfindingsforsøg Fortyndinger Bias % 1 2 3 4 Tabel 4: Beregnede bias for de 4 fortyndinger 3,889515-0,56953-7,80423-11,6892 I tabel 4 ses vores beregnede bias, ud fra de målte og sande værdier på de 4 fortyndinger. Denne bias udtrykker hvor meget vores analyse ikke kunne genfinde af den sande værdi i fortyndingerne. Den samlede afvigelse fra den sande værdi ligger på 4,04 %, dette er ikke højt da man har en tommelfinger regel på højest 10 %. Man kan også tydelig se at jo mindre koncentration i prøverne jo større bias beregnes der. Dette har noget at gøre med at analysen, har svært ved at finde de meget lave koncentrationer i en prøve. Man kan sige at vores udregnede bias kun siger noget om den enkelte måling, men fordi der både er positive og negative bias resultaterne vil det være svært at lave yderligere statistiske beregninger. (bilag 9 ark 4) Side 32/51

Beregnet koncentration Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen Ditte S. Christensen 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Genfindingsforsøg 0 5 10 15 20 Målt koncentration y = 0,9215x + 0,753 R² = 0,9998 tendenslinie Vores Linear (Vores) Figur 10: Vurdering af analysens bias, hvor godt vores linje ligger i forhold til tendenslinien. X - aksen angiver den målte værdi på apparatet og y-aksen angiver den beregnede værdi altså den sande værdi. Som det kan ses i figur 8 ligger vores linje både over og under tendenslinien, det fortæller os at vores bias er positiv først, for så at blive negativ i de senere fortyndinger, det kan også ses i tabel 4. Hvis vi ser nærmere på vores ligning for grafen kan vi se at Y = 0,92 dette tal siger noget om hvor godt vores linje ligger oven i tendenslinien, og dette er rimelig godt, da den skal ligge så tæt på 1 som muligt, for at være en fuldstændig ret linje. Ud fra disse forskellige udregninger og grafer kan vi sige med sikkerhed at analysen ikke er udstyret med nogen betydende bias. (bilag 9 ark 4) Side 33/51