cobas KRAS Mutation Test

cobas KRAS Mutation Test TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 Tests P/N: 05985536190 cobas KRAS Mutation Test KRAS 24 Tests P/N: 05852170190 BEMÆRK: Købet af dette produkt giver køberen tilladelse til at anvende det til amplifikation og detektion af nukleinsyresekvenser ved hjælp af PCR (Polymerase Chain Reaction) og relaterede metoder til human in vitro-diagnostik. Der gives ingen generelle patent- eller andre licensrettigheder i forbindelse med købet, bortset fra brugsretten. TILSIGTET BRUG cobas KRAS-mutationstesten, til brug med cobas 4800-systemet, er en real-time PCR-test, der er beregnet til identificering af mutationer ved codon 12, 13 og 61 i KRAS-genet i DNA, der stammer fra formalinfikseret parraffinindstøbt humant kolorektalt cancervæv (CRC) og ikke-småcellet lungecancervæv (NSCLC). OVERSIGT OVER OG FORKLARING AF TESTEN KRAS-protein: KRAS-proteinet er medlem af superfamilien af små G-proteiner. KRAS virker som en GDP/GTP-reguleret kontakt, der afgiver ekstracellulære signaler, som påvirker celledeling, apoptose og ombygning af actin-cytoskelettet. Mutationer, der påvirker aminosyre 12, 13 eller 61, hvilket sker ved en lang række humane maligniteter, herunder kolorektal cancer (CRC) og ikke-småcellet lungecancer (NSCLC), låser enzymet i den GTP-bundne, aktiverede form, hvilket resulterer i konstitutiv signalering, som dermed bidrager til den onkogene proces. 1 Kolorektal cancer (CRC): KRAS-mutationer observeres i 24 % - 43 % af kolorektale tumorer. 2-3 Selvom mere end 3.000 punktmutationer af KRAS-genet er blevet identificeret, forekommer de fleste i codon 12 eller 13 (~82 % i codon 12 og ~17 % i codon 13); KRAS-mutationer i andre codoner (f.eks. codon 61) er mindre almindelige (1 % - 4 % af mutationer). Selvom mutationer i codon 61 er sjældne, er det påvist, at de resulterer i konstitutiv aktivering af KRAS på samme måde, som codon 12- og 13-mutationer gør, 4 og offentliggjorte data indikerer, at codon 61-mutationer forudsiger manglende respons på anti-egfr monoklonal antistofbehandling. 5-6 Cetuximab og panitumumab er monoklonale antistoffer, der angriber den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) og er godkendt til brug hos patienter med metastatisk kolorektal cancer. Selv om 50 % til 80 % af kolorektale tumorer overudtrykker EGFR, har EGFRproteinudtryk og genamplifikation kun begrænset prædiktiv værdi, hvad angår bestemmelsen af risikoen for respons på cetuximab eller panitumumab. 7 Der er dog nu meget, der peger på, at tilstedeværelsen af KRAS-mutationer korrelerer med manglende respons på EGFR-målrettet antistofbehandling hos patienter med metastatisk kolorektal cancer, og at brugen af EGFR-målrettet antistofbehandling i denne patientundergruppe i visse situationer kan være skadelig. 8-9 Det understøttende bevis for disse fund kommer fra: Retrospektive analyser af enkeltarmede forsøg 10-11 Retrospektive analyser af randomiserede forsøg 12-13 Prospektive randomiserede forsøg 14 Som følge af disse forsøg anbefales KRAS-mutationstesten til det udvalg af patienter, der skal modtage anti-egfr-antistofbehandling, af større onkologiorganisationer i USA (ASCO, NCCN) 15-16 og Europa (ESMO). 17 Ydermere har amerikanske og europæiske kontrolmyndigheder begrænset brugen af disse stoffer til patienter med vildtype-kras-tumorer. 18-19 Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC): Der er identificeret et antal tilbagevendende molekylære abnormiteter i NSCLC. Der er fundet punktmutationer i KRAS-genet i 10 % til 30 % af fremskreden NSCLC, hovedsageligt, men ikke udelukkende, i adenokarcinomer. 20 Som oftest påvirker somatiske KRAS/RASmutationer codon 12, 13 og 61, hvilket medfører ophobning af aktivt KRAS/RAS-protein i cellerne og efterfølgende aktivering af de signalveje, der er involveret i ondartet transformation. Den udgivne litteratur peger på, at patienter med KRAS-positiv fremskreden NSCLC har en dårligere prognose 21 og muligvis ikke kan drage fordel af hjælpemiddelskemoterapi 22 eller EGFR TKI-behandling. 23 Der er også indikationer for, at patienter med tumorer med EGFR-mutationer, ikke har KRAS-mutationer og omvendt 24 Sådanne patienter udgør dermed en undergruppe af NSCLC-patienter med store uopfyldte kliniske behov på grund af færre tilgængelige behandlingsmuligheder sammenlignet med patienter, der har vildtype- KRAS-tumorer. Afsnittet med oplysninger om dokumentrevision findes sidst i dette dokument. 06322379001-07DA 1 Doc Rev. 7.0

cobas KRAS-mutationstest cobas KRAS-mutationstesten er en PCR-baseret analyse, der er designet til at identificere tilstedeværelsen af somatiske mutationer, der involverer codon 12, 13 og 61 af den proto-onkogene KRAS, og dermed identificere patienter med fremskreden CRC, som næppe vil få gavn af behandling med anti-egfr monoklonale antistoffer, eller patienter med NSCLC, der muligvis ikke kan drage fordel af hjælpmiddelskemoterapi eller erlotinib. PRINCIPPER FOR PROCEDUREN cobas KRAS-mutationstesten er baseret på to hovedprocesser: (1) manuel prøveforberedelse til opnåelse af genomisk DNA fra formalinfikseret paraffinindstøbt væv (FFPET); og (2) PCR-amplifikation af target-dna ved hjælp af komplementære primerpar og to oligonukleotidprober, der er mærket med fluorescensfarve. En probe er designet til at detektere KRAS-codon 12/13-sekvensen i exon 2, og den anden probe er designet til at detektere KRAS-codon 61-sekvensen i exon 3 af KRAS-genet. Mutationsdetektion opnås gennem smeltekurveanalyse med analyseinstrumentet cobas z 480. Der er inkluderet en mutant kontrol, en negativ kontrol og kalibrator i hver kørsel for at bekræfte validiteten af kørslen. Klargøring af prøver FFPET-prøver behandles, og genomisk DNA isoleres ved hjælp af cobas DNA-prøveforberedelseskittet, en generisk manuel prøveforberedelse, der er baseret på nukleinsyrebinding til glasfibre. Et afparaffineret snit på 5 µm af en FFPET-prøve lyseres ved hjælp af inkubation ved en forhøjet temperatur med en protease og kaotropisk lyserings-/bindingsbuffer, der frigiver nukleinsyrer og beskytter det frigivne genomiske DNA mod DNaser. Efterfølgende tilsættes isopropanol til lysisblandingen, som derefter centrifugeres igennem en kolonne med en glasfiberfilterindsats. Under centrifugeringen bindes det genomiske DNA til glasfiberfilterets overflade. Ubundne stoffer, f.eks. salte, proteiner og andre cellulære urenheder, fjernes ved centrifugering. De adsorberede nukleinsyrer vaskes og elueres derefter med en vandig opløsning. Mængden af genomisk DNA bestemmes spektrofotometrisk og justeres til en fastsat koncentration, der skal tilsættes amplifikations-/detektionsblandingen. Target-DNA'et amplificeres derefter og detekteres på cobas z 480-analyseinstrumentet ved hjælp af amplifikations- og detektionsreagenserne, der følger med cobas KRAS-mutationstestkittet. PCR-amplifikation Valg af target cobas KRAS-mutationstestkittet anvender primere, der definerer en baseparsekvens på 85 for exon 2, der indeholder KRAS-codon 12 og 13, og en baseparsekvens på 75 for exon 3, der indeholder KRAS-codon 61 i humant genomisk DNA. Amplifikationen foregår kun i områderne for KRAS-genet mellem primerne. Hele KRAS-genet amplificeres ikke. Amplifikation af target Der anvendes et derivat af Thermus-art Z05 DNA-polymerase til amplifikation af target. Først opvarmes PCR-reaktionsblandingen for at denaturere det genomiske DNA og blotlægge primerens targetsekvenser. Når blandingen afkøler, bindes upstream- og downstreamprimerne til DNA-targetsekvenserne. Z05 DNA-polymerasen forlænger hver bundne primer under tilstedeværelsen af en divalent metalion og overskydende dntp og syntetiserer dermed en anden DNA-streng. Dette afslutter den første cyklus af PCR, der giver en dobbeltstrenget DNA-kopi, som inkluderer de tilsigtede 85 basepar og 75 baseparregioner af KRAS-genet. Denne proces gentages et antal gange, hvor mængden af amplikon-dna fordobles for hver cyklus. Amplifikationen foregår kun i områderne for KRAS-genet mellem primerparrene. Hele KRAS-genet amplificeres ikke. Automatiseret real-time mutationsdetektion cobas z 480-analyseinstrumentet kan måle mængden af fluorescens, der genereres af specifikke PCR-produkter, i real-time. Efter amplifikation er hver amplikon, der er genereret ved hjælp af cobas KRAS-mutationstesten, underlagt et smelteprogram, hvor temperaturen øges i trin fra 40 C til 95 C (TaqMelt). Den vildtypespecifikke probe er bundet til både vildtype og mutant amplikon ved lave temperaturer. I bunden tilstand er fluoresceinrapporterstoffet på 5'-enden af proben tilstrækkeligt langt væk fra 3'-endens quencher-farvestof, og giver det fluorescerende farvestof mulighed for at udsende en specifik bølgelængde af lys. Efterhånden som temperaturen stiger, dissocieres proben fra amplikonet og giver quencher-farvestoffet mulighed for at komme nær det fluorescerende farvestof og reducerer dermed mængden af målbar fluorescens. Amplikoner med perfekt overensstemmelse til proben (vildtype) smelter ved en højere temperatur end amplikoner med én eller flere overensstemmelser (mutant). Mængden af fluourescens ved hver temperaturstigning måles, og smeltetemperaturen/-erne beregnes. Tilstedeværelsen af en mutant KRAS-sekvens i exon 2, codon 12 og 13 og i exon 3, codon 61 kan detekteres, når smeltetemperaturerne er inden for de angivne områder. For at undgå detektion af tavse mutationer i codon 12 og codon 13 (ingen aminosyreændring) tjener en modificeret base som en universel base og producerer en smeltetemperatur inden for vildtypeområdet. 06322379001-07DA 2 Doc Rev. 7.0

Selektiv amplifikation Selektiv amplifikation af target-nukleinsyren fra prøven opnås i cobas KRAS-mutationstesten ved hjælp af AmpErase-enzym (uracil-n-glycosylase) og deoxyuridintrifosfat (dutp). 25 AmpErase-enzymet genkender og katalyserer nedbrydningen af DNAstrenge, der indeholder deoxyuridin, men ikke DNA, der indeholder deoxythymidin. Deoxyuridin findes ikke i naturligt forekommende DNA, men findes altid i amplikon som følge af brugen af dutp i stedet for thymidintrifosfat som én af nukleotidtrifosfaterne i reaktionsmixreagenset. Det er derfor kun amplikonet, der indeholder deoxyuridin. Deoxyuridin gør kontaminerende amplikon modtageligt for nedbrydning med AmpErase-enzym, før amplifikationen af target-dna'et. AmpErase-enzymet, der findes i reaktionsmixreagenset, katalyserer spaltningen af deoxyuridinholdigt DNA ved deoxyuridin-residues ved at åbne deoxyribosekæden ved positionen C1. Ved opvarmning i den første termiske cyklus ved alkalisk ph brækker amplikonets DNA-kæde ved positionen for deoxyuridin, og dermed kan DNA'et ikke amplificeres. AmpErase-enzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 C, dvs. i de termiske cyklusser, og derfor ødelægges target-amplikonet ikke. Det er påvist, at cobas KRAS-mutationstesten kan inaktivere mindst 10 3 kopier af deoxyuridin-holdigt KRAS-mutant amplikon pr. PCR. REAGENSER cobas DNA Sample Preparation Kit cobas DNA-prøveforberedelseskit (P/N: 05985536190) DNA TLB (DNA-vævlysisbuffer) Tris-HCl-buffer Kaliumklorid 0,04 % EDTA 0,1 % triton X-100 0,09 % natriumazid PK (Proteinase K) Proteinase K (frysetørret) Xn Proteinase K DNA SP 24 tests 1 x 10 ml 1 x 100 mg Sundhedsskadelig DNA PBB (DNA-paraffinbindingsbuffer) Tris-HCl-buffer 49,6 % guanidinhypoklorid 0,05 % carbamid 17,3 % triton X-100 Xn 49,6 % (w/w) guanidin-hcl 1 x 10 ml Sundhedsskadelig WB I (DNA-vaskebuffer I) Tris-HCl-buffer 64 % guanidinhypoklorid Xn 64 % (w/w) guanidin-hcl 1 x 25 ml Sundhedsskadelig WB II (DNA-vaskebuffer II) Tris-HCl-buffer Natriumklorid 1 x 12,5 ml 06322379001-07DA 3 Doc Rev. 7.0

DNA EB (DNA-elueringsbuffer) Tris-HCl-buffer 0,09 % natriumazid FT (filterrør med låg) CT (prøveglas) cobas KRAS Mutation Test (P/N: 05852170190) KRAS-MIX (KRAS-reaktionsmix) Tricinbuffer Kaliumacetat Kaliumhydroxid Glycerol 4,76 % dimethylsulfoxid 0,1 % ProClin 300-konserveringsmiddel < 0,9 % dntp'er < 0,1 % Z05 DNA-polymerase (mikrobiel) < 0,1 % AmpErase-enzym (uracil-n-glycosylase) (mikrobielt) MGAC (Magnesiumacetat) Magnesiumacetat 0,09 % natriumazid KRAS 12/13 OM (KRAS codon 12/13 Oligo Mix) Tris-HCl-buffer EDTA Poly-rA RNA (syntetisk) 0,1 % ProClin 300-konserveringsmiddel < 0,01 % upstream- og downstream-kras-primere < 0,01 % fluorescerende KRAS-probe KRAS 61 OM (KRAS Codon 61 Oligo Mix) Tris-HCl-buffer EDTA Poly-rA RNA (syntetisk) 0,1 % ProClin 300-konserveringsmiddel < 0,01 % upstream- og downstream-kras-primere < 0,01 % fluorescerende KRAS-probe KRAS 1 x 6 ml 1 x 25 stk. 3 x 25 stk. 24 tests 4 x 0,3 ml 4 x 0,2 ml 2 x 0,3 ml 2 x 0,3 ml KRAS MC (KRAS-mutantkontrol) Tris-HCl-buffer EDTA Poly-rA RNA (syntetisk) 0,05 % natriumazid < 0,001 % plasmid-dna indeholdende KRAS exon 2- og 3-sekvenser (mikrobielt) < 0,001 % KRAS-vildtype-DNA (cellekultur) KRAS CAL (KRAS-kalibrator) Tris-HCl-buffer EDTA Poly-rA RNA (syntetisk) 0,05 % natriumazid < 0,001 % KRAS-vildtype-DNA (cellekultur) 4 x 0,1 ml 4 x 0,1 ml 06322379001-07DA 4 Doc Rev. 7.0

DNA SD (DNA-prøvediluent) Tris-HCl-buffer 0,09 % natriumazid 2 x 3,5 ml ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. B. Denne test er til brug med formalinfikseret paraffinindstøbte prøver af kolorektalt cancervæv (CRC) og ikke-småcellet lungecancervæv (NSCLC). C. Brug ikke mundpipette. D. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. E. Undgå mikrobiel og DNA-kontaminering af reagenser. F. Reagenser og affald skal bortskaffes i overensstemmelse med nationale, regionale og lokale bestemmelser. G. Brug ikke kittene efter udløbsdatoen. H. Reagenser fra forskellige lot eller kit må ikke blandes. I. Der skal bæres handsker, og de skal skiftes mellem håndtering af prøver og reagenser for at forhindre kontamination. J. For at undgå kontamination af arbejds-master Mix'et (arbejds-mmx) med DNA-prøver bør amplifikation og detektion foretages i et område, der er adskilt fra DNA-isolering. Arbejdsområdet for amplifikation og detektion bør gøres grundigt rent, før der arbejdes med MMX-forberedelse. For korrekt rengøring bør alle overflader, inklusive racks og pipetter, aftørres grundigt med en opløsning på 0,5 % natriumhypoklorit og derefter med en opløsning på 70 % ethanol. K. DNA PBB og WB I indeholder guanidinhypoklorid. Rengør med egnet laboratorierengøringsmiddel og vand, hvis der spildes væske, som indeholder denne buffer. Hvis der spildes potentielt smittefarlige stoffer, skal det berørte område først rengøres med laboratorierengøringsmiddel og derefter med 0,5 % natriumhypoklorit. Hvis der spildes på cobas z 480-analyseinstrumentet, skal instruktionerne i manualen til cobas z 480-analyseinstrumentet følges. *BEMÆRK: Almindeligt tilgængeligt flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natriumhypoklorit med en koncentration på 5,25 %. En 1:10-fortynding af et sådant blegemiddel giver en 0,5 % opløsning af natriumhypoklorit. L. Prøver skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 26 og i CLSI-dokument M29-A3. 27 M. DNA PBB indeholder triton X-100, som kan irritere slimhinderne. Undgå kontakt med øjne, hud og slimhinder. N. DNA TLB, DNA EB, MGAC, KRAS MC, KRAS CAL og DNA SD indeholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Når natriumazidholdige opløsninger hældes ud i laboratorievasken, skal afløbet skylles med store mængder koldt vand for at undgå ophobning af azider. O. Xylen er et farligt kemikalie og bør anvendes i et stinkskab. Bortskaf kemisk affald i overensstemmelse med lokale, regionale og nationale bestemmelser. P. Anvend beskyttelsesbriller, særligt arbejdstøj og engangsbeskyttelseshandsker ved håndtering af alle reagenser. Undgå kontakt med huden, øjnene og slimhinderne. Ved kontakt skylles straks med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis området ikke behandles. Hvis der spildes, skal der fortyndes med vand, før det tørres op. Q. Alle engangsartikler må kun bruges én gang. De må ikke genbruges. R. Anvend ikke engangsartikler efter deres udløbsdato. S. Anvend ikke natriumhypokloridopløsning (blegemiddel) til rengøring af cobas z 480-analyseinstrumentet. Rengør cobas z 480 i henhold til de procedurer, der er beskrevet i manualen, der følger med cobas z 480-analyseinstrumentet. T. I manualen til cobas z 480-analyseinstrumentet findes der yderligere advarsler, forholdsregler og procedurer til reducering af risikoen for kontaminering af cobas z 480-analyseinstrumentet. U. Det anbefales at bruge sterile engangspipetter og DNase-fri pipettespidser. 06322379001-07DA 5 Doc Rev. 7.0

KRAV TIL OPBEVARING OG HÅNDTERING A. Opbevar DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, PK, FT og CT ved 15 C til 30 C. Efter åbning kan DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB og PK holde sig op til 8 anvendelser over 90 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der kommer først. B. Efter tilsætning af sterilt, nukleasefrit vand til PK skal ubrugt, rekonstitueret PK opbevares i mængder på 450 µl ved -20 C. Efter rekonstitution skal PK anvendes inden for 90 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der kommer først. C. Efter tilsætning af absolut ethanol skal WB I og WB II opbevares ved 15 C til 30 C. Disse arbejdsopløsninger er holdbare i 90 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der kommer først. D. Opbevar KRAS MIX, MGAC, KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM, KRAS MC, KRAS CAL og DNA SD ved -15 C til -25 C. Efter åbning kan reagenserne holde sig til 4 anvendelser over 60 dage eller indtil udløbsdatoen, afhængig af hvad der kommer først. E. Optø hvert reagens ved 15 C til 30 C i mindst 1 time før brug. Efter optøning skal reagenserne anvendes inden for 1 time. Ubrugte reagenser skal returneres til opbevaring ved -15 C til -25 C inden for 1 time. Efter åbning må alle reagensflaskerne, med undtagelse af DNA SD, bruges til pipettering af op til 4 afmålte mængder over 60 dage eller indtil den angivne udløbsdato afhængig af, hvad der indtræder først. F. KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM og arbejds-mmx (forberedes ved at tilsætte KRAS 12/13 OM eller KRAS 61 OM og MGAC til KRAS MIX) skal beskyttes mod længerevarende udsættelse for lys. G. Efter forberedelse skal arbejds-mmx opbevares på et mørkt sted ved 2 C til 8 C. De forberedte prøver og kontroller skal tilsættes inden for 1 time efter forberedelsen af arbejds-mmx. H. Behandlede prøver (oprenset DNA) er holdbare i op til 24 timer ved 15 C til 30 C eller op til 14 dage ved 2 C til 8 C eller op til 60 dage ved -15 C til -25 C efter at have gennemgået 3 nedfrysninger/optøninger ved opbevaring ved -15 C til -25 C. Oprenset DNA skal amplificeres inden for de anbefalede opbevaringsperioder eller før udløbsdatoen for det cobas DNA-prøveforberedelseskit, der bruges til oprensning af DNA'et, afhængigt af hvilken der forekommer først. I. Amplifikation skal påbegyndes inden for 1 time fra det tidspunkt, de behandlede prøver og kontroller tilsættes arbejds-mmx (forberedes ved tilsætning af KRAS 12/13 OM eller KRAS 61 OM og MGAC til KRAS MIX). MEDFØLGENDE MATERIALER A. cobas DNA Sample Preparation Kit 24 tests cobas DNA SP DNA-prøveforberedelseskit (P/N: 05985536190) DNA TLB (DNA-vævlysisbuffer) PK (Proteinase K) DNA PBB (DNA-paraffinbindingsbuffer) WB I (DNA-vaskebuffer I) WB II (DNA-vaskebuffer II) DNA EB (DNA-elueringsbuffer) FT (filterrør med låg) CT (prøveglas) B. cobas KRAS Mutation Test KRAS 24 tests (P/N: 05852170190) KRAS MIX (reaktionsmix) (låg med naturfarvet knap) 06322379001-07DA 6 Doc Rev. 7.0

MGAC (magnesiumacetat) (låg med gul knap) KRAS 12/13 OM (KRAS Codon 12/13 Oligo Mix) (låg med hvid knap) KRAS 61 OM (KRAS Codon 61 Oligo Mix) (låg med guldfarvet knap) KRAS MC (KRAS-mutantkontrol) (låg med rød knap) KRAS CAL (KRAS-kalibrator) (låg med lilla knap) DNA SD (DNA-prøvediluent) NØDVENDIGE, MEN IKKE MEDFØLGENDE MATERIALER Xylen (Sigma, katalognummer 247642 eller Fisher Scientific, katalognummer X5-4) Absolut ethanol (Sigma, katalognummer E7023 eller Fisher Scientific, katalognummer BP2818-500) Isopropanol (Sigma, katalognummer 190764 eller Fisher Scientific, katalognummer A451-1) Sterilt vand, nukleasefrit (Applied Biosystems PCR Grade Water, katalognummer AM9937 eller Thermo Scientific Molecular Biology Grade Water, katalognummer SH-3053801) Sterile, serologiske engangspipetter: 5 og 25 ml Microwell-plade (AD-plade) og forseglingsfilm til cobas 4800-systemet (Roche P/N 05232724001) cobas 4800-hjælpespartel til forseglingsfilm (Roche P/N 04900383001) Justérbare pipetter* (kapacitet 10 µl, 20 µl, 200 µl og 1000 µl) med aerosolbarriere- eller DNase-fri positive displaceringsspidser Pipette-værktøj (Drummond P/N: 4-000-100 eller tilsvarende) Benchtop-mikrocentrifuge med kapacitet til 8.000 x g og 16.000 til 20.000 x g (Eppendorf 5417C eller tilsvarende)** To (2) tørvarmeblokke, der kan varme mikrocentrifugerør op til hhv. 56 C og 90 C** 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugerør, der er sterile, RNase/DNase-fri og af PCR-kvalitet (Eppendorf, katalognummer 022363212) Nanodrop UV-Vis-spektrofotometer (Thermo Scientific ND-1000 eller ND-2000)** Vortex-mixer** Mikrocentrifugerør-racks Talkumfrie engangsbeskyttelseshandsker Kalibrerede termometre til tørvarmeblok** Vandbad** der kan opretholde en temperatur på 37 C Enkeltkantet barberblad eller tilsvarende Fryseenhed med mulighed for opbevaring ved -15 C til -25 C * Pipetter bør vedligeholdes i henhold til producentens anvisninger og må højst afvige 3 % fra den angivne volumen. Der skal anvendes aerosolbarriere- eller positive DNase-fri displaceringsspidser, hvor det er angivet, for at undgå nedbrydning af prøverne og krydskontaminering. ** Alt udstyr bør vedligeholdes korrekt i henhold til producentens anvisninger Instrumenter og software cobas z 480-analyseinstrument cobas 4800 SR2-systemkontrolenhed med OSXP-billede cobas 4800 SR2-systemsoftware, version 2.0 eller nyere KRAS-analysepakkesoftware, version 1.0 eller nyere Stregkodelæser, ekstern USB Printer 06322379001-07DA 7 Doc Rev. 7.0

INDSAMLING, TRANSPORT OG OPBEVARING AF PRØVER BEMÆRK: Alle prøver skal håndteres som potentielt smittefarlige. A. Indsamling af prøver FFPET-prøver af kolorektalt cancervæv (CRC) og ikke-småcellet lungecancervæv (NSCLC) er blevet valideret til brug med cobas KRAS-mutationstesten. B. Transport af prøver FFPET-prøver kan transporteres ved 15 C til 30 C. Transport af FFPET-prøver skal overholde nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer. 28 C. Opbevaring af prøver FFPET-prøver kan opbevares ved 15 C til 30 C i op til 12 måneder efter datoen for vævsindsamling. 5 µm-snit, der er anbragt på objektglas, kan opbevares ved 15 C til 30 C i op til 60 dage. BRUGSANVISNING BEMÆRK: Kun FFPET-snit på 5 µm tykkelse, der indeholder mindst 10 % tumorindhold, kan anvendes i cobas KRASmutationstesten. Enhver prøve med mindre end 10 % tumorindhold bør makrodissekeres forud for afparaffinering. BEMÆRK: Se manualen til cobas z 480-analyseinstrumentet for detaljerede oplysninger om betjening af cobas z 480- analyseinstrumentet. BEMÆRK: Tørvarmeblokke, der kan opvarme mikrocentrifugerør, bør tændes og indstilles til hhv. 56 C og 90 C. Kørselsstørrelse En enkelt kørsel kan inkludere 1 til 45 prøver (plus kontroller og kalibrator) pr. microwell-plade med 96 brønde. Ved kørsel med mere end 24 prøver er det nødvendigt at anvende flere cobas KRAS-mutationstestkit fra samme lotnummer. cobas KRAS-mutationstesten indeholder tilstrækkelige reagenser til 8 kørsler af 3 prøver (plus kontroller og kalibrator) for maksimalt 24 prøver pr. kit. Arbejdsgang Testprocessen med cobas KRAS-mutationstesten består af en manuel prøveforberedelse ved hjælp af cobas DNA-prøveforberedelseskittet efterfulgt af amplifikation/detektion på cobas z 480-analyseinstrumentet med cobas KRAS-mutationstestkittet. Reagensforberedelse 1. Rekonstituér proteinase K (PK) ved at tilsætte 4,5 ml sterilt, nukleasefrit vand (PCR-kvalitet) til flasken ved hjælp af en steril, serologisk engangspipette på 5 ml. Bland ved at vende flasken 5 til 10 gange. Afmål 450 µl rekonstitueret PK i 1,5 ml Safe-Lockmikrocentrifugerør, og opbevar ved -20 C. Hvis proteinase K allerede er blevet rekonstitueret og nedfrosset, optøs et passende antal afmålte mængder til behandling af det prøveantal, der skal køres forud for afparaffinering (70 µl rekonstitueret PK er nødvendigt for hver prøve). 2. Alle opløsninger, der opbevares ved 15-30 C, skal være klare. Hvis der er bundfald til stede i et reagens, skal opløsningen opvarmes i et vandbad på 37 C, indtil bundfaldet opløses. Brug ikke opløsningen, før alt bundfaldet er opløst. 3. Forbered arbejds-dna-vaskebuffer I (WB I) ved at tilsætte 15 ml absolut ethanol til flasken med WB I. Bland ved at vende flasken 5 til 10 gange. Datér flasken og notér, at der er tilsat ethanol. Opbevar arbejds-wb I ved 15 C til 30 C. 4. Forbered arbejds-dna-vaskebuffer II (WB II) ved at tilsætte 50 ml absolut ethanol til flasken med WB II. Bland ved at vende flasken 5 til 10 gange. Datér flasken og notér, at der er tilsat ethanol. Opbevar arbejds-wb II ved 15 C til 30 C. 06322379001-07DA 8 Doc Rev. 7.0

Afparaffinering af FFPET-snit placeret på objektglas BEMÆRK: Xylen er et farligt kemikalie. Alle trin til afparaffinering bør foretages i et stinkskab. Se "Advarsler og forholdsregler". A. Anbring et objektglas, hvorpå der er placeret et 5 µm FFPET-snit, i en beholder med tilstrækkelig xylen til at dække vævet; lad det stå i blød i 5 minutter. B. Overfør objektglasset til en beholder med tilstrækkeligt absolut ethanol til at dække vævet; lad det stå i blød i 5 minutter. C. Fjern objektglasset fra ethanolen og lad snittet lufttørre (5 til 10 minutter). D. Foretag makrodissektion, hvis prøven indeholder < 10 % tumorindhold. E. Markér et 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugerør for hver prøve med prøveidentifikationsinformationen. F. Tilsæt 180 µl DNA TLB til 1,5-ml Safe-Lock-mikrocentrifugerøret. G. Tilsæt 70 µl rekonstitueret PK til Safe-Lock-røret indeholdende DNA TLB. H. Skrab vævet af objektglasset og ned i Safe-Lock-røret. Nedsænk vævet i blandingen med DNA TLB/PK. I. Fortsæt med trin A i DNA-isoleringsproceduren. Afparaffinering af FFPET-snit, der ikke er placeret på objektglas BEMÆRK: Xylen er et farligt kemikalie. Alle trin til afparaffinering bør foretages i et stinkskab. Se "Advarsler og forholdsregler". BEMÆRK: Hvis prøven har et tumorindhold på mindre end 10 %, skal snittet placeres på et objektglas til makrodissektion, og proceduren, der er angivet i Afparaffinering af FFPET-snit placeret på objektglas, skal følges. A. Placér et 5-µm FFPET-snit i et 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugerør, der er mærket med prøveidentifikationsinformationen for hver prøve. B. Tilsæt 500 µl xylen til Safe-Lock-røret indeholdende FFPET-snittet. C. Bland på vortex-mixer i 10 sekunder. D. Lad røret stå i 5 minutter ved 15 C til 30 C. E. Tilsæt 500 µl absolut ethanol og bland på vortex-mixer i 10 sekunder. F. Lad røret stå i 5 minutter ved 15 C til 30 C. G. Centrifugér ved 16.000 x g til 20.000 x g i 2 minutter. Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten. Bortskaf supernatanten sammen med kemisk affald. H. Tilsæt 1 ml absolut ethanol og bland på vortex-mixer i 10 sekunder. I. Centrifugér ved 16.000 x g til 20.000 x g i 2 minutter. Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten. Bortskaf supernatanten sammen med kemisk affald. BEMÆRK: Hvis pelleten flyder i den resterende supernatant, centrifugeres igen i 1 minut ved 16.000 x g til 20.000 x g. Fjern eventuel resterende supernatant. J. Tør vævspelleten i 10 minutter ved 56 C i en varmeblok med røret åbent. BEMÆRK: Sørg for, at ethanolen er helt fordampet, og pelleten er tør, før der fortsættes med næste trin. BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, kan tørre pelleter opbevares i op til 24 timer ved 2 C til 8 C. K. Resuspendér vævspelletten i 180 µl DNA-vævlysisbuffer (DNA TLB). L. Tilsæt 70 µl rekonstitueret PK. M. Fortsæt med trin A i DNA-isoleringsproceduren. 06322379001-07DA 9 Doc Rev. 7.0

KLARGØRING AF PRØVER DNA-isoleringsprocedure BEMÆRK: Behandl en negativ kontrol sideløbende med prøven/prøverne. Forbered den negative kontrol ved at blande 180 µl DNA-vævlysisbuffer (DNA TLB) og 70 µl PK-opløsning i et 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugerør, der er mærket NEG CT. Den negative kontrol skal behandles ved at følge den samme procedure som den for prøverne. A. Bland rørene, der indeholder prøveblandingen/dna TLB/PK, og den negative kontrolblanding (NEG CT) i 30 sekunder. BEMÆRK: Vævet skal være helt nedsænket i DNA TLB/PK-blandingen. B. Placér rørene i tørvarmeblokken på 56 C, og inkubér i 60 minutter. C. Bland rørene i 10 sekunder på en vortex-mixer. BEMÆRK: Vævet skal være helt nedsænket i DNA TLB/PK-blandingen. D. Placér rørene i tørvarmeblokken på 90 C, og inkubér i 60 minutter. BEMÆRK: Under inkuberingen skal det nødvendige antal filterrør (FT'er) med hængslede låg forberedes ved at placere filterrøret på et prøveglas (CT) og mærke hvert filterrørslåg med den rette prøve- eller kontrolidentifikation. BEMÆRK: Hver prøve behøver 1 FT, 3 CT'er og 1 elueringsrør (1,5 ml mikrocentrifugerør). BEMÆRK: Under inkuberingen mærkes det nødvendige antal elueringsrør (1,5 ml mikrocentrifugerør) med den rette prøve- eller kontrolidentifikation. E. Lad rørene køle ned til 15 C til 30 C. Efter afkøling pulscentrifugeres rørene for at opsamle væske fra lågene. F. Tilsæt 200 µl DNA PBB i hvert rør; bland ved at pipettere op og ned 3 gange. G. Inkubér rørene ved 15 C til 30 C i 10 minutter. H. Tilsæt 100 µl isopropanol i hvert rør; bland lysat ved at pipettere op og ned 3 gange. I. Overfør hvert lysat til den relevant mærkede FT-/CT-enhed. J. Centrifugér FT-/CT-enhederne ved 8.000 x g i 1 minut. K. Placér hvert FT i et nyt CT. Bortskaf udskillelsen fra det gamle CT sammen med kemisk affald, og bortskaf det brugte CT på korrekt vis. L. Tilsæt 500 µl arbejds-wb I i hvert FT. BEMÆRK: Forberedelse af arbejds-wb I er beskrevet i afsnittet "Reagensforberedelse". M. Centrifugér FT-/CT-enhederne ved 8.000 x g i 1 minut. N. Bortskaf udskillelsen i hver CT sammen med kemisk affald. Sæt FT tilbage i samme CT. O. Tilsæt 500 µl arbejds-wb II i hvert FT. BEMÆRK: Forberedelse af arbejds-wb II er beskrevet i afsnittet "Reagensforberedelse". P. Centrifugér FT-/CT-enhederne ved 8.000 x g i 1 minut. Q. Placér hvert FT i et nyt CT. Bortskaf udskillelsen fra det gamle CT sammen med kemisk affald, og bortskaf det brugte CT på korrekt vis. R. Centrifugér FT-/CT-enhederne ved 16.000 til 20.000 x g i 1 minut for at tørre filtermembranerne. S. Placér hvert FTi et elueringsrør (1,5 ml mikrocentrifugerør), der er mærket med prøve- eller kontrolidentifikationen. Bortskaf udskillelsen fra det gamle CT sammen med kemisk affald, og bortskaf det brugte CT på korrekt vis. 06322379001-07DA 10 Doc Rev. 7.0

T. Tilsæt 100 µl DNA EB til midten af hver FT-membran uden at røre FT-membranen. U. Inkubér FT med elueringsrøret ved 15 C til 30 C i 5 minutter. V. Centrifugér FT med elueringsrør ved 8.000 x g i 1 minut for at opsamle eluat i elueringsrøret. Bortskaf det brugte FT på korrekt vis. W. Luk låget på elueringsrøret. Elueringsrøret indeholder DNA-stock-opløsningen. Fortsæt med trin A i afsnittet DNA-kvantificering. BEMÆRK: Måling af DNA-koncentrationen bør foretages umiddelbart efter DNA-isoleringsproceduren og før opbevaring. DNA-kvantificering: A. Bland hver DNA-stock-opløsning på vortex-mixeren i 5 sekunder. B. Kvantificér DNA ved hjælp af et Nanodrop UV-Vis-spektrofotometer (ND-1000 eller ND-2000) i henhold til producentens anvisninger. Anvend DNA EB som blindprøve for instrumentet. Det er nødvendigt med gennemsnitligt to konsistente aflæsninger. De to målinger skal være inden for ±10 % fra hinanden, når DNA-koncentrationsaflæsningerne er 20,0 ng/µl. For DNAkoncentrationsaflæsninger < 20,0 ng/µl skal de to målinger være inden for ± 2 ng/µl. Hvis de to målinger ikke er inden for ± 10 % fra hinanden, når DNA-koncentrationsaflæsningerne er 20,0 ng/µl eller inden for ± 2 ng/µl, når DNA-koncentrationsaflæsningerne er < 20,0 ng/µl, skal der foretages yderligere 2 aflæsninger, indtil kravene opfyldes. Gennemsnittet af disse to nye målinger skal derefter beregnes. BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at måle DNA-stock-opløsningen fra den behandlede negative kontrol (NEG CT). C. DNA-stock-opløsningskoncentrationen fra prøverne skal være 4 ng/µl for at kunne foretage cobas KRAS-mutationstesten. Der køres to amplifikationer/detektioner pr. prøve ved hjælp af 25 µl af en fortynding af DNA-stock-opløsning på 2 ng/µl (i alt 50 ng DNA) for hver amplifikation/detektion. BEMÆRK: Hver DNA-stock-opløsning skal have en minimumkoncentration på 4 ng/µl for at kunne foretage cobas KRASmutationstesten. Hvis koncentrationen af DNA-stock-opløsningen er < 4 ng/µl, skal proceduren for afparaffineringen, DNA-isolering og DNA-kvantificering for den pågældende prøve gentages ved hjælp af to 5 µm FFPET-snit. For prøver, der er placeret på objektglas, kombineres vævet fra begge snit i et rør efter afparaffinering, herefter nedsænkes vævet i DNA TLB + PK, og der foretages DNA-isolering og -kvantificering som beskrevet ovenfor. For prøver, der ikke er placeret på objektglas, kombineres to snit i et rør, hvorefter vævet nedsænkes i DNA TLB + PK, og der foretages DNA-isolering og -kvantificering som beskrevet ovenfor. Hvis DNA-stock-opløsningen stadig er < 4 ng/µl, skal der anmodes om en ny FFPET-prøve. BEMÆRK: Behandlede prøver (oprenset DNA) er holdbare i op til 24 timer ved 15 C til 30 C eller op til 14 dage ved 2 C til 8 C eller op til 60 dage ved -15 C til -25 C eller efter at have gennemgået 3 nedfrysninger/optøninger ved opbevaring ved -15 C til -25 C. Oprenset DNA skal amplificeres inden for de anbefalede opbevaringsperioder eller før udløbsdatoen for det cobas DNA-prøveforberedelseskit, der bruges til oprensning af DNA'et, afhængigt af hvilken der forekommer først. AMPLIFIKATION OG DETEKTION BEMÆRK: For at undgå kontamination af arbejds- MMX med DNA-prøver bør amplifikation og detektion foretages i et område, der er adskilt fra DNA-isolering. Arbejdsområdet for amplifikation og detektion bør gøres grundigt rent, før der arbejdes med MMX-forberedelse. For korrekt rengøring bør alle overflader, inklusive racks og pipetter, aftørres grundigt med en opløsning på 0,5 % natriumhypoklorit og derefter med en opløsning på 70 % ethanol. Almindeligt tilgængeligt flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natriumhypoklorit med en koncentration på 5,25 %. En 1:10-fortynding af et sådant blegemiddel giver en 0,5 % opløsning af natriumhypoklorit. Opsætning af instrumentet: Se manualen til cobas z 480-analyseinstrumentet for detaljerede instruktioner i opsætning af cobas z 480. Opsætning af testrækkefølge: Se manualen til cobas 4800-systemet for cobas KRAS-mutationstest (manualen til cobas KRAS) for detaljerede instruktioner vedrørende trinene i KRAS-arbejdsgangen. 06322379001-07DA 11 Doc Rev. 7.0

Fortyndingsberegning for prøve-dna-stock-opløsningen: Fortyndingsberegning for DNA-stock-opløsningskoncentrationer fra 4 ng/µl til 28 ng/µl BEMÆRK: DNA-stock-opløsninger fra prøver bør fortyndes umiddelbart før amplifikation og detektion. BEMÆRK: Der køres to (2) amplifikationer/detektioner for hver prøve, hvilket kræver en samlet volumen på 50 µl (25 µl hver for codon 12/13 og for codon 61) for en fortynding af DNA-stock-opløsning på 2 ng/µl (af i alt 100 ng DNA). A. For hver prøve beregnes den nødvendige volumen (µl) af DNA-stock-opløsning: µl af DNA-stock-opløsning = (70 µl x 2 ng/µl) DNA-stock-opløsningskoncentration [ng/µl] B. For hver prøve beregnes den nødvendige volumen (µl) af DNA-prøvefortynder (DNA SD): Eksempel: µl af DNA SD = 70 µl µl af DNA-stock-opløsning DNA-stock-opløsningskoncentration = 6,5 ng/µl A. µl af DNA-stock-opløsning = (70 µl x 2 ng/µl) 6,5 ng/µl = 21,5 µl B. µl af DNA SD = (70 µl 21,5 µl) = 48,5 µl Fortyndingsberegning for DNA-stock-opløsningskoncentrationer > 28 ng/µl BEMÆRK: DNA-stock-opløsninger fra prøver bør fortyndes umiddelbart før amplifikation og detektion. BEMÆRK: Der køres to (2) amplifikationer/detektioner for hver prøve, hvilket kræver en samlet volumen på 50 µl (25 µl hver for codon 12/13 og for codon 61) for en fortynding af DNA-stock-opløsning på 2 ng/µl (af i alt 100 ng DNA). A. Ved DNA-stock-opløsningskoncentrationer > 28 ng/µl, anvendes følgende formel til at beregne mængden af DNA-prøvefortynder (DNA SD), der er nødvendig til at forberede mindst 70 µl fortyndet DNA-stock-opløsning. Dette er for at sikre, at hver prøve anvender minimum 5 µl DNA-stock-opløsning. B. For hver prøve beregnes den nødvendige volumen (µl) af DNA SD, der skal anvendes til at fortynde 5 µl DNA-stock-opløsning til 2 ng/µl: Eksempel: Nødvendig volumen af DNA SD i µl = [(5 µl af DNA-stock-opløsning x DNA-stock-opløsningskoncentration i ng/µl) / 2 ng/µl] 5 µl DNA-stock-opløsningskoncentration = 31,7 ng/µl A. Nødvendig volumen af DNA SD i µl = [(5 µl x 31,7 ng/µl) / 2 ng/µl] 5 µl = 74,3 µl B. Anvend den beregnede volumen af DNA SD til at fortynde 5 µl DNA-stock-opløsning. Prøvefortynding Bemærk! Fjern prøvediluent (DNA SD) fra opbevaring ved -15 C til -25 C og tø op ved 15 C til 30 C i mindst 1 time før DNA-fortynding. Bland hvert reagens i 5 sekunder, og indsaml væsken i bunden af røret før brug. A. Forbered det relevante antal 1,5 ml Safe-Lock-mikrocentrifugerør til DNA-fortyndinger ved at mærke dem med den rette prøveidentifikation. B. Tilsæt ved hjælp af en pipette med en ny aerosolresistent spids den beregnede volumen af DNA SD i rørene, der er mærket hertil. Pipettér 35 µl DNA SD i et Safe-Lock-rør, der er mærket som NEG CT. C. Bland hver DNA-stock-opløsning og den negative kontrol i en vortex-mixer i 5 til 10 sekunder. D. Tilsæt ved hjælp af en pipette med en aerosolresistent pipettespids (en ny spids til hver pipettering) forsigtigt den beregnede volumen af hver DNA-stock-opløsning i det pågældende rør, der indeholder DNA SD. Pipettér 35 µl negativ kontrol (oprenset eluat) i NEG CT-røret. E. Sæt låg på rørene, og bland hvert rør i 5 til 10 sekunder på vortex-mixer. F. Skift handsker. 06322379001-07DA 12 Doc Rev. 7.0

Forberedelse af arbejds-master Mix (MMX 12/13 og MMX 61) BEMÆRK: KRAS 12/13 OM, KRAS 61 OM og arbejds-mmx er lysfølsomme og skal beskyttes mod længerevarende udsættelse for lys. BEMÆRK: På grund af viskositeten i KRAS-MIX og arbejds-mmx skal man pipettere langsomt for at sikre, at blandingen er helt afpipetteret fra spidsen. BEMÆRK: KRAS MIX, KRAS 12/13 OM og KRAS 61 OM kan være klar til gul. Dette påvirker ikke reagensets performance. Forbered to arbejds-mmx, én indeholdende KRAS 12/13 OM og den anden indeholdende KRAS 61 OM i separate 1,5 ml Safe- Lock-mikrocentrifugerør. A. Beregn den nødvendige volumen af KRAS MIX til hver arbejds-mmx ved hjælp af følgende formel: Nødvendig volumen af KRAS MIX = (antal prøver + 2 kontroller + 1 kalibrator +1) x 10 µl B. Beregn den nødvendige volumen af KRAS 12/13 OM eller KRAS 61 OM til hver arbejds-mmx ved hjælp af følgende formel: Nødvendig volumen af KRAS 12/13 OM eller KRAS 61 OM = (antal prøver + 2 kontroller + 1 kalibrator +1) x 10 µl C. Beregn den nødvendige volumen af MGAC til hver arbejds-mmx ved hjælp af følgende formel: Nødvendig volumen af MGAC = (antal prøver + 2 kontroller + 1 kalibrator + 1) x 6 µl Brug tabel 1 til at bestemme volumenen for hver reagens, der er nødvendig til forberedelse af arbejds-mmx, baseret på antallet af prøver i kørslen. Tabel 1 Nødvendige volumener af reagenser til arbejds-mmx 12/13 og arbejds-mmx 61 Volumener af reagenser nødvendige til arbejds-mmx Antal prøver* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 KRAS MIX 10 µl KRAS 12/13 OM eller KRAS 61 OM 10 µl MGAC 6 µl Volumen i alt µl 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 130 156 182 208 234 260 286 312 338 364 *Inkluderer tilstrækkelige volumener til 1 rør pr. prøve, 2 kontrolrør, 1 kalibratorrør og 1 ekstra rør D. Fjern det relevante antal KRAS MIX-, KRAS 12/13 OM-, KRAS 61 OM- og MGAC-rør fra opbevaringen ved -15 C til -25 C. Optø hvert reagens ved 15 C til 30 C i mindst 1 time før brug. Bland hvert reagens i 5 sekunder, og indsaml væsken i bunden af røret før brug. Mærk et sterilt mikrocentrifugerør til arbejds-mmx 12/13 og arbejds-mmx 61. Bemærk! Arbejds-MMX'er skal forberedes inden for 1 time, efter reagenserne er optøet. Efter optøning skal eventuelle ubrugte reagenser returneres til opbevaring ved -15 C til -25 C inden for 1 time efter brug. E. Tilsæt den beregnede volumen af KRAS MIX til arbejds-mmx-rørene. F. Tilsæt den beregnede volumen af KRAS 12/13 OM eller KRAS 61 OM til det relevante arbejds-mmx-rør. G. Tilsæt den beregnede volumen af MGAC til arbejds-mmx-rørene. H. Bland rørene på vortex-mixer 3-5 sekunder for at sikre korrekt blanding. BEMÆRK: Prøver og kontroller bør tilføjes microwell-pladen (AD-plade) inden for 1 time efter forberedelsen af arbejds- MMX'er. BEMÆRK: Brug kun microwell-plade (AD-plade) og forseglingsfilm (Roche P/N 05232724001) til cobas 4800-systemet. 06322379001-07DA 13 Doc Rev. 7.0

Figur 1 Prøvepladelayout Prøvepladelayout 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H KRAS MC 12/13 NEG CTL 12/13 KRAS CAL 12/13 KRAS MC Prøve 6 Prøve 6 Prøve 14 Prøve 14 Prøve 22 Prøve 22 61 12/13 61 12/13 61 12/13 61 NEG CTL Prøve 7 Prøve 7 Prøve 15 Prøve 15 Prøve 23 Prøve 23 61 12/13 61 12/13 61 12/13 61 KRAS CAL Prøve 8 Prøve 8 Prøve 16 Prøve 16 Prøve 24 Prøve 24 61 12/13 61 12/13 61 12/13 61 Prøve 1 Prøve 1 Prøve 9 Prøve 9 Prøve 17 Prøve 17 12/13 61 12/13 61 12/13 61 Prøve 2 Prøve 2 Prøve 10 Prøve 10 Prøve 18 Prøve 18 12/13 61 12/13 61 12/13 61 Prøve 3 Prøve 3 Prøve 11 Prøve 11 Prøve 19 Prøve 19 12/13 61 12/13 61 12/13 61 Prøve 4 Prøve 4 Prøve 12 Prøve 12 Prøve 20 Prøve 20 12/13 61 12/13 61 12/13 61 Prøve 5 Prøve 5 Prøve 13 Prøve 13 Prøve 21 Prøve 21 12/13 61 12/13 61 12/13 61 A. Pipettér 25 µl arbejds-mmx i hver reaktionsbrønd på microwell-pladen (AD-plade), som er nødvendig til kørslen. Lad ikke pipettespidsen røre pladen uden for brønden. Tilsæt arbejds-mmx 12/13 (indeholdende KRAS 12/13 OM) til microwell-pladebrøndene (AD-plade) i de ulige talrækker (1, 3, 5 osv.) Tilsæt arbejds-mmx 61 (indeholdende KRAS 61 OM) til microwell-pladebrøndene (AD-plade) i de lige talrækker (2, 4, 6 osv.) B. Pipettér 25 µl af KRAS MC i brønd A1 og A2 på microwell-pladen (AD-plade); bland grundigt ved at bruge pipetten til at aspirere og dispensere i brønden minimum 2 gange. C. Pipettér 25 µl af NEG CT i brønd B1 og B2 på microwell-pladen (AD-pladen) ved brug af en ny pipettespids; bland grundigt ved at bruge pipetten til at aspirere og dispensere i brønden minimum 2 gange. D. Pipettér 25 µl af KRAS CAL i brønd C1 og C2 på microwell-pladen (AD-pladen) ved brug af en ny pipettespids; bland grundigt ved at bruge pipetten til at aspirere og dispensere i brønden minimum 2 gange. BEMÆRK: Hver kørsel skal indeholde positiv kontrol (KRAS MC) i brønd A1 og A2, negativ kontrol (NEG CT) i brønd B1 og B2 og kalibrator (KRAS CAL) i brønd C1 og C2. I modsat fald ugyldiggøres kørslen. BEMÆRK: Skift handsker efter behov for at beskytte mod prøve-til-prøve-kontamination og kontamination af ydersiden af PCR-reaktionsrør. E. Brug en ny pipettespids til hver fortyndet DNA-prøve, og tilsæt 25 µl af den første DNA-prøve til brønd D1 og D2 på microwellpladen (AD-pladen); bland grundigt ved at bruge pipetten til at aspirere og dispensere minimum to gange i brønden. Gentag denne procedure for det fortyndede DNA fra den anden prøve (brønd E1 og E2). Følg templaten i figur 1, indtil alle prøvernes DNAfortyndinger er pipetteret til microwell-pladen (AD-plade). Sørg for, at al væske er samlet i bunden af brøndene. F. Tildæk microwell-pladen (AD-plade) med forseglingsfilm (leveres sammen med pladerne). Brug hjælpespartlen til forseglingsfilm til at forsegle microwell-pladen (AD-plade). G. Kontrollér, at al væske er opsamlet i bunden af hver brønd, før PCR startes. BEMÆRK: Amplifikation og detektion bør startes inden for 1 time efter tilsætning af den første prøve DNA-fortynding til arbejds-mmx. Start af PCR Se manualen til cobas KRAS for detaljerede instruktioner vedrørende trinene i KRAS-arbejdsgangen. 06322379001-07DA 14 Doc Rev. 7.0

FORTOLKNING AF RESULTATER BEMÆRK: Al validering af kørsler og prøver udføres af cobas 4800-softwaren. BEMÆRK: En gyldig testkørsel kan indeholde både gyldige og ugyldige prøveresultater. Hvis kørslen er gyldig, skal prøveresultaterne fortolkes som vist i tabel 2. Tabel 2 Fortolkning af resultater fra cobas KRAS-mutationstest Testresultat Mutationsresultat Fortolkning Mutation Detected Codon 12/13 eller Codon 61 (begge kan være til stede) Mutation Not Detected eller No Mutation Detected* Mutation fundet i KRAS codon 12/13 eller 61, eller begge. Ikke tilgængelig Mutation ikke fundet i KRAS codon 12/13 og 61. Invalid Ikke tilgængelig Prøveresultatet er ugyldigt. Gentag testen af prøver med ugyldige resultater ved at følge instruktionerne, der er beskrevet i afsnittet Gentagelse af test af prøver med ugyldige resultater nedenfor. Failed Ikke tilgængelig Kørsel mislykket på grund af hardware- eller softwarefejl. Kontakt dit lokale Roche-kontor for teknisk hjælp. * Resultatet "Mutation Not Detected" eller "No Mutation Detected" udelukker ikke tilstedeværelsen af en mutation i KRAS 12/13 eller 61 codonområderne, da resultater afhænger af procenten af mutante sekvenser, korrekt prøveintegritet, fravær af inhibitorer og tilstrækkelig DNA, før der kan foretages en detektion. Gentagelse af test af prøver med ugyldige resultater A. Gentag fortynding af den ugyldige prøve af DNA-stock-opløsning startende fra proceduren Fortyndingsberegning for prøve- DNA-stock-opløsning og Prøvefortynding i afsnittet AMPLIFIKATION OG DETEKTION. B. Efter at have foretaget DNA-stock-opløsningsfortynding til 2 ng/µl, som beskrevet i Prøvefortynding, fortsættes med Forberedelse af arbejds-master Mix (MMX 12/13 og MMX 61) og resten af amplifikations- og detektionsproceduren. BEMÆRK: Hvis prøven forbliver ugyldig efter at have foretaget testen igen, eller hvis der ikke var tilstrækkelig DNA-stockopløsning til at forberede en anden opløsning i "Gentagelse af test af prøver med ugyldige resultater", trin A, skal hele testproceduren gentages for den pågældende prøve ved at starte med afsnittet Afparaffinering og DNA-isolering ved hjælp af ny 5-µm FFPET. KVALITETSKONTROL Der skal inkluderes et sæt af cobas KRAS-testmutantkontrol (KRAS MC), negativ kontrol (NEG CT) og KRAS-kalibrator (KRAS CAL) til arbejds-mmx 12/13 og arbejds-mmx 61 i hver kørsel. En kørsel er gyldig, hvis brøndene for KRAS-mutantkontrollen (KRAS MC) (A1 og A2), den negative kontrol (NEG CT) (B1 og B2) og KRAS-kalibratoren (KRAS CAL) (C1 og C2) er gyldige. Hvis KRASmutantkontrollen (KRAS MC), den negative kontrol (NEG CT) eller KRAS-kalibratoren (KRAS CAL) for arbejds-mmx 12/13 eller arbejds-mmx 61 er ugyldige, er hele kørslen ugyldig og skal gentages. Forbered en frisk fortynding af den tidligere isolerede prøve af DNA-stock-opløsning for at opsætte en ny microwell-plade (AD-plade) med kontrol til amplifikation og detektion. Positiv kontrol Resultatet af KRAS-mutantkontrol (KRAS MC) skal være "Valid" (gyldigt) for både arbejds-mmx 12/13 og arbejds-mmx 61. Hvis KRAS MC-resultaterne konstant er ugyldige, kontaktes Roche for teknisk hjælp. Negativ kontrol Resultatet af den negative kontrol (NEG CT) skal være "Valid" (gyldigt) for både arbejds-mmx 12/13 og arbejds-mmx 61. Hvis NEG CT-resultaterne konstant er ugyldige, kontaktes Roche for teknisk hjælp. Kalibrator Resultatet af KRAS-kalibratoren (KRAS CAL) skal være "Valid" (gyldigt) for både arbejds-mmx 12/13 og arbejds-mmx 61. Hvis KRAS CAL-resultaterne konstant er ugyldige, kontaktes Roche for teknisk hjælp. 06322379001-07DA 15 Doc Rev. 7.0

FORHOLDSREGLER VED PROCEDURERNE Som ved alle testprocedurer er det vigtigt med god laboratorieteknik for en korrekt performance af analysen. På grund af testens høje analytiske sensitivitet skal man være omhyggelig med at undgå, at reagenser og amplifikationsblandinger kontamineres. BEGRÆNSNINGER VED PROCEDURERNE 1. Test kun de angivne prøvetyper. cobas KRAS-mutationstesten er kun blevet valideret til brug med FFPET-prøver af kolorektalt cancervæv (CRC) og ikke-småcellet lungecancervæv (NSCLC). 2. cobas KRAS-mutationstesten er kun blevet valideret ved hjælp af cobas DNA-prøveforberedelseskittet (Roche P/N: 05985536190). 3. Detektionen af en mutation er afhængig af det antal kopier, der findes i prøven, og kan påvirkes af prøveintegriteten, mængden af isoleret DNA og tilstedeværelsen af interfererende stoffer. 4. Pålidelige resultater er afhængige af korrekte procedurer for prøvefiksering, transport, opbevaring og behandling. Følg procedurerne i dette pakningsindlæg og i manualen til cobas KRAS. 5. Tilsætningen af AmpErase-enzym til cobas KRAS-mutationstestens Master Mix aktiverer den selektive amplifikation af target- DNA. Kontaminering fra reagenser kan dog kun undgås med god laboratoriepraksis og nøje overholdelse af de procedurer, der er angivet i dette pakningsindlæg. 6. Dette produkt må kun anvendes af medarbejdere, som er uddannet i brugen af PCR-teknikker og brugen af cobas 4800-systemet. 7. Kun cobas z 480-analyseinstrumentet er blevet valideret til brug med dette produkt. Der kan ikke anvendes nogen anden thermocycler med real-time optisk detektion med dette produkt. 8. På grund af naturlige forskelle mellem teknologier anbefales det, at brugeren udfører metodekorrelationsundersøgelser i laboratoriet for at fastslå teknologiske forskelle, før der skiftes fra en teknologi til en anden. 9. Effekten fra andre potentielle variabler, såsom prøvefikseringsvariabler, er ikke blevet evalueret. 10. Selvom de er sjældne, kan mutationer inden for regionerne af de genomiske DNA i KRAS-genet, som er dækket af cobas KRASmutationstestens primere og/eller prober, medføre, at tilstedeværelsen af en mutation ikke detekteres. 11. Forekomst af PCR-hæmmere kan medføre falsk-negative eller ugyldige resultater. 12. Selvom det er sjældent (< 0,2 % 29 ), viser cobas KRAS-mutationstesten resultatet "Mutation Not Detected" for visse komplekse og multiple mutationer af codon 12/13 og codon 61 og påviser begrænset krydsreaktivitet for mutationer, der ligger ved siden af codon 12/13 på exon 2, codon 61 på exon 3 samt codon 59. I tilfælde af en prøve med en mutation i de omgivende områder kan testen rapportere resultatet "Mutation Detected". 13. cobas KRAS-mutationstesten er valideret til brug med 50 ng DNA pr. reaktionsbrønd. DNA-inputmængder mindre end 50 ng pr. reaktionsbrønd anbefales ikke. 14. Den ovenfor beskrevne procedure skal følges for detektion af 5 % mutante sekvenser i en baggrund af vildtype DNA for KRASmutationerne 29 i tabel 3. 06322379001-07DA 16 Doc Rev. 7.0