Evaluering af to forskellige screeningsmetoder til detektion af Streptococcus agalactiae hos gravide

2014 Evaluering af to forskellige screeningsmetoder til detektion af Streptococcus agalactiae hos gravide Evaluation of two different screening methods for the detection of Streptococcus agalactiae in pregnant women Forfatter: Kristine Marie Ravn Studienr: ba11s130 Kliniskvejleder: Margrethe Dahl Vejleder fra University college Syddanmark: Pia Christensen Klinisk uddannelsessted: Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Vejle, Sygehus Lillebælt Uddannelsesinstitution: University College Syddanmark 0 Antal anslag: 48748 Afleveringsdato: 16-12-2014

Indholdsfortegnelse 1.0 Introduktion... 1 1.1 baggrund... 1 1.2 Formål... 3 1.3 Problemformulering... 3 1.4 Målformulering... 3 1.5 Metodevalg... 4 1.6 Teori... 5 1.6.1 Steptococcus agalactiae... 5 1.6.2 GRANADA... 6 1.6.3 Real-time PCR BDmax TM... 6 2.0 Materialer... 7 2.1 Utensilier... 7 2.2 Apparatur... 7 3.0 Metode... 8 3.1 Dyrkning af podninger og urinprøver... 8 3.2 Real-time PCR på BDmax TM... 11 3.3 Etik... 12 3.4 Litteratursøgning... 12 3.5 Databearbejdning... 13 4.0 Resultater... 13 4.1 Antal positive i procent i prøvematerialerne... 14 4.2 Sammenligning af dyrkning 35. graviditetsuge vs ved fødslen... 15 4.3 Real-time PCR på BDmax TM... 18 5.0 Diskussion... 19 5.1 Diskussion af resultater... 19 5.1.1 Prøvematerialet... 19 5.1.2 Dyrkning på Granada agar i 35. graviditetsuge vs. ved fødsel... 21 5.1.3 Sensitivitet og specificitet af real-time PCR på BDMax TM... 22 5.2 Diskussion af brugervenligheden af Granada agar og BDmax TM... 23 5.2.1 Brugervenligheden af Granada agar... 23 5.2.2 Brugervenligheden af real-time PCR på BDmax TM... 24 6.0 Konklusion... 25

7.0 Perspektivering... 25 8.0 Litteraturliste... 27 Bilag 1 Rådata for dyrkning fra 35. graviditetsuge + fødsel... 29 Bilag 2 Rådata for real-time PCR på BDmax TM + dyrkning fødsel... 36 Bilag 3 Granada agar indlægsseddel... 40 Forord Projektets praktiske del er udført på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Vejle, Sygehus Lillebælt. Målgruppen for bachelorprojektet, er bioanalytiker personaltet på afdelingen, da det er dem der ved implementering skal lave, det i praksis. Der skal specielt takkes projektleder, overlæge, Gyn./Obs. afd., Mohammed Khalil, Sygehus Lillebælt, Kolding for, at dette bachelorprojekt kan blive til, da den bygger på baggrund af Mohammed Khalil s kliniske studie, som er en del af hans ph.d projekt. Derudover skal der lyde et stort tak til hovedvejleder, professor, specialchef, dr. med Jens Kjølseth Møller, Vejle Sygehus, Syddanmark som har designet bachelorprojektets metode. Til sidst vil jeg gerne takke personalet på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Vejle, Sygehus Lillebælt for deres hjælpsomlighed ved oplæring og fordi de har hjulpet ved at lægge pladerne til side, så vi kunne aflæse dem om eftermiddagen.

Evaluering af to forskellige metoder til detektion af Streptococcus agalactiae hos gravide Forfatter: Ravn, Kristine Marie, Klinisk vejleder: Dahl, Margrethe, UCSyd vejleder: Christensen. Pia, Klinisk institution: Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Vejle, Sygehus Lillebælt Baggrund: Der benyttes i dagens Danmark, risikoregimet til detektion af Gruppe B streptokokker (GBS). Denne metode er ikke den bedste, da mange gravide kvinder, ikke bliver identificeret med GBS. Det ønskes derfor, at indføre et screeningsprogram, som samtidig kan finde flest sandt positive. Metode: Der blev indsamlet prøver fra 163 gravide, til dykning på Granada agar samt 5 % blodager. Hver gravid kvinde indsendte to prøvesæt, som hver bestod af en urinprøve samt en rectum- og vaginalpodning. Det første prøvesæt, blev taget i 35. graviditetsuge og det andet prøvesæt, ved fødslen. Der blev yderligere kørt real-time PCR på 157 vaginalpodninger, som var uafhængige, fra dem, som der blev lavet dyrkning på. Real-time PCR blev kørt på BDmax TM, som er et fuldautomatisk lukket system. Resultater: Der blev fundet flest positive koloniseret, ved GBS i dyrkning af rectumpodninger taget i 35. graviditetsuge og ved fødslen. Sensitiviteten var højest ved BDmax TM på 85,7 %. Real-time PCR klarede sig bedst og fik en næsten perfekt overensstemmelse, med dyrkning fra fødslen. Konklusion: Bachelorprojektet viste, at rectumpodningerne var det mest effektive prøvemateriale. I forhold til sensitiviteten, er vaginalpodninger kørt på BDmax TM. Den screeningsmetode med højest sensitivitet og dermed den med flest sandt positive. Rectumpodninger ved dyrkning i 35. graviditetsuge, havde næsten samme sensitivitet, som realtime PCR på BDmax TM og har dermed også mange sandt positive. Det bekræftes hermed, at professionsbachelorprojektet er udfærdiget uden uretmæssig hjælp. 16/12-2014_ Dato Underskrift 0

1.0 Introduktion 1.1 baggrund I dette bachelorprojekt, som blev udført på Klinisk Mikrobiologisk afdeling i Vejle, Sygehus Lillebælt ønskes det, at undersøge to metoder til eventuelt implementering af en screeningsmetode, til detektion af Streptococcus agalactiae også kaldet Gruppe B streptokokker (GBS) [1] med sammenligning af den nuværende metode. Forsøget blev lavet sideløbende, med et klinisk studie af Mohammed Khalil, projektleder, overlæge, Gyn./Obs. afd., Sygehus Lillebælt, Kolding som blev udført på Klinisk Mikrobiologisk afdeling i Vejle, Sygehus Lillebælt som en del af hans ph.d projekt. [2] Dette bachelorprojekt er opbygget på baggrund af dette ph.d projekt og metoden er ligeledes opbygget på samme måde. GBS kan forårsage alvorlige sygdomme hos nyfødte, som i værste fald kan føre til barnedød. Gravide der er koloniseret med GBS, varierer mellem 10-30 % i forskellige lande. Det er ca. 40-50 % af nyfødte, født af en koloniseret mor, der bliver koloniseret med GBS, heraf er det 1-2 % der bliver syge af kolonisationen. [3] Det første menneske inficeret med GBS blev rapporteret i 1930 erne og var den gang ukendt for kliniker. Dette ændrede sig i 1964, hvor det første studie om prænatal GBS infektioner blev publiceret. I 1970 erne steg forekomsten af GBS og der var en dødelighed på 20-50 % hos nyfødte. Der blev derfor indført overvågning. I 1980 erne og tidligt i 1990 erne steg antallet af GBS infektioner konstant på 1,5 til 2 tilfælde pr. 1000 fødsler. Med indførelse af forebyggelse mod GBS i 1990 erne blev antallet af inficerede med GBS nedsat med 70% og der var derfor i stedet 0,5 tilfælde pr 1000 fødsler. Incidenten var stabil fra 1999 frem til 2002 [4]. USA opdaterede deres guidelines fra Centers for Disease Control and prevention (CDC) i 2002, hvorefter incidenten blev nedsat yderligere. [3] I Danmark er der cirka 30 tilfælde om året af nyfødte der bliver ramt af sygdommen. [5] Dette er ikke mange tilfælde om året, men da det er den førende årsag til sygelighed og dødelighed hos nyfødte, [6] er det vigtigt at identificere flest mulige gravide koloniseret med GBS. I dagens Danmark benyttes der risikoregimet til detektion af GBS. Alle gravide får foretaget en screening for asymptomatisk bakteriuri i 1. og 2. trimester samt ved svangerundersøglesen i 3. trimester. Ved en positiv screening for urinmikroskopi eller positiv urinstix for nitrit og leukocytter, suppleres der med en urindyrkning. Rutinemæssigt foretages der urindyrkning og evt. resistensbestemmelse i uge 16 hos gravide med anamnese omfattende hyppige urinvejsinfektioner, tidligere urinvejsinfektion i 1

graviditeten, præterme veer eller præterm vandafgang i tidligere graviditet. Uanset mængden af GBS fund ved urindyrkningen behandles den gravide med antibiotika og fødestedet bliver informeret. Under fødslen gives der endvidere antibiotikabehandling i form af intrapartum prophylaxis, for at forebygge GBS-sygdomme hos den nyfødte. [5] I dette bachelorprojekt vil der blive undersøgt to screeningsmetoder til detektion af GBS. Den er baseret på dyrkning på Granada agar i 35. graviditetsuge, og den anden er en hurtig real-time PCR på BDmax TM lavet ved fødslen. De to metoder er beskrevet kort herunder: Dyrkning på Granada agar i 35. graviditetsuge I mange andre lande har de skiftet fra risikoregimet til en universal screening til detektion af GBS med dyrkning på Granada agar. [3] Skiftet skete på baggrund af CDC guideline som blev revideret i 2002 på baggrund af nye studier. De nye studier demonstrerede en lavere risiko for nyfødte, der blev syge af GBS ved brug af universal screening i forhold til risikoregimet. De nye guidelines fra CDC blev blandt andet benyttet i USA. [3] Anbefaling fra CDC og andre samfund lyder derfor i dag på, at der screenes prænatal omkring 35. til 37 graviditetsuge med en samlet rectal-vaginal podning. Problemet med denne screeningsmetode ifølge studier er, at der på trods af brugen af universal screening alligevel er tilfælde af sygdommen hos nyfødte. Dette involverer især for tidligt fødte, og de mødre der har en negativ GBS screening før fødslen. Mødre til for tidligt fødte bliver vurderet i forhold til risikoregimet og får intrapartum prophylaxis på baggrund af dette. Dette er et problem, da den udbredte brug af antibiotika er forbundet med anafylaksi hos mødre. [7] Hurtig real-time PCR på BDmax TM ved fødslen På baggrund af disse ulemper ved dyrkning i 35. graviditetsuge er der blevet lavet betydelige indsatser, for at udvikle et diagnoseværktøj som kan identificere GBS hos gravide ved fødslen. Der er derfor lavet forskellige studier på brugen af real-time PCR ved fødslen med gode prognoser. [7] Real-time PCR r hurtig og kan mindske antallet af unødvendige antibiotika behandlinger til forebyggelse for GBS hos de gravide. Dog er den væsentlige ulempe ved real-time PCR r, at denne model koster mere end dyrkning. Den skal derfor være væsentlig mere fordelagtig end dyrkning i 35. graviditetsuge. [8] Derfor bliver den også undersøgt med dyrkning som gylden standard. 2

1.2 Formål Det nuværende risikoregime til detektion af GBS er forældet i forhold til mange andre landes brug af universal screening. Formålet med dette bachelorprojekt er derfor at sammenligne to screeningsmetoder til detektion af GBS med den nuværende risikoregime, med henblik på at finde den metode med flest sandt positive. Der bliver derfor undersøgt forskellige faktorer for at finde frem til dette. Disse faktorer er prøvematerialet og tidspunktet for screeningen. Prøvematerialerne der vil blive sammenlignet i dette projekt er urin, vaginal- og rectumpodninger, for at se hvilket af disse der indeholder flest positive GBS. Prøvetagningstidspunktet er i forhold til om der skal screenes i 35. graviditetsuge ved dyrkning på Granada agar, eller ved en real-time PCR på BDmax TM ved fødslen. Det er derfor formålet at sammenligne antallet af sand positive på disse to prøvetagningstidspunkter, samt sensitiviteten af vaginalpodninger på real-time PCR på BDmax TM med dyrkning fra fødslen som gyldenstandard. 1.3 Problemformulering Hvordan vil en screening for hæmolytiske streptokokker gruppe B hos gravide kunne designes, så der opnås flest sandt positive? - Hvilket prøvemateriale (urin, vaginal- eller rectumpodning) er mest effektivt (flest positive) til detektion af hæmolytiske streptokokker gruppe B hos gravide? - Hvilke konsekvenser har det for screeningen, om den udføres i graviditetsuge 35 eller ved fødslen? - Hvordan er sensitiviteten af Real-Time PCR på BDMax for vaginalpodninger taget i E-swab til detektion af hæmolytiske streptokokker gruppe B med dyrkning på Granada-agar som gylden standard. 1.4 Målformulering Undersøgelsen af dyrkning på Granada agar i 35. graviditetsuge og real-time PCR på BDmax TM ved fødslen, laves med henblik på eventuel implementering af et screeningsprogram på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Vejle, Sygehus Lillebælt eller på en fødeafdeling. 3

Det ønskes at afgøre hvilket prøvemateriale der har flest positive samt om det i 35. graviditetsuge eller ved fødslen. Målet med projektet er at finde frem til det screeningsprogram enten ved dyrkning på Granada agar i 35. graviditetsuge eller real-time PCR, som ved fødslen har flest positive og højest sensitivitet og specificitet, med dyrkning fra fødslen som gylden standard. 1.5 Metodevalg Metoden blev designet af hovedvejleder, professor, specialchef, dr. med Jens Kjølseth Møller, Vejle Sygehus, Syddanmark og projektleder, overlæge, Gyn./Obs. afd., Mohammed Khalil, Sygehus Lillebælt, Kolding. Det blev valgt at udføre forsøgene efter den benyttede metode til Mohammed Khalil kliniske studie, som blev udført af personalet på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Vejle, Sygehus Lillebælt, som ved starten af dette bachelorprojekt allerede var i gang. Dette blev valgt på baggrund af personalet, for at de ikke skulle komme ud af rytme, i forhold til proceduren efter den periode hvor projektet blev overtaget af os under indsamling af data til bachelorprojektet. Det mentes derfor, at det ville være lettere for personalet at forsætte efter dataet til bachelorprojektet var blevet indsamlet. Målet for bachelorprojektet var at indsamle 150 prøvesæt, bestående af en urinprøve i spidsglas samt en vaginal- og rectumpodning i Eswab fra gravide kvinder, enten taget i 35. graviditetsuge eller ved fødslen. Ved ankomst til jordmoder kontrol i uge 35-37 blev de gravide kvinder bedt om selv at pode sig fra vagina og rectum og aflevere en urinprøve. Der blev så igen ved fødslen taget de samme prøver. Prøverne blev herefter sendt blindet til Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Vejle, Sygehus Lillebælt. Under indsamlingen af data til dette bachelorprojekt blev alle prøverne fra en hel dag samlet og udsået sent om eftermiddagen. Der blev i perioden i alt indsamlet 163 prøvesæt. Urinprøverne blev udsået på 5 % blodagar og vaginalog rectumpodningerne blev udsået på en Granada agar til sammen. Granada agaren blev delt op i midt ved at tegne en streg med en tusch, hvor der på den ene side blev udsået med vaginalpodningen og på den anden side med rectumpodningen. Dette blev valgt på baggrund af, at det var mere økonomisk. Det blev først bestemt, at der kun skulle udsåes direkte med podepind fra Eswab på Granada agaren. Dette blev dog lavet om af personalet på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Vejle, Sygehus Lillebælt, da 4

udsåningen kun med podepinden var for tæt og derfor svært at få enkelt stående kolonier. Det blev lavet om til en 2-kants eller en 3-kants spredning. Til real-time PCR på BDmax TM blev der kun kørt vaginalpodninger som blev bestemt på en økonomisk baggrund. Vaginalpodningerne der blev kørt på BDmax TM, blev taget op fra frys før kørsel, på grund af disse var blevet nedfrosset efter dyrkning. Det blev valgt at fryse vaginalpodningerne, da real-time PCR på BDmax TM først blev kørt senere inde i det kliniske studie og ved starten af dette bachelorprojekt. Dette medførte dermed også, at der til bachelorprojektet blev kørt BDmax TM på vaginalpodninger fra starten af det kliniske studie, og ikke på de prøver der blev indsamlet under bachelorprojektet, da der ikke blev nået op til disse prøvenumre. Der blev i alt kørt PCR på 157 vaginalpodninger fra de gravide, som var uafhængige af dem der blev lavet dyrkning på. 1.6 Teori 1.6.1 Steptococcus agalactiae Streptokokker er fakultative gram positiv kokker i kæde som alle er katalase negative. Streptococcus agalctiae, også kaldet Gruppe B Streptokokker (GBS), er kendetegnet ved, at de danner en lille β- hæmolysezone rundt om kolonierne på 5 % blodager plade. [1] GBS er den førende årsag til infektioner hos nyfødte. [7] Den bliver primært fundet i vagina, rectum og i urinrøret. Kolonisation af GBS er ikke altid patogen, men kan forårsage alvorlige infektioner hos voksne som meningitis, sepsis, infektion af knoglerne, endokarditis, urinvejsinfektioner, infektion af fosterhinder, underlivsbetændelse, kejsersnit og episiotomi infektion. [3] Den nyfødte bliver typisk inficeret med GBS fra moderen under fødslen. Dette sker ved en vertikal transmission i begyndelsen af fødslen eller efter bristning af fosterhinderne. [9] Symptomer på GBS infektion hos den nyfødte viser sig ofte inden de først 24-48 timer efter fødsel. De mest typiske symptomer hos den nyfødte er respiratoriske sygdomme som lungebetændelse, apnø, sepsis og meningitis. [3] For at forhindre smitten fra moderen til den nyfødte, behandles der i Danmark med intrapartum prophylaxis hos de gravide med særlige risikofaktorer og ved fund af GBS i urindyrkning. [5] Det valgte antibiotika til dette er typisk penicillin eller ampicillin.[4] 5

1.6.2 GRANADA Granada agar fra Biomérieux er et selektiv medie. Den kan bruges som screeningsmedie ved detektion af GBS. Ingredienserne og opskriften på Granada agaren er baseret på en formel af Dr. De La Rosa. Den består af en næringsbase, som består af en kombination af forskellige peptoner, pyruvater og glykose. Tilstede i mediet er også methotrexaten, hesteserum og stivelse, som gør det muligt at producere et pigment ved tilstedeværelsen af GBS kolonier. Den kombination af ingredienser gør at mediet hæmmer de fleste gram negative bakterier og gærsvampe. [6] Granada agaren indeholder et differentiel medium, som ved tilstedeværelsen af GBS identificeres ved produktionen af orange kolonier. [10] 1.6.3 Real-time PCR BDmax TM Til PCR blev der benyttet BDmax TM, som er et fuldautomatisk lukket system, der benytter real-time PCR til analysering. Da det er et lukket system vil det sige, at der ikke skal oprenses inden analysering. [11] Til analysering af GBS benyttes der specielle GBS assay kits til formålet. Et GBS assay kit inderholder 24 enhedsinddelt reagensstrimler, 24 GBS mastermix og 24 reaction tubes. I GBS assay kittet findes også en intern proceskontrol, som overvåger tilstedeværelsen af potentielt hæmmende stoffer eller reagensfejl. [11] Oprensningen sker ved en kombination af lytiske- og ekstraktionsreagenser. De frigjorte nukleinsyrer bliver herefter indfanget af magnetiske affinitetsperler, som bliver vasket og nukleinsyre frigøres og forberedes til PCR ved tilføjelse af neutraliseringsreagens. [11] PCR bruges til at opformere DNA-sekvensere til senere analysering. PCR består af tre trin: 1. Først sker der en denaturering, hvor den dobbelt strengede DNA s hydrogenbindinger brydes, så der dannes to enkelt strenget. Dette sker ved en opvarmning på ca. 94-96 C. 2. Ved annealing sker der en hurtig temperatursænkning til omkring 50-60 C her påsættes primer stykkerne. 3. I det sidste trin ekstension forlænges primerne ved brug af en polymerase og enkelte nukleiotider.[12] 6

Da princippet i BDmax TM er real-time PCR, har primerne en fluorfor og en quencher forbundet. Primerne er yderlig forbundet til en probe. Under ekstensionen forlænges primerne langs med en strengløkke, som holder fluorfor og quencheren fast til primeren. Dette forårsager at fluoroforen og quencheren deassocieres. Derefter arrangeres den forlængede primer igen og bindes til den nyligt forlængede DNAstreng og begynder at fluorescere imens primeren der ikke forlænges bliver hæmmet. Fluorescerende signal der udsendes af proberne i slutningen af amplificationscyklussen analyseres af BDmax TM. Der kommer så et endeligt svar på enten positiv, negativ eller inkonklusiv. [11] 2.0 Materialer 2.1 Utensilier Granada-agar fra BioMériuex 5 % blodagar fra Statens serum institut (SSI) 1 µl øser 10 μl øser Tandstikker Matrix Handsker Pipettespidser GBS Assay Kit (a 24 styk) 2.2 Apparatur Microflex LT MALDI-TOF-system fra Bruker BDMax Køleskab Fryser (-80 C) CO 2 -varmeskab 7

3.0 Metode Data blev indsamlet i perioden d. 23/10-2014 til d. 12/11-2014. Der blev indsamlet i alt 163 prøvesæt fra gravide. Et prøvesæt bestod af en urinprøve i spidsglas samt en vaginal- og en rectalpodning i Eswab. De gravide fik taget et prøvesæt i 35. graviditetsuge og endnu et prøvesæt ved ankomst til fødslen. Der blev kun kørt real-time PCR på vaginalpodninger ved brug af BDmax TM. BDmax TM blev kørt fra andre vaginalpodninger end dem der blev dyrket på. Dette var på grund af real-time PCR på BDmax TM først blev kørt i starten af bachelorprojektet. Der blev først kørt real-time PCR på de ældste prøver i fryseren og derefter optil de nyere. I alt blev der kørt real-time PCR på BDmax TM på 157 vaginalpodninger. Som gylden standard blev der benyttet dyrkning på Granada agar fra fødslen. Dyrkningerne fra Granada agar fra fødslen blev brugt til sammenligning af resultater opnået fra henholdsvis dyrkning på Granada agar fra 35. graviditetsuge og real-time PCR på BDmax TM. 3.1 Dyrkning af podninger og urinprøver Prøvemodtagelse: Prøvesæt fra de gravide ankom løbende over hele dagen og blev samlet til sent eftermiddag. Om eftermiddagen ankom de sidste prøver, og alle prøvesæt blev udsået på samme tidspunkt. Ved modtagelse ankom prøverne blindede sammen med en rekvisitionsseddel. Der fulgte en rekvisitionsseddel med til et prøvesæt. På Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Vejle, Sygehus Lillebælt blev hvert prøvesæt tildelt et fælles projekt nummer (R-serie). Et prøvesæt fra en gravid taget ved fødslen, fik tildelt et andet projekt nummer end det indsendte prøvesæt, fra samme gravide taget i 35. graviditetsuge. Rekvisitionssedlerne blev registret i Mikrobiologisk Afdelings Data System (MADS). Der blev på forsiden anført nummeret 177 samt oplysning om evt. behandling med antibiotika. Urinprøverne i spidsglas blev udsået på en 5 % blodagar fra SSI og vaginal- og rectumpodningerne i Eswab blev udsået på Granada agar fra BioMérieux. 8

Udsåning: Fremgangsmåde 5% blodager fra SSI: 1. Urinprøven vendes 2. Der opsamles 1μL urin med øse 3. Der udsåes kvantitativ (Se figur 1) 4. Inkuberes i CO 2 varmeskab i 48 timer Fremgangsmåde Granada agar: 1. Pladen deles op i midten med en tusch 2. Vaginalpodningerne udsåes på den ene side og rectumpodningerne på den anden side (Se figur 1) 3. Med vaginalpodepinden afsættes der prøvemateriale på den vaginale side af pladen mærket V 4. Med en 10μL øse laves en 2-kants eller 3-kantsspredning 5. Det samme gøres ved rectumpodningen på den rectale side på pladen mærket R 6. Pladen inkuberes i CO 2 varmeskab i 48 timer 7. Vaginal- og rectumpodningerne i Eswab fryses ned til senere PCR brug. Figur 1: Viser 5 % blodagar udsået kvantitativ med 1 μl urin. Granada agaren delt i to med vaginalpodning udsået med 2- kantsspredning på den ene side og rectumpodning på den anden side også 2-kantsspredning. Billdet er lavet i Paint til brug til egen undersøgelser. 9

Aflæsning: Granada agar og 5 % blodagar pladerne blev aflæst efter inkubation i 48 timer. Der sendes ingen svar ud på baggrund af dette projekt. 5 % blodagar plade: GBS blev genkendt ved, at den dannede en lille beta-hæmolysezone på 5 % blodagar pladen. De var i nogle tilfælde svære at skelne fra andre bakterier med hæmolyse. Dette skyldtes især manglende erfaring. Der blev derfor lavet katalase-test for at skelne Streptokokker fra især Stafylokokker. Streptokokker er alle katalase negative, hvor Stafylokokker er katalase positive. [1] Blev katalase-testen negativ blev der kørt Microflex LT Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization Time Of Flight (MALDI- TOF)-system fra Bruker. Katalase testen medvirkede, at der ikke blev kørt mange unødige kørsler på MALDI-TOF. Granada agar: GBS blev detekteret som små til større kolonier på Granada agar som kunne være fra lys til mørk orange (figur 2). De negative kolonier dannede hvide til gule kolonier (figur 3). Der blev kørt MALDI-TOF på de gule kolonier. Dette blev gjort for at sikre, at de var negative og ikke svage orange. Der var ingen af de gule kolonier der blev kørt på MALDI-TOF, der blev detekteret at værende Streptococcus agalactiae. Figur 2: Positiv Granada agar for GBS med orange kolonier på både rectum og vagina siden. Billedet er taget fra egne undersøgelser Figur 3: Negativ Granada agar for GBS med hvide kolonier. Billedet er taget fra egne undersøgelser- 10

Yderlig dataindsamling: Da indsamlingsperioden d. 23/10-2014 til d. 12/11-2014 kun var på 3 uger, var det ikke realistisk at modtage et prøvesæt fra 35. graviditetsuge samt et sæt ved fødslen for alle de 150 ønskede prøvesæt. Ud af de 163 prøvesæt indsamlet i perioden var der 8 gravide der nåede at føde og indsende to prøvesæt. De gravide som indsendte et prøvesæt fra 35. graviditetsuge, men som ikke nåede at sende anden prøvesæt i perioden blev ekskluderet. De gravide vi modtog prøvesæt fra ved fødslen blev inkluderet, og det første prøvesæt fra 35. graviditetsuge blev hentet i MADS på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Vejle, Sygehus Lillebælt. Dette giver i alt med MADS 170 prøvesæt fra 85 gravide. Dette blev igen suppleret med prøver udført af personalet på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Vejle, Sygehus Lillebælt, som blev udleveret af hovedvejleder, professor, specialchef, dr. med Jens Kjølseth Møller, Vejle Sygehus, Syddanmark. Dette gav i alt en sum af 610 prøvesæt fra 305 gravide. 3.2 Real-time PCR på BDmax TM Der blev kun kørt real-time PCR på BDmax TM på vaginalpodninger. Real-time PCR blev udført på BDmax TM ved brug af GBS assay kits. Da BDmax TM er et fuldautomatisk lukket system med en analyseringstid på 2½ time, er den forholdsvis simpel at administrere. Opsætning af BDmax TM : 1. Vaginalpodningerne hentes fra fryseren 2. Der indtastes manuelt en arbejdsliste på computeren tilhørende BDMax TM 3. Når vaginalpodningerne er optøet, udtages der 300 μl som overføres til et separat rør (reaction tubes) 4. Derefter klikkes der GBS Master-mix og GBS Extraction reagent i den enhedsinddelte reagensstrimmel. 5. Det separate rør med prøvematerialet samt reagensstrimlen sættes på BDmax TM 6. Der tjekkes at alt sidder korrekt og BDmax TM startes Aflæsning: Efter analysering blev svarende fra BDmax TM udskrevet i papirform, hvor svaret står som positiv, negativ eller inkonklusiv. Ved inkonklusive svar blev disse vaginalpodninger kørt om. Svarende blev skrevet ind i skema i et Excel ark. 11

Yderlig dataindsamling: På grund af det var ældre numre, der ikke stemte overens med de gravide fra dyrkning, blev der hentet dyrkningssvar fra fødslen i MADS. De hentede dyrkningssvar var blevet udført på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling i Vejle, Sygehus Lillebælt før bachelorprojektet startede. 3.3 Etik De deltagende kvinder i projektet underskriver en samtykkeerklæring, hvor de tillader at deres prøvemateriale benyttes i projektet. Alle prøvesvar anonymiseres til resultatbehandlingen. Overlæge Mohammed Khalil, som er projektleder for det overordnede projekt, har indhentet godkendelse fra Datatilsynet og Den Regionale Videnskabsetiske Komité. Alle resultater vil blive offentliggjort. 3.4 Litteratursøgning Litteratursøgning blev foretaget ved brug af Pubmed. Kriterierne for artiklerne var at de skulle være fra 2002, hvor CDC guidelines ændrede sig og frem til 2014. Til diskussionsafsnittet minimum 5 år gammel t. Ekskluderingskriterierne var også artikler der ikke omhandlede gravide med GBS. Tabel 1: Viser nogle af de søgeord der er blevet søgt på Pubmed. Søgeord Antal fund Tidspunkt Streptococcus agalactiae + 2194 23/10-2014 screening Streptococcus agalactiae + 20 23/10-2014 granada agar Streptococcus agalactiae + 433 25/10-2014 pregnancy Group b streptococcus + 483 25/10-2014 pregnancy Group b streptococcus + pcr 383 25/10-2014 Group b streptococcus + vaginal 1127 6/11-2014 12

3.5 Databearbejdning Til databearbejdning opsamles alle dyrknings resultater i et Excel ark (se bilag 1) samt alle PCR resultater i et Excel ark. Her foretages sammenligning af prøvematerialerne vaginal- og rectumpodningerne samt urinprøverne fra 35. gravitetsuge, og ved fødslen beregnes antal positive i procent opsamlet i en tabel samt en graf i resultatafsnittet. Derudover beregnes sensitivitet og specificitet på de forskellige prøvematerialer for 35. graviditetsuge med dyrkning ved fødslen som gylden standard. Til at sammenligne dyrkning i 35. graviditetsuge med dyrkning ved fødslen anvendes kappa-koefficient. Databearbejdningen for PCR består af en kappa-koefficient beregning med formålet at sammenligne PCR ved fødslen på vaginalpodninger med dyrkning på vaginalpodninger. Sensitiviteten og specificiteten vil blive beregnet med dyrkning på vaginalpodninger som gylden standard. Data der vil blive ekskluderet fra databearbejdningen er: De gravide der mangler en urinprøve, vaginaleller rectumpodning vil blive ekskluderet fra beregning af disse prøvematerialer. Det vil sige, hvis der mangler en urinprøve fra en gravid fra 35. graviditetsuge, bliver denne ekskluderet sammen med urinprøven fra fødslen, og vil ikke være med i beregningen af antal positive, kappa-koefficient og sensitivitet samt specificitet for urinprøver. Den samme kvindes vaginal- samt rectumpodning vil blive inkluderet i beregningerne her af. 4.0 Resultater Målet med dette bachelorprojekt er, at finde den screeningsmetode til detektion af GBS med flest sandt positive. Derfor er resultaterne evaluret i forhold til flere faktorer: prøvematerialet, prøvetagningstidspunkt samt metodevurdering. 13

Antal i procent % 4.1 Antal positive i procent i prøvematerialerne Tabel 2 Demonstrer antallet af positive og negative ved dyrkning af urinprøver samt vaginal- og rectumpodninger taget henholdsvis i 35. graviditetsuge og ved fødslen Positive i Negative i Positive i Negative i antal antal procent procent Vagina 35. graviditetsuge 40 259 13,4 86,6 Vagina Fødsel 45 254 15,1 84,9 Rectum 35. graviditetsuge 57 241 19,1 80,9 Rectum fødsel 55 243 18,5 81,5 Urin 35. graviditetsuge 18 272 6,2 93,8 Urin fødsel 11 279 3,8 96,2 Graf 1: Fordeling af positive og negative resultater i procent i forhold til prøvemateriale og tidspunkt for prøvetagning 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Vagina - uge 35 Fordeling af positive og negative Vagina - fødsel Rectum - uge 35 Rectum - fødsel Urin - uge 35 Urin - fødsel Negative Positive 14

4.2 Sammenligning af dyrkning 35. graviditetsuge vs ved fødslen Vaginalpodninger: Tabel 3; Viser oversigt over sandt positive + sandt negative for vaginalpodninger ved 35. graviditetsuge med dyrkning fra fødslen som gylden standard Uge 35 Pos Neg Total Fødsel Pos 33 (sand positiv) 12 (falsk negative) 45 Neg 7 (falsk positive) 247 (sand negativ) 254 Total 40 259 299 Beregnede kappa-koefficient for dyrkning med vaginalpodning taget i 35.graviditetsuge sammenlignet med dyrkning af vaginalpodninger taget ved fødslen: Kappa-koeficient = 0,74 God overensstemmelse Sensitivitet og specificitet beregnede for vaginalpodninger taget i 35. graviditetsuge: Sensitivitet = = = 73,3 % Specificiteten = = = 97,2 % 15

Rectumpodninger: Tabel 4: Viser oversigt over sandt positive og sandt negative for rectumpodninger ved 35. graviditetsuge med dyrkning fra fødsel som gylden standard Uge 35 Pos Neg Total Fødsel Pos 46 9 55 Neg 11 232 243 Total 57 241 298 Beregnede kappa-koefficient for dyrkning med rectumpodninger taget i 35.graviditetsuge sammenlignet med dyrkning af rectumpodninger taget ved fødslen: Kappa-koeficient = 0,78 God overensstemmelse Sensitivitet og specificitet beregnede for rectumpodninger taget i 35. graviditetsuge: Sensitivitet = = = 83,6 % Specificiteten = = = 95,5 % 16

Urinprøver: Tabel 5: Viser oversigt over sandt positive og sandt negative for urinprøver ved 35. graviditetsuge med dyrkning fra fødsel som gylden standard Uge 35 Pos Neg Total Fødsel Pos 2 9 11 Neg 16 263 279 Total 18 272 290 Beregnede kappa-koefficient dyrkning af urinprøver taget i 35.graviditetsuge sammenlignet med dyrkning af urinprøver taget ved fødslen: Kappa-koeficient = 0,1 Svag overensstemmelse Sensitivitet og specificitet beregnede for urinprøver taget i 35. graviditetsuge: Sensitivitet = = = 18,2 % Specificiteten = = = 94,3 % 17

4.3 Real-time PCR på BDmax TM Tabel 6: Viser oversigt over sandt positive og sandt negative for vaginalpodning ved real-time PCR på BDmax TM med dyrkning fra fødsel som gylden standard. PCR Pos Neg Total Fødsel Pos 24 3 27 Neg 4 126 130 Total 28 129 157 Beregnede kappa-koefficient for vaginalpodninger fra fødslen analyseret ved real-time PCR BDmax TM sammenlignet med dyrkning fra fødslen: Kappa-koeficient = 0,85 Næsten perfekt overensstemmelse Sensitivitet og specificitet beregnede for vaginalpodninger taget ved fødslen kørt på BDmax TM : Sensitivitet = = = 88,9 % Specificiteten = = = = 96,9 % 18

5.0 Diskussion 5.1 Diskussion af resultater I dette afsnit vil de opnåede resultater i dette bachelorprojekt blive sammenholdt med relevant litteratur. Diskussionsafsnit er sat op efter punkterne i problemformuleringen. 5.1.1 Prøvematerialet Resultaterne fra tabel 2 samt graf 2 viser, at der er en stor variation i antallet af positive fund i urinprøverne, vaginal- og rectumpodningerne. I vaginalpodningerne som blev udsået på Granada agar, blev der fundet 13,4 % positive i 35. graviditetsuge og 15,1 % positive ved fødslen. Rectumpodningerne udsået på Granada agar havde lidt flere positive end vaginalpodningerne 19,1 % i 35. graviditetsuge og 18,5 % ved fødslen. Der var altså en forskel i antal positive i vaginapodningerne og rectalpodningerne på 5,7 % i 35. graviditetsuge og 4 % ved fødslen. I artiklen Comparison of different sampling techniques and of different culture methods for detection of group B streptococcus carriage in pregnant women af El Aila. et. al.[13] har de sammenlignet vaginal- og rectumpodninger, men også rectum-vaginal podninger. El Aila. et. al. forklarer, at den rectumvaginal podning skal tages med samme podepind. Først podes vagina og derefter i rectum. I studiet blev der brugt 300 E-swabs fra 100 gravide taget omkring 35-37 graviditetsuge. Alle gravide fik taget en podning fra rectum-vaginal, vagina og rectum. Ud af de 100 kvinder blev der fundet 22% som var koloniseret med GBS. Der blev med rectum-vaginalpodningen fundet alle 22 positive gravide koloniseret med GBS i alt 100 %. I vaginalpodningerne fandt man kun halvdelen 50% af de positive gravide og i rectumpodningerne fandt man 82 % af de gravide koloniseret med GBS positive. Der var altså ikke en signifikant forskel fra brugen af rectum-vaginalpodning og ved rectumpodning alene. Sammenlignet med dette projekts resultater ser det ud til, at de begge finder en rectumpodning bedre end vaginalpodning til detektion af GBS. Procenterne kan dog ikke sammenlignes, da El Aila. et. al. har beregnet resultaterne ud fra antallet af rectumpodninger, der blev fundet positive ud af alle positive gravide fundet med GBS kolonisation i studiet. I dette studie er der beregnet ud fra, hvor mange positive GBS der er i procent ud af alle rectalpodningerne. El Aila. et. al. anbefaler ud fra deres studie, at der benyttes rectum-vaginalpodninger. Urinprøverne blev udsået på 5 % blodager og havde meget lavere antal positive for GBS i procent. Der blev i urinprøverne fundet 6,2 % positive i 35. graviditetsuge og 3,8 % ved fødslen. Dette er et væsentlig mindre fund end ved vaginalpodningerne og rectalpodningerne. Det er ca. 10 % mindre positive der er blevet fundet i urinprøverne som i podningerne. Dog er det ikke helt overraskende, da ifølge 19

Prevention of perinatal group B streptococcal disease--revised guidelines from CDC, 2010. af Verani, JR et. al. [14] bliver GBS kun fundet i urin hos 2-7 % af gravide. Sensitivitet og specificitet: For at undersøge hvor stabilt vaginal- og rectumpodningerne samt urinprøverne var som prøvemateriale ved dyrkning i graviditetsuge 35, blev der beregnet sensitivitet og specificitet. Vaginal- og rectumpodningerne samt urinprøverne fra fødslen, blev brugt som gylden standard. Prøverne fra fødslen blev brugt som gylden standard, da dyrkningen ved fødslen er den sande værdi for antallet af positive gravide inficeret med GBS. Vaginalpodningerne fra 35. graviditetsuge fik en sensitivitet på 73,3 % og specificitet på 97,2 %. Rectumpodningerne fra 35. graviditetsuge fik en sensitivitet på 83,6 % og specificitet på 95,5 %. Urinprøverne fra 35. graviditetsuge fik en sensitivitet på 18,2 % og en specificitet på 94,3 %. Sensitiviteten af vaginalpodningerne fra 35. graviditetsuge blev lidt lavere end den for rectumpodningerne. I artiklen Reduction of the use of antimicrobial drugs following the rapid detection of Streptococcus agalactiae in the vagina at delivery by real-time PCR-assay af Poncelet-Jasserand, E et. al. [8] var der i alt 225 gravide med i studiet. Poncelet-Jasserand, E et. al. undersøger i studiet ligesom i dette bachelorprojekt vaginalpodninger fra 34.-37. graviditetsuge dyrket på Granada med dyrkning samt PCR ved fødslen. I studiet af Poncelet-Jasserand, E et. al. blev der også beregnet sensitivitet og specificitet for vaginalpodning dyrket på Granada agar fra 34.-37. graviditetsuge. Der blev også benyttede dyrkning på Granada agar ved fødslen som gylden standard. Sensitiviteten af vaginalpodning dyrket på Granada agar fra 34.-37. graviditetsuge gav i studiet en sensitivitet på 55,6 % og en specificitet på 84,5 %. Sammenlignet med resultater i dette bachelorprojekt, ser det ud til, at i begge studier var der ikke er en speciel høj sensitivitet. Sensitiviteten blev dog en del højere i dette bachelorprojekt end i studiet af Poncelet-Jasserand, E et. al.. Specificiteten for vaginapodning fra 35. graviditetsuge i dette bachelorprojekt på 97,2 % var en del højere end i Poncelet-Jasserand, E et. al. studie hvor specificiteten kun var på 84,5 %. Opsummering lyder ud fra resultaterne lavet på prøvematerialet i dette bachelorprojekt er, at rectumpodninger i Eswab er det bedste prøvemateriale til detektion af GBS. Dette bedømmes ud fra, at rectumpodningerne har den højeste procentvise positive fund af GBS hos gravide på i 35. graviditetsuge og ved fødslen. Samtidig har den også den største sensitivitet ved dyrkning på Granada agar i 35. graviditetsuge. Ud fra studiet af El Aila. et. al.[13] er det eventuelt en ide at se nærmere på brugen af rectum-vaginalpodninger som i studiet finder alle GBS positive 100 % i modsat vaginalpodningerne. 20

5.1.2 Dyrkning på Granada agar i 35. graviditetsuge vs. ved fødsel Da dataet i dette studie var nominal samt ikke parametisk kunne der ikke beregnes en p-værdi til, at sammenligne dykninger på Granada agar i 35. graviditetsuge med dykning på Granada agar ved fødslen. Der blev derfor lavet Cohens kappa-koefficient for vaginapodninger, rectumpodninger og urinprøverne. Denne test blev lavet for, at se om der var overensstemmelse, mellem dyrkning på Granada agar i graviditetsuge 35. og dyrkning på Granada agar ved fødslen. Kappa-koefficienten for vaginalpodningerne og rectumpodningerne var på 0,74 og 0,78. Ifølge skalaen fra Landis og Koch [15] er der god overensstemmelse i mellem dyrkning af vaginal- samt rectumpodninger på Granada agar i 35. graviditetsuge, samt dyrkning på Granada agar ved fødslen. Kappa-koefficienten er for urinprøverne derimod knap så god og kun på 0,1. Denne kappa-koefficient betyder, at der en svag overensstemmelse. Det vil altså sige at ifølge Cohens kappa-koefficient vil de fleste gravide, der får taget en rectumpodning og/eller en vaginalpodning i 35. graviditetsuge også blive postive, ved dyrkning på Granada agar ved fødslen. Den højeste score på skalaen fra Landis og Koch er 0,8-1, som betegnes, som næsten perfekt overensstemmelse. Hvilket især med rectalpodningerne er meget tæt på, at opnå med kun 0,02 fra 0,8. Det er dog vigtigt, at huske på at der ikke findes nogen universal skala for kappa-koeficient og at den brugte skala fra The Measurement of Observer Agreement for Categorical Data af Landis og Koch ingen objektive argumentationer har for, deres valg af skalaen. Derfor kan man altså ikke bruge kappakoefficient, som endegyldigt resultat.[16] En anden metode der kunne være blevet benyttet til, at sammenligne dyrkning i 35. graviditetsuge med dyrkning ved fødslen var Chi-i-anden test. Dette blev også undersøgt og beregnet, men da Chi-i-anden test kun vurderede om fundet af antallet af positive og negative for GBS i 35. graviditetsuge og ved fødslen er lige mange og ikke noget om sammenhængen af sandt positive og negative, er denne test ikke brugbar i dette bachelorprojekt. Resultatet var dog heller ikke valid, da de forventede værdier var under 5, som Chi-i-anden test kræver, det skal være højere end for, at kunne beregnes. Opsummering i forhold til Cohens kappa-koefficient, er der ingen signifikant forskel på vaginal- og rectumpodninger, dyrket på Granada agar i 35. graviditetsuge og ved fødslen. Der er dog en signifikans uoverensstemmelse mellem urinprøverne dyrket på 5 % blodagar i 35. graviditetsuge og ved fødslen. 21

5.1.3 Sensitivitet og specificitet af real-time PCR på BDMax TM Der blev ligesom ved dyrkning beregnet sensitivitet og specificitet på real-time PCR på BDMax TM. Det var kun vaginalpodninger der blev kørt på BDmax TM. Sensitiviteten og specificiteten af real-time PCR på BDmax TM, blev beregnet ligesom ved dyrkning i 35. graviditetsuge, med dyrkning fra fødslen som gylden standard. Resultaterne for real-time PCR på BDMax TM gav en sensitivitet på 88,9 % og en specificitet på 96,9 %. I artiklen intrapartum polymerase chain reaction for detection of group B streptococcus colonization af Abdelazim, Ibrahim A. et. al. [7] blev der taget en vaginalpodning i 35-37 graviditetsuge samt en dobbelt vaginalpodning ved fødslen. Den ene vaginalpodning taget ved fødslen blev brugt til PCR på GeneXpert system. GeneXpert er et fuldautomatisk system. Den anden vaginalpodning fra fødslen, blev der lavet dyrkning på. Der var i alt 445 gravide med i studiet. Ud af disse var der 464 spædbørn der blev født og ud af dem 12 som blev indlagt på intensiv, på grund af GBS sepsis. Der blev ligesom i dette bachelorprojekt benyttet dyrkning ved fødsel som gylden standard. PCR testen på GeneXpert havde en sensitivitet på 98,3 % og en specificitet på 99 %. I sammenligning med egne resultater for BDmax TM på vaginalpodninger ved fødslen havde af Abdelazim, Ibrahim A. et. al. højere sensitivitet og specificitet en de opnåede i dette bachelorprojekt. Hvor af Abdelazim, Ibrahim A. et. al studie var hele 10 % højere i sensitivitet. De opnåede dog omtrent samme specificitet. Der blev også beregnet sensitivitet og specificitet på dyrkning fra 35.-37. graviditetsuge. Sensitiviteten for dette var 73 % og specificiteten 95,5 %. Sensitiviteten er den samme som i dette bachelorprojekt nemlig 73,3 % for dyrkning med vaginalpodninger i 35. graviditetsuge. I en anden artiklen Multicenter Evaluation of the BD Max GBS Assay for Detection of Group B Streptococci in Prenatal Vaginal and Rectal Screening Swab Specimens from Pregnant Women af Riedlinger, J et. al. [17] har de også benyttet BDmax TM GBS assay kit, som i dette bachelorprojekt. De har dog benyttet 601 rectum-vaginalpodninger istede. I dette studie blev der fundet en sensitivitet på 95 % og en specificitet på 96,7 %. Sammenlignet med resultaterne kun for vaginapodninger i dette studie ses det at der er en lidt større sensitivitet i Riedlinger, J et. al. studie i forhold til dette. Dog kan det ikke sammenlignes helt konkret da det var rectum-vaginalpodninger der blev brugt i Riedlinger, J et. al. studie. Det viser dog at der en høj sensitivt ved brugen af rectumvaginalpodninger. Dog var sensitiviteten ikke højere end i af Abdelazim, Ibrahim A. et. al. studie med brug af vaginalpodninger. Specificiteten var dog stort set den samme i alle tre studier 96,9 %, 99 % og 96,7 %. Ved sammenligning af sensitiviteten og specificiteten af dyrkning på Granada agar med vaginalpodninger i 35. graviditetsuge med vaginalpodninger kørt på BDmax TM viser dette at sensitiviteten af real-time PCR med BDmax TM er en del højere end den for dyrkning. Dette skyldes at der 22

ved dyrkning på Granada agar i 35. graviditetsuge var langt flere falsk negative 12 i forhold til 33 sandt positive. Hvor der ved real-time PCR på BDmax TM var 3 falske negative i forhold til 24 sandt positive. Der blev også lavet Cohen kappa-koefficient for at sammenligne dyrkning af vaginalpodninger på Granada agar ved fødslen med vaginalpodninger kørt real-time PCR på BDMax TM ved fødslen. Dette gav en kappa-koefficient på 0,85, som betegnes som en næsten perfekt overensstemmelse mellem PCR og dyrkning. Opsummering sensitiviteten for vaginalpodninger på real-time PCR på BDmax TM blev ikke helt vildt høj i dette bachelorprojekt. Dog var den højere end sensitiviteten af vaginalpodninger dyrket på Granada agar i 35. graviditetsuge. Der var derfor flere sandt positive i forhold til falsk negative ved real-time PCR på BDmax TM. Det er dog vigtigt at tage højde for at antallet af prøver kørt på BDmax TM er mindre end dem der blev dyrket på Granada agar. Derudover var det ikke samme patientprøver der blev kørt på BDmax TM som dem der blev dyrket på Granada agar. 5.2 Diskussion af brugervenligheden af Granada agar og BDmax TM 5.2.1 Brugervenligheden af Granada agar For at vurdere brugervenligheden af Granada agar, blev det valgt, at se på udførelsen af analysen samt andre plader til detektion af GBS. Aflæsningen af Granada agaren betragtes som nem, da den ikke producere en masse forskellige farver. En fordel ved Granada agar er, at de positive kolonier detekteres nemt, ved en meget tydelig orange farve. I bachelorprojektet blev alle de orange kolonier på Granada agaren bekræftet ved MALDI-TOF. MALDI-TOF bekræftede, at alle orange kolonier fundet i studiet var Streptococcus agalactiae. Under aflæsning blev der, også fundet en del gule kolonier på Granada agaren. De gule kolonier blev ligeledes, som de orange bekræftede på MALDI-TOF. Alle gule kolonier som blev kørt på MALDI-TOF, blev identificeret som ikke værende GBS. Ifølge Granada agarens indlægsseddel og andre studier er der beskrevet, at Granada agar bør inkuberes anaerob [18][[19]. I dette studie blev Granada agar ikke inkuberet anaerob, men i CO 2 -varmeskab. GBS kolonierne voksede dog fint frem alligevel med en intens orange farve. Granada agar er dog ikke den eneste mulighed, hvad angår GBS selektive plader. Der findes en del forskellige på market bl.a. ChromID STRB fra biomérieux og Brilliance GBS medium fra Thermo Ficher Scientific. I artiklen Evaluation of the New Brilliance GBS Chromogenic Medium for Screening 23

of Streptococcus agalactiae Vaginal Colonization in Pregnant Women af Verhoeven, PC [18] blev disse GBS selektive plader sammenlignet, med Granada agar fra biomérieux. I studiet blev der udsået 200 vaginalpodninger fra Eswab, på hver af de tre mediere. Brilliance GBS medium og ChromID STRB blev inkuberet aerob og Granada agar blev inkuberet anaerob. De tre forskellige plader blev aflæst efter 24-48t. Der blev beregnet sensitivitet og specificitet for de 3 forskellige plader. Sensitiviteten på forholdsvis Granada agar, Brilliance GBS medium og ChromID STRB var 94,3 %, 100 % og 100 % og specificiteten var 100 %, 90,3 % og 98,8 %. Grunden til den lavere sensitivitet ved Granada agar var at den ikke fandt 2 non-hæmolytiske GBS. Det at Granada agar, ikke kan finde de non-hæmolytiske GBS er kan være et problem, da disse også kan fører til infektion hos de nyfødte. ChromID STRB havde en god sensitivitet men var meget svære at aflæse på grund af de mange chromogener i pladen. Brilliance GBS medium havde også en god sensitivitet, men en lavere specificitet end de andre to plader. Det større antal falsk positive ved Brilliance GBS medium skyldes, at den havde svært ved at skelne mellem forskellige species af streptokokker. Det er derfor nødvendigt, at udfør MALDI-TOF som bekræftelse ved brug af Brilliance GBS medium. 5.2.2 Brugervenligheden af real-time PCR på BDmax TM Til at vurdere brugervenligheden af BDmax TM blev det valgt at se på udførelsen af analysen og artikler omkring BDmax TM. BDmax TM er et meget brugervenligt system, da det er et fuldautomatisk lukket system. Den kræver derfor ingen oprensning og det eneste man manuelt skal gøre er, at afpipetter prøvematerialet fra Eswab over i reagensstrimlen og derefter sætte den på maskinen. Da BDMax TM netop er så nem at betjene og derfor ikke kræver den store oplæring. Den er derfor ideel, at have stående på en fødeafdeling. BDMax TM har også en forhåndsvis kort analyseringstid på ca. 2½ time. Den er derfor oplagt som hurtigmetode, som kan benyttes når de gravide, ankommer til fødeafdeling omkring fødslen. En væsentlig ulempe ved PCR er som beskrevet i flere artikler heriblandt artiklen Multicenter Evaluation of the BD Max GBS Assay for Detection of Group B Streptococci in Prenatal Vaginal and Rectal Screening Swab Specimens from Pregnant Women af Riedlinger, J et. al. [17] er det økonomiske perspektiv. Real-time PCR på BDMax TM er meget dyrere end dyrkning på Granada agar. I artiklen vurdere de at prisen pr test vil være ca. $25 og hvor den for Granada agar kun er ca. $9 pr test. Dette er en stor hindring i implementeringen af BDMax TM. 24

6.0 Konklusion Ved vurdering af resultaterne fra dyrkning i dette bachelorprojekt i form af prøvemateriale og prøvetagningstidspunkt, er den screeningsmetode med flest sandt positive; rectumpodninger dyrket på Granada agar i 35. graviditetsuge. Dette bedømmes på baggrund af, at rectumpodningerne havde det største antal positive i forhold til vaginalpodningerne samt urinprøverne. Derudover havde rectumpodningerne dyrket på Granada agar fra 35. graviditetsuge også den største sensitivitet og specificitet af prøvematerialerne. Tilsidst var kappa-koefficienten, som blev brugt til at sammenligne rectumpodningerne dyrket på Granada agar i 35. graviditetsuge med dyrkning på Granada ved fødslen god. Vaginalpodninger kørt ved real-time PCR på BDmax TM gav i projektet, den bedste sensitivitet på 88,9 %, dog stærkt efterfulgt af rectumpodninger fra 35. graviditetsuge på 83,6 %. Hvilket vil sige, at der blev fundet færrest falsk negative i forhold til sandt positive ved BDmax TM. Kappa-koefficienten for real-time PCR ved fødslen sammenlignet med dyrkning ved fødslen gav en næsten perfekt overensstemmelse. Derfor på baggrund af disse resultater, ville en real-time PCR på BDmax TM være lige så god en screeningsmetode, som dyrkning i 35. graviditetsuge. Begge metoder er brugervenlige og kræver ikke meget oplæring. Real-time PCR på BDmax TM er dog en dyrere metode end dyrkning på Granada agar i 35. graviditetsuge. Ved anvendelse af den pågældende litteratur i diskussionen, kan det i øvrigt pointeres, at i mange andre lande, benytter de sig af rectumvaginalpodninger, både ved dyrkning og ved PCR. Derudover er der fundet en højere sensitivitet, ved real-time PCR på BDmax TM på rectumvaginalpodninger. Det kan yderligere konkluderes ud fra dette bachelorprojekt at urinprøver dyrket på 5 % blodager er den dårligst metode til detektion af GBS. Den scorede lavest i alle beregning både i antal positive i procent, sensitivitet samt ved kappa-koefficient. Derfor bør denne dyrkningsmetode skiftes ud. 7.0 Perspektivering Dette bachelorprojekt ligger op til yderligere undersøgelser, da antallet af de samlede prøver, der blev kørt real-time PCR på BDmax TM kun var fra 156 gravide. Det ville derfor give et mere troværdigt resultat ved en større teststørrelse. I det kliniske studie af Mohammed Khalil, projektleder, overlæge, Gyn./Obs. afd., Sygehus Lillebælt, Kolding laves det samme studie dog med et større antal gravide til 25