Fordele og ulemper ved Immunocard STAT! CGE i forbindelse med detektionen af patogene parasitter i human fæces.

Fordele og ulemper ved Immunocard STAT! CGE i forbindelse med detektionen af patogene parasitter i human fæces. Pros and cons of Immunocard STAT! CGE in relation to the detection of pathogenic parasites in humane faeces. Anna abigail H. Schmidt, BA12s022, modul 14. Klinisk vejleder: Randi Michelsen Duus. University College Syddanmark vejleder: Pia Christensen. Mikrobiologisk klinik, Sygehus Sønderjylland, Sønderborg. University college Syddanmark, Esbjerg. Antal anslag: 52.493 Undertegnede bioanalytikerstuderende bekræfter herved, at besvarelsen er udfærdiget uden uretmæssig hjælp, jf Bekendtgørelse om prøver i erhvervsrettede videregående uddannelser nr. 1519 af 16/12/2013 kap. 5, 19 Dato: 15/12-2015 Underskrift: 15-12-2015

Forord: En særlig tak skal lyde til Dr. Med. Klinisk mikrobiologi og forskningslektor; Ming Cheng, mikrobiologisk klinik sygehus Sønderborg, for en enestående indsats i forhold til fremskaffelse af prøvemateriale til projektet. Derudover skal en speciel tak gives til Randi Duus Michelsen for at gå den ekstra mil som vejleder. Herudover et dybfølt tak til afdelingslæge og Ph.d.-studerende på mikrobiologisk klinik, Odense, Gitte Nyvang Hartmeyer, som på trods af hun ikke kender os velvilligt hjalp med at fremskaffe endnu mere prøvemateriale der hjalp enormt meget til at belyse den problemstilling vi havde valgt at undersøge. Desuden en stor tak til klinikkens ansatte, der altid stod klar med deres ekspertise og en hjælpende hånd samt godt humør og rummelighed overfor projektet. Sluttelig tak til Simoco diagnostics for en favorabel pris på immunocard-kittene til vores forsøg, så vi kunne få lov at teste langt flere end budgettet ellers ville tillade. 1

Abstract: Introduktion: Der ønskes at sammenligne immunocard STAT! CGE med den nuværende guld-standard; mikroskopi af Iod-formalin fikseret fæces, da metoden har visse problemer. Korrekt identifikation af Entamoeba species må regnes for en af de mest presserende, samt lang svartid og dårlige arbejdsstillinger. Det ønskes at højne patientsikkerheden og kvaliteten af analysesvaret. Formålet med forsøget er at finde ud af om immunocard STAT! CGE kan spare klinisk mikrobiologisk afdeling på sygehus Sønderborg for nogle negative mikroskopier. Metode: Begge analyser blev udført på 59 patient prøver, 30 kendte og 29 patient prøver. Resultater: Der blev beregnet diagnostisk sensitivitet og specificitet samt Cohen s kappa-koefficient for begge metoder, både før og efter nye oplysninger om PCR-konfirmering af prøverne på afdelingen. Disse viste dårlig enighed mht. identifikation af Entamoeba histolytica, men god overensstemmelse mht. identifikationen af Giardia lamblia. Konklusion: Det bør med visse forbehold overvejes at implementere analysen på afdelingen. 2

Indhold Forkortelser:... 5 Introduktion:... 5 Problembaggrund:... 5 Formål:... 6 Problemformulering:... 7 Teoretisk grundlag:... 7 Entamoeba histolytica:... 7 Giardia lamblia:... 8 Immunocard STAT! CGE:... 9 Kontrol af proceduren:... 10 Arbejdsmiljø Immunocard STAT! CGE:... 10 Mikroskopi af Iod-formalin fikseret fæces:... 10 Kontrol af proceduren:... 12 Arbejdsmiljø mikroskopi:... 12 Metode:... 12 Valg af metode:... 12 Den gyldne standard:... 12 Design:... 12 Fejlkilder:... 13 Præ og post-analytiske overvejelser:... 13 Litteratursøgning:... 14 Materialer:... 15 Prøveindsamling:... 16 Inklusions og eksklusionskriterier:... 16 Etik:... 16 Dataindsamling:... 18 Pilot projekt:... 18 Databearbejdning:... 19 Resultater:... 20 Diskussion:... 27 Præsentation og diskussion af resultaterne:... 27 Økonomi og arbejdsmiljø:... 29 3

Problemet med Entamoeba histolytica og manglende viden:... 30 Det etiske aspekt og fejlkilder:... 31 Sammenligning med et andet forsøg:... 32 Konklusion:... 33 Perspektivering:... 33 Referencer:... 35 Bilag 1:... 37 Bilag 2:... 39 Bilag 3:... 46 Bilag 4:... 51 4

Forkortelser: Herunder forkortelser af visse termer, der kan optræde på andre måder i opgaven. For eksempel fx Immunocard STAT! CGE immunocard Mikroskopi af Iod-formalin fikseret fæces mikroskopi Mikrobiologisk klinik sygehus Sønderborg MKS World Health organisation - WHO Immunoglobulin A og G IgA og IgG Polymerase chain reaction PCR Real-time polymerase chain reaction RT-PCR Introduktion: Problembaggrund: Parasitologi er et fag-område der løbende opdateres og der er inden for de sidste år kommet en del forskning på området. Fx ændrede WHO så sent som i 1997 hvad Entamoeba histolytica og Entamoeba dispar hed; de gik fra patogen og nonpatogen til at have hver deres respektive navn hvilket jo er lidt af en omvæltning.[1][2] På mikrobiologisk klinik i Sønderborg laves analysen for parasitter i øjeblikket ved at man mikroskoperer præparaterne ved hjælp af fx Iod-formalin fiksering, eller en udvalgt farvemetode. Denne metode kræver enormt stor erfaring fra bioanalytikerens side, og et vågent øje. Altså er der plads til menneskelige fejl i et relativt stort omfang. Derfor findes det relevant at undersøge om en metode som Immunocard STAT! CGE kortene kan give et bedre, hurtige og sikrere resultat. Dog er der visse komplikationer i forbindelse med dette, da det ikke er en helt billig metode, den er relativt ny og så kan den kun detektere tre slags parasitter; Entamoeba histolytica, Giardia lamblia og Cryptosporidium parvum. [3] Det vil desuden fra et grundlæggende kernefagligt synspunkt være ideelt at undersøge om den måde vi forholder os til identifikationen af patogene parasitter i humant prøvemateriale, 5

kendetegnes af vores fem grundlæggende værdier; faglighed, ansvarlighed, kvalitetsbevidsthed, professionalisme, og fællesskabsfølelse.[4] Disse parasitter er som oftest nogle man får med hjem fra en længerevarende udlandsrejse, og ses især ved indvandrere der har besøgt oprindelseslandet. Dog er der stadig en begrænset incidens.[5] I Giardia lamblia s tilfælde er det omkring 2-4 % af de patienter med rejse-associeret diarre der er positive herfor, dog er der ingen overvågning af denne i Danmark så det er svært at sige hvor mange der rent faktisk bliver inficeret årligt.[6] Entamoeba histolytica er som Giardia lamblia heller ikke anmeldelsespligtig eller under overvågning, så igen er det svært at sige hvor mange tilfælde der er på årlig basis. Det estimeres af statens serum institut at der er omkring 100 tilfælde af Entamoeba histolytica infesteringer årligt, men de fagfolk vi har talt med (blandt andet mikrobiologisk klinik Sønderborg s overlæge og en afdelingslæge fra mikrobiologisk klinik i Odense) udtaler at tallet er meget højt sat efter deres professionelle mening. Det var desuden enormt svært at finde positivt materiale, i form af fæces, til vores projekt der indeholdt denne protozo af samme årsag. Man er meget interesseret i at kunne detektere denne parasit, da den kan invadere andet væv og være enormt skadelig. Nærmere herom i teoriafsnittet.[7] Vi ved på nuværende tidspunkt ikke om immunocard STAT! CGE kan erstatte den nuværende procedure (mikroskopi) på mikrobiologisk klinik i Sønderborg, men dette ønsker vi at forsøge afdækket ved hjælp af denne undersøgelse og erfaringer fra andre brugere af metoden, samt videnskabelig litteratur om emnet. Formål: Formålet med denne opgave er at afdække om immunocard STAT! CGE kan erstatte eller supplere nuværende procedure på mikrobiologisk klinik, sygehus Sønderborg og om muligt forbedre kvaliteten af analysen for parasitter i fæces, for dermed om muligt at forbedre patientsikkerheden, arbejdsmiljøet og svar-tiden på analysen. Herudover ønsker vi at kigge nærmere på om implementeringen af immunocard STAT! CGE analysen eventuelt vil kunne åbne op for implementering af yderlige af denne type analyser, og om immunkemiske analyser i et bredere perspektiv kan løfte nogle af de byrder der til daglig er inden for det mikrobiologiske 6

felt så som arbejdsmiljømæssige problematikker med fastlåste stillinger, omgang med kemikalier og indånding af dampe/sporer under arbejdets udførelse. Problemformulering: Hvordan er diagnostisk sensitivitet og diagnostisk specificitet for mikroskopi af Iod formalin fikseret fæces sammenlignet med ImmunoCard STAT! CGE ved detektion af følgende parasitter; Giardia lamblia og Entamoeba histolytica? Hvilke fordele og ulemper er der ved at anvende den ene metode frem for den anden, og vil ImmunoCard STAT! CGE kunne nedbringe antallet af undersøgelser af negative mikroskopier for Giardia lamblia og Entamoeba histolytica? Teoretisk grundlag: Entamoeba histolytica: Entamoeba histolytica er en protozo, hvilket vil sige det er en encellet eukaryot mikroorganisme. Der findes enormt mange arter, men kun nogle ganske få er patogene for mennesker.[8] Protozoen Entamoeba histolytica er vidt udbredt i subtropiske og tropiske egne, og har to stadier; cystestadiet hvor den udskilles fra værten og er smittefarlig, og et trophozoit stadie hvor den forårsager sygdommen amøbedysenteri. Lige netop Entamoeba histolytica kan lysere væv, under infektionen med den infiltrerer den tarmvæggene og kan sprede sig til andet væv, og ses især ofte i leveren i form af abscesser.[7][8] Celleopbygningen er med en organiseret kernestruktur, et relativt stort genom og omgivet af en kernemembran. Derudover indeholde cellerne talrige organeller så som ribosomer, golgiapperat og lignende. I trophozoit stadiet deler de sig ved binær fission i en process der minder om mitose hvor de i tarmvæggen kan spredes hæmatogent, i dette stadie er de endvidere store celler på mellem 10-60 µm, og er her yderst mobile. De har talrige pseudopodier og nogle mindre filiforme processer også kaldet filipodier, disse fungerer som adhæsiner så de kan hænge fast i tarmvæggen. Herefter frigøres en række enzymer der slår celler ihjel og nogle peptider der laver hul i cellemembranen på disse, så Entamoeba histolytica kan penetrere tarmvæggen. [8] Grundet denne invaderings process vil der opstå små blødende sår i tarmvæggen, og dermed en inflammatorisk reaktion. Under denne inflammatoriske reaktion udsendes komplementfaktorer og IgG og IgA antistoffer, hvor Entamoeba histolytica dog har et relativt godt forsvar mod disse 7

da den simpelthen kan nedbryde dem ved hjælp af enzymer. Der opbygges tilsyneladende ingen immunitet på trods af udskillelsen af antistoffer. Selvom dette lyder voldsomt er det langt fra alle tilfælde af infektion med Entamoeba histolytica der giver symptomer. I tyktarmen sker der en udvikling af nogle af trophozoitterne til cyster, så de kan udskilles med fæces og indtages af nye værter. Disse cyster er mellem 10-16 µm og derudover sfæriske og ubevægelige. Til at starte med indeholder de kun én kerne, men denne deler sig så der slutteligt er fire kerner. Disse cyster kan grundet deres solide cellevæg overleve i flere uger udenfor en værts-organisme, og er desuden enormt modstandsdygtige overfor fx klor. Der dannes fra hver cyste 4-8 trophozoitter.[8] Sygdomsbilledet er meget forskelligt fra person til person, hvor nogle blot er raske smittebærere er der nogle individer der bliver så infesteret at de uden korrekt behandling af eksperter risikerer livet. Dette skyldes blandt andet Entamoeba histolytica s evne til at lysere væv, hvor der så ses vævsnekrose i fx leveren hvor der opstår en abcess og/eller lungesymptomer. Dette kaldes entamoebiasis, og rammer oftere unge mænd end andre aldersgrupper og køn. Dødeligheden er ubehandlet meget høj årligt er der mellem 40.000 til 100.000 dødsfald på verdensplan.[9] Behandlingen er typisk i Danmark metronidazol kombineret med et amøbicid fx diloxanid furoat. I nogle tilfælde vil man desuden være nød til at foretage en kirurgisk drænage af store abscesser, for eksempel i leveren.[7][8] Giardia lamblia: Giardia lamblia er en flagellat, fordi den i trophozoit stadiet har 8 flageller. [8] Den har ligesom Entamoeba histolytica to stadier; trophozoit og cyste. Cysterne udskilles også her med fæces og indtages oralt. Cysterne deler sig til trophozoitter i tyndarmen, disse er pæreformede ca. 15 µm lang og 7 µm bred, med førnævnte flageller. De bøjer foran lidt indad, så denne side kan fungere som sugekop i forbindelse med adhæsion til tarmepithelet.[8] Cysterne er ovale og omkring 10 x 8 µm, indeholdende 4 kerner, disse kan overleve i måneder uden en værtsorganisme grudnet deres hårdførhed. Parasitten er relativt udbredt i udviklingsland, og i vores del af verden er ca. 1-7 % inficeret med den. Den smitter også fx hunde og katte, så smitten kan på denne måde gå fra disse til mennesker via afføring fra dyrene. I modsætning til Entamoeba histolytica ses denne også som epidemier i fx daginstitutioner, dog ret sjældent.[8] 8

Når trophozoitterne adhærerer til tarmvæggene sker der efterhånden en nedbrydelse af strukturerne i tarmen, blandt andet mikrovilli, dette kan resultere i malabsorption af føden der indtages. Hos langt de fleste inficerede individer ses en ukarakteristisk diarre, evt. slimet, men som regel uden blod. Behandlingen består som regel af metronidazol, dog går sygdommen som regel i sig selv efter et vist stykke tid.[8] Immunocard STAT! CGE: Immunocard STAT! CGE er en hurtig in vitro analyse, baseret på en kvalitativ immunokromatografisk teknik hvor farvede micro-latexpartikler der er kovalent bundet til monoklonale antistoffer, kan danne komplekser med parasitternes antigener. De forskellige parasit-antistoffer i kortet kendetegnes af hver deres farve; blå kovalent bundet til anticryptosporidium antistoffer, rød kovalent bundet til anti-giardia-lamblia antistoffer og grøn kovalent bundet til anti-entamoeba-histolytica antistoffer. Antistofferne bevæger sig efter blanding med prøvematerialet og afpippetering i hullet i kortet, op gennem membranen sammen med eventuelle parasitter som et kompleks (såfremt prøven er positiv vil parasittens antigener her være bundet til den antistof og farvestof-coatede latex partikel). I denne membran er der immobiliserede monoklonale antistoffer mod Entamoeba histolytica, Giardia lamblia og Cryptosporidium parvum, der så vil binde sig til de aktiverede komplekser og derved vil man kunne se en farvet streg på kortet som det ses på billede 1, herunder.[10] Prøvematerialet, der er ganske almindelig fæces i transportrør, opblandes i 1 ml diluent, vortexmixes grundigt og henstilles i 5 minutter. Alternativt kan man centrifugere den diluterede prøve i 5 minutter ved 3000 rpm. Når prøven har bundfældet sig overføres 125 µl af supernantanten ved afpippetering til hullet i immunocardet, og dette inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Herefter kan resultatet aflæses, dette skal gøres indenfor 1 minut.[10] Billede 1 (eget billede fra d.20/10-2015, her ses immunocardet, hvor vi til højre ser hullet til at afpippetere prøvematerialet i, i midten ses resultat-vinduet der i dette tilfælde er positiv i alle, da den positive kontrol er brugt.) 9

Kontrol af proceduren: Til forsøget er den positive kontrol fra producenten brugt, og en kendt negativ prøve er brugt som negativ kontrol. Da metoden endnu ikke er implementeret er det svært at udtale sig om hvilke kontroller afdelingen har påtænkt at bruge, men man kunne forestille sig noget i retning af den kontrol meridian bioscience selv producerer (positiv kontrol) og en kendt negativ kontrol som afdelingen selv fremstiller til daglig brug. Herudover kunne man eventuelt overveje eksterne kontroller i form af fx at følge et program fra UKNEQAS hvor man får tilsendt prøver med en fast rate og de fører statstik omkring genfindingsprocenten og kvaliteten af analysen. [11] Arbejdsmiljø Immunocard STAT! CGE: Der skal ikke umiddelbart tages specielle hensyn i forbindelse med denne analyse, dog skal man være opmærksom på at det er fæces der arbejdes med og dermed kan der være patogene agenter i. Der bør foretages håndsvask og afspritning efter endt arbejde. proceduren bør udføres med handsker på, og prøvematerialet og de brugte immunocards bør komme i risikoaffaldsspanden. Diluent-mediet indeholder sodium azide, der kan reagere med forskellige metaller og bør derfor skylles ud i vasken med rigelige mængder vand og man bør undgå at hælde det i afløb der består af kobber eller bly, da dette kan udskille eksplosive gasser.[10] Mikroskopi af Iod-formalin fikseret fæces: Den gyldne standard indenfor identificering af parasitter i fæces har gennem mange år været mikroskopi, og eventuel farvning alt efter hvilke parasitter der undersøges for. På mikrobiologisk klinik i Sønderborg gøres dette på følgende måde: Mikroskopi af fæces for parasitter foregår på den måde at prøven bliver leveret til klinikken i et transportrør, disse opbevares ved stuetemperatur eller i køleskab ved længere tids opbevaring. Inden mikroskopering skal prøven opkoncentreres for ormeæg, trofozoitter og flagellater. Dette forgår ved at man udtager en cirka 6 mm. stor klump fæces i dybden fra en fast prøve, eller hvad der svarer til cirka. 0,5 gram af en flydende prøve. Dette røres op i et mini parasep faecal parasite concentrator prøverør hvor der i forvejen er tilsat 2,4 ml 10% formalin, 0,9 ml 10

ethylacetat og en dråbe triton X-100, dette gøres for at opløse fedt, samt konservere prøvematerialet under henstanden. Mini parasep systemet skrues sammen og skal nu henstå i 1-24 timer, hvorefter man vender systemet med spidsen nedad og centrifugerer prøvematerialet igennem filtersystemet 1 minut ved 3000 rpm. Nu skrues den øverste del af systemet af, og de øverste faser hældes fra i en opsamlingsflaske til risikoaffald, og der aftørres for fedtrester og lign med en vatpind. Sedimentet i bunden af prøverøret opslemmes i 4 % jod opløsning til det har den ønskede konsistens, bliver den for tyk eller tynd gør det mikroskoperingen vanskelig. Dette gøres for at opnå den ønskede farvning af præparatet. Der monteres dækglas og prøven mikroskoperes ved lysfeltmikroskopi ved 16X, 20X, eller 40X forstørrelse. Der kan foruden orm, æg og cyster findes Charcot-Leyden krystaller under mikroskopering, disse kan eventuelt tyde på en positiv prøve og bør bemærkes og resultere i grundig mikroskopering. De kan både være tegn på infektionstilstande, allergier og parasit infestation af patienten.[12] Herunder ses en prøve der er lagt op og klar til mikroskopering under udsug ved 20X forstørrelse.[billede 2] Billede 2 11

(Eget billede taget d 12/10-2015, mikroskop med udsug.) Kontrol af proceduren: Mikrobiologisk klinik sygehus Sønderjylland deltager i et ekstern kontrol program udarbejdet af UKNEQAS[12][11] Arbejdsmiljø mikroskopi: Da der arbejdes med fæces bør dette gøres med forsigtighed af udannet personale, da fæces kan indeholde patogene agenter. Der bør foretages håndvask og afspritning efter endt arbejde. I forbindelse med arbejdet med formalin (10%) og ethylacetat henvises til afdelingens arbejdsmiljø instruks, hvor der står at man bør arbejde under sug og med handsker da der er fare for at få det på huden og alle ansatte er derfor bekendt med hvordan man forholder sig under arbejdet med førnævnte kemikalier. Der står desuden instrukser på arbejdspladserne. Bortskaffelse af prøvemateriale og resterende kemikalier sker i en beholder under sug i en godkendt plastflaske.[13] Metode: Valg af metode: Metoden er valgt med det mål for øje at belyse problemformuleringens spørgsmål bedst muligt, hvilket er forsøgt gjort ved hjælp af en sammenligning af mikroskopi af iod-formalin fikseret fæces og immunocard STAT! CGE. Den gyldne standard: I forsøget betragtes mikroskopi af Iod-formalin fikseret fæces som den gyldne standard, da det er den metode der bruges på mikrobiologisk klinik sygehus Sønderborg, og som man traditionelt set har brugt.[12][2] Design: Forsøget var designet på en måde så det forløb over to uger fra d 19/10-2015 til den 30/10-2015. [bilag 1] 12

Forsøget forløb i dette tidsrum på den måde at den foregående dag sluttede af med at gøre klar til mikroskopi af iod-formalin-fikseret fæces i mini parasep feacal parasite concentrator, så der dagen efter kunne centrifugeres og disse prøver kunne lægges op. Herefter blev prøverne mikroskoperet ved 40x og 16x forstørrelse, ved et mikroskop med udsug. Efterfølgende blev samme prøver fra dagen før slemmet op i immunocard STAT! CGE diluenten, de fik lov til at bundfælde, der blev overført 125 µl til kortet og herefter fulgte en aflæsning af dem efter 10 minutter. For specifikke detaljer se forsøgsbeskrivelsen. [bilag 2] Forsøget er baseret på at ønsket om at sammenligne de to metoder, dette gøres i praksis ved at se hvordan resultaterne ser ud i forhold til hinanden ved hjælp af beregning af sensitivitet og specificitet for henholdsvis immunocard STAT! CGE og mikroskopi af Iod-formalin fikseret fæces, hvorefter resultaterne vil blivefremstillet ved hjælp af tabeller og betydningen af dette diskuteres senere i opgaven. I dette forsøg betragtes mikroskopi af Iod-formalin fikseret fæces som den gyldne standard, og der arbejdes med data herudfra. Der er fra anden side lavet PCRanalyser på nogle af prøverne, der også kan inddrages i diskussionen og sammenligningen. Fejlkilder: Af fejlkilder kan nævnes; manglende mikroskopi erfaring, forkert afpippetering, for tykt/tyndtflydende materiale, forkert fortyndingsforhold under mikroskopien eller til immunocard-analysen, frysning og optøning af prøvematerialet, transport af prøvematerialet, menneskelige fejl såsom forkert mærkning af prøver, eller forkert nedskrivning af resultaterne selvom vi har forsøgt at sikre os det ikke er sket og lignende. Præ og post-analytiske overvejelser: Under forsøget er især det positive prøvematerialet blevet frosset og optøet. Dette er forsøgt undgået at gøre for meget, og i den tid prøvematerialet har været i brug/henstået har det stået på køl. Det frarådes ved immunocard STAT! CGE at fryse prøvematerialet for mange gange, da dette kan have betydning for analysen kvalitet.[10] prøvematerialet er desuden blevet transporteret fra forskellige sygehuse i, så vidt vides, isolerede kasser. Patientprøverne er blevet behandlet som almindelige patientprøver, der efter analyse ved mikroskopi henstår på køl i en uge og derefter bortskaffes. Der er blevet taget forholdsregler for at undgå kontaminering af prøvematerialet og arbejdsområdet, dette er gjort ved hyppig og grundig håndhygiejne, samt brug af personlige værnemidler der blev skiftet efter behov. 13

Litteratursøgning: Fokusområdet for søgninger har været at finde relevant og nylig-udgivet litteratur omhandlende immunocard STAT! CGE og mikroskopi af Iod-formalin fikseret fæces, eventuelt i forbindelse med implementering af immunocard STAT! CGE metoden. Derudover har fokus været på det teoretiske aspekt omkring Entamoeba histolytica og Giardia lamblia, samt de metoder der er brug under forsøget. Litteraturen skal søge at give svar på hvilke fordele og ulemper der er ved den ene analyse fremfor den anden, samt på hvilke måder antallet af negative mikroskopier kan nedbringes. Der er brug for fagligt relevant viden, samt den nyeste og mest relevante viden inden for feltet der kan bidrage positivt til besvarelse af problemformuleringen. Der søges især efter primær litteratur, og/eller cohorte studier der sammenholder flere forskellige artiklers resultater. Der er primært søgt på PubMed, google.dk og google scholar. Nogle af de tekster der er fundet på google scholar er blevet søgt gennem PubMed for at få adgang til hele teksten. Ud fra de artikler, hjemmesider og lignende der er blevet fundet ud fra nedenstående termer er der gået systematisk videre igennem deres kilder hvis der var noget der fandtes relevant og på den måde er der blevet gennemgået en stor og bred mængde information om emnet. Dette er også kendt som en kaskadesøgning. [14] Der er søgt på følgende termer som udgangspunkt, hvorefter der er blevet stillet på søgefiltrene for at skille det relevante fra; for eksempel udgivelsesår, sprog. Herefter er der suppleret med søgninger på de kilder der fandtes gennem de første artikler og lign. Pubmed: Giardia lamblia Giardia lamblia AND immunocard Giardia lamblia antigenic variation Antigenic variation in giardia lamblia Entamoeba histolytica Google og google scholar: Giardia lamblia Giardia lamblia AND immunocard 14

Immunocard STAT! CGE Meridian bioscience Simoco Dpdx parasitology Statens serum institut parasitter Charcot leyden krystaller Materialer: - 3 X Immunocard STAT! CGE kits med 20 immunocards + en diluent-væske i hver pakke lotnummer: 751420.008 udløb 2016-09-30-0,5 ml Positiv kontrol til immunocard STAT! CGE lotnummer: 751403 udløb 2016-03- 31 - Eppendorf centrifuge 5810 - Nikon eclipse E400 mikroskop - Triton X-100-4% neutral buffet formaldehyd fremstillet d 7/4-2015 - Iod lot nummer 295032435 - Etylacetat indexnummer: 607-022-00-5 udløb 2018/08/31 - Objektglas fra SARSTEDT lot Nummer: 5104984 - Dækglas lot nummer: 28064017 - Mini Parasep Faecal Parasite Cencentrator fra Apacor lot: 4015 ref: 146000 - Øser - Engangspipetter fra SARSTEDT Lot. Nummer: 094515089010 - Vådkammer til opbevaring af de færdige objektglas - Pipettespidser 200 µl - Pipette eppendorf research plus 20-200 µl nr. 3556189 - Reagensglas - Vatpinde fra SARSTEDT lot. 15.05.15 15

Prøveindsamling: Vi har med hjælp fra personalet på mikrobiologisk klinik sygehus Sønderborg indsamlet positive prøver inden forsøgets start. Dette vil sige fra Juni og frem til forsøgets start, nogle af prøverne fik vi desuden først efter forsøgets start da muligheden bød sig. Derudover har klinikkens overlæge Ming Cheng og en besøgende afdelingslæge fra mikrobiologisk klinik i Odense, Gitte Nyvang Hartmeyer suppleret med positive prøver fra andre sygehuse. (rigshospitalet og Odense universitetshospital) vi har desuden brugt tilfældigt udvalgte patientprøver der ved mikroskopi af erfarne bioanalytikere blev kendt negative. Inklusions og eksklusionskriterier: For at en prøve kunne blive inkluderet i forsøget måtte den gå ind under følgende kriterier: det skal helst være frisk human fæces, og altså u-fikseret i for eksempel formalin. Vi har medtaget de fleste positive prøver vi overhovedet kunne få fat på for at se om kortet krydsreagerede med nogle af disse, men at foretrække var selvfølgelig Entamoeba histolytica og Giardia lambliapositive prøver, da det er disse vi i problemformuleringen undersøger for. Dog er det ønskværdigt med andre typer også, for at identificere eventuelle krydsreaktioner. Prøver der enten ikke var fæces, var behandlede med formalin eller indeholdt andre typer parasitter er principielt ekskluderet fra forsøget og bliver regnet for negative de der ikke sås noen krydsreaktion. Selvom kortet kan påvise cryptosporidier har vi valgt at eksludere disse da tiden ikke tillod at vi undersøgte for disse med Ziehl-neelsen farvning, og det økonomisk og omfangsmæssigt ville blive for meget. Etik: Alle prøver var anonymiseret, så det ikke var os bekendt hvem patienten var uden at slå det op i en database, dog vidste vi hvad der var fundet i prøverne før ved henholdsvis mikroskopi eller polymerase chain reaction (PCR). Derudover har vi et dokument hvor vores numre er linket til prøvenumrene hvis der skulle opstå tvivl om indholdet. Dette dokument er aldrig lagt ud steder hvor der er adgang til dem, som for eksempel i vores gruppe på facebook, i mails eller lignende. Det er kun blevet delt mellem de to gruppemedlemmer på usb-stik. 16

Forsøget er forsøgt udført til mindst mulig gene for afdelingens personale, og de prøver der er blevet anvendt er blevet udvalgt efter at der var nok materiale til eventuel re-analyse på afdelingen hvis det skulle blive nødvendigt. Af samme årsag menes forsøget ikke at påvirke patienters behandlingsforløb. Forsøgets formål er blevet fremlagt for afdelingen på et møde. Her blev talt om hvad projektet omhandler, og hvordan det kan komme til at påvirke personalet. I denne forbindelse opfordredes der til åben dialog omkring det, samt hvor eventuelle indvendinger kunne rettes til hvis forsøget skulle være til gene for afdelingens personel. Inden for konsekvensetikken står det gode liv, altså lykken, som det endelige mål til alle tider. Det vil altså sige at konsekvenserne/målet tilegnes en stor værdi. Her bruges den kendte sætning: målet helliger midlet ofte for at synliggøre hvad denne teori så at sige handler om. Inden for pligtetikken er der fokus på hvordan man handler, og altså ikke kun målet/konsekvensen. Her anvendes pligter som målestok for om man gør det rigtige, dette kan for eksempel være love og regler eller normer, og konsekvenserne tages her ikke på samme måde i betragtning som i konsekvensetikken.[4] Inden for mikrobiologien kan det ofte være svært at få øje på det etiske aspekt, da den direkte patientkontakt er fraværende. Dog kan det for eksempel være vigtigt at tænke over hvordan prøvematerialet for omtales og behandles vi har blandt andet været opmærksomme på at tale ordentligt om prøvematerialet, og fremfor at kalde det lort eller lignende valgt at kalde det fæces, da vi ud fra vores viden om pligtetik føler at det er normen, altså vores pligt, at behandle prøvematerialet med respekt og omhu. Dette føler vi også er rart for patienterne at vide, da det for nogle kan være svært grænseoverskridende at levere en fæces-prøve. Der er visse love og regler på området når det kommer til studerendes brug og omgang med personfølsomme data. Disse love og regler står datatilsynet blandt andet for at håndhæve og informere om. Vi er som bachelorstuderende på en proffesionshøjskole undtaget fra at indhente samtykke grundet disse regler, det andet krav for at være undtaget er at man indhenter udtrykkeligt samtykke ved indsamling af personoplysninger.[15] udover at dette krav er opfyldt, gør sundhedsloven sig gældende såfremt man ikke er bachelorstuderende.[16] Ved nogle forsøg kan det være nødvendigt at få forsøget godkendt ved videnskabsetiske komite, specielt hvis det involverer mennesker, dyr, eller biologisk materiale fra mennesker.[17] 17

Dataindsamling: Forsøget er udført af Søren Culmbach Lund, samt Anna abigail Hansen Schmidt. Alle resultater er så vidt muligt fotograferet for at kunne dokumentere dem senere i forløbet. Dette var dog ikke muligt under mikroskopi arbejdet. Vi analyserede kendt positive fæces prøver, samt tilfældigt udvalgte kendt-negative fæces prøver. Analyserne blev udført i henhold til forskriften på mikrobiologisk klinik sygehus Sønderjylland for tarmpatogene parasitter, orm, æg og cyster.[12] og i henhold til package-insert og folder fra immunocard STAT! CGE kittene.[3][10] For at minimere fejlkilder er der så vidt muligt brugt samme LOT-nummer af alle utensilier, samt medtaget en positiv og negativ kontrol ved immunocard STAT! CGE analysen. Mikrobiologisk klinik sygehus Sønderjylland deltager desuden i UKNEQUAS kvalitetssikringsprogram af mikroskopi af Iod-formalin fikseret fæces.[11] Opgaverne blev opdelt i etaper, så en fx om mandagen lagde mikroskopi præparater op mens den anden mikroskoperede og omvendt tirsdag. Vi skiftedes desuden til at lave immunocard STAT! CGE analysen. På denne måde lavede begge stort set samme mængde arbejde, og det var umiddelbart det mest tidsbesparende og kvalitetsmæssigt forsvarlige da der på denne måde er taget hensyn til at begge har været lige meget inde over forsøget rent praktisk. Der er desværre ikke skrevet ned præcis hvornår hvem, gjorde hvad. Dette burde der nok være blevet gjort, set i bagklogskabens lys, da det ville kunne belyse eventuelle systematiske forskelligheder og blotlægge eventuelle fejlkilder. Pilot projekt: Der blev ikke udført et pilot projekt, blandt andet fordi immunocard STAT! CGE kortene er dyre i indkøb. Derudover er det svært at få egnet positivt materiale, hvor vi for eksempel først fik noget af det efter forsøget var blevet indledt og det var vigtigt at der var nok til selve forsøget. 18

Databearbejdning: - Til at belyse hvordan diagnostisk sensitivitet og specificitet er for mikroskopien af iodformalin fikseret fæces i forhold til den diagnostiske sensitivitet og specificitet for immunocard beregnes disse parametre for henholdsvis mikroskopi og immunocards evne til at finde de to parasitter. - Til dette bruges følgende formler: diagnostisk sensitivitet = sandt positive antal syge 100 diagnostisk specificitet = sandt negative antal raske 100 - Der laves ikke-vægtet kappa-statistik på immunocard STAT! CGE overfor mikroskopi af Iod-formalin fikseret fæces for begge arter (Giardia lamblia og Entamoeba histolytica), for at finde ud af hvor god overensstemmelse der er mellem de to metoder ifølge Cohens kappa-koefficient. Til dette er der blevet brugt følgende formel: - Efter påbegyndelsen af opgaven er det kommet frem ved PCR-konfirmation at de Entamoeba histolytica prøver der er brugt til forsøget må betragtes som værende Entamoeba dispar. Derfor regnes diagnostisk sensitivitet og specificitet for disse både før og efter disse nye oplysninger. 19

Resultater: ID: Der medtages KUN de arter i resultaterne, som vi kigger efter; det vil sige Entamoeba histolytica og Giardia lamblia! For yderlige resultater se [bilag 3] Resultater mikroskopi: Resultater immunocard STAT! CGE: Forventet resultat: Kommentarer: K1 Neg neg Strongyloides stercoralis K2 Entamoeba Neg E. coli Lidt materiale. cyster K3 Neg neg Negativ - Vi bruger denne som intern kendt negativ kontrol. - Lidt prøvemateriale. K4 Entamoeba Neg Enkelte e coli cyster K5 Neg Neg Enterobius vermicuaris K6 Entamoeba neg E coli cyster K7 Muligt fund af Pos giardia GL giardia cyster. K8 Entamoeba Neg Histolytica cyster* K9 Muligt fund af Pos giardia GL + crypto giardia cyster K10 Entamoeba Neg Hist cyster* K11 Pos giardia Pos giardia gl K12 Entamoeba Neg Histolytica cyster* K13 Muligt fund af giardia cyster. Pos giardia GL Lidt prøvemateriale. K14 Muligt fund af giardia cyster. Pos giardia GL Lidt prøvemateriale. K15 Neg Neg Histolytica K16 Entamoeba Neg E.Dispar Pcr konfirmeret! cyster K17 Muligt fund af Pos giardia Gl + crypto giardia cyster. K18 Neg Neg Crypto K19 Neg Neg Crypto K20 Neg Neg TT + AL????? K21 Giardia cyster Pos giardia GL K22 Neg Neg Crypto 20

K23 Entamoeba cyster Neg Blastocytis hominis, endolinax nana, entamoeba coli, ent. Hominis. K24 Neg Pos giardia GL K25 Pos giardia Pos giardia GL + histolytica K26 Entamoeba cyste Neg Coli cyster Ikke pcrkonfirmeret. K27 Muligt fund af Neg Dispar entamoeba cyste K28 Neg Neg Dispar Lidt materiale. K29 Neg Neg Dispar K30 Neg Neg Dispar P1 Neg Neg Neg P2 Neg Neg Neg P3 Neg Neg Neg P4 Neg Neg Neg P5 Neg Neg Neg P6 Neg Neg Neg P7 Neg Neg Neg P8 Neg Neg Neg P9 Neg Neg Neg P10 Neg Neg Neg Barn hostede spol-orm op. P11 Neg Neg Neg P12 Neg Neg Neg P13 Neg Neg Neg P14 Neg Neg Neg P15 Neg Neg Neg P16 Neg Neg Neg P17 Neg Neg Neg P18 Neg Neg Neg P19 Neg Neg Neg P20 Neg Neg Neg P21 Neg Neg Neg P22 Neg Neg Neg P23 Neg Neg Neg P24 Neg Neg Neg P25 Neg Neg Neg P26 Neg Neg Neg P27 Neg Neg Neg P28 Neg Neg Neg P29 Neg Neg Neg I alt: 59 prøver 10 entamoeba species, i alt, heraf: 7 coli/dispar, og 3 histolytica. 0 entamoeba species, i alt. 0 entamoeba histolytica. 9 Giardia 15 entamoeba species i alt, heraf: 10 coli/dispar, og 5 histolytica. 21

8 giardia lamblia. lamblia. 9 giardia lamblia. Tabel 1 Farvekoder i skemaet: Rød: giardia lamblia blå: entamoeba histolytica grøn: entamoeba species *Hvor entamoeba histolytica forventes og der er fund af entamoeba cyster under mikroskopien, betragtes disses om histolytica og er derfor markeret med blå skrift i mikroskopi-kolonnen. - Alle kontroller indbygget i kortet fungerede planmæssigt og blev pænt positive. Den positive kontrol fra producenten af immunocard STAT! CGE blev pænt positiv som det ses på billede 1. Giardia lamblia: Sensitivitet og specificitet immunocard: syg rask i alt positiv 9 (sp) 0 (fp) 9 (positive) negativ 0 (Fn) 50 (sn) 50 (negative) i alt sensitivitet: 9 (antal syge) 50 (antal raske) specificitet: 59 (antal undersøgte) Tabel 2 Her ses den diagnostiske sensitivitet og specificitet for Giardia lamblia ved immunocard STAT! CGE 100 % 100 % 22

Entamoeba Histolytica: syg rask i alt positiv 0 (sp) 0 (fp) 0 (positive) negativ 5(fn) 54 (sn) 59 (negative) i alt sensitivitet: 5 (antal syge) 54 (antal raske) specificitet: 0 % 100 % 59 (antal undersøgte) Tabel 3: Her ses diagnostisk sensitivitet og specificitet for Entamoeba histolytica ved immunocard STAT! CGE før PCR. Efter pcr bekræftelse: Entamoeba histolytica: syg rask i alt positiv 0 (sp) 0 (fp) 0 (positive) negativ 0(fn) 59 (sn) 59 (negative) i alt sensitivitet: 0 (antal syge) 59 (antal raske) specificitet: 59 (antal undersøgte) Tabel 4: Her ses diagnostisk sensitivitet og specificitet for Entamoeba histolytica ved immunocard STAT! CGE efter PCR. 0 % 100 % 23

Sensitivitet og specificitet mikroskopi: Giardia lamblia: syg rask i alt positiv 8 (sp) 0 (fp) 8 (positive) negativ 1 (Fn) 50 (sn) 51 (negative) i alt sensitivitet: 9 (antal syge) 50 (antal raske) specificitet: 59 (antal undersøgte) Tabel 5: Her ses den diagnostiske sensitivitet og specificitet for Giardia lamblia ved mikroskopi. 88,89 % 100 % Tabel 6: Entamoeba Histolytica: syg rask i alt positiv 4 (sp) 0 (fp) 4 (positive) negativ 1 (fn) 54 (sn) 55 (negative) i alt 5 (antal syge) 54 (antal raske) 59 (antal undersøgte) Her ses diagnostisk sensitivitet og specificitet for Entamoeba histolytica ved mikroskopi før PCR. sensitivitet: specificitet: 80 % 100 % 24

Efter pcr-bekræftelse: Entamoeba histolytica: syg rask i alt positiv 0 (sp) 0 (fp) 0 (positive) negativ 0 (fn) 59 (sn) 59 (negative) i alt sensitivitet: 0 (antal syge) 59 (antal raske) specificitet: 59 (antal undersøgte) Tabel 7: Her ses diagnostisk sensitivitet og specificitet for Entamoeba histolytica ved mikroskopi efter PCR. 0 % 100 % Cohens Kappa-koeficient: Entamoeba histolytica: Før PCR: immunocard pos neg total mikroskopi pos 0 4 4 neg 0 55 55 total 0 59 59 observerede overenstemmelser Po 0,932 enighed: 55 total: 59 tilfældige overenstemmelser Pt 0,932 Tabel 8: Her ses Cohen s kappa-koefficient for Entamoeba histolytica før PCR. kappa koefficient: 0 25

Efter PCR bekræftelse: Entamoeba histolytica immunocard pos neg total mikroskopi pos 0 0 0 neg 0 0 0 total 0 0 59 observerede overenstemmelser Po 0,000 enighed: 0 total: 59 tilfældige overenstemmelser Pt 0,000 Tabel 9: Her ses Cohen s kappa-koefficient for Entamoeba histolytica efter PCR. kappa koefficient: 0 Giardia lamblia: immunocard pos neg total mikroskopi pos 8 0 8 neg 1 50 51 total 9 50 59 Tabel 10: Her ses Cohen s kappa-koefficient for Giardia lamblia. observerede overenstemmelser Po 0,983 enighed: 58 total: 59 tilfældige overenstemmelser Pt 0,753 kappa koefficient: 0,931 26

Diskussion: Præsentation og diskussion af resultaterne: Ud fra resultaterne ses nogle ret specielle ting. Beregningerne af den diagnostiske sensitivitet og specificitet for henholdsvis Giardia lamblia og Entamoeba histolytica virker umiddelbart ret lige til; for Giardia lamblia ses en rigtig god både diagnostisk sensitivitet og specificitet både under mikroskopien og ved brug af immunocard STAT! CGE, i Entamoeba histolytica s tilfælde er det noget mere indviklet. Her ser vi nogle enormt forskellige resultater. Ved brug af immunocard STAT! CGE ser vi en diagnostisk sensitivitet på 0 % både før og efter vi fik melding om at vi godt kunne regne med alle vores Entamoeba histolytica faktisk var Entamoeba dispar af afdelingens overlæge. Se tabel 3 + 4. Sensitiviteten fortæller her noget om analysens evne til at definere syge patienter, som værende syge. [18] denne lave sensitivitet kan muligvis skyldes at det rent faktisk viser sig at forsøget ikke har inkluderet nogle syge, altså Entamoeba histolytica inficerede patienter, da det er enormt svært at finde prøvemateriale fra sådanne patienter her i Danmark. Noget der taler for dette er at vores positive kontrol blev rigtig flot positiv i alle tre identificerbare arter, men denne kontrol er udarbejdet af firmaet der også står bag selv immunocard STAT! CGE. Kan dette have en betydning? Ifølge firmaet bag immunocard, Meridian bioscience Europe, har Entamoeba histolytica delen af kortet en diagnostisk sensitivitet på 82,4 % imod den sammenlignelige PCR-analyse for parasittens diagnostiske sensitivitet på 75,0 %.[10] altså skulle kortet være bedre til at finde de sandt-syge end både PCR-analysen og vores guldstandard; mikroskopi af iod-formalin fikseret fæces. Der er under forsøget Rapid-test ImmunoCard STAT! CGE for detection of intestinal parasites directly on faecal samples udarbejdet på Copenhagen university hospital, Hvidovre, fundet krydsreaktioner med Entamoeba dispar i immunocard STAT! CGE.[19] dette oplevedes ikke under udarbejdelsen af dette forsøg, da der var 0 positive prøver ifølge immunocard STAT! CGE. Man kan godt studse lidt over de meget forskellige resultater, da det i denne opgave udførte forsøg netop havde forventet at få en eller anden form for krydsreaktion grundet de op til flere krydsreaktioner i andre forsøg. Især når vi nu havde en del Entamoeba dispar/coli. Den diagnostiske specificitet for Entamoeba histolytica for både mikroskopi af Iod-formalin fikseret fæces og immunocard STAT! CGE er på 100 % hele vejen igennem. Se tabel 3 + 4 + 6 + 7. Den diagnostiske specificitet fortæller noget om en analyses evne til at vise raske personer som værende raske, hvilket vi må være tilbøjelige til at give statistikken ret i er ganske udmærket for det nye immunocard STAT! CGE, da vi jo ganske rigtigt ikke havde nogle syge. Ifølge producenten 27

ligger den diagnostiske specificitet for analysen på 96,4 % mod PCR-analyse for Entamoeba histolytica s 89,8 %.[10] endnu engang ser vi ingen krydsreaktioner, som det ellers var forventet. Giardia lamblia s diagnostiske sensitivitet er som sagt rigtig god både under analyserne med immunocard STAT! CGE og under mikroskopien. Se tabel 2 + 5. Den er på 100 % for immunocard STAT! CGE og 88,89 % for mikroskopien. Dette kan skyldes at vi med immunocard STAT! CGE genfandt alle 9 Giardia lamblia, hvor vi i mikroskopien kun var i stand til at genfinde 8 ud af 9 positive prøver. Dette kan dog skyldes vores manglende erfaring med mikroskopi af iod-formalin fikseret fæces, og man kan så overveje om man skulle lade tvivlen komme mikroskopien til gode? De positive prøver er inden de blev mikroskoperet af os, mikroskoperet af erfarne bioanalytikere og i nogle tilfælde førende eksperter inden for området parasitologi. Derfor kan man diskutere om sensitiviteten her også burde være 100 %, da den måske fortæller mere om vores evne end analysens til at finde de sandt syge patienter i dette tilfælde? Den diagnostiske specificitet for Giardia lamblia er både under immunocard STAT! CGE analyserne og mikroskopi af Iod-formalin fikseret fæces på 100 %. Se tabel 2 + 5. Her kan man godt tænke; men hvordan nu det når de kun fandt 8 ud af 9? Dette kan skyldes at analysen faktisk er udmærket til at frikende folk for infestation med Giardia Lamblia, altså finde de sandt negative prøver, men med os bag mikroskopet kunne vi ikke finde alle de positive altså påvirker vi muligvis sensitiviteten men ikke specificiteten. Ifølge producenten af immunocard STAT! CGE er den diagnostiske sensitivitet for Giardia lamblia i kortet på 93,8 % og for mikroskopi hos dem 92,4 %. Den diagnostiske specificitet er i kortet ifølge producenten på 98,9 % mod mikroskopiens 98,6 %. Altså ses der heller ikke her nogle store udsving med hensyn til evnen til at genfinde sandt positive og negative mellem de to analyser her. De skriver at disse resultater jeg her opgiver fra deres folder er kommet til verdenen takket være interne og eksterne evalueringer af deres assay, mod de mere gængse analysesteknikker der bruges på klinikkerne i dag.[10] De har også undersøgt reproducerbarheden og præcisionen af analysen, på flere forskellige måder. Blandt andet ved at tjekke om immunocardet på samme dag, ved samme person over tre gange gav det samme resultat. Udover en fejlkilde i fortyndingen (altså en menneskelig fejl) gav det over 10 dage et godt resultat, og viste altså at immunocardet var i stand til at finde det samme tre gange om dagen over 10 dage.[10] jeg har ikke været i stand til at finde nogle forsøg hvor der er gjort det samme med mikroskopien, men man kan så diskutere om der mon var sket det 28

samme hvis dette forsøg blev udført for mikroskopi-analysen? Det kan ikke udelukkes at en erfaren bioanalytiker/ekspert ville kunne gøre dette, men jeg tror muligvis ikke nogle der er så grønne som os ville kunne reproducere det samme resultat tre gange om dagen over 10 dage. For Entamoeba histolytica gør det sig gældende, både før og efter, vi har modtaget besked om at prøverne vi har brugt ved pcr-konfirmering højst sandsynligt er Entamoeba dispar at Cohens kappe-koefficient for disse er på 0. se tabel 8 + 9. Dette fortæller os at der i vores forsøg er absolut ingen overensstemmelse mellem de to metoder i diagnosen for Entamoeba histolytica. Dette giver egentlig god mening, da det netop ses at immunocard STAT! CGE ikke finder nogle Entamoeba histolytica, men vi i mikroskopien finder 5 ifølge de udannede og erfarne bioanalytikere og eksperter. I Giardia lamblia s tilfælde ser vi en kappa-koefficient på 0,931. se tabel 10. dette vidner om at de to metoder er relativt enige om resultaterne, og kappa-koefficienten er tæt på perfekt enighed.[20] dette kan tolkes på mange måder, men det kan blandt andet give et tilsagn om at vores guldstandard og denne nye metode som vi overvejer at bruge til noget på mikrobiologisk klinik, sygehus Sønderborg er ret enige. Dette holdt op imod resultaterne fra Entamoeba histolytica delen af forsøget giver virkelig stof til eftertanke. Kan immunocard STAT! CGE erstatte mikroskopien af iod-formalin fikseret fæces? Er immunocard-analysen bedre eller dårligere end mikroskopien, der både er en billig og internationalt anerkendt metode?[21] kan immunocard eventuelt bruges som en ekstra analyse, altså en supplering af mikroskopien? Ville det hjælpe hvis lægerne i deres rekvirering af parasit-analyser blev mere specifikke omkring hvilke parasitter de tror, kunne være at finde i prøve-materialet for på denne må at vurdere om immunocardet skulle tages i brug? Økonomi og arbejdsmiljø: Dette bringer os videre til økonomien i de to analyser. Vi har fået immunocard STAT! CGE kitsene til halvpris; 1787,5 kr. dette vil sige de normalt koster 3575 kr for 20 immunocards. Dette er en stykpris på 178,75 kr, heri skal så medregnes cirka et kvarters personale, da det er omkring den tid det tager at udføre analysen. Ifølge kliniklederen på mikrobiologisk klinik sygehus sønderjylland, Lisbet Sierk Matthiesen, koster en mikroskopi analyse for parasitter af iodformalin fikseret fæces cirka 350 kr pr analyse inklusiv personale.[bilag 4] Et andet aspekt i det er arbejdsforholdene, og bortskaffelsen af affaldet fra analyserne. Under mikroskopien arbejdes der med forskellige skrappe kemikalier så som formalin og ethylacetat. 29

Disse kemikalier skal bortskaffes igen, og det kræver specielt udstyr at have udsug oppe så personalet ikke indånder dampene. Der arbejdes også i en klassisk mikroskopi stilling, med let bøjet nakke og ret fastlåst position nogle gange lang tid af gangen.[22] Dette er, uanset hvor meget arbejdspladsen kan indstilles, trættende for medarbejderen og man kunne diskutere om tiden foran mikroskopet muligvis kunne nedsættes ved hjælp af immunocard-analysen hvor man ikke har brug for mikroskop eller udsug. Man er her kun stationær under afpippeteringen i prøvebrønden på kortet. Der er desuden ikke noget affald der decideret skal tages specielle hensyn til, dog skal man som nævnt i teorien være opmærksom på typen af afløb hvor overskuds-opblandings væske hældes i. spørgsmålet er så; kan immunocard erstatte mikroskopien? Både ja og nej. Den kunne måske erstatte nogle unødvendige mikroskopier hvis man kunne få ensrettet kommunikationen mellem afdelingen og lægerne når der rekvireres parasit-analyser. Men da der endnu ikke er nok erfaringer med brugen af dem, specielt i forhold til Entamoeba histolytica, og hele parasitologien er et relativt nyligt åbnet emne er det enormt svært at spå om hvorvidt de endda kan erstatte mikroskopien totalt. Men de kunne muligvis være et skridt i den retning? Problemet med Entamoeba histolytica og manglende viden: Dette bringer os igen videre til et lidt andet aspekt af hele spørgsmålet om hvorvidt vi kan erstatte eller supplere mikroskopien for parasitter med immunocard-analysen. For hvad ved vi egentlig om parasitter? Det er et ret, tiden vi lever i taget i betragtning, nyligt udforsket emne. Først for få år siden fik man en forståelse for den store forskel med hensyn til patogenicitet og genetik inden for Entamoeba slægten. Rent morfologisk ligner fx Entamoeba Dispar og Entamoeba histolytica hinanden og kan derfor ikke skelnes ved hjælp af mikroskopi. [1][21] En anden ofte forekommende morfologisk identisk protozo er Entamoeba coli. Denne har vist så stor genetisk diversitet at den er blevet kategoriseret i to undergrupper, ST1 og ST2. hvor ST1 ser ud til kun at findes hos mennesker ses den anden type også hos andre typer primater, og ST2 udviser selv indenfor denne undergruppering stor genetisk diversitet. Egentlig er Entamoeba coli ikke patogen, men hvordan disse to subtyper i klinisk forstand viser sig er endnu ikke kendt.[1] Den eneste relativt sikre måde at differentiere mellem både Entamoeba histolytica, dispar og coli er indtil videre DNA-baserede metoder.[1][21] 30

Dette vidner om at der muligvis er mange ting vi endnu ikke ved om parasitologien, og der findes utallige artikler omkring emnet på PubMed og google scholar. Det er et felt i ret kraftigt udvikling, så måske er immunocard STAT! CGE blot et skridt på vejen mod noget helt andet? Der findes en forgænger til det immunocard vi har haft glæde af at arbejde med. Her i er kun inkluderet Giardia lamblia og Cryptosporidium parvum. [23] dette er et enzym immunoassay, men princippet er ret ens med immunocard STAT! CGE, der umiddelbart er en slags videreudvikling af forgængeren med specielt fokus på at opspore det sandt positive entamoeba histolytica. Det er også en hurtigtest, hvilket måske vidner om at det er den retning feltet bevæger sig i? der kan måske antages at der have været grundlag for at videreudvikle produktet yderlige, grundet efterspørgslen efter en mindre tidskrævende metode? Det etiske aspekt og fejlkilder: Det har i vores forsøg ikke været muligt at indhente personligt samtykke fra patienterne der har leveret prøverne, og heller ikke ud fra lovmæssige krav umiddelbart været nødvendigt.[15][16] Man kan så diskutere om det er personoplysninger vi har indhentet, eller ej. Man kan tale for at prøvematerialet ses som et selvstændigt værktøj her, også blandt andet fordi vi selv har undladt at undersøge prøverne oprindelse og i steder har fået overlægerne på afdelingen eller vores kliniske vejleder til det. Spørgsmålet er så om man anser parasitter for at være humant biologisk materiale, eller om man kan vende det på den måde at det er fæces jo måske? Fæces kommer unægtelig jo fra mennesker, og man kan så argumentere for at vi måske skulle have indhentet samtykke fra de patienter hvis fæces vi har brugt. Dette har bare været urimeligt svært, da vi ikke umiddelbart har adgang til oplysninger om patienterne hvorfra mange a prøverne er taget. Denne anonymisering kunne man vælge at se som et led i at forsøge at lave forsøget på den mest etisk hensigtsmæssige måde, og selvom vi inden for sundhedsvæsenet går meget op i både pligt og konsekvensetik er der mange måder at anskue netop vores forsøg på. Dette har givet anledning til tanker om hvorvidt forsøget var etisk forsvarligt, og man kan argumentere for at én ting er de helt specifikke nedskrevne regler (pligtetikken i det), og en anden er den normen. De prøver vi har brugt er prøver der før har været brugt til formålet, og vi har så bare genbrugt dem. På denne måde er det ikke til gene for patienten, og vi har ikke direkte måtte ud og spørge syge og dårlige mennesker om samtykke, noget man kunne tale for er til mindst mulig gene for patienterne, samtidig med at de indirekte er med til at hjælpe med at forsøge at gøre analysen hurtige og mere effektiv? Her kan man ud fra konsekvensetikken tale om at konsekvenserne af forsøget; at vi kan undersøge om immunocard STAT! CGE kan nedsætte svartiden og lignende, 31