(19) DANMARK (11) DK 175072 B1 2six,l (12) PATENTSKRIFT Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.C1 7.: C 12 N 15/38 A 61 K 39/245 C 12 N 15/63 G 01 N 33/569 (21) Patentansøgning nr: PA 1987 02888 (22). 1: I'dleveringsdag: 1987-06-04 (24) Løbedag: 1986-08-28 (41) Alm. tilgængelig: 1987-06-04 (45) Patentets meddelelse bkg. den: 2004-05-24 (86) International ansøgning nr: PCT/US86/01761 (86) International indleveringsdag: 1986-08-28 (85) Videreførelsesdag: 1987-06-04 (30) Prioritet: 1985-10-04 US 784787 1985-11-26 US 801799 1986-03-26 US 844113 1986-07-16 US 886260 (73) Patenthaver: Pharmacia & Upjohn Company, 301 Henrietta Street, Kalamazoo, Michigan, USA (72) Opfinder: Erik A. Petrovskis, 317 Prospect, Kalamazoo, Michigan 49007, USA Leonard E. Post, 6129 Old Log Trail, Kalamazoo, Michigan 49007, USA James G. Timmins, 550 Memorail Drive 18F, Cambridge, Massachusetts 02139, USA (74) Fuldmægtig: Budde, Schou & Ostenfeld A/S, Vester Søgade 10, 1601 København V, Danmark (54) Benævnelse: Rekombinant DNA-molekyle, værtscelle transformeret dermed, fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ved anvendelse af det rekombinante DNA-molekyle, og diagnostisk sæt omfattende et sådant polypeptid (56) Fremdragne publikationer: Journal of Virology, Vol. 56, No. 1 (1985), s. 307-311 Journal of Virology, Vol. 53, No. 1 (1985), s. 52-57 (57) Sammendrag: Den foreliggende opfindelse tilvejebriner rekombinante DNA-molekyler omfattende en sekvens, der koder et ' pseudorabiesvirus-(prv)-glycoprotein valgt blandt gi, gp50 og gp63, værtsceller transformeret af de nævnte rekombinante. DNA-molekylsekvenser, gi-, gp50- og gp63-polypeptider. Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også underenheds-vacciner mod PRV, metoder til beskyttelse af dyr mod PRV-infektion og metoder til at skelne mellem inficerede og vaccinerede dyr.
Den foreliggende opfindelse angår et rekombinant DNA-molekyle, en værtscelle transformeret dermed, en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ved anvendelse af det rekombinante DNA-molekyle, og diagnostisk sæt omfat- 5 tende et sådant polypeptid. Polypeptidet og det diagnostiske sæt er anvendelige til screening af dyr til bestemmelse af, om de er inficeret med PRV, og det rekombinante DNA-molekyle er egnet til eksprimering af PRV-glycoproteinerne, som kodes deraf. 10 Pseudorabies-virus (PRV) er en sygdom, som angriber mange dyrearter over, hele verden. PRV-infektioner betegnes afvekslende paralysis bulbaris infectiosa, Aujeszky's sygdom og "mad itch". Infektioner kendes hos vigtige husdyr, såsom svin, kvæg, hunde, katte, får, 15 rotter og mink. Værtsdyr-området er meget bredt og omfatter de fleste pattedyr og, i det mindste eksperimentelt, mange fuglearter (vedrørende en detaljeret liste over værtsdyr, se D.P. Gustafson, "Pseudorabies", in Diseases of Swine, 5. udg., A.D. Leman et al.,eds., (1981)). For 20 de fleste inficerede dyr er sygdomme dødelig. Voksne svin og muligvis rotter dør imidlertid ikke af sygdommen og er derfor bærere. Svinebesætninger er særlig udsatte for PRV. Selv om de voksne svin sjældent udviser symptomer eller dør af 25 sygdommen, bliver smågrise akut.;syge, når de smittes, og de dør sædvanligvis i løbet af 24-48 timer-, ofte uden specifikke kliniske tegn (T.C. Jones og R.D. Hunt, Veterinary Pathology, 5. udg., Lea & Febiger (1983)). PRV-vacciner er blevet fremstillet ved forskellige 30 metoder, og. vaccination i endemiske områder af Europa er blevet praktiseret i mere end 15 år. Tabene er blevet nedsat ved vaccinationen, men vaccinationen har bibeholdt virusset i miljøet. Der er ikke blevet fremstillet nogen vaccine, som vil forhindre infektion. Vaccinerede dyr, som udsættes for virulent virus, overlever infektionen og udskiller derefter mere virulent virus. Vaccinerede dyr kan derfor huse en latent infektion, som kan blusse op igen (se D.P. Gustaf son, ovenfor). 1
2 Levende svækkede og inaktiverede vacciner mod PRV er tilgængelige i handelen i USA og er blevet godkendt af USDA (Se C.E. Aronson, ed., Veterinary Pharmaceuticais & Biologicals, (1983)). 5 Fordi voksne svin er bærere af PRV, har mange stater startet screening-programmer til påvisning af smittede dyr. DNA/DNA-hybridis ering kan anvendes til diagnosticering af aktivt inficerede dyr under anvendelse af et rekombinant DNA-molekyle ifølge den foreliggende opfin- 10 delse. Nogle af PRV-glycoproteinerne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse er også anvendelige til fremstilling af diagnostika for PRV-infektioner og også til fremstilling af vacciner mod PRV. PRV er et herpesvirus. Herpesvira er generelt 15 blandt de mest komplekse af dyre-vira. Deres genorner koder mindst 50 virus-specifikke proteiner og indeholder over 150.000 nucleotider. Blandt de mest immunologisk reaktive proteiner af herpesvira findes glycoproteinerne blandt andet i virion-membraner og membranerne af infi- 20 cerede celler. Litteraturen vedrørende PRV-glycoproteiner refererer til mindstfire vinde glycoproteiner (T. Ben- -Porat og A.S. Kaplan, Virology 41, 265-73 (1970); A.S. Kaplan og T. Ben-Porat, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66, 799-806 (1970)). 25 M.W. Wathen og L.K. Wathen, J. Virol. 51, 57-62 (1984) refererer til et PRV, der indeholder en mutation i et viralt glycoprotein (gp50), og en fremgangsmåde til selektering af mutanten under anvendelse af neutraliserende monoclonalt antistof rettet mod 30 gp50. Wathen og Wathen anfører også, at et monoclonalt antistof rettet mod gp50 er en stærk neutraliserende faktor for PRV, med eller uden hjælp af komplement, og at polyvalent immunserum er særdeles reaktivt mod gp50, og konkluderer derfor, at gp50 kan være et af de vigtige
3 PRV-immunogener. På den anden side er det blevet rapporteret, at monoclonale antistoffer, som reagerer med kappe-glycoproteinet med en molekylvægt på 98.000, neu- traliserer PRV-infektionsevnen, men at monoclonale an- 5 tistoffer rettet mod nogle af de andre membran-glycoproteiner har meget lille neutraliserende aktivitet (H. Hampi et al., J. Virol. 52, 583-90 (1984); og T. Ben-Porat og A.S. Kaplan, "Molecular Biology of Pseudorabies Virus", i B. Roizman ed., The Herpesviruses, 10 3, s. 105-73 (1984)). L.M.K. Wathen et al., Virus Research 4, 19-29 (1985 beskriver fremstilling og karakterisering af monoclonale antistoffer rettet mod PRV-glycoproteiner identificeret som gp50 og gp83 og deres anvendelse til pas- 15 siv immunisering af mus mod PRV-infektion. A.K. Robbins et al., "Localization of a Pseudorabies Virus Glycoprotein Gene Using an E. coli Expression Plasmid Library", i Herpesvirus, s. 551-61 (1984) beskriver konstruktion af et bibliotek af 20 E. coli-plasmider indeholdende PRV-DNA. De beskriver også identifikation af et PRV-gen som koder glycoproteiner med en molekylvægt på 74.000 og 92.000. De beskriver ikke glycoproteinerne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse. 25 A.K. Robbins et al., EP-patentansøgning nr. 85400704.4 (publikation nr. 162.738) beskriver isolering, cloning og eksprimering af PRV-glycoproteiner, der identificeres som gii og giii. De beskriver ikke PRV-glycoproteinerne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse. 30 T.C. Mettenleiter et al., "mapping of the Struc- tural Gene of Pseudorabies Virus Glycoprotein A and Identification of Two Non-Glycosylated Precursor Polypeptides", J. Virol. 53, 52-57 (1985), beskriver kortlægning af det kodende område af glycoprotein ga (som de ligestiller med gi) til BamHI-7-fragmentet af
4 DK 175072 B1 PRV-DNA. De anfører også, at BamHI-7-fragmentet koder for mindst tre andre virale proteiner med en molekylvægt på 65.000, 60.000 og 40.000. De beskriver eller antyder ikke DNA-sekvensen, som koder for glycoproteinerne fremstillet 5 ifølge den foreliggende opfindelse, eller fremstilingen af sådanne polypeptider ved rekombinante DNA-metoder. B. Lomniczi et al., "Deletions in the Genomes of Pseudorabies Virus Vaccine Strains and Existence of Four Isomers of the Genomes", J. Virol. 49, 970-79 10 (1984) beskriver PRV-vaccine-stammer, som har udeladelser i den særlige korte sekvens mellem 0,855 og 0,882 kort- -enheder. Dette er i nærheden af gi-genet. T.C. Mettenleiter et al., "Pseudorabies Virus Avirulent Strains Fail to Express a Major Glycoprotein", J. Virol. 56, 15 307-11 (1985), har demonstreret, at tre kommercielle PRV- -vaccine-stammer mangler glycoprotein gi. Det har også for nylig vist sig, at Bartha-vaccine-stammen indeholder en udeladelse af det meste af gp63-genet. T.J. Rea et al., J. Virol. 54, 21-29 (1985), 20 beskriver kortlægning og sekvensbestemmelse af genet for PRV-glycoproteinet, som akkumuleres i mediet af inficerede celler (gx). Blandt de flankerende sekvenser af gx-genet, som er vist deri, er en lille del af gp50-sekvensen, der specifikt begynder ved base:nummer 1682 25 i fig. 6 deri. Denne sekvens blev imidlertid ikke identificeret som gp50-sekvensen. Endvidere er der fejl i sekvensen publiseret af Rea et al. Baserne 1586 og 1603 skal udelades. Baserne skal indføres mellem baserne 1708 og 1709, baserne 1737 og 1738, baserne 1743 og 30 1744 og baserne 1753 og 1754. Konsekvensen af disse fejl i den publicerede delvise sekvens af gp50 er en læserammeforskydning. Translation af den åbne læseramme, der begynder ved AUG-startstedet, vil give en ukorrekt aminosyresekvens for gp50-glycoproteinet.
EP-patentpublikation nr. 133.200 beskriver en diagnostisk antigen faktor, der skal anvendes sammen med visse lectin-bundne PRV-glycoprotein-underenheds-vacciner til at skelne mellem bærere af PRV og ikke-bærere af PRV. 5 Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes et rekombinant DNA-molekyle indeholdende en DNA-sekvens kodende for et polypeptid, der udviser pseudorabiesvirus-(prv)-glycoprotein-gi-immunogenitet, hvor den nævnte DNA-sekvens er operativt forbundet med en ekspressionskon- 10 trolsekvens, hvorved DNA-sekvensen, der koder for polypeptidet, er valgt blandt sekvensen, der koder for gi, og som er.atg CGG CCC TIT CTG CTG CGC GCC GCG CAG CTC CTG CCG CTG crc GCC CTG GCG CTC TCC ACC GAG GCC CCG AGC CTC TCC CCC GAG ACG ACC CCC GGC CCC GTC ACC 15 GAG GTC CCG AGT CCC TCG GCC GAG GTC TOG GAC CTC TCC ACC GAG GCC GGC GAC GAT GAC CTC GAC GGC GAC CTC AAC CGC CAC CAC CGC CGC GCC CCC TTC GGC TCG dcc CTC GCC TCC CTG AGG GAG GCA CCC CCG GCC CAT CTG GTG AAC GTG TCC GAG GGC CCC AAC TTC ACC CTC GAC GCG CGC CCC GAC CCC GCC GTG CTG GCC GGG ATC 5 20 TGG ACG TTC CTG CCC GTC CGC GGC TGC GAC CCC CTG GCG GTG ACC ATG GTG TGC TTC GAG ACC GCC TGC CAC CCG GAC CTG GTG crc GGC CGC GCC TGC GTC CCC GAG GCC CCG GAG CGG GGC ATC CGC GAC TAC CTG CCG CCC GAG GTG CCG CCG CTC CAG CGC GAG CCG CCC ATC GTC ACC CCG GAG CGG TOG TCG CCG CAC CTG ACC GTC CGG CGG GCC ACG CCC AAC GAC ACG GGC CTC TAC ACG crc CAC GAC GCC TCG GCG CCG 25 CGG GCC GTG TTC TTT GTG GCG crc GGC GAG CGG CCG CCC GCG CCG CTG GCC CCG GTG GGC CCC GCG CGC CAC GAG CCC CGC TTC CAC GCG crc GCC TTC CAC TCG GAG CTC TTC TCC CCC GGG GAC ACG TTC GAC crc ATG CCG CGC GIG GTC TCC GAC ATG CCC GAC TCG CGC GAG AAC TTC ACC GCC ACG CTG GAC TGG TAC TAC GCG CGC GCG CCC CCG CGC TGC CTG CTG TAC TAC GTC TAC GAG CCC TGC ATC TAC CAC CCG CGC 30 GCG CCC GAG TGC CTG CGC CCG GTG GAC CCG GCG TCC AGC TTC ACC TCG CCG GCC CGC CCC CCG CTG GTG GCG CGC CGC GCG TAC GCC TCG TGC ACC CCG CTG CTC GCG GAC CGG TGG CTG ACC GCC TGC CCC TTC GAC GCC TTC GGC GAG GAG GTG CAC ACG AAC CCC ACC COG GAC GAG TCG GGG CTG TAC GTG CTC GTG ATG ACC CAC AAC GGC CAC CTC GCC ACC TGG CAC TAC ACG CTC GTC GCC ACC GCG GCC GAG TAC GTC ACG GTC ATC AAG GAG CTG ACG GCC CCG GCC CGG GCC CCG GGC ACC CCG TGG GGC CCC GGC GGC GGC GAC GAC CCG ATC TAC GTG GAC GGC GTC ACG ACG CCC GCC CCG CCC GCC CGC CCG TGG AAC CCC TAC GGC CGG ACG ACC CCC CGG CCG CTC TIT GIG CTG
GCG CTG GGC TCC 1TC GTG ATG ACG TGC GTC GTC GGG GGG GCC CTC TGG CTC TGC GTC CTG TGC TCC CGC CCC CGC GCC GCC 6 tcc ccc CCC ITC 03G GTG CCG ACG CGG GCG GGG ACG CGC ATG CTC TCG CCG GTG TAC ACC AGC CTG CCC ACC CAC GAG GAC TAC TAC GAC GGC GAC GAC GAC GAC GAG GAG GCC GGC GAC GCC CGC CGG 03G CCC 5 TCC TCC CCC GGC GGG GAC AGC GCC TAC CAC GGG CCG TAC GTG AGC CM GAC GCC GAG CAC GAG ITC AGC AGC GAC GAG GAC GAC GGG CTG TAC GTG CGC CCC GAG GAG GCG 0:C CGC TCC GGC ITC GAC GTC TVG. ITC CGC GAT CCG GAG AAA CCG GAA GTG ACG RAT 03G CCC AAC TAT GGC GTG ACC GCC AGC CGC CTC ITG AAT GCC CGC CCC G CT TAA 10 og fragmenter deraf, som koder for polypeptider, der udviser PRV-glycoprotein-antigenitet. Desuden tilvejebringes der ifølge den foreliggende opfindelse en værtscelle transformeret med et rekombinant DNA-molekyle ifølge ofindelsen. 15 Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, der udviser PRV-gI-antigenitet, omfattende: (a) fremstilling af et rekombinant DNA-molekyle, hvor molekylet indeholder en DNA-sekvens, der koder for et 20 polypeptid, som udviser PRV-gI-antigenitet, hvor den nævnte DNA-sekvens er operativt forbundet med en ekspressionskontrolsekvens, (b) transformering af en passende værtscelle med det nævnte rekombinante DNA-molekyle, 25 (c) dyrkning af den nævnte værtscelle, og (d) opsamling af polypeptidet, hvorved DNA-sekvensen er valgt blandt gi-sekvensen, som er ATG CGG CCC TTT CTG CTG CGC GCC GCG CAG CTC CTG GCG CTG CTG GCC CTG GCG CTC TCC ACC GAG GCC 05G AGC CTC TCC GCC CAG ACG ACC CCG GGC CCC GTC ACC 3 0 GAG GTC CCG AGT CCC TCG GCC GAG GTC TCG GAC CTC TCC ACC GAG GCC GGC CAC GAT GAC CTC GAC GGC GAC CTC AAC GGC CAC GAC CGC CGC GCG GGC TTC GGC TCG GCC CTC GCC TCC crc AGC GAG GCA CCC CCG GCC CAT CTG GTG AAC GTG TCC GAG GGC GCC AAC ITC ACC CTC GAC GCG CGC GGC GAC GGC GCC GTG GIV GCC GGG ATC TGG ACG ITC CTG CCC GTC CGC GGC TGC GAC GCC GTG GCC GTG ACC ATG GIG 'MC ITC GAG ACC GCC TGC CAC CCG GAC CTG GTG CTG GGC CGC GCC TGC GTC CCC GAG
7 GCC CCG GAG CGG GGC ATC 03C GAC TAC CTG CCG CCC GAG CTG CCG CGG GTC CAG CGC GAG CCG CCC ATC GTC ACC CCG GAG CGG TGG TCG CCG CAC CTG ACC GTC CGG CGG GCC ACG CCC AAC GAC ACG 03C TAC ACG CTG CAC CAC GCC TCG GCG CCG CGG GCC GTG TTC ITT CTG GCG GTG GGC GAC CGG CCG CCC GCG CCG CTG GCC CCG 5 GTG GCC CCC ccc Ccc CAC GAG CCC CGC TTc CAC GCG CTC GGC TTC CAC TCG CAG CTC TTC TCG CCC GGG GAC ACG TTC GAC GTG ATG CCG CGC GTG crc TCG GAC ATG GGC GAC TCG CGC GAG AAC TI'C ACC GCC ACC CTG GAC TGG TAC TAC GCG CGC GCG CCC CCG 0= MC CTG GTG TAC TAC GTG TAC GAG CCC TGC ATC TAC CAC CCG CGC GCG CCC GAG MC CTG CGC CCG GTG GAC CCG GCG TCC AGC TTC ACC TCG CCG GCG 1 0 CCC GCG GCG GTG GTG GCG CGC CGC GCG TAC GCC TCG ICC AGC CCG CTG CTC GGG GAC OGG TGG CTG ACC GCC TCC CCC TTC GAC GCC TTC GGC GAC GAG CTG CAC ACG AAC GCC ACC GCG GAC GAG TCG GGG GTG TAC GTG GTC GTG ATG ACC CAC AAC GGC CAC GTC GCC ACC TGC GAC TAC ACG CTC GTC GCC ACC GCG GCC GAG TAC GTC ACG GTC ATC AAG GAG GTG ACG GCC CCG GCC CGG GCC CCG GGC ACC CCG TCG GGC CCC 15 GGC GGC GGC GAC GAC GCG ATC TAC GTG GAC GGC GTC ACG ACG CCG GCG CCG CCC GCG CGC CCG ICC AAC CCG TAC CGC CGG ACG ACC CCC GGG CGG CTG Tir GTG GTG GCG CTG GGC TCC TTC GTG ATG ACG TGC GTC GTC GGG GGG GCC GTC TGG CTC TGC GTG CTG TGC TCC CGC CGC CGG GCG GCC TCG Ø CCG ITC CGG GTG CCG ACG CGG GCG GGG ACG CGC ATG CTC TCG CCG CT TAC ACC AGC CTG CCC ACG CAC CAG GAC 20 TAC TAC GAC GGC GAC GAC GAC GAC GAG CAG GCG GGC GAC GCC Ø CGG CGG CCC TCC TCC CCC GGC CGG GAC AGC GGC TAC GAG 03G CCG TAC GTG AGC CTG GAC GCC CAG CAC GAG ITC AGC AGC CAC GAG GAC GAC GGG CTG TAC GTG CGC CCC GAG GAG GCG CCC CGC TCC GGC TTC GAC CTC MG TTC CGC GAT CCG GAC AAA CCG GAA GTG ACG AAT 03G CCC AAC TÅT GGC G'TG ACC GCC AGC CGC CTC TIG AAT GCC CGC CCC 25 GCT TAA og fragmenter deraf, som koder polypeptider, der udviser pseudorabiesvirus-antigenitet. Endelig tilvejebringes der ifølge den foreliggende opfindelse også et diagnostisk sæt til anvendelse til at 30 skelne mellem dyr, der er vaccineret mod PRV, og dyr, der er inficeret med PRV, hvilket sæt er ejendommeligt ved, at at det omfatter flere beholdere, og en af beholderne indeholder et polypeptid, der udviser PRV-glycoprotein-gIantigenitet og er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 8.
8 Med det omhandlede rekombinante DNA-molekyle, den omhandlede værtscelle og den omhandlede fremgangsmåde muliggøres for første gang fremstilling af et diagnostisk sæt af den omhandlede art, hvilket udgør et oplagt og væsentligt 5 teknisk fremskridt. Glycoproteinet, som kodes af genet, er defineret som et glycoprotein, der reagerer med et bestemt monoclonalt antistof. Dette glycoprotein svarer ikke til nogen af de hidtil kendte PRV-glycoproteiner. Wathen og Wathen 10 har kortlagt en mutation, som er resistent mod det monoclonale antistof, som på basis af fortilfælde i herpes simplex-virus (f.eks. T.C. Holland et al., J. Virol 52, 566-74 (1984)), kortlægger placeringen af det strukturelle gen for gp50. Wathen og Wathen har kortlagt gp50-15 -genet til det mindre SalI/BamHI-fragment inden i BamHI-7-fragmentet af PRV. Rea et al., se ovenfor, har kortlagt PRV-glycoprotein-gX-genet til det samme område. PRV-gI-genet er isoleret ved screening af PRV-DNA-biblioteker konstrueret i bakteriofag- 20 -ekspressionsvektoren Ågt11 (J.G. Timmins et al., "A method for Efficient Gene Isolation from Phage gt11 Libraries: Use of Antisera to Denatured, Acetone- -Precipitated Proteins", Gene 39, 89-93 (1985); R.A. Young og R.W. Davis, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 80, 25 1194-98 (1983); R.A. Young og R.W. Davis, Science 222, 778-82 (1983)). PRV-genomisk DNA afledt af PRV-Rice-stammen, der oprindelig blev tilvejebragtfra D.P. Gustaf son ved Purdue University, blev isoleret fra cytoplasmaet af 30 PRV-inficerede Vero-celler (ATCC CCL 81). Det genomiske DNA blev fragmenteret ved lydbehandling og derefter clonet i 2gt.11 til dannelse af et 2/PRV rekombinant ( -ÅPRV) DNA-bibliotek. Antisera til screening af.1drv-biblioteket frem- stilles ved at pode mus med proteiner isoleret fra celler inficeret med PRV (inficeret-celle-proteiner eller
ICP'er), som er blevet adskilt efter størrelse på SDS-geler, og derefter isolere antistofferne. XPRV-fagerne, der skal screenes, udplades på et lag E. coli. gt11 indeholder et enestående cloningssted i 5 3'-enderne af lacz-genet. Fremmede DNA'er, som indføjes i dette enestående sted i den rette orientering og læseramme giver ved ekspression polypeptider bundet til 8-galactosidase. Et nitrocellulosefilter indeholdende en inducer for lacz-transcription til at fremme eks- 10 pressionen af PRV-DNA anbringes oven på laget. Efter at fusions-polypeptiderne eksprimeret af 2PRV'er har haft tilstrækkelig tid til at binde til nitrocellulosefilterne, fjernes filterne fra lagene og undersøges med de ovenfor anførte muse-antisera. Pletter, som producerer antigen, 15 der bindes til muse-antiserum, identificeres ved under- søgelse med et mærket antistof for muse-antiserum. Pletter, som giver et positivt signal, anvendes til at transformere en E. coli-vært (Y1090, tilgængelig fra ATCC, Rockville, MD 20852). Kulturerne inkuberes 20 derefter natten over til dannelse af»rv-fagmaterialer. Disse fag-materialer anvendes til at inficere E. coli K95 (D. Friedman i The Bacteriophage Lambda, s. 733-38, A.D. Hershey, ed. (1971)). Polypeptider produceret af den transformerede E. coli K95 renses ved præparativ 25 gelelektroforese. Polypeptider, som er overproduceret (på grund af induktionen af transcriptionen af lacz- -genet), der har molekylvægte over 116.000, og som også er fraværende i a gt11-kontrolkulturer, er (3-galactosidase-PRV-fusionsproteiner. Hvert enkelt fusionspro- 30 tein injiceres derefter særskilt i en mus til dannelse af antisera. Mærkede PRV-ICP'er dannes ved at inficere Vero-, -celler, der vokser i'et medium, som f.eks. indeholder 14 C-glucosamin (T.J. Rea et al., ovenfor). De ovenfor an- førte fusionsprotein-antisera anvendes til immunopreci - pitation af disse mærkede ICP'er. De således udfældede polypeptider analyseres ved gelelektroforese. Et af dis- 9
se er et glycoprotein (gi) med en molekylvægt på 110.000. Det demonstreres på denne måde, at genet clonet i fagerne, der danner det hybride protein, som fremkalder anti-gi-gp63- serum, er gi-genet. Dette gen viser sig at være placeret i 5 BamHI-7-fragmentet af PRV-genomet (T.J. Rea et al., ovenfor) (se blad D). gi-placeringen stemmer generelt overens med det område, hvor Mettenleiter et al., ovenfor, har placeret gi-genet. Imidlertid har Mettenleiter et al. antydet, at gi-genet strækker sig ind i BamHI-12-fragmentet, hvilket 10 det ikke gør. Denne :tprv-genisoleringsmetode er hurtig og effektiv i sammenligning med DNA-hybridisering og in vitro-translation af udvalgte mrna'er. Da rensede glycoproteiner ikke stod til rådighed, kunne oligonucleotid- 15 -sonder ikke hurtigt konstrueres ud fra aminosyresekvensdata, og der kunne heller ikke dannes højspecifikke polyclonale antisera. Derfor blev den ovenfor anførte metode anvendt. Som ovenfor nævnt placeres genet, der koder gi, i 20 BamHI-7-fragmentet af PRV-DNA. BamHI-7-fragmentet af PRV kan afledes af plasmidet pprxhl (også kendt som puc1129), og fragmenter, der er bekvemme til DNA-sekvensanalyse, kan fås ved standard-subcloningsprocedurer. Plasmidet puc1129 kan fås fra E. coli HB101, NRRL B-15772. Denne kultur er 25 tilgængelig fra den permanente samling hos Northern Regional Research Center Fermentation Laboratory (NRRL), U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A. E. coli HB101 indeholdende puc1129 kan dyrkes i L-næringsmedium ved velkendte procedurer. Typisk dyrkes 30 kulturer til en optisk tæthed på 0,6, hvorefter der tilsættes chloramphenicol, og kulturen henstilles under om- 1 0
11 rystning natten over. Kulturen lyseres derefter f.eks. ved anvendelse af SDS med høj saltkoncentration, og den ovenstående væske underkastes en casiumchlorid/- ethidiumbromid-ligevægtsdensitetsgradientcentrifuge- 5 ring, hvorved plasmiderne fås. Tilgængeligheden af denne gensekvens muliggør direkte manipulering af genet og gensekvensen, hvilket tillader modifikationer af reguleringen af ekspressionen og/eller strukturen af proteinet kodet af 10 genet eller et fragment deraf. Kendskabet til denne gensekvens gør det også muligt at clone det tilsvarende gen eller fragment deraf fra enhver stamme af PRV under anvendelse af den kendte sekvens som hybridiseringssonde og at eksprimere hele proteinet eller et fragment deraf 15 ved rekombinante metoder, der er almindeligt kendte. Kendskabet til denne gensekvens har gjort det muligt at udlede aminosyresekvensen af det tilsvarende polypeptid (kort C). Som resultat heraf kan fragmenter af dette polypeptid med PRV-immunogenitet frem- 20 stilles ved standardmetoder til proteinsyntese-eller re- kombinante DNA-metoder. Som anvendt i den foreliggende beskrivelse anvendes udtrykkene immunogenitet og anti- genitet afvekslende om evnen til at stimulere enhver type af adaptiv immunreaktion, dvs. udtrykkene antigen 25 og antigenitet er ikke i betydning begrænset til stoffer, der stimulerer produktionen af antistoffer. Den primære struktur (sekvens) af genet, der koder for gi er også anført i kort C. Genet eller fragmenterne deraf kan udvindes 30 fra puc1129 ved nedbrydning af plasmid-dna'et fra en kultur af NRRL B-15772 med passende endonuclease-restriktionsenzymer. F.eks. kan BamHI-7-fragmentet isoleres ved nedbrydning af et præparat af puc1129 med BamHI og isoleres ved gelelektroforese.
12 Alle restriktions-endonucleaserne, som er omtalt i den foreliggende beskrivelse, er kommercielt tilgængelig, og deres anvendelse er velkendt. Brugsanvisninger gives i almindelighed af de kommercielle leverandører af 5 restriktionsenzymerne. Det udskårne gen eller fragmenter deraf kan ligeres til forskellige cloningsbærere eller vektorer til anvendelse ved transformering af en værtscelle. Vektorerne indeholder fortrinsvis DNA-sekvenser til at starte, 10 kontrollere og afslutte transcription og translation (som tilsammen udgør ekspression) af PRV-glycoprotein- -generne og er derfor operativt forbundet dermed. Disse "ekspressionskontrolsekvenser" er fortrinsvis forenelige med værtscellen, der skal transformeres. Når værtcellen 15 er en celle af et højere dyr, f.eks. en pattedyrcelle, kan de naturligt forekommende ekspressionskontrolsekvenser af glycoprotein-generne anvendes alene eller sammen med heterologe ekspressionskontrolsekvenser. Heterologe sekvenser kan også anvendes alene. Vektorerne indeholder 20 yderligere fortrinsvis et markørgen (f.eks. antibioti- kumxesistens), således at der fås et fænotypisk træk til selektion af transformerede værtsceller. Desuden vil en replikerende vektor indeholde et replicon. 30 Typiske vektorer er plasmider, fager og vira, 25 der inficerer dyreceller. Der kan i det væsentlige anvendes enhver DNA-sekvens, som er i stand til at transformere en. værtscelle. Ved udtrykket "værtscelle" som anvendt i den foreliggende beskrivelse menes en celle, der er i stand til at blive transformeret med DNA-sekvensen, der koder for et polypeptid, som udviser PRV-glycoprotein-antigenitet. Fortrinsvis er værtscellen i stand til at eksprimere PRV-polypeptidet eller fragmenter deraf. Værtscellen kan være prokaryotisk eller eukaryotisk. Illustrerende pro-
13 DK 175072 B1 karyotiske celler er bakterier, såsom E. coli, B. subtilis, pseudomonas og B. stearothermofilus. Illustrerende eukaryotiske celler er gærceller eller celler af højere dyr, såsom celler fra insekter, planter eller pat- 5 tedyr. Pattedyr-cellesystemer vil ofte foreligge i form af monolag af celler, selv om pattedyrcelle-suspensioner også kan anvendes. Pattedyr-cellelinier omfatter f.eks. Vero og HeLa-celler, kinesisk hamster-ovarie-cellelinier (CHO-cellelinier), WI38-, BHK-, COS-7- eller MDCK- 10 -cellelinier. Insekt-cellelinier omfatter Sf9-linien af Spodoptera frugiperda (ATCC CRL1711). En sammenfatning af nogle tilgængelige eukaryotiske plasmider, værtsceller og metoder til anvendelse af disse til cloning og ekspression af PRV-glycoproteiner kan findes i 15 K. Esser et al., Plasmids of Eukaryotes (Fundamentals and Applications), Springer-Verlag (1986). Som ovenfor anført indeholder vektoren, f.eks. et plasmid, som anvendes til at transformere værtscellen, fortrinsvis forenelige ekspressionskontrolsekvenser til 20 ekspression af PRV-glycoprotein-genet eller fragmenter der- af. Ekspressionskontrolsekvenserne er derfor operativt forbundet med genet eller fragmentet. Når værtscellerne er bakterier, omfatter illustrerende anvendelige eks- pressionskontrolsekvenser trp-promotoren og -operatoren 25 (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8, 4057 (1980)); lac- -promotor og -operator (Chang et al., Nature 275, 615 (1978)); ydre membran protein promotor (EMBO J. 1, 771-775 (1982)); bakteriofag, -promotorer og -ope- ratorer (Nucl. Acids Res. 11, 4677-4688 (1983)); a-amy- 30 fase (B. subtilis) promotor og -operator. Termineringssekvenser og andre ekspressionsfremmende og -kontrollerende sekvenser, som er forenelige med den valgte værtscelle. Når værtscellen er gær, omfatter illustrerende anvendelige ekspressionskontrolsekvenser f.eks. a-mating
14 DK 175072 B1 faktor. Til insektceller kan polyhedrin-promotoren af baculovira anvendes (Mol. Cell. Biol. 3, s. 2156-65 (1983)). Når værtscellen stammer fra insekter eller pattedyr, omfatter illustrerende anvendelige ekspres- 5 sionskontrolsekvenser f.eks. SV-40 promotor (Science 222, 524-527 (1983)) eller f.eks. metallothionein- -promotor (Nature 296, 39-42 (1982)) eller en varmechok-promotor (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, s. 4949-53 (1985)). Som ovenfor anført kan man, 10 når værtscellen er en pattedyrcelle, anvende ekspres- sionskontrolsekvenserne for PRV-glycoprotein-genet, men fortrinsvis i kombination med heterologe ekspressionskontrolsekvenser. Plasmidet eller replikerende eller integrerende 15 DNA-materiale indeholdende ekspressionskontrolsekvenserne spaltes under anvendelse af restriktionsenzymer, størrelses-justeres i nødvendigt eller ønskeligt omfang og ligeres med PRV-glycoprotein-genet eller fragmenter deraf ved velkendte metoder. Når der anvendes gær-værtsceller 20 eller værtsceller af højere dyr, kan polyadenylerings- eller terminatorsekvenser fra kendte gær- eller pattedyrgener inkorporeres i vektoren. Der kan f.eks. anvendes kvæg-væksthormon-polyadenyleringssekvensen som anført i EP-patentpublikation nr. 93.619. Desuden kan gensekven- 25 ser til kontrol af replikationen af værtscellen inkorpo- reres i vektoren. Værtscellerne er kompetente. eller gøres kompetente til transformation på forskellig måde. Når bakterieceller er værtsceller, kan de gøres kompetente ved 30 behandling med salte, typisk et calciumsalt, som generelt beskrevet af Cohen, PNAS, 69, 2110 (1972). En gær- -værtscelle gøres i almindelighed kompetent ved fjernelse af dens cellevæg eller på anden måde, f.eks. ved ionisk behandling (J. Bacteriol. 153, 163-168 (1983)).
Der findes flere velkendte metoder til indføring af DNA i dyreceller, herunder f.eks. calciumphosphat-præcipitation, fusion af de modtagende celler med bakterie- -protoplaster indeholdende DNA'et, behandling af de 5 modtagende celler med liposomer indeholdende DNA'et og mikroinjektion af DNA'et direkte i cellerne. De transformerede celler opformeres ved velkendte metoder (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982); Biochemical 10, Methods In Cell Culture And Virology, R.J. Kuchler, Dowden, Hutdhinson og Ross, Inc., (1977); Methods In Yeast Genetics, F. Sherman et al., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)) og det eksprimerende PRV-glycoprotein eller fragmentet deraf høstes fra cellemediet 15 i de systemer, hvor proteinet udskilles fra værtscellerne, eller fra cellesuspensionen efter brydning af værtscellesystemet ved f.eks. velkendte mekaniske eller enzymatiske metoder. Som ovenfor anført er aminosyresekvensen af PRV- 20 glycoproteinet som afledt af genstrukturen anført i kort C. Polypeptider, som udviser PRV-glycoprotein-antigenitet, omfatter sekvensen anført i kort C og enhver del af polypeptidsekvensen, som er i stand til at fremkalde en immunreaktion hos et dyr, f.eks. et pattedyr, som har modtaget 25 en injektion af polypeptidsekvensen. Som ovenfor anført kan hele genet, der koder for PRV-glycoproteinet, anvendes til at konstruere vektorerne og transformere værtscellerne til ekspression af PRV-glycoproteinet, eller der kan anvendes fragmenter 30 af genet, som koder for PRV-glycoproteinet, hvorved den resulterende værtscelle vil eksprimere polypeptider, der udviser PRV-antigenitet. Ethvert fragment af PRV-glycoprotein-genet kan anvendes, hvilket resulterer i ekspression af et polypeptid, som er et immunogent fragment af PRV-glycoproteinet eller en analog deraf. Som det er velkendt, muliggør degenerationen af den genetiske kode let 15
16 DK 175072 B1 substitution af basepar til dannelse af funktionelt ækvivalente gener eller fragmenter deraf, som koder polypeptider, der udviser PRV-glycoprotein-antigenitet. Disse funktionelle ækvivalenter er også omfattet af opfindelsen. 5 Kort D og N-Q er anført for at illustrere konstruktionerne ifølge eksemplerne. Der anvendes bestemte konventioner til illustrering af plasmider og DNA-fragmenter på følgende måde: (1) Figurerne med en enkelt linie viser både cirkulært 10 og lineært dobbeltstrenget DNA. (2) Stjerner viser, at det viste molekyle er cirkulært. Hvis der ikke er anført en stjerne, er molekylet lineært. ' (3) Endonuclease-restriktionssteder af interesse er anført over linien. 15 (4) Gener er anført under linien. (5) Afstandene mellem gener og restriktionssteder er ikke i korrekt målestok. Figurerne viser kun de relative posi-. tioner, medmindre andet er anført. De fleste af de rekombinante DNA-metoder, der an- 20 vendes ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse, er standardprocedurer, der er velkendte af fagmanden og f.eks. beskrevet detaljeret i Molecular Cloning, T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982) og B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 25 John Wiley & Sons (1984). Eksempel 1 I dette eksempel beskrives isolering, kloning og 30 sekvensbestemmelse af gi-genet. 1. Bibliotekskonstruktion. PRV-genomisk DNA fremstilles som tidligere beskrevet (T.J. Rea et al., ovenfor). Fragmenter på 0,5- -3,0 kb fås ved lydbehandling af det PRV-genomiske DNA af PRV-Rice-stammen to gange i 4 sekunder hver gang på indstilling 2 med et Branson 200-1ydbehandlingsappa-
17 DK 175072 B1 rat. Efter dannelse af stumpe ender hos fragmenterne med T4-DNA-polymerase ligeres fragmenterne til kinasebehandlede EcoRI-linkere (T. Maniatis et al., ovenfor). Efter over-nedbrydning med EcoRI (da PRV-DNA ikke inde- 5 holder et EcoRI-sted, er methylering unødvendig), fjer- nes overskydende linkere ved agarose-gellektroforese. PRV-DNA-fragmenter i det ønskede størrelseinterval elueres ved glasopslæmningsmetoden (B: Vogelstein og D. Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, s 615-19 10 (1979)). Et bibliotek på 61.000 /PRV-rekombinanter ( PRV'er) konstrueres ved at ligere 500 ng af PRV- -DNA-fragmenter til 750 ng af EcoRI-nedbrudt 2gt11 (R.A. Young og R.W. Davis, ovenfor) DNA i 50 mm Tris (ph-værdi 7,4), 10 mm magnesiumchlorid, 10 mm dithio- 15 treitol, 1 mm spermidin, 1 mm ATP, 400 enheder af T4-20 -DNA-ligase (New England Biolabs), i et slutvolumen på 10,u1. Det ligerede DNA emballeres i bakteriofag -virioner under anvendelse af "Packagene"-ekstrakt (Promega Biotec, Madison, Wisconsin). 2. 2 PRV-bibliotek-screening. 1:.RV-biblioteket screenes som ovenfor beskrevet (J.G. Timmins et al., ovenfor; R.A. Young og R.W. Davis, ovenfor). 20.000 fager screenes pr. 150 mm LB-ampicil- 25 lin-plade. Screening-antisera dannes ved injektion hos mus af størrelsesfraktioner af proteiner af PRV-inficerede celler (ICP'er) elueret fra SDS-polyacrylamidgeler (J.G. Timmins et al., ovenfor). Pletter, som giver positive signaler ved screening med antisera, opsamles 30 fra agarpladerne med en steril pasteurpipette, resuspenderes i 1 ml SM-puffer (T. Maniatis et al., ovenfor) og screenes igen. Screeningen gentages, indtil pletterne reagerer ensartet positivt. Ca. 43.000 PRV-rekombinanter screenes med mu- se-antisera over for proteiner fra PRV-inficerede Vero- -celler isoleret fra SDS-polyacrylamidgeler. Der iso- leres 60 positive PRV-fager.
18 3. Fag-forrådsfremstilling. Fag-forråd med høj titer ( 1010_1011 pfu/ml) fremstilles ved plade-lysat-metoden (T. Maniatis et al., ovenfor). En enkelt velisoleret positiv sig- 5 nalplet opsamles og resuspenderes i 1 ml SM. 100 /u1 af suspensionen adsorberes til 300,u1 af E. coli Y1090 (tilgængelig fra American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland) ved 37 C i 15 minutter, fortyndes med 10 ml LB-top-agarose, udhældes 10 jævnt på en 150 mm LB-ampicillin-plade og inkuberes natten over ved 42 C. Top-agarosen skrabes forsigtigt af med et flammebestrøget objektglas og overføres til et 30 ml Corex-rør. Der tilsættes 8 ml SM og 250 /u1 chloroform, hvorefter der blandes og inkuberes ved 15 37 C i 15 minutter. Lysatet klares ved centrifugering ved 10.000 oani 30 minutter på en HB-4-rotor. Fag-forrådet opbevares ved 4 C med 0,3% chloroform. 4. Fusionsprotein-fremstilling og -analyse. 20 LB-medium (Maniatis et al., ovenfor) podes i forholdet 1:50 med en frisk kultur fra natten over af E. coli K95 (sup, gal, strr, nusa; D. Friedman, ovenfor) og dyrkes til &I ORD- 550 -værdi på 0,5 ved 30 C. 25 ml af kulturen inficeres med PRV-fag ved en multi- 25 plicitet på 5 og inkuberes ved 42 C i et omrystnings- -vandbad i 25 minutter, efterfulgt af overføring til 37 C i 2-3 timer. Cellerne pelleteres ved 5.000 o/m i 10 minutter i HB-4-rotoren og resuspenderes i 100 /u1 100 mm Tris (ph-værdi 7,8), 300 mm NaCl. Der tilsættes 30 et lige så stort volumen af 2x SDS-PAGE-prøvepuffer, og prøven koges i 10 minutter. 5 /u1 af hver prøve analyseres ved elektroforese på analytiske SDS-polyacrylamidgeler som beskrevet af L. Morse et al., J. Virol. 26, s. 389-410 (1978). Fusionspolypeptid-præparaterne
19 DK 175072 B1 opskaleres 10 gange til injektion i mus. 8-Galactosidase/PRV-fusionspolypeptiderne isoleres efter farvning af en strimmel af gelen med Coomassie blue (L. Morse et al., ovenfor; K. Weber og M. Osborn, 5 The Proteins 1, s. 179-223 (1975)). Fusionspolypeptid- -mængderne vurderes ved analytisk SDS-PAGE. Cellelysaterne fra PRV-inficerede E. coli K95-kulturer underkastes elektroforese i 9,25%'s SDS-polyacrylamid-- geler. Overproducerede polypeptidbånd med molekylvægte 10 over 116.000, der ikke findes i 'Igt11-inficerede kon- troller, er 8-galactosidase-PRV-fusionspolypeptider. 8-Galactosidase-PRV-fusionspolypeptiderne har molekylvægte fra 129.000 til 158.000. Ca. 50-75 /ug fusionspolypeptid resuspenderes i komplet Freund's adjuvans 15 og injiceres subcutant og interperitonealt i hver mus. Senere injektioner foretages intraperitonealt i ukomplet Freund's adjuvans. 5. Antisera-analyse. 20 Immunopræcipitationer af 14 C-glucosamin-ICP'er, S-methionin-ICP'er og 14 C-glucosamin-gX gennemføres 25 som tidligere beskrevet (T.J. Rea et al., ovenfor). Disse metoder viser, at gi er isoleret i en Xgtll rekombinant fag. Denne fag betegnes X23 (gi). 6. %1-DNA-minipræparationer. Bakteriofager isoleres hurtigt fra pladelysater (T.J. Silhavy et al., Experiments With Gene 30 Fusions, (1984)). 5%'s og 40%'s glyceroltrin (3 ml af hver i SM-buffer) lægges i lag i et SW41-rør. Et pladelysat (ca. 6 ml) lægges i lag og centrifugeres ved.000 o/m i 60 minutter ved 4 C. Den ovenstående væske bortkastes, og den fremkomne fag-pellet resus-